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UNIVERSIDADE FEDERAL DE OURO PRETO
ESCOLA DE FARMÁCIA
PROGRAMA DE PÓS GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
“DO LEISHFLOW AO LEISHPLEX: INOVAÇÕES
TECNOLÓGICAS DA SOROLOGIA POR CITOMETRIA DE
FLUXO APLICADA AO DIAGNÓSTICO DA LEISHMANIOSE
VISCERAL CANINA”
Henrique Gama Ker
Escola de Farmácia
Ouro Preto - 2016
Henrique Gama Ker
“DO LEISHFLOW AO LEISHPLEX: INOVAÇÕES
TECNOLÓGICAS DA SOROLOGIA POR CITOMETRIA DE
FLUXO APLICADA AO DIAGNÓSTICO DA LEISHMANIOSE
VISCERAL CANINA”
Tese apresentada ao Programa de Pós
Graduação em Ciências Farmacêuticas da
Universidade Federal de Ouro Preto, como parte
integrante dos requisitos para obtenção do Título
de Doutor em Ciências Farmacêuticas.
Área de concentração: Fármacos, Medicamentos
e Vacinas.
Orientador: Dr. Alexandre Barbosa Reis
Co-orientadora: Dra. Andréa Teixeira de Carvalho
Escola de Farmácia
Ouro Preto – 2016
Orientador: Dr. Alexandre Barbosa Reis, Laboratório de Imunopatologia,
Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas (NUPEB), Universidade Federal de
Ouro Preto, MG.
Co-orientadora: Dra. Andréa Teixeira de Carvalho, Grupo Integrado de
Pesquisas em Biomarcadores, Centro de Pesquisas René Rachou, FIOCRUZ,
MG.
Colaboradores:
Dr. Olindo Assis Martins Filho (CPqRR/FIOCRUZ/MG)
Dra. Patrícia Sampaio Tavares Veras (CPqGM/FIOCRUZ/BA)
Dra. Hélida Monteiro de Andrade (UFMG/MG)
Dr. Diogo Garcia Valadares (UFOP/MG)
Dr. Evandro Marques de Menezes Machado (UFOP/MG)
Dr. Rodrigo Dian de Oliveira Aguiar Soares (UFOP/MG)
Dr. Wendel Coura Vital (UFOP/MG)
Instituições Parcerias:
Centro de Pesquisas René Rachou/FIOCRUZ/MG
Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz/FIOCRUZ/BA
Universidade Federal de Minas Gerais
Universidade Federal de Ouro Preto
Suporte Financeiro:
FAPEMIG - EDITAL 14/2013 - PROGRAMA DE PESQUISA PARA O SUS -
PPSUS (CDS - APQ-03505-13)
FAPEMIG - EDITAL 70/2013 - PROGRAMA INVENTIVA (CBB - INV-00037-14)
CAPES: Bolsa de doutorado
Ao meu pais João e Maria José,
Pelos ensinamentos,
E apoio aos meus sonhos.
Ao meus afilhados João Pedro e Francisco,
Pela sincera ternura,
E alegria do nosso laço.
Aos meus irmãos Pedro e Mariana
Pelo companheirismo,
E perene amizade.
À memória das minhas avós Lourdes e Irene,
Pelas queridas lembranças,
E eterno carinho.
Ao meu avô Carlito,
Pela simplicidade,
E contagiante alegria de viver.
À Hélia,
Pelo amor,
E adorável companhia.
“É chato chegar
A um objetivo num instante”
Raul Seixas
Agradecimentos
Agradeço primeiramente a Deus por colocar em meu caminho pessoas que me
acompanharam nesta jornada e por conceder-me sabedoria para enfrentar esta longa
jornada durante estes quatro anos.
A Escola de Farmácia e à Universidade Federal de Ouro Preto por fazer parte da minha
formação pessoal e por proporcionar minha formação profissional e científica.
Ao Dr. Alexandre Barbosa Reis, meu orientador, e grande amigo, pela confiança, pelo
incentivo, pelas críticas, e pelos ensinamentos que concederam-me a oportunidade de
vislumbrar novos horizontes no âmbito científico e acadêmico.
À Dra. Andréa Teixeira de Carvalho, minha co-orientadora, pela convivência sempre
distinta, de marcante sensibilidade, aliada a um enorme conhecimento. Seus
ensinamentos iluminaram-me o raciocínio e certamente tem grande importância nesta
conquista.
À Dra. Cláudia Martins Carneiro, pela amizade, pela confiança, e pelo amparo nas horas
em que mais precisei, e pelo grande exemplo de pessoa.
Ao Dr. Wendel Coura Vital, grande parceiro que representa um verdadeiro exemplo
profissional. Obrigado pela importante contribuição dada ao longo da minha formação.
Ao Dr. Rodolfo Cordeiro Giunchetti e a Dra. Denise da Silveira Lemos Giunchetti, pela
fundamental contribuição nos meus primeiros passos durante o mestrado.
A Dra. Patrícia Sampaio Tavares Veras e Dra. Hélida Monteiro de Andrade e toda a
equipe a quem sempre nos atendeu com solicitude e boa vontade para o fornecimento
dos recombinantes.
Ao Dr. Evandro Marques de Menezes Machado pelos conselhos.
Ao Dr. Diogo Garcia Valadares e ao Dr. Rodrigo Dian de Oliveira Aguiar Soares pela
efetiva participação no desenvolvimento deste trabalho.
Aos Professores André Vasconcelos, Wagner Miranda, Francisco Careta e Taís Bastos,
pela acolhida durante minha estadia no Departamento de Farmácia e Nutrição da
Universidade Federal do Espírito Santo.
Aos meus pais João Carlos e Maria José pela dedicação, amor e compreensão durante
todos esses anos.
Aos meus irmãos Pedro e Mariana, e à Cristina, pela duradoura amizade e
companheirismo. Sempre contarei com vocês!
À Hélia pelo amor, amizade, incentivo e companheirismo. Você é a essência da minha
vida!
Aos meus sobrinhos e afilhados João Pedro e Francisco pela alegria da nossa amizade.
Aos meus avós Carlito e Lourdes, e João e Irene, pelos valores familiares.
Aos amigos do Laboratório de Imunopatologia e Laboratório de Pesquisas Clínicas, pela
convivência harmoniosa e pelos valores de união.
Aos amigos que carrego da cidade de Viçosa-MG, Thiago Andrade, Rafael Santana,
André Féres, Leonardo Comastri e Alexandre Dantas, pelas saudosas lembranças da
minha infância e adolescência. Um dos sacrifícios desta conquista foi viver distante de
vocês.
Aos amigos que carrego da cidade de Ouro Preto-MG, Galeno Cortes, Sheler Martins,
Rodrigo Dian, Kelvinson Viana, Alexandre Rotondo, Ricardo Junqueira e Bernardo
Machado pela verdadeira amizade. A convivência com cada um de vocês ficou marcada.
Aos amigos que carrego da cidade de Manhumirim-MG, Emerson Portugal, João Paulo
Portugal, Orbino Werner, Raphael Gerardi e Gelsomiro Basílio, pelos momentos em que
pude estar da alegre companhia de vocês.
Aos amigos, Antônio Calais e Raphael Bolzan, que me acolheram durante uma curta,
mas importante passagem pela cidade de Alegre-ES.
A todos meus familiares, colegas e amigos, que, mesmo em pensamentos, um sorriso,
ou uma palavra de incentivo, me apoiaram nessa longa jornada.
i
Resumo
Os ensaios sorológicos para Leishmania são determinantes para indicar a eutanásia de
cães como medida de controle da Leishmaniose Visceral no Brasil. No presente estudo,
buscou-se avaliar o desempenho das metodologias sorológicas que atualmente são – e
os que já foram – adotadas pelo Ministério da Saúde do Brasil (DPP, ELISA e RIFI),
assim como o da sorologia por Citometria de Fluxo (CF), no diagnóstico da
Leishmaniose Visceral Canina (LVC). Os ensaios foram conduzidos em uma ampla
variedade de amostras de soro, que incluiu cães naturalmente infectados por
Leishmania infantum portadores de diferentes formas clínicas, cães infectados com
outras protozooses caninas (L. braziliensis, Trypanosoma cruzi, Ehrlichia canis e
Babesia canis) e cães vacinados contra LVC (Leishmune®, Leish-Tec® e LBSap). Em
relação aos testes oficiais, o principal achado se deu pela elevada especificidade do
DPP (99,4%) em relação à ELISA (89,9%) e RIFI (75,2%). Quanto ao teste LeishFlow,
destacou-se a sensibilidade de 95,0% tanto nos cães assintomáticos, quanto nos
oligossintomáticos e sintomáticos. A especificidade do LeishFlow em amostras de soro
de cães infectados por L. braziliensis foi de 80,0%, 55,6% nas amostras de T. cruzi,
93,3% em E. canis, e 100,0% em B. canis. Nos cães vacinados pela Leishmune®, Leish-
Tec® e LBSap observou-se 100,0% de especificidade. A sequência do trabalho buscou
o desenvolvimento de uma inovação metodológica na sorologia por CF por meio do
acoplamento de antígenos recombinantes à microesferas de poliestireno. Os antígenos
multiepitopo PQ20 e C1, e os recombinantes rLci1A e rLci2B foram acoplados a
diferentes microesferas, formando os sistemas antigênicos microesfera–proteína C6–
PQ20, E7–C1, A4–rLci1A, e E4–rLci2B. Constatou-se que os sistemas A4−rLci1A e
E4−rLci2B foram os únicos que se mostraram adequadamente funcionais para a
pesquisa de anticorpos caninos IgG. O ensaio sorológico pelo sistema A4−rLci1A
apresentou sensibilidade de 85,0% nos cães assintomáticos, e 95,0% nos
oligossintomáticos e sintomáticos. A especificidade deste sistema nos cães infectados
por L. braziliensis foi de 100,0%, enquanto que nas infecções por E. canis e B. canis,
esse valor foi de 30,0% e 20,0% respectivamente. Nos cães vacinados por Leishmune®
e Leish-Tec® a especificidade foi de 70,0%, e por LBSap de 80,0%. O sistema
antigênico E4−rLci2B, por sua vez, apresentou sensibilidade de 85,0% nos animais
assintomáticos, e de 100,0% nos oligossintomáticos e sintomáticos. A especificidade
deste sistema em relação as infecções por L. braziliensis e E. canis foi de 80,0%, e de
60,0% quanto a infecção por B. canis. A especificidade relacionada à vacinação por
Leishmune® e pela Leish-Tec® foi de 90,0%, e na LBSap foi de 50,0%. A combinação
dos sistemas A4−rLci1A e E4−rLci2B para o ensaio sorológico único, LeishPlex,
apresentou sensibilidade de 85,0% nos cães assintomáticos, e 100,0% nos grupos
oligossintomático e sintomático. A especificidade em cães infectados por L. braziliensis
foi de 100,0%, enquanto que em E. canis foi de 70,0%, e em B. canis foi 60,0%. Nos
cães vacinados pela Leishmune®, Leish-Tec® e LBSap observou-se 100,0% de
especificidade. Portanto, a inovação LeishPlex resultou em uma elevação da precisão
geral de acertos. O conjunto de dados evidenciados no presente trabalho fortalecem a
sorologia por CF como uma importante abordagem para o diagnóstico sorológico da
LVC.
Palavras chave: Leishmania infantum; Leishmaniose Visceral Canina; Diagnóstico;
Sorologia; Citometria de Fluxo.
ii
Abstract
Serologic tests for Leishmania are key to determine the euthanasia of infected dogs as
a control measure of Visceral Leishmaniasis in Brazil. In the present study, we sought to
evaluate the performance of serologic methods that are currently – and those that have
already been – adopted by the Ministry of Health of Brazil (DPP, ELISA and IFAT), as
well as the serology by Flow Cytometry (FC), in the diagnosis of Canine Visceral
Leishmaniasis (CVL). The tests were conducted in a wide variety of serum samples, that
included dogs naturally infected with Leishmania infantum with different clinical forms,
dogs infected with other canine protozoosis (L. braziliensis, Trypanosoma cruzi, Ehrlichia
canis and Babesia canis), and vaccinated against CVL (Leishmune®, Leish-Tec® and
LBSap). Regarding the official tests, the main finding was associated to the high
specificity of the DPP (99.4%) in relation to ELISA (89.9%) and IFAT (75.2%). For the
LeishFlow test, it was worth noting a sensitivity of 95.0% in all asymptomatic,
oligosymptomatic and symptomatic dogs. The specificity of LeishFlow in serum samples
of dogs infected with L. braziliensis was 80.0%, 55.6% in T. cruzi, 93.3% in E. canis, and
100.0% in B. canis. In the dogs vaccinated with Leishmune®, Leish-Tec® and LBSap,
100.0% of specificity was observed. The next step of the work sought the development
of an innovative approach in FC serology by coupling recombinant antigens to
polystyrene beads. The multiepitope antigens PQ20 e C1, and the recombinants rLci1A
e rLci2B were coupled to different beads generating the antigenic systems C6–PQ20,
E7–C1, A4–rLci1A and E4–rLci2B. It was observed that the systems A4–rLci1A and E4–
rLci2B were the only ones that were properly functional to the research of IgG canine
antibodies. The serological assay by the system A4–rLci1A presented sensitivity of
85,0% in the asymptomatic dogs, and 95,0% in the oligosymptomatic and symptomatic
ones. The specificity of this system in dogs infected by L. braziliensis was 100,0%,
whereas in E. canis and B. canis infections this value was 30,0% and 20,0% respectively.
In dogs vaccinated with Leishmune® and Leish-Tec® the specificity was 70,0%, e with
LBSap it was 80,0%. The antigenic system E4–rLci2B, in turn, showed sensitivity of
85,0% in asymptomatic animals, and of 100,0% in oligosymptomatic and symptomatic
dogs. The specificity of this system concerning infections by L. braziliensis and E. canis
was 80,0%, and 60,0% concerning the infection by B. canis. The specificity regarding
the vaccination with Leishmune® and Leish-Tec® was 90,0%, and with LBSap it was
50,0%. The combination of the systems A4−rLci1A and E4−rLci2B for a single
serological assay, LeishPlex, presented sensitivity of 85,0% in asymptomatic animals,
and of 100,0% in oligosymptomatic and symptomatic dogs. The specificity in dogs
infected by L. braziliensis was 100,0%, while in E. canis it was 70,0%, and 60,0%
concerning the infection by B. canis. In the dogs vaccinated with Leishmune®, Leish-
Tec® and LBSap, 100.0% of specificity was observed. Thus, the innovative LeishPlex
yielded increased accuracy. The data set evidenced by the present work strengthened
the FC serology as an important approach for CVL serological diagnosis.
Key words: Leishmania infantum; Canine Visceral Leishmaniasis; Diagnosis;
Serological Test; Flow Cytometry.
iii
Sumário
Resumo................................................................................................................i
Abstract.............................................................................................................iii
Índice de figuras ............................................................................................... v
Índice de tabelas ............................................................................................ vii
Lista de abreviaturas e siglas ...................................................................... viii
1. INTRODUÇÃO ............................................................................................... 1
2. REVISÃO DA LITERATURA ......................................................................... 5
2.1. Aspectos clínicos-laboratoriais e considerações sobre o diagnóstico da LVC ..... 5
2.2. Abordagem histórica das técnicas sorológicas clássicas empregadas no
diagnóstico da LVC ................................................................................................................ 9
2.3. Aprimoramento dos testes sorológicos usualmente empregados no diagnóstico
da LVC ................................................................................................................................... 10
2.4. A necessidade de elevada acurácia para o diagnóstico sorológico da LVC ...... 13
2.5. Atuais perspectivas biotecnológicas na construção de metodologias sorológicas
para o diagnóstico da LVC .................................................................................................. 14
3. JUSTIFICATIVA ........................................................................................... 17
4. HIPÓTESE ................................................................................................... 18
5. OBJETIVOS ................................................................................................. 18
5.1. Objetivo Geral .............................................................................................................. 18
5.2. Objetivos específicos ................................................................................................... 18
6. MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................... 19
6.1. Ensaios sorológicos para diagnóstico da LVC: avaliação das metodologias
adotadas pelo Ministério da Saúde do Brasil .................................................................. 19
6.2. Ensaios sorológicos para diagnóstico da LVC: o teste por citometria de fluxo
LeishFlow .............................................................................................................................. 19
6.3. Ensaios sorológicos para diagnóstico da LVC: o desenvolvimento de uma nova
metodologia diagnóstica por citometria de fluxo e a geração de uma plataforma
diagnóstica – LeishPlex....................................................................................................... 19
6.3.1. Animais experimentais.............................................................................................. 20
6.3.2. A tecnologia Cytometric Bead Array (CBA) .......................................................... 22
6.3.3. Padronização do acoplamento de proteínas às microesferas funcionais CBA
................................................................................................................................................ 23
6.3.4. O acoplamento de proteínas recombinantes com potencial para diagnóstico
da LVC e o desenvolvimento de uma nova metodologia diagnóstica por citometria de
fluxo ........................................................................................................................................ 26
6.3.5. Análise dos dados obtidos no citômetro de fluxo ................................................. 28
iv
6.3.6. Análise dos resultados ............................................................................................. 31
6.3.6.1. Análises aplicadas à seleção das condições ideais para reação sorológica 31
6.3.6.2. Análises aplicadas à determinação do ponto de corte .................................... 31
6.3.6.3. Análises aplicadas à avaliação de desempenho diagnóstico ......................... 32
6.4. Comparação entre os testes sorológicos ................................................................. 34
7. RESULTADOS ............................................................................................. 35
7.1. Avaliação das metodologias adotadas pelo Ministério da Saúde do Brasil no
diagnóstico da LVC .............................................................................................................. 35
7.2. Avaliação do teste por citometria de fluxo LeishFlow no diagnóstico da LVC ... 35
7.3. Desenvolvimento e avaliação de um novo teste multiplex por citometria de fluxo
utilizando sistemas microesfera−proteína no diagnóstico da LVC e construção do
LeishPlex ............................................................................................................................... 35
7.3.1. Os sistemas microesfera−proteína E7−C1 e C6−PQ20 ..................................... 35
7.3.2. Os sistemas microesfera−proteína rLci1A e rLci2B ............................................. 37
7.3.3. A construção do novo teste por citometria de fluxo LeishPlex pela combinação
dos sistemas microesfera−proteína rLci1A e rLci2B ...................................................... 45
7.4. Avaliação comparativa entre os testes sorológicos LeishPlex, LeishFlow, DPP,
ELISA e RIFI ......................................................................................................................... 52
8. DISCUSSÃO ................................................................................................ 53
9. CONCLUSÕES ............................................................................................ 66
10. PERSPECTIVAS ........................................................................................ 67
11. ANEXOS .................................................................................................... 68
12. APÊNDICES .............................................................................................. 72
13. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................ 108
v
Índice de figuras
Figura 1: Panorama dos grupos de soros empregados neste estudo..........................21
Figura 2: Painel das microesferas que compõem o kit BD™ CBA Flex Set................22
Figura 3: Etapas para acoplamento de proteínas a microesferas funcionais do kit BD™
CBA Flex Set..................................................................................................................23
Figura 4: Representação esquemática da sequência da análise dos dados da
confirmação do acoplamento de soroalbumina bovina em microesferas C7 do kit BD™
CBA Flex Set.................................................................................................................26
Figura 5: Representação esquemática da sequência da análise dos dados da
confirmação do acoplamento da proteína recombinante C1 à microesfera E7 do kit BD™
CBA Flex Set..................................................................................................................29
Figura 6: Representação esquemática da sequência da análise dos dados da
confirmação do acoplamento da proteína recombinante PQ20 à microesfera C6 do kit
BD™ CBA Flex Set.......................................................................................................29
Figura 7: Representação esquemática da sequência da análise dos dados da
confirmação do acoplamento da proteína recombinante rLci1A à microesfera A4 do kit
BD™ CBA Flex Set.......................................................................................................30
Figura 8: Representação esquemática da sequência da análise dos dados da
confirmação do acoplamento da proteína recombinante rLci1A à microesfera A4 do kit
BD™ CBA Flex Set.......................................................................................................30
Figura 9: Fluxograma do processo da avaliação dos sistemas microesfera−proteína
para aplicação no diagnóstico da LVC. ........................................................................31
Figura 10: Curvas de titulação da reatividade de IgG canino realizado com o sistema
microesfera−proteína E7−C1........................................................................................36
Figura 11: Curvas de titulação da reatividade de IgG canino realizado com o sistema
microesfera−proteína C6−PQ20....................................................................................36
Figura 12: Curvas de titulação da reatividade de IgG canino realizado com o sistema
microesfera−proteína A4−rLci1A...................................................................................38
Figura 13: Curvas de titulação da reatividade de IgG canino realizado com o sistema
microesfera−proteína microesfera−proteína E4−rLci2B................................................38
Figura 14: Obtenção do ponto de corte empregando o sistema
A4−rLci1A......................................................................................................................39
Figura 15: Obtenção do ponto de corte empregando o sistema
A4−rLci1A......................................................................................................................40
Figura 16: Avaliação de desempenho do sistema A4-Lci1A no diagnóstico da
LVC................................................................................................................................41
vi
Figura 17: Avaliação de desempenho do sistema E4-rLci2B no diagnóstico da
LVC................................................................................................................................42
Figura 18: Análise dos valores preditivos em cenários artificiais da doença...............44
Figura 19: Representação esquemática da sequência da análise dos dados o teste
LeishPlex empregando a matriz antigênica composta pelos sistemas microesfera-
proteína A4−rLci1A e E4−rLci2B...................................................................................47
Figura 20: Obtenção do ponto de corte empregando o teste LeishPlex......................48
Figura 21: Avaliação do desempenho do teste LeishPlex em ensaio sorológico por
citometria de fluxo no diagnóstico da LVC....................................................................49
Figura 22: Análise dos valores preditivos em cenários artificiais da doença utilizando o
teste LeishPlex..............................................................................................................51
Figura 23: Protótipo do teste sorológico LeishFlow......................................................58
vii
Índice de tabelas
Tabela 1: Relação das microesferas e respectivo antígeno usado na construção dos
sistemas antigênicos microesfera−proteína deste estudo............................................27
Tabela 2: Categorias de resultados do teste diagnóstico em uma população que inclui
cães não infectados e cães infectados com L. infantum...............................................33
Tabela 3: Desempenho dos sistemas antigênicos A4−rLci1A e E4−rLci2B no
diagnóstico da LVC.......................................................................................................43
Tabela 4: Valores preditivos negativo (VPNs) e positivo (VPPs) da análise dos sistemas
antigênicos A4−rLci1A e E4−rLci2B em diferentes cenários de
prevalência....................................................................................................................43
Tabela 5: Razões de verossimilhança (RVs) e probabilidade pós-teste dos sistemas
antigênicos A4−rLci1A e E4−rLci2B. ............................................................................45
Tabela 6: Desempenho dos teste LeishPlex no diagnóstico da LVC...........................50
Tabela 7: Valores preditivos negativo (VPNs) e positivo (VPPs) da análise do teste por
citometria de Fluxo LeishPlex em diferentes cenários artificiais de
prevalência....................................................................................................................50
Tabela 8: Razões de verossimilhança (RVs) e probabilidade pós teste.......................51
Tabela 9: Avaliação da concordância entre as metodologias sorológicas. .................52
viii
Lista de abreviaturas e siglas
ALT - Alaninaminotransferase
AST- Aspartatoaminotransferase
AUC - Area under a curve
BSA - Bovine Serum Albumin
CA - Cães assintomáticos
CBA - Cytometric bead array
CF - Citometria de Fluxo
CCA - Centro de Ciência Animal
CCZ-BH - Centro de Controle de Zoonoses de Belo Horizonte
CNI - Controle não infectado
CO - Cães oligossintomáticos
CRC - Controle de reatividade cruzada
CS - Cães sintomáticos
DFIP - Departamento de Fiscalização de Insumos Pecuários
DNA - Deoxyribonucleic acid
DPP - Dual Path Platform
DTT - Ditioteitrol
ELISA - Enzime Lynked Immunosorbent Assay
FIOCRUZ - Fundação Oswaldo Cruz
FITC - Isotiocianato de fluoresceína
FL1 - Fluorescência 1
FL3 - Fluorescência 3
FL4 - Fluorescência 4
ix
FSC - Foward Scatter
Ig - Imunoglobulina
IgA - Imunoglobulina da classe A
IgE - Imunoglobulina da classe E
IgG - Imunoglobulina da classe G
IgG1 - Imunoglobulina de subclasse G1
IgG2 - Imunoglobulina de subclasse G2
INF - Cães infectados por L. infantum
IFAT - Indirect Fluorescent Antibody Test
INPI - Instituto Nacional De Propriedade Industrial
hsp - Heat shock protein
kDNA - DNA de cinetoplasto
L - Litro
LV - Leishmaniose Visceral
LVC - Leishmaniose Visceral Canina
LPC - Laboratório de Pesquisas Clínicas
LIMP - Laboratório de Imunopatologia
MAPA - Ministério da Agricultura Pecuária e Abastecimento
mL - Mililitros
µL- Microlitros
mg - Miligramas
MS - Ministério da Saúde
MWCO - Molecular Weight Cut-Off
NEM - N-Ethylmaleimide
NITE - Núcleo de Inovação Tecnológica e Empreendedorismo
x
NNN - Meio de cultura Novy-MacNeal-Nicolle
NUPEB - Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas
PBS - Phosphate Buffer Salin
PCLV - Programa de Controle da Leishmaniose Visceral
PCR - Polimerase Chain Reaction
pH - Potencial hidrogeniônico
PPF - Percentual de Partículas Fluorescentes
qPCR - Real Time Polimerase Chain Reaction
RIFI - Reação de Imunofluorescência Indireta
RNA - Ribonucleic Acid
ROC - Receiver Operation Characteristc
rpm - Rotação por minuto
RV - Razão de verossimilhança
SDA - Secretaria de Desenvolvimento Agrário
SSC - Side Scatter
Sulfo-SMCC - Sulfosuccinimidil 4-N-maleimidometil ciclohexano 1-carboxilato
UFOP - Universidade Federal de Ouro Preto
UFMG - Universidade Federal de Minas Gerais
VPN - Valor preditivo negativo
VPP - Valor preditivo positivo
KER, H.G. INTRODUÇÃO
1
1. INTRODUÇÃO
A leishmaniose visceral (LV) é uma doença negligenciada com um importante
impacto para a saúde pública mundial, apresentando cerca de 200.000−400.000 novos
casos por ano (Alvar et al., 2012). A infecção é causada por protozoários parasitos do
gênero Leishmania e é transmitida pela picada da fêmea de flebotomíneos Lutzomyia
spp no Novo Mundo e Phlebotumus spp no Velho Mundo. A LV tem dois principais tipos
de ciclos de transmissão: a antroponótico e a zoonótico. Em relação a primeira, os seres
humanos são os únicos ou principais reservatórios do parasito, e ocorre principalmente
no subcontinente indiano e na África Oriental. A transmissão zoonótica é tipicamente
observada nos países do Mediterrâneo e nas Américas, mas também pode ser
encontrada na Ásia Central, e alguns países do Oriente Médio.
Embora a LV de transmissão antroponótica corresponde a aproximadamente
80.0−90.0% dos casos em todo o mundo, a LV de transmissão zoonótica tem chamado
a atenção de órgãos oficiais de saúde pública e da comunidade científica, dada a
crescente expansão da doença em regiões urbanas de países da América do Sul (OMS,
2010). Nesta região, a doença é causada pelo protozoário Leishmania infantum,
transmitida por flebotomíneos da espécies do gênero Lutzomyia spp (Quinnell et al.,
2009). No Brasil, há uma série de evidências experimentais e epidemiológicas que
suportam os cães como os principais hospedeiros reservatórios de L. infantum em áreas
urbanas.
Partindo do princípio de que os cães infectados desempenham um papel
essencial na transmissão para os seres humanos em um ambiente urbano no Brasil,
uma estratégia de controle eficaz deve ser capaz de diminuir a incidência de infecção
na população canina. Neste contexto, os argumentos relacionados à ação de controle
composta pela eutanásia de cães infectados mostram-se controversos no Brasil.
Enquanto algumas pesquisas questionam a eficácia desta medida (Dietze et al., 1997;
Costa et al., 2011; Werneck et al., 2014), outros estudos, por sua vez, admitem que esta
estratégia pode produzir resultados positivos (Ashford et al., 1998; Palatnik-de-Sousa et
al., 2001; Nunes et al., 2010). Diante desta divergência, uma certeza comum ressalta
que um dos principais fatores que contribuiu e vem contribuindo para a expansão da LV
nos centros urbanos é a limitação do Programa de Controle da Leishmaniose Visceral
(PCLV) em controlar a Leishmaniose Visceral Canina (LVC).
Dentre os principais determinantes que limitam a eficácia da estratégia de
controle em cães destacam-se: (i) a reposição imediata de cães pela população
(Andrade et al. 2007; Nunes et al., 2008); (ii) a descontinuidade das intervenções
(Malaquias et al., 2007; Barata et al., 2013); (iii) os problemas na logística de eliminação
KER, H.G. INTRODUÇÃO
2
do reservatório doméstico relacionado a demora no diagnóstico e eutanásia dos animais
infectados (Braga et al. 1998; Courtenay et al. 2002); (iv) baixa acurácia dos métodos
de diagnósticos adotados (Courtenay et al. 2002; Palatnik-de-Sousa et al., 2004;
Romero et al., 2010).
Em face destas evidências e em especial a primeira questão sobre a reposição
imediata de cães pela população, tem sido sugerido a implementação de medidas de
apoio ao PCLV. Neste sentido, a implantação de programas de educação voltado a
conscientização da comunidade sobre as práticas de prevenção da LV e posse
responsável do cão tem se mostrado como uma promissora iniciativa (Esch et al., 2012).
Outra medida de apoio ao PCLV trata-se de manejo sanitário dos ambientes domiciliares
e seus entornos (quintais, galinheiros, canis) dentre outros que contribuem para o
aumento de flebotomíneos e consequentemente manutenção do ciclo de transmissão
(MS 2006).
O problema da segunda questão, que trata da descontinuidade das ações
epidemiológicas de controle e vigilância da população canina, é um fato constato em
diversos centros urbanos do Brasil atualmente. Como exemplo, a cidade de Governador
Valadares localizada na região do Vale do Rio Doce, Minas Gerais, teve os primeiros
casos de LV registrados na década de 60 (Coelho & Falcão, 1966). A partir de então,
por meio de um intenso trabalho sobre o controle e a profilaxia da LV na região do Vale
do Rio Doce realizado pelo Professor Wilson Mayrink do Departamento de Parasitologia
do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais
(ICB/UFMG), e o epidemiologista da Superintendência de Campanhas de Saúde
Pública (SUCAM) Paulo Araújo Magalhães, a doença foi considerada “controlada” nesta
região. Já em meados dos anos 90 todo o serviço foi interrompido e vigilância
epidemiológica não foi realizada regularmente desde então, resultando em ausência de
notificações de casos de LV até 2007, quando se mostrou a retomada dos casos de
LVC no município (Malaquias et al., 2007). Em seguida, os casos de LV começaram a
ser novamente registrados no município revelando um foco re-emergente de intensa
transmissão (Barata et al., 2013).
A respeito da terceira questão, sobre a logística do PCLV, era relatado uma
demora de 80 a 180 dias entre a coleta da amostra biológica, sua análise e a eutanásia
dos animais infectados no controle da LVC (Vieira & Coelho, 1998; Moreira et al., 2004).
Assim, a recente implementação do teste imunocromatográfico rápido DPP em
substituição à RIFI sinaliza para uma maior agilidade entre a identificação e eliminação
do reservatório doméstico. Desta forma, a partir do ano de 2012, o protocolo de
eutanásia do cão infectado passou a ser realizado pelo rastreamento com o DPP e
confirmação com o ELISA. Todavia, para proporcionar uma logística ainda melhor, foi
KER, H.G. INTRODUÇÃO
3
sugerido que o ELISA seja usado para rastreamento e o DPP para confirmação em
munícipios com elevada demanda de exames (Coura-Vital et al., 2014). Entretanto, em
áreas de baixa demanda de exames, o DPP certamente pode melhor contribuir como
um teste de triagem uma vez que pode ser aplicado a campo (Schubach et al., 2014).
Apesar das conquistas alcançadas, uma unanimidade entre as principais
considerações sobre as limitações do PCLV tratam da quarta e última questão, que se
relaciona com a necessidade de uma elevação na acurácia dos testes de diagnóstico
sorológico para a melhoria das ações voltadas ao controle e vigilância da LVC
(Courtenay et al. 2002; Palatnik-de-Sousa et al., 2004; Romero et al., 2010; Ribeiro et
al., 2013; Otranto & Dantas-Torres, 2013). Dentro deste contexto, o presente trabalho
buscou tanto avaliar os métodos oficialmente recomendados pelo Ministério da Saúde
(DPP, ELISA e RIFI), quanto desenvolver novas tecnologias aplicadas ao diagnóstico
sorológico da LVC.
Sobre a avaliação dos métodos oficialmente recomendados pelo Ministério da
Saúde (DPP, ELISA e RIFI), os resultados desta avaliação compõe o primeiro trabalho
apresentado nesta tese, designado: “The specificity of canine visceral leishmaniasis
diagnosis in Brazil: a report of laboratory investigation about the cross-reactivity to other
canine infections and seroconversion by vaccination”, recentemente submetido à
Revista de Saúde Pública.
O desenvolvimento e avaliação de novas ferramentas para o diagnóstico
sorológico da LVC se baseou em tecnologias por citometria de fluxo e compreendem
dois trabalhos.
Os resultados do desenvolvimento de um teste sorológico por citometria de fluxo
de primeira geração, nomeado LeishFlow, foram patenteados no Instituto Nacional de
Propriedade Intelectual (BR 10 2012 0047420) sob título “Protótipo de um kit de
diagnóstico sorológico da leishmaniose visceral canina, empregando formas
promastigotas fixadas pela técnica de citometria de fluxo” e foram publicados no ano de
2013 no periódico Diagnostic Microbiology and Infectious Disease intitulado “Effect
of the preservative and temperature conditions on the stability of Leishmania infantum
promastigotes antigens applied in a flow cytometry diagnostic method for canine visceral
leishmaniasis”. A avaliação do desempenho do teste LeishFlow, por sua vez, está
retratada no trabalho “Evaluation of a Prototype Flow Cytometry Test for Serodiagnosis
of Canine Visceral Leishmaniasis” publicado no ano de 2013 no periódico Clinical and
Vaccine Immunology.
Além dos resultados alcançados pelo teste LeishFlow, o presente trabalho
buscou uma nova inovação metodológica para o diagnóstico da LVC para constituir uma
segunda geração de testes sorológicos da LVC por citometria de fluxo. Sob um novo
KER, H.G. INTRODUÇÃO
4
conceito biotecnológico, a tecnologia multiplex empregando microesferas funcionais
fluorescentes de poliestireno permite a construção de testes sorológicos por citometria
de fluxo configuráveis que podem determinar uma elevação no desempenho diagnóstico
dos ensaios. Esta nova plataforma é designada pelo nome de LeishPlex e os resultados
obtidos compõem um pedido de patente de invenção depositado pelo Núcleo de
Inovação Tecnológica e Empreendedorismo (NITE) da UFOP junto ao INPI (BR 10 2017
006706 8) sob o título “Teste sorológico multiplex por citometria de fluxo”.
KER, H.G. REVISÃO DA LITERATURA
5
2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1. Aspectos clínicos-laboratoriais e considerações sobre o diagnóstico
da LVC
A LVC é um modelo de uma disfunção imunológica específica resultante do
parasitismo do sistema mononuclear fagocitário pela Leishmania infantum, produzindo
um amplo espectro de manifestações clínicas e imunológicas.
Entre os principais sinais clínicos comumente observados destaca-se a presença
de alterações dermatológicas (opacificação e queda dos pelos, úlceras de pele, e
dermatites localizadas ou generalizadas), onicogrifose, perda de peso,
hepatoesplenomegalia, ceratoconjutivite, ceratite com opacificação da córnea, e paresia
dos membros posteriores (Ferrer, 1999; Reis et al., 2006a; Reis et al., 2006b; Solano-
Gallego et al., 2011). Com base nesta extensa apresentação sintomatológica, vale aqui
referendar o clássico estudo de Mancianti et al. (1988), que determinou três formas
clínicas básicas em: assintomáticos com ausência de sinais clínicos sugestivos de
infecção por L. infantum, oligossintomáticos com até três sinais clínicos, e sintomáticos
com vários sinais clínicos patognomônicos da doença.
No entanto, o diagnóstico clínico da LVC é difícil de ser determinado, e alguns
importantes fatores podem contribuir com esta constatação. Em áreas endêmicas, uma
considerável proporção dos cães pode ter contato com o parasito e não desenvolver
sinais clínicos da doença, permanecendo inaparente por longos períodos (Dantas-
Torres, 2007). Além disso, há grande porcentagem de cães assintomáticos ou
oligossintomáticos existentes em áreas endêmicas (Solano-Gallego et al., 2001; Otranto
et al., 2009; Paradies et al., 2010). Adicionalmente, outros cães podem apresentar sinais
clínicos comuns a outras patologias caninas como, por exemplo, a erliquiose e
babesiose (Dantas-Torres et al., 2008), ou ainda, podem estar relacionados à
desnutrição dos animais em regiões com baixo desenvolvimento socioeconômico (MS,
2006). Isto é, em áreas endêmicas, um cão que esteja infectado pode não apresentar
sinais clínicos categóricos da LVC, ou mesmo quando os apresentar, pode não ser
específico à infecção por L. infantum.
Diante da dificuldade de um diagnóstico clínico conciso, alguns autores
aconselham que determinados exames laboratoriais sejam adotados para auxiliar na
identificação clínica de cães infectados por L. infantum (Solano-Gallego et al., 2009;
Dantas-Torres et al., 2013). Quanto aos parâmetros bioquímicos, é comumente
observado alterações nas proteínas plasmáticas geralmente observadas em cães
KER, H.G. REVISÃO DA LITERATURA
6
oligossintomáticos e sintomáticos, dentre as quais se destacam o aumento sérico das
enzimas hepáticas [Alaninaminotransferase (ALT) e Aspartatoaminotransferase (AST)],
elevação da uréia e creatinina, diminuição de albumina sérica e da razão
albumina/globulina (Reis et al., 2006b; Giunchetti et al., 2008; Freitas et al., 2012). Por
sua vez, as avaliações dos parâmetros hematológicos revelem que animais das
variadas formas clínicas podem apresentar quadros de anemia e leucopenia, sendo
estes mais acentuados em cães sintomáticos. Os quadros de anemia correspondem a
um aspecto normocítico/normocrômico apresentando eritrócitos, hemoglobina e
hematócrito diminuídos (Nicolato et al., 2013). A leucopenia é determinada por
monocitopenia, eosinopenia e linfopenia e pode estar relacionada com possíveis
disfunções na medula óssea ocasionadas pelo intenso parasitismo neste tecido (Reis et
al., 2006b; Trópia de Abreu et al., 2011).
Todavia, vale salientar que apesar dos exames laboratoriais dos perfis
bioquímico e hematológico serem instrumentos prognósticos para a compreensão do
estado clínico de um cão infectado por L. infantum, estes não são propriamente
empregados como ferramentas de diagnóstico da LVC. Para a finalidade de diagnóstico,
a LVC carece de metodologias particulares para a confirmação dos casos.
Os métodos parasitológicos buscam conferir diretamente a presença do parasito
em material biológico obtido por punções ou biopsias de diferentes tecidos,
principalmente do fígado, baço, linfonodos, medula óssea ou pele (Sundar & Rai, 2002;
Maia & Campino, 2008). A partir da coleta do tecido, diferentes abordagens podem ser
utilizadas. Pode ser empregada a coloração dos esfregaços de tecidos em lâmina com
corantes de rotina tais como Giemsa, Wright e Panótico, ou pela cultura in vitro de
fragmentos dos tecidos ou aspirados em meios de crescimento (MS, 2006). No entanto,
essas abordagens não são normalmente empregadas na rotina, uma vez que o tempo
consumido para a confirmação do resultado é demorado, além de serem bastante
invasivos (Gontijo & Melo, 2004; Maia & Campino, 2008; Faria & Andrade, 2012). Em
comparação com outras metodologias de diagnóstico, a sensibilidade dos testes
parasitológicos é a que pode sofrer maiores variações tomando em consideração o grau
de parasitismo tecidual e tipo de tecido avaliado (Moreira et al., 2007). Assim, visto a
necessidade de se avaliar um grande número de animais em curto espaço de tempo,
os métodos parasitológicos são impraticáveis para aplicação em programas de saúde
pública.
O diagnóstico molecular é outro tipo de método parasitológico e é baseado na
detecção de sequências de DNA específicas do parasito, sendo a Reação em Cadeia
da Polimerase (PCR) a PCR em tempo real (qPCR) as principais técnicas utilizadas
(Gomes et al., 2008; Maia et al., 2009). No diagnóstico da LVC, essa vertente molecular
KER, H.G. REVISÃO DA LITERATURA
7
é fundamentada na amplificação de distintos oligonucleotídeos que formam uma
sequência conhecida do parasito. Várias sequências do genoma de Leishmania já foram
descritas como alvos de amplificação e incluem os genes para o RNA ribossomal, β-
tubulina, locus gp63, locus hsp70, cisteino-proteinases, e minicírculos do DNA de
cinetoplasto (kDNA) (Singh 2006b, Reithinger & Dujardin 2007).
Estes testes podem ser realizados em diferentes amostras biológicas, mas é
sabido que a sensibilidade da PCR pode variar de acordo com a amostra utilizada na
reação, (Reale et a., 1999; Lachaud et al., 2002; Strauss-Ayali et al., 2004; Baneth &
Aroch, 2008). Entretanto, em amostras de coleta menos invasiva, tais como aspirados
de medula, aspirados de linfonodos, biópsias de pele, sangue, urina, e swab com
amostras de mucosa canina (oral, nasal ou conjuntiva) apresentam sensibilidade inferior
àquela obtida com outros tecidos tais como fígado e baço (Solano-Gallego et al., 2007;
Leite et al., 2010; Lombardo et al., 2012; de Almeida Ferreira et al., 2012; Reis et al.,
2013).
Para superar estes problemas, uma variação da PCR que vem ganhando
destaque nos últimos anos trata-se do método de PCR em tempo real (qPCR), que como
principal vantagem sobre a PCR convencional, permite a quantificação de um número
mínimo de parasitos por reação que corresponde a poucos fentogramas de DNA
(Quaresma et al., 2009). O uso da qPCR no diagnóstico da LVC tem proporcionado um
ganho substancial de desempenho empregando amostras biológicas menos invasivas
(Manna et al., 2008; Paiva-Cavalcanti et al., 2009; Reis et al., 2013). Além disso, vale
aqui mencionar que um novo protocolo de qPCR por uma abordagem denominada High
Resolution Melting (HRM) foi recentemente proposto para o diagnóstico diferencial de
espécies de Leishmania (Zampieri et al., 2016), o que poderia auxiliar numa melhor
certificação dos perfis epidemiológicos da LVC futuramente.
Esta crescente busca por novos métodos moleculares para o diagnóstico da LVC
é amparada por importantes trabalhos que recomendam a incorporação de testes
moleculares para a confirmação da infecção por L. infantum (Baneth et al., 2008;
Solano-Gallego et a., 2011). Este fato se motiva na constatação de que no início da
infecção, a aplicação do diagnóstico molecular mostra-se mais sensível do que a
sorologia (Quinnell et al., 2001). De fato, diferentes estudos mostram que uma
considerável proporção de cães em áreas endêmicas pode apresentar diagnóstico
molecular positivo e sorologia negativa (Martin-Sanchez et al., 2001; Solano-Gallego et
al., 2001; Lachaud et a., 2002). De fato, em um estudo epidemiológico realizado em uma
área endêmica de Belo Horizonte, Coura-Vital et al. (2011a) relatou prevalência de cerca
de 22% relacionado ao diagnóstico molecular, enquanto que a sorologia alcançou
valores em torno de 8%.
KER, H.G. REVISÃO DA LITERATURA
8
Diante deste cenário, uma nova categoria clínica caracterizada por apresentar
PCR+/Sorologia‒ foi descrita por Coura-Vital et al. (2011b) e denominada assintomático
I (um) para distinguir dos cães assintomáticos clássicos (CA-II) cães soropositvos e
PCR+ anteriormente descritos por Mancianti et al. (1988) e revisados por Reis et al.
(2006). Entretanto, a PCR (ou alguma de suas variações) ainda não foi admitida como
uma técnica empregada no diagnóstico da LVC no âmbito de programas de controle,
uma vez que um dos questionamentos que emergem é o que fazer com estes cães
assintomáticos I.
Neste contexto, a detecção de anticorpos pelos métodos sorológicos torna-se
bastante relevante, e uma série de fatores destaca a sorologia como importante
ferramenta para o emprego em larga escala nas campanhas de controle.
Os ensaios sorológicos constituíram uma ferramenta essencial para a ampliação
do conhecimento sobre a resposta imune humoral em cães naturalmente ou
experimentalmente infectados por L. infantum (Abranches et al., 1991; Martinez-Moreno
et al., 1993; Genaro, 1993; Pinelli et al., 1994; Deplazes et al., 1995). Ao revisar diversos
trabalhos realizados pelo nosso grupo de pesquisa, torna-se possível inferir que a
resposta imune humoral dos cães naturalmente infectados e portadores das formas
clínicas (assintomática, oligossintomática, ou sintomática), mostram as seguintes
evidências: há aumento dos níveis de IgG total de acordo com a evolução clínica da
LVC; cães assintomáticos e oligossintomáticos apresentam aumentados níveis de IgG1;
a presença de IgG total, IgG2, IgA e IgE é mais evidente em cães sintomáticos (Reis et
al., 2006a; Reis et al., 2006b. Andrade et al., 2007; Giunchetti et al., 2008; Teixeira Neto
et al. 2010; Coura-Vital et al., 2011b). Adicionalmente, é importante relatar que a maior
concentração de anticorpos IgG anti-Leishmania também se correlaciona com a maior
capacidade do cão de independentemente da forma clínica transmitir o parasito ao vetor
Lutzomyia longipalpis (Costa-Val et al., 2007; Michalsky et al., 2007; Laurenti et al.,
2013).
Assim, a intensa atividade policlonal de células B com consequente elevação na
produção de imunoglobulinas é um ponto fundamental na evolução da história natural
da infecção por L. infantum, torna-se preponderante a escolha de metodologias
sorológicas como ferramenta essencial para o controle da LVC em campanhas de
saúde. Somando a esse fato, vale salientar que a coleta da amostra de sangue
necessária à realização destes testes é na maioria das vezes menos invasiva, e o
processamento do sangue por centrifugação é um procedimento muito mais simples do
que o cultivo em meios de cultura ou extração do material genético para a obtenção do
resultado.
KER, H.G. REVISÃO DA LITERATURA
9
2.2. Abordagem histórica das técnicas sorológicas clássicas empregadas
no diagnóstico da LVC
A reação de fixação do complemento (RFC) foi bastante realizada no
Brasil nas décadas de 1950 e 1960 (Nussenzweig et al., 1957; Pellegrino & Brener,
1958; Cunha et al., 1963;). Durante a década de 80 a RFC foi amplamente difundida
em institutos de pesquisas do exército dos Estados Unidos, sendo aplicada para a
detecção de anticorpos em cães experimentalmente infectados com L. donovani
(Flemmings et al., 1984), mas foi na LV que a RFC fora amplamente empregada para
fins diagnósticos (Hockmeyer et al., 1984; Smith et al., 1984; Pappas et al., 1985).
Atualmente a RFC encontra-se em desuso no mundo por ser uma técnica complexa e
trabalhosa, necessitando de um dispendioso tratamento prévio para a inativação do
complemento procedente da amostra de soro.
Dentre os métodos imunológicos mais utilizados atualmente, destaca-se a RIFI,
empregada a partir da década de 1960 (Duxbury & Sadun, 1964). Este teste, que utiliza
como antígeno o parasito íntegro, é amplamente utilizado em estudos epidemiológicos
(Alvar et al., 2004). Entretanto, trata-se de um teste sorológico dispendioso, que carece
um alto nível de habilidade técnica para execução do protocolo, e experiência para a
leitura correta da amostra (Gontijo & Melo, 2004). Apesar de a RIFI ter sido
recentemente entrado em desuso nas campanhas de controle do Brasil, alguns
pesquisadores ainda discutem seu uso (Ribeiro et al., 2013). Esse grupo de
pesquisadores se reuniu em um encontro chamado de Brasileish, e sugeriram que cães
soropositivos pela RIFI em ensaio sob diluição de 1:40 deveriam ser considerados
apenas suspeitos, e somente com diluições superiores a 1:160 evidenciaria um
resultado positivo. Apesar desta sugestão já ser habitualmente empregada no
continente europeu (Otranto et al., 2009; Solano-Gallego et al. 2011), a aplicabilidade
desta medida tornaria a operacionalidade da RIFI ainda mais complexa em um cenário
de uso em larga escala, sendo, portanto, mais adequadamente contextualizada
unicamente ao contexto de clínico-veterinário.
Os testes sorológicos de aglutinação Direct Agglutination Test (DAT) e Fast
Agglutination Screening Test (FAST), embora não tenham uso tão comum no
diagnóstico da LVC Brasil, são usualmente empregados para este fim em diferentes
regiões do velho mundo (Harith et al., 1989; Cardoso et al., 2004; Mohebali et al., 2004;
Schallig et al., 2004; Babakhan et al., 2009; Sousa et al., 2011). O fato do número
reduzido de estudos sobre estes testes no Brasil pode estar relacionado a algumas as
limitações sobre a praticidade operacional que remetem à necessidade de etapas
prévias para a inativação do sistema do complemento, que ocorre através da anulação
da atividade aglutinante dos pentâmeros de IgM para tornar o teste mais sensível às
KER, H.G. REVISÃO DA LITERATURA
10
aglutinações estabelecidas pela classe IgG. Enquanto que em alguns protocolos
sorológicos do DAT requerem incubação prévia das amostras com β-mercaptoetanol
(um composto altamente tóxico) (Ferreira et al., 2007), a sorologia pelo FAST
geralmente utiliza do aquecimento prévio (56°C) das amostras em banho-maria
(Cardoso et al., 2004; Schallig et al., 2002).
Vale aqui salientar que tanto os testes de RFC, RIFI, DAT e FAST são testes
qualitativos, ou semi-quantitativos, quando é realizada uma diluição seriada da amostra
observando-se a máxima diluição onde ocorre reação positiva.
Assim, pode-se afirmar que o teste de ELISA representou um importante avanço
tecnológico para o diagnóstico na LV e LVC, pois o seu resultado final é obtido por uma
reação enzimática colorimétrica expressa em densidade óptica, o que torna a leitura da
amostra mais objetiva e quantitativa (Voller et al., 1976). Além disso, seu protocolo pode
ser facilmente adaptado para a utilização de diferentes antígenos, e permite a avaliação
de um grande número de amostras em um curto espaço de tempo. No contexto do
diagnóstico da LV, o teste de ELISA foi pioneiramente descrito por Hommel et al. (1978),
e na LVC por Mansueto et al. (1982).
Algumas poucas adaptações nos testes de ELISA seguiram durante a década
de 80 (Badaró et al., 1986), e uma franca expansão na década de 90 foi observada.
Durante este período, estes testes começaram ser largamente empregados em estudos
sorodiagnósticos e epidemiológicos da LVC em todo o Brasil (Evans et al., 1990; Ashford
et al., 1993; Paranhos-Silva et al., 1996; Dietze et al., 1997). Estes trabalhos certamente
ajudaram a credenciar o teste de ELISA para o emprego como teste de rastreamento
de cães soropositivos de 2006 a 2011 (MS, 2006). Atualmente, o teste de ELISA é
empregado como teste sorológico confirmatório nas campanhas de vigilância da LVC
no Brasil (MS, 2011), e mostra-se como um teste confiável em laboratório de diferentes
níveis de complexidade da rede pública de saúde brasileira (de Arruda et al., 2013).
Por fim, mediante o amplo histórico de aplicação das metodologias clássicas
usualmente empregadas para a detecção de anticorpos na LVC, reforça-se a
importância dos testes sorológicos como ferramenta indispensável para o diagnóstico
de uma doença de grande importância para a medicina veterinária e para a saúde
pública. Isso certamente releva a necessidade de contínuos investimentos para a
melhoria destes testes.
2.3. Aprimoramento dos testes sorológicos usualmente empregados no
diagnóstico da LVC
Nos últimos anos, muito se tem feito em prol de alcançar melhor desempenho
de ensaios sorológicos na LVC.
KER, H.G. REVISÃO DA LITERATURA
11
A iniciar com o teste sorológico de aglutinação Direct Agglutination Test (DAT),
a melhoria deste ensaio tem sido atribuída a adaptações na preparação dos
componentes antigênicos do teste (Mohebali et al., 2015). O novo método para a
produção do antígeno para o DAT mostra a mesma sensibilidade, especificidade e
durabilidade em comparação com o método de DAT convencional, mas tem as
vantagens adicionais de redução de custos na produção de antígeno, a normalização
de alguns materiais específicos, mas principalmente se beneficia da e redução do tempo
de preparação do antígeno de 3 dias para apenas 5 horas. O aprimoramento do método
Fast Agglutination Screening Test (FAST) não foi tão contundente quanto a ponto de
mudar o panorama de produção do mesmo, mas alguns protocolos distintos podem ser
observados (Schallig et al., 2002; Babakhan et al., 2009).
O que foi avaliado no contexto da RIFI, e que é relevante tratar aqui, inclui o
desempenho do teste empregando diferentes preparações antigênicas, homólogas (L.
infantum) ou heterólogas (L. major-like). O estudo de Silva et al. (2012), mostrou que o
uso de antígenos homólogos foi responsável por uma melhoria na especificidade da
RIFI. Além disso, outro ponto que merece ser ressaltado no sentido de aprimoramento
deste teste sorológico trata-se da detecção de anticorpos por meio do uso de amostras
de soro canino ou eluato de sangue colhido em papel filtro. Figueiredo et al. (2010)
sugeriu que as amostras de sangue recolhidas em papel filtro apresentam pior
desempenho e não devem ser utilizadas em levantamentos epidemiológicos.
Por outro lado, em relação a metodologia de ELISA, o aprimoramento dos testes
ocorreu de forma aguda nos últimos 20 anos. Em um primeiro momento o
aperfeiçoamento dos testes se deu a partir do melhor domínio das ferramentas de
biologia molecular, e diversos estudos se ocuparam em buscar novos candidatos
antigênicos através da produção de proteínas recombinantes. Um exemplo clássico foi
o K39, uma proteína imunodominante específica do complexo L. donovani e que contém
epítopos repetitivos (Badaró et al. 1993). Esta proteína demonstrou bons resultados
quando pelo teste de ELISA, mostrando simplicidade e rapidez para o diagnóstico de
cães em grande escala (Scalone et al. 2002). Além disso, a combinação de diferentes
subunidades de antígenos recombinantes como rK9, rK26 e rK39 também foi utilizada
com o ensaio de ELISA, e esse procedimento aumentou a sensibilidade deste teste
sorológico (Rosati et al. 2003).
Em um segundo momento, após a era pós-genômica, duas estratégias foram
determinantes para os avanços na evolução dos ensaios sorológicos. Tanto por uma,
quanto pela outra, destaca-se a participação do vasto conhecimento produzido no Brasil
e, desta forma, o presente trabalho se aterá a apresentar os avanços obtidos neste país.
KER, H.G. REVISÃO DA LITERATURA
12
Uma das estratégias trata-se das abordagens imunoproteômicas, que
constituem uma série de técnicas que se voltam para a separação, identificação e
quantificação de proteínas, permitindo a realização de estudos com as mais diversas
aplicações na área biológica, incluindo o aprimoramento de testes diagnósticos para a
LVC. Neste contexto, um grande número de proteínas que apresentam considerável
potencial de reconhecimento de anticorpos foi mostrado por alguns pesquisadores
brasileiros (Ferraz-Coelho et al., 2009; Coelho et al., 2012 Braga et al. 2014).
De forma mais recente, com o domínio das ferramentas de bioinformática, uma
potente estratégia para a descrição e obtenção de novos antígenos, marcou um novo
salto tecnológico para o aprimoramento dos ensaios sorológicos. A predição de epítopos
imunorreativos com células B pela bioinformática foi capaz de gerar um grande volume
de novos candidatos antigênicos para o diagnóstico sorológico da LVC. Os antígenos
obtidos por aplicação da bioinformática pode fornecer diferentes proteínas
recombinantes (Oliveira et al., 2011; Souza et al., 2012; Martins et al., 2013; Souza et
al., 2013; Menezes-Souza et al., 2015), peptídeos sintéticos (Costa et al., 2011; Faria et
al., 2011; Chavez-Fumagalli et al., 2013; Costa et al., 2013; Toledo-Machado et al.,
2015), ou mesmo por proteínas multiepítopos (Fonseca et al., 2014; Faria et al., 2015).
Mediante a todo este repertório, destaca-se alguns importantes antígenos que
ganharam espaço na literatura. Dois destes antígenos são as proteínas recombinantes
rLci1A e rLci2B, que apresentam homologia com duas importantes proteínas do
complexo L. donovani aplicadas no diagnóstico da LVC. A proteína rLci1A tem
homologia com a proteína de choque térmico Heat shock protein 70 (HSP70), enquanto
que a rLci2B tem homologia a proteína do citoesqueleto da classe das cinesinas Kinesin
39 (K39). Estes dois antígenos mostraram excelente acurácia no diagnóstico sorológico
da LVC (Oliveira et al., 2011; Souza et al., 2012; Fraga et al., 2014). Outras duas
proteínas recombinantes em evidência na literatura foram originadas por genes
sintéticos elaborados através da combinação das sequências de codificação de
peptídeos com potencial antigênico (Fonseca et al., 2014; Faria et al., 2015). A proteína
PQ20 abordada em Faria et al., 2015, utilizou-se de 20 sequências codificadoras de
epítopos de células B e T estudas previamente em Costa et al. (2011). A proteína
quimérica C1 tratada em Fonseca et al., (2014), é uma proteína com função
desconhecida que gerou diversos peptídeos reportados no trabalho de Faria et al.,
(2011). Estas proteínas evidenciaram uma conveniência relacionada à sensibilidade de
detecção dos animais assintomáticos na LVC.
Finalmente, sobre o aprimoramento dos teste rápidos de diagnóstico sorológico
na LVC, observa-se que estes testes variam essencialmente nas características dos
suportes imunocromatográficos no qual a proteína recombinante K39 é fixada. A fixação
KER, H.G. REVISÃO DA LITERATURA
13
do antígeno em uma faixa de nitrocelulose é comum ao Teste Rápido Anticorpo
Leishmania donovani − TRALd (Badaró et al., 1996), e ao Kalazar DetectTM (Lemos et
al., 2008; Lima et al., 2010; Zanette et al., 2014). A associação de outros antígenos ao
K39, tais como o K9 e/ou K26 é também verificada por outras condições de suporte
imunocromatográfico, como no teste proposto por da Costa et al. (2003), bem como no
mais novo teste, o DPP – Dual Path Plataform (Grimaldi et al., 2012). Apesar das
distintas vias para se realizar um teste sorológico imunocromatográfico rápido para LVC,
um consenso geral indica que o desempenho na acurácia diagnóstica destes testes é
útil para confirmação da infecção em casos clínicos suspeitos, mas a sensibilidade para
a detecção de cães assintomáticos ainda é muito baixa para estudos epidemiológicos
em grande escala (Quinnell et al., 2013).
Mediante o exposto, apesar do aperfeiçoamento dos testes sorológicos alcançados
com uma variedade de antígenos estudados, bem como das variações técnicas, a
busca por melhorias no diagnóstico sorológico da LVC ainda carece de maiores
progressos para configurar testes com maior acurácia.
2.4. A necessidade de elevada acurácia para o diagnóstico sorológico da
LVC
O termo acurácia refere-se à quantidade de resultados corretos de um teste em
comparação aos resultados do padrão de referência (Bossuyt et a., 2003). A acurácia
do diagnóstico pode ser expressa em uma série de parâmetros, incluindo a sensibilidade
e especificidade, valores preditivos positivos e negativos, razões de verossimilhança e
as áreas sob as curvas Receiver Operating Characteristc (Griner et al., 1982).
Entretanto, é importante salientar que as medidas de precisão do teste pode variar entre
diferentes estudos. A variabilidade pode se originar por diferenças entre os grupos de
indivíduos usadas no estudo, diferenças de fatores ambientais, diferenças na
prevalência da doença, assim como e diferenças nos protocolos de ensaio ou em
critérios de positividade do teste (Irwig et al., 2002).
A acurácia dos estudos diagnósticos da LVC apesar de revelarem uma
determinada e esperada variabilidade entre os métodos de diagnóstico sorológicos,
chama a atenção a notória influência de algumas limitações comuns. Essas limitações
podem ser usualmente observadas em métodos convencionalmente adotadas pelo
mundo, assim como nos métodos sorológicos oficialmente recomendadas pelo
Ministério da Saúde (MS) do Brasil.
A principal deficiência na acurácia diagnóstica da LVC trata da baixa
sensibilidade de detecção de casos assintomáticos da doença, e é observada tanto nos
KER, H.G. REVISÃO DA LITERATURA
14
testes rápidos que empregam antígenos recombinantes tais como o DPP (Lemos et al.,
2008; Grimaldi et al., 2012; Schubach et al., 2014), assim como nos testes
convencionais de ELISA e RIFI, que empregam antígenos totais de Leishmania sp
(Mettler et al., 2005; Lira et al., 2006; Porrozzi et al., 2007; Ferreira et al., 2007). Além
desta comum constatação, os testes de ELISA e RIFI mostram baixa especificidade
relacionada à reatividade cruzada com anticorpos originários de outras infecções
caninas, tais como por Babesia canis e Ehrlichia canis, bem como por outras
tripanossomíases, como na infecção por Leishmania braziliensis, Trypanossoma cruzi,
e T. caninum (Lira et al., 2006; Ferreira et al., 2007; Alves et al., 2012; Laurenti et al.,
2014). Adicionalmente, a possibilidade de soroconversão após a vacinação contra LVC
mostra-se como uma preocupante questão que pode interferir na acurácia dos testes de
diagnóstico sorológico (Romero et al., 2010). No Brasil já são documentadas evidências
de falhas de alguns testes mediante a imunização canina pela vacina Leishmune®
(Marcondes et al., 2013; Ribeiro et al., 2015).
Sendo assim, ainda há um extenso caminho a ser seguido no sentido de
desenvolver um teste diagnóstico que forneça melhor acurácia, e esta necessidade tem
sido cada vez mais discutida e invocada pela comunidade científica (Dantas-Torres et
al., 2012; Ribeiro et al., 2013).
2.5. Atuais perspectivas biotecnológicas na construção de metodologias
sorológicas para o diagnóstico da LVC
Diante da clara necessidade de alcançar elevada acurácia, diversas
metodologias sorológicas vem sendo propostas nos últimos anos e a construção de
testes imunocromatográficos rápidos tem sido bastante explorada.
Recentemente, foi descrito por um grupo de pesquisadores brasileiros, um
ensaio denominado Multi-antigen Print Immunoassay (MAPIA) que constitui uma
plataforma de teste sorológico rápido capaz de detectar simultaneamente a resposta da
amostra de soro a 12 antígenos que revestem uma única tira de nitrocelulose (Oliveira
et al., 2015). No entanto, apesar da combinação de vários antígenos a sensibilidade não
ultrapassou 81.0%. Além disso, a leitura de um teste rápido com múltiplos antígenos em
uma única fita de nitrocelulose pode apresentar viés de interpretação do resultado, uma
vez que a intensidade de coloração das áreas reativas varia de forma considerável entre
os distintos antígenos. Isto torna a leitura de um certo modo subjetiva, visto a dificuldade
na determinação de um padrão de positividade único.
Utilizando os antígenos recombinantes rLci1A e rLci2B para construção de um
teste rápido pela tecnologia Dual Path Plattform (DPP), a mesma empregada pela
Biomanguinhos com a proteína recombinantes K28, observou-se que embora a
KER, H.G. REVISÃO DA LITERATURA
15
associação destes dois recombinantes forneça uma melhora no desempenho
diagnóstico em relação à avaliação individual de cada antígeno, a sensibilidade deste
teste ainda mostrou-se menor do que à do DPP (K28) oficialmente adotado no Brasil.
De forma semelhante ao encontrado pelo MAPIA, que também utiliza os recombinantes
rLci1A e rLci2B em sua composição, o DPP (rLci1A/rLci2B) mostrou sensibilidade de
83.0%. A especificidade, tanto do MAPIA, quanto do DPP (rLci1A/rLci2B), revelaram
elevados valores (Fraga et al., 2014; Oliveira et al., 2015).
Em paralelo ao desenvolvimento de testes rápidos com fundamentos já bem
definidos como o caso da fixação de antígenos à fita de nitrocelulose e a Dual Path
Plattform, o surgimento de novos conceitos de plataformas diagnósticas é crescente, e
a construção de Biosensores pela técnica de Ressonância de Plasmóns de Superfície
(SPR) vem ganhando destaque, inclusive no âmbito do diagnóstico da LVC (Souto et
al., 2013; Souto et al., 2015). Estes testes permitem uma análise sorológica sem a
necessidade de marcadores químicos e/ou biológicos, com capacidade de detectar
analitos em níveis nanomolares, aumentando a sensibilidade (Souto et al., 2013; Souto
et al., 2015) o que poderia aumentar a capacidade de detecção de cães assintomáticos.
Entretanto, maiores estudos ainda são necessários para a determinação da acurácia
diagnóstica obtida por testes sorológicos com os Biosensores SPR.
Outra vertente que ganhando destaque ultimamente, trata-se da sorologia por
citometria de fluxo (CF) para o diagnóstico de doenças infecto-parasitárias. Essa
abordargem se deu por iniciativa pioneira do Dr. Olindo Assis Martins-Filho do Centro
de Pesquisas René Rachou, pesquisador associado ao nosso grupo de pesquisa
(Martins-Filho et al., 1995). Por esta estratégia, novas perspectivas foram abertas no
sentido do estabelecimento de técnicas diagnósticas de alta eficiência.
Esta linha de pesquisa liderada por Martins-Filho na FIOCRUZ e pelo Dr. Reis
na UFOP já perdura por mais de uma década e estabeleceu inovações metodológicas
aplicadas ao diagnóstico e monitoração de doenças infecto-parasitárias de interesse na
saúde pública, incluindo a doença de Chagas (Vitelli-Avelar et al., 2002; Vitelli-Avelar et
al., 2007; Matos et al., 2011), a Leishmaniose Tegumentar Americana Humana (Rocha
et al., 2002; Rocha et al., 2006; Pereira et al., 2012), a Leishmaniose Visceral Humana
(Lemos et al., 2007; Pissinate et al., 2008), e a Leishmaniose Visceral Canina (Carvalho-
Neta et al., 2006; Andrade et al., 2007; Andrade et al., 2009; Ker et al., 2013a; Ker et al.,
2013b; Sousa et al., 2013).
No tocante ao diagnóstico da LVC, a sorologia por citometria de fluxo tem
mostrado grande potencial, e gerou um diagnóstico preciso em todas as formas clínicas
da LVC, incluindo os casos assintomáticos, e, além disso, apresentou ausência de
resultados falso-positivos em cães vacinados e mínima reatividade cruzada contra
KER, H.G. REVISÃO DA LITERATURA
16
outros patógenos caninos (Andrade et al., 2009; Ker et al., 2013b). Esses resultados
foram alcançados utilizando de uma preparação antigênica composta por promastigotas
de L. infantum. Recentemente, a sorologia por CF vem ampliando seu portfólio de
ensaios através do uso de microesferas de níquel revestidas com antígenos
recombinantes de Leishmania (Sousa et al., 2013).
Embora importantes avanços tecnológicos tenham ocorrido, ainda não existe um
método absolutamente preciso para o diagnóstico da LVC. Atualmente, permanece o
desafio para obtenção de um método satisfatoriamente sensível e específico. Neste
cenário o presente trabalho buscou melhorar os aspectos biotecnológicos da sorologia
por citometria de fluxo, seja a que emprega promastigotas fixadas gerando um teste que
denominamos de LeishFlow, ou pelo emprego de microesferas de poliestireno
acopladas com antígenos recombinantes, gerando o LeishPlex.
A crescente contribuição alavancada pela sorologia por citometria de fluxo
permitiu não somente oferecer novas perspectivas para o diagnóstico da LVC, mas se
propôs a avançar no desenvolvimento de protótipos de kit de diagnóstico para serem
testados em estudos multicêntricos em nível de saúde pública, ou seja, em larga escala.
Todos os avanços biotecnológicos que o presente estudo trouxe a luz vieram a contribuir
definitivamente para um importante ponto que se assemelha ao que ocorreu com a
ELISA na década de 80 e 90 – A democratização da sorologia por citometria de fluxo no
Brasil e no Mundo.
KER, H.G. JUSTIFICATIVA
17
3. JUSTIFICATIVA
A leishmaniose visceral canina é endêmica em muitas regiões do mundo e no
Brasil. Nessas áreas, a elevada taxa de infecção em cães está associada com o maior
risco de doença humana. Até o momento não existe alternativas terapêuticas capazes
de conduzir a cura parasitológica em cães infectados e consequentemente reverter seu
papel de reservatório no ciclo de transmissão. Apesar da existência de alternativas
imunoprofiláticas comerciais anti-LVC, a vacinação de cães ainda não é recomendada
pelo Ministério da Saúde.
A necessidade da eliminação dos cães infectados, dada a sua relevância como
reservatório doméstico da doença humana, traz um grande impacto social. Assim, o
diagnóstico seguro tem fundamental importância na dinâmica de controle da doença em
áreas endêmicas. As falhas recorrentes pelo uso dos métodos sorológicos oficialmente
adotados podem levar a eutanásia de cães não acometidos pela LVC, comprometendo
a eficácia das ações de vigilância, gerando uma menor adesão da população ao
programa de controle proposto pelo Ministério da Saúde.
Além disso, a necessidade de ações de controle voltadas aos animais
sorologicamente positivos são relevantes dado pela clássica correlação entre a
severidade da infecção com a presença de anticorpos IgG e presença de sinais clínicos,
e somando-se a isto, mais dois importantes fatores: o fato de que a maior concentração
de anticorpos IgG anti-Leishmania estar correlacionada com uma elevada capacidade
do cão transmitir o parasito ao vetor Lutzomyia longipalpis; e a constatação de que os
animais assintomáticos com baixos títulos de anticorpos IgG anti-Leishmania também
são efetivos na transmissão do parasito ao vetor.
Neste contexto, torna-se urgente a pesquisa e disponibilização de novas
ferramentas aplicadas ao diagnóstico da doença com elevada capacidade de identificar
os animais infectados e discriminar cães sadios, animais vacinados ou, até mesmo,
portadores de outras infecções caninas, evitando assim falso-positivos por reações
cruzadas. Para isso, fundamentalmente, um teste diagnóstico deve apresentar elevada
acurácia.
O uso da citometria de fluxo é uma tendência mundial no desenvolvimento de
abordagens diagnósticas de alto desempenho, e pode contribuir com a melhoria da
confiabilidade e eficácia do diagnóstico da LVC. Portanto, encontra-se neste trabalho
um conjunto de inovações na busca de desenvolvimento biotecnológico de testes
sorológicos empregando a por citometria de fluxo. Tais testes poderão trazer um
impacto positivo sobre as ações voltadas ao controle da leishmaniose visceral.
KER, H.G. HIPÓTESE E OBJETIVOS
18
4. HIPÓTESE
A tecnologia multiplex empregando microesferas funcionais fluorescentes de
poliestireno permite a construção de um teste sorológico por citometria de fluxo que
proporciona elevado desempenho no diagnóstico sorológico da LVC.
.
5. OBJETIVOS
5.1. Objetivo Geral
Estabelecer inovações biotecnológicas que proporcionem o desenvolvimento de um
teste multiplex por citometria de fluxo de elevada acurácia no diagnóstico sorológico da
LVC.
5.2. Objetivos específicos
I. Avaliar o desempenho das metodologias que já foram e as que atualmente são
oficialmente adotadas pelo Ministério da Saúde do Brasil (RIFI, ELISA e DPP)
no diagnóstico sorológico da LVC;
II. Avaliar o desempenho do teste por citometria de fluxo LeishFlow no diagnóstico
sorológico da LVC;
III. Padronizar os procedimentos metodológicos para o acoplamento de proteínas
em microesferas funcionais para uso em ensaio citofluorimétrico;
IV. Padronizar os procedimentos metodológicos para pesquisa sorológica de
anticorpos caninos IgG utilizando sistemas antigênicos microesfera−proteína no
diagnóstico sorológico da LVC;
V. Avaliar o desempenho individual e combinado dos sistemas antigênicos
microesfera-proteína no diagnóstico sorológico da LVC;
VI. Comparar o desempenho das distintas metodologias deste trabalho no
diagnóstico sorológico da LVC.
KER, H.G. MATERIAL E MÉTODOS
19
6. MATERIAL E MÉTODOS
6.1. Ensaios sorológicos para diagnóstico da LVC: avaliação das
metodologias adotadas pelo Ministério da Saúde do Brasil
Empregando os testes recomendados pelo Ministério da Saúde foram realizados
ensaios sorológicos de forma a avaliar a especificidade dos testes Dual Path Platform
(DPP-LVC®), ELISA (EIE-LVC®), e RIFI (IFI-LVC®) produzidos pelo Instituto de
Tecnologia em Imunobiológicos de Bio-Manguinhos da Fundação Oswaldo Cruz
(FIOCRUZ). Estes experimentos seguiram as orientações listadas na bula dos kits.
Maiores detalhes sobre o material e os métodos utilizados neste estudo estão
apresentados no Apêndice A sob a forma de Artigo Original submetido à Revista de
Saúde Pública (online) da Faculdade de Saúde Pública da Universidade de São Paulo.
6.2. Ensaios sorológicos para diagnóstico da LVC: o teste por citometria
de fluxo LeishFlow
O teste diagnóstico desenvolvido neste estudo e denominado LeishFlow basea-
se em uma reação sorológica entre os anticorpos caninos IgG anti-Leishmania a uma
matriz antigênica composta por antígenos totais de promastigotas de L. infantum
estabilizadas em conservante formaldeído 0.5%. Todo o processo que caracteriza este
teste teve pedido de patente depositado junto ao Instituto Nacional de Propriedade
Intelectual (INPI) sob o título “ Protótipo de um kit de diagnóstico da leishmaniose
visceral canina, empregando formas promastigotas fixadas pela técnica de citometria de
fluxo” como indicado no Apêndice B. O detalhamento dos materiais e dos métodos
referentes à padronização e adequação da reação sorológica com o teste LeishFlow
está apresentado no Apêndice C sob forma de artigo científico, publicado no formato
de artigo original na revista Diagnostic Microbiology and Infectious Disease (Ker et al.,
2013a). Os dados relacionados à avaliação de desempenho diagnóstico do LeishFlow
estão apresentados no Apêndice D sob forma de artigo científico, publicado no formato
de artigo original na revista Clinical and Vaccine Immunology (Ker et al., 2013b).
6.3. Ensaios sorológicos para diagnóstico da LVC: o desenvolvimento de
uma nova metodologia diagnóstica por citometria de fluxo e a geração de
uma plataforma diagnóstica – LeishPlex
As informações sobre o processo descrito a seguir tiveram pedido de patente de
invenção depositado junto ao INPI sob o título “Teste sorológico multiplex por citometria
de fluxo” como indicado no Apêndice E.
KER, H.G. MATERIAL E MÉTODOS
20
6.3.1. Animais experimentais
Para os ensaios sorológicos distintos empregados neste trabalho, foram
utilizados amostras biológicas de soros de cães (Canis familiaris), com idade variável e
sexos diferentes. Este material foi dividido em dois subconjuntos como ilustrado na
Figura 2. O subconjunto de amostras de soros caninos não infectados (NI) é formado
por três grupos: pelo grupo de cães não infectados (CNI); pelo grupo de cães do controle
de reação cruzada (CRC); e pelo grupo de cães do controle vacinado com diferentes
imunoprofiláticos anti-LVC (VAC). O subconjunto de amostras de soros caninos
infectados (INF) é formado por cães naturalmente infectados por L. infantum que foram
subdivididos em três grupos clínicos: cães assintomáticos (CA), cães oligossintomáticos
(CO) cães sintomáticos (CS). A seguir todos os grupos serão descritos detalhadamente.
Subconjunto de soros de cães não infectados (NI)
O grupo controle não infectado [CNI (n =30)], correspondem a cães nascidos,
criados, e mantidos no canil do Centro de Ciência Animal (CCA) da UFOP. Além de
Ouro Preto ser considerada área indene para LV este canil possuí uma barreira
composta de uma fina tela de aço inoxidável que impede a entrada de qualquer inseto.
Desta forma, estes cães comprovadamente apresentavam resultados negativos em
exames sorológicos (in house ELISA) e em testes moleculares por PCR realizados em
amostras de medula óssea. Além de negativos em testes sorológicos e moleculares, os
cães do grupo CNI também são negativos em exames parasitológicos realizados em
aspirado de medula óssea corado pelo Giemsa.
O grupo controle de reatividade cruzada [CRC (n=30)] foi composto por amostras
de soro gentilmente cedidas por diferentes laboratórios de pesquisa, e foi constituído de
cães naturalmente infectados com Leishmania braziliensis (n=10), Erlichia canis (n=10)
e Babesia canis (n=10). Essas amostras foram caracterizadas por apresentar resultados
positivos em exames sorológicos e PCR para a respectiva infecção, assim como por
resultados negativos em exames específicos para detecção de infecção por L. infantum
(in house ELISA e PCR).
O grupo controle vacinado (VAC) foi constituído de soro de animais nascidos,
criados, e mantidos no CCA da UFOP, e que foram submetidos a diferentes protocolos
de vacinação contra LVC utilizando as vacinas Leish-Tec® (n=10), Leishmune® (n=10) e
LBSap (n=10). Antes da vacinação, todos os animais apresentavam resultados
negativos por exame sorológico (in house ELISA), e por exame molecular (PCR de
medula óssea). As amostras de soro empregadas neste estudo foram coletadas 100
dias após o protocolo completo de vacinação. Para as vacinas Leish-Tec® e
Leishmune®, a imunização seguiu as normatizações descritas na bula dos respectivos
KER, H.G. MATERIAL E MÉTODOS
21
fabricantes, exceto para LBSap, cujo protocolo de imunização foi descrito por Roatt et
al. (2012).
Subconjunto de soros de cães infectados (INF)
Compõem este subconjunto, soros de 60 cães provenientes da área endêmica
de Belo Horizonte recolhidos pelo Centro de Controle de Zoonoses (CCZ-BH) durante
campanhas de vigilância e controle do município no ano de 2010. Estes animais são
caracterizados por apresentarem exames sorológicos positivos para LVC [sorologia em
papel filtro − ELISA (EIE-LVC®) e RIFI (IFI-LVC®) − realizado no CCZ-BH], bem como
positivos por exames moleculares (qPCR − realizado no LIMP/UFOP) em pelo menos
um tecido (pele, baço, fígado, medula óssea e linfonodo poplíteo) utilizando
oligonucleotídeos específicos para L. infantum. Além disso, seguindo com a
classificação clínica proposta por Mancianti et al. (1988) e revista por Reis et al. (2006),
os cães foram subdivididos em grupos de cães assintomáticos [CA (n =20)],
caracterizados pela ausência de sinais clínicos; cães oligossintomáticos (CO (n =20)],
caracterizados por apresentarem de 1 a 3 sinais clínicos da doença; e cães sintomáticos
[CS (n =20)], caracterizados por apresentarem mais de 3 sinais clínicos da LVC. Cabe
aqui mencionar que foram realizados exames parasitológicos nestes cães (esfregaços
de tecidos corados pelo Giemsa e/ou isolamento em cultura com meio LIT), dos quais
foram observados 35 animais positivos, em pelo menos 1 dos testes parasitológicos
realizados. Os 60 animais do subconjunto INF foram estudados em trabalhos prévios do
LIMP da UFOP com aprovação no Comitê de Ética da UFOP (Parecer 2007/83 - Anexo
A), bem como pelo Comitê de Ética da Prefeitura Municipal de Belo Horizonte (Parecer
001/2008 - Anexo B).
A Figura 1 apresenta o esquematicamente o panorama dos grupos de soros
empregados no estudo da nova metodologia diagnóstica por citometria de fluxo.
Figura 1: Panorama dos grupos de soros empregados neste estudo.
Soroteca para o estudo
LeishPlex
n = 150
Controle não
infectado (CNI)
n = 30
Controle de reação
cruzada (CRC)
n = 30
Cntrole vacinado
(VAC)
n = 30
Subconjunto de cães
não infectados n = 90
Leishmune®
n =10
Leish-Tec®
n = 10
LBSap
n =10
L. braziliensis
n =10
E. canis
n =10
B. canis
n =10
Subconjunto de cães
infectados
n = 60
Assintomáticos
(CA)
n = 20
Oligossintomáticos
(CO)
n = 20
Sintomáticos
(CS)
n = 20
KER, H.G. MATERIAL E MÉTODOS
22
6.3.2. A tecnologia Cytometric Bead Array (CBA)
O sistema BD™ CBA Flex Set (BDTM Biosciences, San Diego, California, EUA)
fornece um menu aberto e configurável de reagentes projetados para criação de ensaios
multiplex. Cada microesfera possui intensidade de fluorescência única, determinado por
um nível discreto de marcação fluorescente, de modo que pode ser distinguida pela sua
intensidade de fluorescência medida no canal de fluorescência FL3 ou FL4 do citômetro
de fluxo (Figura 2). Microesferas com intensidade de fluorescência diferentes podem ser
combinadas para criar um ensaio sorológico do tipo multiplex.
Figura 2: Painel dos tipos distintos de microesferas que compõem o kit BD™ CBA Flex Set. As
letras (A−E) e números (1−6) são empregados para diferenciar as microesferas quanto às suas
características de fluorescência medidas no canal de fluorescência 3 - FL3 (fluorescência
vermelha) x fluorescência 4 - FL4 (fluorescência violeta).
O acoplamento de proteínas às microesferas funcionais do CBA ocorre a partir
de uma ligação covalente estável entre os grupamentos amina das proteínas e os
grupamentos sulfidrila das microesferas. O protocolo de acoplamento baseou-se nas
informações técnicas presentes no Techniques for Immune Function Analysis (Becton
& Dickinson, Application Handbook, Second Edition), com algumas modificações feitas
para este estudo. De forma geral, o mecanismo de acoplamento de proteínas às
microesferas funcionais CBA pode ser dividido nas 3 etapas ilustradas na Figura 3, e
compreende: (i) o preparo da microesfera; (ii) o preparo da proteína; (iii) a conjugação
da microesfera à proteína. A primeira etapa é caracterizada pelo preparo da microesfera
com o reagente Ditioteitrol (DTT), responsável pela redução do grupo dissulfeto
presente na superfície das microesferas e formação de um grupo sulfidrila. A segunda
etapa da reação, que compreende o preparo da proteína, é caracterizada pela reação
da amina primária presente na porção terminal da proteína com uma hidroxisuccinamida
da molécula de Sulfosuccinimidil 4-N-maleimidometil ciclohexano 1-carboxilato (Sulfo-
SMCC) formando um grupo maleimida, que caracteriza-se por ser altamente reativo com
A
B
C
D
E
1 2 3 4 5 6
105
104
103
102
105104103102
FL4
FL3
KER, H.G. MATERIAL E MÉTODOS
23
grupos sulfidrilas. A terceira e última etapa deste mecanismo trata da formação da
ligação sulfidrila-maleimida que é estabilizada na presença de N-Ethylmaleimida (NEM),
formando ligações tio-éster estáveis.
Figura 3: Etapas para acoplamento de proteínas a microesferas funcionais do kit BD™ CBA Flex
Set. O DTT reduz o grupo dissulfeto formando grupos sulfidrilas, que são reativos com o grupo
maleimida inserido na porção aminoterminal da proteína por meio de uma reação química com
Sulfo-SMCC. A ligação sulfidrila-maleimida é estabilizada por tratamento com o NEM.
6.3.3. Padronização do acoplamento de proteínas às microesferas
funcionais CBA
Como parte importante que compôs o desenvolvimento metodológico, o plano
inicial de trabalho contou com a elaboração de um protocolo de acoplamento que
utilizou-se de um suporte proteico genérico, neste caso, a soro albumina bovina (bovine
seroalbumin - BSA). Esta estratégia visou o acerto da padronização do acoplamento de
proteínas a microesferas CBA em menor custo e principalmente sem consumir estoque
de antígeno recombinante, bem como dos soros caninos. Para iniciar os experimentos
de padronização da tecnologia, foi escolhido a microesfera C7 do kit BD™ CBA Flex
Set.
O preparo das microesferas C7 iniciou-se com uma sonicação em banho
ultrassônico (Branson 1510 DTH Ultrasonic Cleaner - Brason Sonic Power Co., EUA)
por 1 minuto em uma frequência de 40 Hertz. As microesferas foram homogeneizadas
em vórtex por 1 minuto e 30 segundos, e 75µL das microesferas C7 foram transferidas
para um microtubo de 1,5mL. Em seguida, adicionou-se 1,9µL de DTT 1M. A reação
para formação do grupo sulfidrila na superfície das microesferas ocorreu em um agitador
orbital por 1 hora a temperatura ambiente. Ao final desta etapa, realizou-se 3 lavagens
com 1mL de tampão de acoplamento coupling buffer (BDTM Biosciences, San Diego,
California, EUA) por centrifugação a 900 x g por 3 minutos. Ao fim da lavagem, o
sobrenadante foi cuidadosamente aspirado e a suspensão de microesferas foi suspensa
Etapa 3: Conjugação microesfera-proteína.
Etapa 1: Preparo da microesfera CBA.
DTT
S-S SH
Etapa 2: Preparo da proteína.
Proteína
NH2
Sulfo-SMCCProteína N
H
SProteína
NH
KER, H.G. MATERIAL E MÉTODOS
24
em 50µL do coupling buffer. As microesferas tratadas na primeira etapa foram
armazenadas em geladeira até o momento do uso.
A segunda etapa referente ao preparo da proteína utilizou uma solução estoque
de BSA preparada na concentração de 1mg/mL. Para o desenvolvimento da reação,
empregou-se 90µL da solução estoque de BSA (1mg/mL) e 2µL da solução de Sulfo-
SMCC (2mg/mL) em incubação sob agitação orbital por 1 hora a temperatura ambiente
e ao abrigo da luz.
Após a conclusão deste processo, para a ligação da proteína à microesfera, o
conteúdo do tubo contendo as microesferas tratadas com DTT foi adicionado ao BSA
tratado com Sulfo-SMCC, rapidamente homogeneizado em vórtex, e incubado em
agitador orbital por 1 hora a temperatura ambiente e ao abrigo da luz. Ao fim do
processo, adicionou-se 2µL de NEM (2mg/ml) e a suspensão obtida foi novamente
incubada em agitador orbital por mais 15 minutos a temperatura ambiente e ao abrigo
da luz. O material foi lavado 3 vezes com 700µL de storage buffer (BDTM Biosciences,
San Diego, California, EUA) por centrifugação a 1000 x g por 3 minutos. Após as
lavagens, aspirou-se o sobrenadante cuidadosamente e o pellet de microesferas foi
suspendido em 500µL de storage buffer (BDTM Biosciences, San Diego, California,
EUA). As microesferas permaneceram por um período mínimo de 18 horas a 4°C para
estabilização da ligação. Após este procedimento, com base nas informações do
fabricante, a concentração final de microesferas é de aproximadamente 3.0 x 106
partículas/mL.
A confirmação da estratégia de acoplamento foi realizada por uma reação
imunológica, através de incubação com diferentes concentrações de um anticorpo
monoclonal anti-BSA (Monoclonal Mouse Anti-Bovine Serum Albumin [Sigma-Aldrich,
Saint Louis, Missouri, EUA]) seguido de posterior incubação com um anti-IgG de
camundongo conjugado com isotiocianato de fluoroceína (FITC) (Goat Anti-mouse IgG
[whole molecule]−FITC [Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, EUA]).
O protocolo de reação imunológica empregado para a confirmação iniciou-se
com a rápida homogeneização da microesfera C7 conjugada à BSA no vórtex e, em
seguida, no banho ultrassônico por 2 minutos (40 Hertz). As microesferas foram diluídas
na proporção de 1:50 v/v em wash buffer (BDTM Biosciences, San Diego, California,
EUA) e 50 µL foram adicionadas em microtubo de 0,5mL, correspondendo a
aproximadamente 4.500 microesferas por microtubo. Em seguida, adicionou-se 50 µL
do anticorpo anti-BSA (diluído em PBS 2% caseína 2% lecitina em títulos de 1:50; 1:100;
1:500; 1:1000) e uma incubação de 90 minutos foi realizada a temperatura ambiente e
ao abrigo da luz. Após este tempo, o conteúdo destes tubos foi transferido para
microtubos de 1,5mL, e então adicionou-se 700 µL do wash buffer (BDTM Biosciences,
KER, H.G. MATERIAL E MÉTODOS
25
San Diego, California, EUA) para lavagem do material, que ocorreu em centrifugação a
2000 rpm por 7 minutos. O sobrenadante foi aspirado, e outras duas lavagens foram
realizadas seguindo este mesmo processo. Ao fim da lavagem, adicionou-se 50 µL do
anticorpo secundário anti-mouse IgG FITC (diluído em títulos de 1:50, 1:100, 1:500 e
1:1000) e uma nova incubação de 90 minutos a temperatura ambiente e ao abrigo da
luz foi realizada. O procedimento de lavagem foi novamente realizado por 3 vezes. Após
a última lavagem, o sobrenadante foi aspirado deixando um volume aproximado de
200µL para leitura no citômetro de fluxo. A aquisição dos dados foi realizada no
citômetro de fluxo FACScalibur® (Becton Dickinson) empregando o software Cell Quest.
A análise dos dados foi feita através do software FlowJo® (FlowJo, Ashland, Oregon,
EUA).
Para análise dos dados foram adquiridas informações relativas ao tamanho
(Forward Scatter [FSC] – dispersão frontal), granulosidade (Side Scatter [SSC] –
dispersão lateral), e intensidade relativa de fluorescência do tipo 1 (FL1 - fluorescência
verde) de 2000 microesferas por amostra. A análise da reatividade de anticorpos foi feita
inicialmente pela seleção da população da respectiva microesfera em gráfico
bidimensional de densidade de FSC versus SSC (Figura 4A). Para avaliar a intensidade
média de fluorescência (FL1) da população selecionada, histogramas foram construídos
em função do número de microesferas. A verificação de acerto do acoplamento do BSA
às microesferas C7 se deu pela análise dos histogramas (Figura 4B, 4C e 4D), através
do estabelecimento de um marcador (M1) de reatividade no controle da reação. A
determinação de M1, evidencia o percentual de partículas positivas (PPF) obtidas
quando as microesferas C7 não foram incubadas com anticorpo anti-BSA, assim como
com o anti-mouse IgG-FITC (Figura 4B). A Figura 4C representa a frequência da
intensidade de fluorescência na ausência de incubação com o anticorpo monoclonal
anti-BSA, porém com a incubação com o conjugado anti-mouse IgG-FITC. Na presença
de incubação com o anticorpo monoclonal anti-BSA, seguido da marcação fluorescente
com anti-mouse IgG-FITC (Figura 4D). Esta sequência de gráficos confirmou, através
da interpretação dos valores medidos em PPF, que a estratégia de acoplamento
proposto no kit BD™ CBA Flex Set funcionou apropriadamente em nossas condições
laboratoriais, favorecendo a continuidade do desenvolvimento deste trabalho.
KER, H.G. MATERIAL E MÉTODOS
26
Figura 4: Representação esquemática da sequência da análise dos dados da confirmação do
acoplamento de soroalbumina bovina (BSA) em microesferas C7 do kit BD™ CBA Flex Set. (A)
Seleção da população de microesferas C7 utilizando-se os parâmetros de tamanho (Forward
scatter - FSC) e granulosidade (Side scatter-SSC). (B) Histograma de Fluorescência 1 – FL1
representando o percentual de partículas positivas (PPF) obtidos com o controle do conjugado
da reação; (C) histograma de FL1 na ausência de incubação com o anticorpo monoclonal anti-
BSA, seguido da marcação fluorescente com anti-mouse IgG-FITC; (D) histograma de FL1 na
presença de incubação com o anticorpo monoclonal anti-BSA, seguido da marcação fluorescente
com anti-mouse IgG-FITC. O posicionamento do marcador (M1) segue o critério de se obter no
máximo 1% de PPF para o controle do conjugado da reação, e é mantido para as demais
análises.
6.3.4. O acoplamento de proteínas recombinantes com potencial para
diagnóstico da LVC e o desenvolvimento de uma nova metodologia
diagnóstica por citometria de fluxo
Com o protocolo de acoplamento de uma microesfera a uma proteína
padronizado, a próxima etapa seguiu no sentido de desenvolver uma tecnologia
inovadora para diagnóstico da LVC. Assim, como parte integrante desta nova etapa,
testamos o acoplamento de distintos antígenos recombinantes a diferentes microesferas
funcionais CBA. Assim, a proposta da nova metodologia diagnóstica por citometria de
fluxo baseia-se em uma reação sorológica entre anticorpos caninos IgG anti-Leishmania
a uma matriz antigênica composta por microesferas funcionais acopladas a antígenos
com potencial antigênico para o diagnóstico da LVC
O acoplamento dos recombinantes deste estudo, os multiepítopos C1 e PQ20,
bem como de rLci1A e rLci2B, basearam-se nas mesmas condições de acoplamento
estabelecidas para a conjugação do BSA às microesferas C7. Com uma particularidade,
o processo de acoplamento de antígenos recombinantes às microesferas CBA exigiu
uma única adaptação ao protocolo: Visto que o sistema de produção de todas as
SS
C
FSC
AGate
99,7%
# d
e e
ve
nto
s
Intensidade de fluorescência FL1
B C D
M1 M1 M1
PPF = 0,68% PPF = 5,6% PPF = 90,1%
KER, H.G. MATERIAL E MÉTODOS
27
proteínas deste trabalho empregou tampão uréia 8M para solubilização e eluição dos
recombinantes, e observando que a etapa do acoplamento referente ao preparo da
proteína é caracterizada pela reação da amina primária presente na porção terminal da
proteína com uma hidroxisuccinamida da molécula de Sulfo-SMCC, a presença de uréia
torna-se um potente interferente nesta etapa. Assim, as proteínas passaram por um
processo de diálise para remoção da uréia. Alíquotas das proteínas foram dialisadas em
membrana semipermeável Spectra/Por® MWCO 12−14 (Spectrum Laboratories,
Rancho Dominguez, California, EUA) em tampão PBS pH 7.9, durante 24 horas, a 4°C
sob agitação. Após este processo, as proteínas foram recolhidas e dosadas em
Nanodrop e pelo método de Bradford (1976). Alíquotas das proteínas a 1mg/mL foram
preparadas e conservadas em freezer -20°C até o momento do uso para acoplamento
às microesferas CBA.
Após este processamento, cada proteína foi conjugada a um respectivo modelo
de microesfera funcional CBA, formando um sistema antigênico microesfera−proteína
(Tabela 1).
Tabela 1: Relação das microesferas e respectivo antígeno usado na construção dos sistemas
antigênicos microesfera−proteína deste estudo
Microesfera Antígeno recombinante Sistema microesfera−proteína
A4 rLci1A A4−rLci1A
E4 rLci2B E4−rLci2B
E7 C1 E7−C1
C6 PQ20 C6−PQ20
Os ensaios sorológicos empregando cada um dos sistemas foram padronizados
em placa de 96 poços em fundo em “U” e o protocolo experimental foi desenvolvido e
aplicado igualmente para todos os sistemas antigênicos.
Inicialmente, os sistemas antigênicos microesfera-proteína foram rapidamente
homogeneizados em vortex e, em seguida, por 2 minutos no banho ultrassônico. Uma
alíquota de 150μL foi retirada do respectivo sistema antigênico (aproximadamente
450.000 microesferas) e diluída em 5.000μL de PBS suplementado com 0.5% p/v de
BSA. Após breve homogeneização, os sistemas antigênicos foram distribuídos em
alíquotas de 50μL por poço (aproximadamente 4.500 microesferas) da placa de 96
poços com fundo em “U” (CostarTM, Corning® Life Science, New York, EUA). Em seguida
foram adicionados 50μL do soro canino previamente diluído em PBS contendo 2% de
caseína e 2% lecitina (títulos variando entre 1:50 ─ 1:12.800), e, em seguida, a placa foi
KER, H.G. MATERIAL E MÉTODOS
28
incubada à temperatura ambiente e ao abrigo da luz por 90 minutos. Após a incubação
com os soros, os sistemas antigênicos foram lavados três vezes com adição de 200μL
de PBS suplementado com 0.5% p/v de BSA, centrifugados a 2.200rpm por 10min a
24°C, seguido do descarte do sobrenadante. Para a etapa de marcação fluorescente,
após a última lavagem, foi adicionado em cada poço da placa uma quantia de 100μL de
anticorpo anti-IgG canino (específico para a porção Fc) marcado com isotiocianato de
fluoresceína-FITC (Bethyl® Laboratories Inc., Montgomery, Texas, EUA), previamente
diluído em PBS contendo 2% de caseína e 2% de lecitina (títulos variando entre 1:100
─ 1:8.000). Uma nova incubação a temperatura ambiente ao abrigo da luz por 90
minutos foi realizada. As microesferas foram novamente lavadas três vezes com 200μL
de PBS suplementado com 0.5% p/v de BSA, centrifugadas (2.200rpm, 10 minutos,
24°C,) e o sobrenadante desprezado. Em seguida, foram adicionados 180μL de PBS
suplementado com 0.5% p/v de BSA e a leitura foi realizada no citômetro de fluxo
modelo FACScalibur® (Becton Dickinson, San Jose, California, EUA). Na aquisição dos
dados foi empregado o software Cell-Quest® (Becton Dickinson, San Jose, California,
EUA) e para cada amostra individual foram adquiridas informações relativas ao
tamanho, granulosidade, e intensidade relativa de fluorescência de 2.000 microesferas
por leitura.
6.3.5. Análise dos dados obtidos no citômetro de fluxo
A análise dos dados contou com a aplicação do software FlowJo® (FlowJo,
Ashland, Oregon, EUA) e o esquema geral da análise dos sistemas
microesfera−proteína E7-C1, C6-PQ20, A4−rLci1A e E4−rLci2B estão representados
nas Figuras 5, 6, 7 e 8 respectivamente. A análise da reatividade de anticorpos foi feita
inicialmente pela seleção da população, da respectiva microesfera, em gráficos de
tamanho versus granulosidade (FSC X SSC), obtidos em função do número de
microesferas (Painel A). Para avaliar a intensidade média de fluorescência (FL1) da
população selecionada, histogramas de FL1 foram construídos em função do número
de microesferas (Painéis B, C e D). Os resultados das análises de fluorescência
apresentados pelas microesferas após incubação com pool de soros controles dos
grupos CNI (n = 3) e INF (n = 3) foram expressos sob a forma de percentual de partículas
fluorescentes (PPF). O PPF para cada amostra de soro foi determinado através do
estabelecimento de um limiar de negatividade (marcador M) em função da fluorescência
obtida para o controle do conjugado da reação (Painel B). É importante salientar que
para cada experimento foi estabelecido um limiar de reatividade de no máximo 1% de
PPF em relação a este controle. Desta forma, a partir da determinação do marcador de
reatividade, foram obtidos os valores de PPF para amostras incubadas com pool de soro
KER, H.G. MATERIAL E MÉTODOS
29
do grupo CNI (Painel C), e do grupo INF (Painel D), seguida por marcação com anticorpo
anti-IgG canino conjugado ao FITC.
Figura 5: Representação esquemática da sequência da análise dos dados da confirmação do
acoplamento da proteína recombinante C1 à microesfera E7 do kit BD™ CBA Flex Set. (A)
Seleção da população de microesferas C1 utilizando-se os parâmetros de tamanho (FSC) e
granulosidade (SSC); Histogramas de FL1 representando o percentual de partículas positivas
(PPF) obtidos com (B) o controle do conjugado da reação; (C) após a incubação com pool de
soros CNI; (D) após incubação com pool de soros INF.
Figura 6: Representação esquemática da sequência da análise dos dados da confirmação do
acoplamento da proteína recombinante PQ20 à microesfera C6 do kit BD™ CBA Flex Set. (A)
Seleção da população de microesferas C6 utilizando-se os parâmetros de tamanho (FSC) e
granulosidade (SSC); Histogramas de FL1 representando o percentual de partículas positivas
(PPF) obtidos com (B) o controle do conjugado da reação; (C) após a incubação com pool de
soros CNI; (D) após incubação com pool de soros INF.
SS
C
FSC
A
# d
e e
ven
tos
Intensidade de fluorescência FL1
M - E7−C1
PPF = 0.465%
M - E7−C1
PPF = 34.3%
M - E7−C1
PPF = 93.8%
Gate
99,7%
B C D
SS
C
FSC
AGate
99,5%
# d
e e
ven
tos
Intensidade de fluorescência FL1
B C
M - C6−PQ20
PPF = 41.9
M - C6−PQ20
PPF = 0.603%
D
M - C6−PQ20
PPF = 93.7%
KER, H.G. MATERIAL E MÉTODOS
30
Figura 7: Representação esquemática da sequência da análise dos dados da confirmação do
acoplamento da proteína recombinante rLci1A à microesfera A4 do kit BD™ CBA Flex Set. (A)
Seleção da população de microesferas A4 utilizando-se os parâmetros de tamanho (FSC) e
granulosidade (SSC); Histogramas de FL1 representando o percentual de partículas positivas
(PPF) obtidos com (B) o controle do conjugado da reação; (C) após a incubação com pool de
soros CNI; (D) após incubação com pool de soros INF.
Figura 8: Representação esquemática da sequência da análise dos dados da confirmação do
acoplamento da proteína recombinante rLci2B à microesfera E4 do kit BD™ CBA Flex Set. (A)
Seleção da população de microesferas E4 utilizando-se os parâmetros de tamanho (FSC) e
granulosidade (SSC); Histogramas de FL1 representando o percentual de partículas positivas
(PPF) obtidos com (B) o controle do conjugado da reação; (C) após a incubação com pool de
soros CNI; (D) após incubação com pool de soros INF.
Gate
99,6%
M - A4−rLci1A
PPF = 0.201%
M - A4−rLci1A
PPF = 1.57%
M - A4−rLci1A
PPF = 98.7%S
SC
FSC
A
# d
e e
ven
tos
Intensidade de fluorescência FL1
B C D
M - E4−rLci2B
PPF = 3.67%
SS
C
FSC
A
# d
e e
ven
tos
Intensidade de fluorescência FL1
B C D
M - E4−rLci2B
PPF = 99.2%M - E4−rLci2B
PPF = 0.286%
Gate
98,9%
KER, H.G. MATERIAL E MÉTODOS
31
6.3.6. Análise dos resultados
O estudo dos sistemas antigênicos microesfera−proteína gerou resultados
obtidos em três etapas distintas (Figura 9), cada qual com sua análise particular
descritas na sequência.
Figura 9: Fluxograma do processo da avaliação dos sistemas microesfera−proteína para
aplicação no diagnóstico da LVC.
6.3.6.1. Análises aplicadas à seleção das condições ideais para reação
sorológica
A determinação das condições ideiais para realização de uma reação sorológica
empregando sistemas antigênicos microesfera‒proteínas distintos se deu por uma
análise exploratória dos resultados obtidos em curvas de titulação de pool de soros
caninos do grupo CNI (n = 3) e do subconjunto INF (n = 3) frente a diferentes
concentrações do conjugado (anti-IgG canino marcado com FITC). Os 3 soros
selecionados do subconjunto INF correspondem a 1 soro do grupo CA, 1 soro do grupo
CO e 1 soro do grupo CS.
A seleção das condições ideais seguiram o mesmo critério estabelecido para o
teste por CF LeishFlow (Ker et al., 2013a), em que determina que um ponto ótimo da
curva de titulação deve corresponder a um título de soro que se encontra entre dois
outros títulos que apresentem excelente diferenciação de reatividade entre CNI e INF.
Isto é, esta região da curva de titulação deve apresentar diferenciação da reatividade
sorológica entre os pool de soro CNI e INF com uma amplitude de variação no PPF
superior a 90% (ΔPPF≥90).
6.3.6.2. Análises aplicadas à determinação do ponto de corte
Quando se tem uma variável contínua, resultado da aplicação de um teste
diagnóstico quantitativo, e se pretende transformá-la numa variável dicotômica, do tipo
doente / não doente, temos que utilizar um determinado valor na escala contínua que
discrimine entre essas duas classes. A esse valor determina-se o nome de ponto de
corte, que pode ser definido arbitrariamente pelo pesquisador dentre os valores da
Seleção das condições ideais para reação sorológica:
Titulação do soro e do conjugado
Determinação do ponto de corte:
Construção da receiver operating characteristic curve – curva ROC
Avaliação de desempenho:
Cálculo dos índices de sensibilidade, especificidade, acurácia, valorespreditivos e razões de verossimilhança
KER, H.G. MATERIAL E MÉTODOS
32
variável contínua. Neste trabalho, tratou-se do valor do PPF acima do qual o cão é
classificado como positivo (teste positivo, animal com a doença), e abaixo do qual é
classificado como negativo (teste negativo, ausência de doença). Foram avaliados
pontos de corte arbitrários que corresponderam a PPF≥20, PPF≥30, PPF≥40, PPF≥50,
PPF≥60. A acurácia global em cada uma destas condições foi avaliada pela medida da
área sob a curva [area under curve (AUC)] geradas pela receiver operating characteristic
curve (curva ROC).
A curva ROC consiste na representação gráfica da sensibilidade (verdadeiro-
positivo) no eixo vertical, e o complemento da especificidade (taxa de falso-positivo) no
eixo horizontal. Neste trabalho, a curva ROC foi construída através dos resultados
gerados por um ensaio sorológico em amostras de animais do grupo CNI (n = 30) e do
subconjunto INF (n = 35) que apresentaram, respectivamente, resultados negativos e
positivos em exames parasitológicos (demonstração direta do parasito por microscopia
e/ou isolamento do parasito em cultura). Conforme estabelecido por Swets (1988), este
trabalho classificou cada ponto de corte como: sem valor (AUC=0,5); baixa acurácia
(0,5<AUC<0,7); de moderada acurácia (0,7<AUC<0,9); elevada acurácia (0,9<AUC<1);
ou perfeito (AUC=1). Na construção das curvas foi utilizado a versão 14.12.0. do
programa estatístico MedCalc®.
6.3.6.3. Análises aplicadas à avaliação de desempenho diagnóstico
A terceira etapa, referente a avaliação do desempenho foi determinada pelos
resultados obtidos um ensaio sorológico que utilizou todas as amostras de soro deste
trabalho. As análises foram incialmente realizadas em uma etapa exploratória por meio
da interpretação de gráficos de dispersão em função do PPF. Adicionalmente, cada
sistema microesfera−proteína teve seu desempenho estimado através dos cálculos da
sensibilidade, especificidade, valor preditivo positivo, valor preditivo negativo e acurácia.
Os índices de desempenho foram obtidos utilizando-se o programa estatístico STATA
versão 10.0 (StataCorp, 2007).
Para avaliar o desempenho dos testes sorológicos por CF foram utilizados
índices de validade expressos em porcentagem e em chance, calculados a partir da
classificação dos resultados em quatro categorias de acordo com a presença (grupo
reativo) ou ausência da doença (grupo não-reativo). Tais categorias estão expressas na
Tabela 2 e foram definidas da seguinte forma: “verdadeiro-positivo” [VPos (a)] =
presença de infecção e teste positivo; “falso-positivo” [FPos (b)] = ausência de infecção
e teste positivo; “falso-negativo” [FNeg (c)] = presença de infecção e teste negativo e
“verdadeiro-negativo” [VNeg (d)] = ausência de infecção e teste negativo. Com base
nesses fundamentos, tabelas similares foram preenchidas de acordo com o modelo da
Tabela 2 com o número de ocorrências de cada uma das categorias (a, b, c, e d).
KER, H.G. MATERIAL E MÉTODOS
33
Tabela 2: Categorias de resultados do teste diagnóstico em uma população que inclui cães não infectados e cães infectados com L. infantum.
A sensibilidade é calculada pela relação a/(a+c) traduzindo, assim, a proporção
de cães portadores de LVC, nos quais o teste foi positivo. Já, a especificidade mostra a
proporção de cães sem infecção cujo teste é negativo sendo, portanto, determinada pela
relação d/(b+d). Cabe aqui ressaltar que estes índices são definidos a partir do eixo
vertical da tabela, que representa o resultado dos testes sorológicos obtidos no CCZ-
BH [ELISA (EIE-LVC®) e RIFI (IFI-LVC®) – sorologia por papel filtro] concomitantemente
com o qual os novos testes por CF em investigação foram comparados. Sendo assim,
em decorrência de serem calculadas a partir do eixo vertical, a sensibilidade e a
especificidade, não são afetadas pela variação da proporção entre cães não infectados
e infectados, ou seja, com a prevalência da doença. Desta forma, são consideradas
propriedades estáveis de um teste diagnóstico.
O valor preditivo de um resultado positivo - VPP e o valor preditivo de um
resultado negativo - VPN denominados de forma simplificada de valores preditivos
positivo e negativo são fornecidos, respectivamente, pelas relações a/(a+b) e d/(c+d)
traduzindo, assim, a proporção de cães com teste positivo que apresentam LVC e a
proporção de cães com teste negativo que não apresentam LVC. Os valores preditivos,
ao contrário da sensibilidade e especificidade, são definidos a partir do eixo horizontal
da tabela, portanto, variam com a proporção entre cães não infectados e infectados, ou
seja, com a prevalência da doença. Assim, são, consideradas propriedades instáveis de
um teste diagnóstico.
Neste contexto, os valores preditivos foram determinados considerando-se a
prevalência da doença neste estudo, isto é, valor dado pela razão a+c / a+b+c+d e que,
neste estudo, correspondeu a 40% (60/150). Adicionalmente, os valores preditivos
foram apurados considerando-se a prevalência da doença em cenários artificiais da
doença, em valores decrescentes determinados a partir da prevalência artificial do
estudo, que correspondem aos valores de 35%, 30%, 25%, 20%, 15%, 10% e 5%. Para
os cálculos, empregou-se o Teorema de Bayes, que é definido pelas fórmulas abaixo:
VPP =Sensibilidade x Prevalência
(Sensibilidade x Prevalência) + (1 − Especificidade) x (1 − Prevalência)
LVC TOTAL
REATIVO NÃO-REATIVO
TESTE POSITIVO VPos (a) FPos (b) (a+b)
TESTE NEGATIVO FNeg (c) VNeg (d) (c+d)
TOTAL (a+c) (b+d) (a+b+c+d)
KER, H.G. MATERIAL E MÉTODOS
34
VPN =Especificidade x (1 – Prevalência)
Espeificidade x (1– Prevalência) + (1 − Sensibilidade) x (Prevalência)
O índice de acurácia, por sua vez, indica a proporção de todos os resultados
corretos de um teste, ou seja, os “verdadeiro-positivos” e os “verdadeiro-negativos”.
Assim, constitui-se em um indicador do valor global do teste.
Outra forma de abordagem do desempenho de testes diagnósticos,
particularmente daqueles cujos resultados são expressos em escala contínua, consiste
na determinação das razões de verossimilhança (RVs) para diferentes resultados. A RV
para um determinado resultado do teste diagnóstico é expressa em chance e é definida
pela razão entre proporção de um referido resultado em cães portadores de LVC em
relação à proporção do mesmo resultado em cães não infectados. A RV negativa é
calculada pela relação (1 – Sensibilidade) / Especificidade e a RV positiva é dada pela
relação Sensibilidade / (1 – Especificidade).
Desta forma, as RVs expressam quantas vezes é mais provável (ou menos
provável) se encontrar um determinado resultado do teste em um cão portador de LVC
em relação a um cão não infectado.
Segundo a literatura, valores de RV negativa abaixo de 0,1 praticamente
confirmam a ausência de doença e valores de RV positiva acima de 10 praticamente
confirmam a presença de doença (Jaeschke et al., 1994b). Cabe ainda ressaltar, que
as proporções empregadas no cálculo das razões de verossimilhança são definidas a
partir do eixo vertical da Tabela 1 ou de tabelas semelhantes, não apresentando, assim,
variações em relação a mudanças na prevalência da doença em questão.
6.4. Comparação entre os testes sorológicos
Para as comparações entre os testes diagnósticos, utilizou-se as proporções de
concordâncias e a estatística Kappa. A interpretação de Kappa foi de acordo com a
seguinte escala: 1.00-0,81 excelente; 0,80-0,61 bom; 0,61-0,40 moderado; 0,40-0,21,
fraco; 0,20-0,0 ausência de concordância (Szklo & Nieto 2000).
KER, H.G. RESULTADOS
35
7. RESULTADOS
7.1. Avaliação das metodologias adotadas pelo Ministério da Saúde do
Brasil no diagnóstico da LVC
Os resultados e discussão dos ensaios sorológicos empregando os testes
oficiais RIFI (IFI-LVC®), ELISA (EIE-LVC®) e Dual Path Platform (DPP-LVC®), estão
apresentados no Apêndice A sob forma de artigo científico submetido à Revista de
Saúde Pública.
7.2. Avaliação do teste por citometria de fluxo LeishFlow no diagnóstico da
LVC
Os resultados seguidos da discussão da metodologia referente ao ensaio
sorológico de avaliação de desempenho diagnóstico pelo teste LeishFlow está
apresentado no Apêndice C sob forma de artigo científico, publicado no formato de
Original Article na revista Clinical and Vaccine Immunology (Ker et al., 2013b).
7.3. Desenvolvimento e avaliação de um novo teste multiplex por citometria
de fluxo utilizando sistemas microesfera−proteína no diagnóstico da LVC
e construção do LeishPlex
De forma a facilitar a interpretação dos resultados, bem como da discussão, os
resultados obtidos empregando os sistemas microesfera−proteína deste trabalho foram
separados em dois agrupamentos de acordo com a natureza dos antígenos. Um
agrupamento é constituído pelos sistemas antigênicos que empregaram as proteínas
multiepítopos recombinantes C1 e PQ20 (Fonseca et al., 2014; Faria et al., 2015). Um
outro agrupamento é composto pelos sistemas que utilizaram as proteínas
recombinantes rLci1A e rLci2B (Oliveira et al., 2011; Souza et al., 2012).
7.3.1. Os sistemas microesfera−proteína E7−C1 e C6−PQ20
As Figuras 10 e 11, representam o comportamento da reatividade sorológica
para os sistemas microesfera−proteína E7−C1 e C6−PQ20 respectivamente.
Considerando os dois sistemas antigênicos, observou-se a ocorrência de diversos
títulos do pool de soros CNI com valores elevados de PPF (PPF˃90) nos títulos do
conjugado de 1:100, 1:500 e 1:1.000. Além disso, no título do conjugado de 1:2.000, é
possível verificar que a reatividade do pool de soros INF está bastante reduzida. Desta
forma, seguindo o protocolo delineado, não foi possível determinar uma faixa adequada
de reatividade diferencial (ΔPPF≥90) para o prosseguimento do trabalho.
KER, H.G. RESULTADOS
36
Diante deste cenário e, buscando acertar na determinação das condições ideais
de reação sorológica, e principalmente diante da evidência dos elevados valores de PPF
relacionados ao grupo CNI, foram reduzidos o tempo das incubações com as amostras
de pool de soros e com conjugado, em 30 minutos (Figura Complementar I − Apêndice
F) e em 60 minutos (Figura Complementar II – Apêndice F).
Figura 10: Curvas de titulação da reatividade de IgG canino para o teste sorológico por citometria
de fluxo realizado com o sistema microesfera-proteína E7−C1: pool de soros CNI ( ) e INF ( )
incubados com diferentes titulações do anticorpo conjugado com isotiocianato de fluoresceína
(FITC). Os resultados foram expressos como percentual de partículas fluorescentes (PPF).
Figura 11: Curvas de titulação da reatividade de IgG canino para o teste sorológico por citometria
de fluxo realizado com o sistema microesfera-proteína C6−PQ20: pool de soros CNI ( ) e INF
( ) incubados com diferentes titulações do anticorpo conjugado com isotiocianato de
fluoresceína (FITC). Os resultados foram expressos como percentual de partículas fluorescentes
(PPF).
Diluição do Soro
PP
F
Titulação 1:100 do conjugado IgG-FITC Titulação 1:500 do conjugado IgG-FITC
Titulação 1:1.000 do conjugado IgG-FITC Titulação 1:2.000 do conjugado IgG-FITC
0
20
40
60
80
100
0
20
40
60
80
0
20
40
60
80
100
0
20
40
60
80
100
Titulação 1:100 do conjugado IgG-FITC Titulação 1:500 do conjugado IgG-FITC
Diluição do Soro
PP
F
Titulação 1:1.000 do conjugado IgG-FITC Titulação 1:2.000 do conjugado IgG-FITC
0
20
40
60
80
100
0
20
40
60
80
100
0
20
40
60
80
100
0
20
40
60
80
100
KER, H.G. RESULTADOS
37
Apesar das tentativas que visaram ajustar na determinação das condições ideais
de reação sorológica (Figuras complementares I e II – Apêndice D), as curvas de
titulação revelaram que os sistemas E7−C1 e C6−PQ20 não foram capazes em
determinar uma faixa de excelente reatividade diferencial (ΔPPF≥90) entre os pool de
soros CNI e INF. Desta forma, como não foi possível estabelecer uma condição
adequada para realização da reação sorológica empregando estes sistemas
antigênicos, as etapas posteriores de determinação do ponto de corte, assim como da
avaliação de desempenho, não se justificaram.
7.3.2. Os sistemas microesfera−proteína rLci1A e rLci2B
As Figuras 12 e 13 representam o comportamento da reatividade sorológica
empregando os sistemas microesfera−proteína A4−rLci1A e E4−rLci2B
respectivamente. Os títulos do conjugado avaliados nesta etapa do estudo foram de
1:1.000, 1:2.000, 1:4.000 e 1:8.000.
O comportamento da reação sorológica do sistema A4−rLci1A mostrou que nos
títulos do conjugado de 1:1.000, 1:2.000 e 1:4.000, a reatividade sorológica em pool de
soros do grupo INF obteve valores elevados de PPF (correspondentes a PPF˃90), que
se mantiveram estáveis ao longo da curva de titulação. O título de 1:8.000 apresentou
redução decrescente dos valores de PPF, indicando que não representa uma boa
condição. Em relação ao pool de soros do grupo CNI, uma baixa reatividade
(correspondentes a PPF<10) é encontrada a partir do título de 1:800 para todas as
concentrações do conjugado.
A reatividade sorológica referente ao sistema E4−rLci2B, por sua vez, mostrou
elevados valores de PPF em pool de soros do subconjunto INF para todos os títulos do
conjugado (1:1.000, 1:2.000, 1:4.000 e 1:8.000). O pool de soros do grupo CNI, assim
como no sistema A4−rLci1A, apresentou baixa reatividade a partir do título de 1:800 em
todas as concentrações do conjugado.
Neste panorama, e atendendo ao critério descrito por Ker et al., 2013a, a
condição para realização da reação sorológica selecionada correspondeu pela titulação
do conjugado de 1:4.000, e o título do soro 1:1.600.
KER, H.G. RESULTADOS
38
Figura 12: Curvas de titulação da reatividade de IgG canino para o teste sorológico por citometria
de fluxo com o sistema microesfera−proteína A4-rLci1A: pool de soros CNI ( ) e INF ( )
incubados com diferentes titulações do anticorpo conjugado com isotiocianato de fluoresceína
(FITC). Os resultados foram expressos como percentual de partículas fluorescentes (PPF). O
sombreado cinza representa a faixa ideal de reatividade e a linha pontilhada destaca a diluição
do pool de soro selecionada.
Figura 13: Curvas de titulação da reatividade de IgG canino para o teste sorológico por citometria
de fluxo com o sistema microesfera−proteína E4−rLci2B: pool de soros CNI ( ) e INF ( )
incubados com diferentes titulações do anticorpo conjugado com isotiocianato de fluoresceína
(FITC). Os resultados foram expressos como percentual de partículas fluorescentes (PPF). O
sombreado cinza representa a faixa ideal de reatividade e a linha pontilhada destaca a diluição
do pool de soro selecionada.
Baseando-se no mesmo critério descrito por Ker et al., (2013), que determina a
utilização de um título de soro que se encontra em meio a outro dois pontos com
excelente reatividade diferencial (ΔPPF≥90%), é possível eleger mais de uma faixa de
reatividade ideal para a realização de um bom ensaio sorológico. Tanto no sistema
Titulação 1:1.000 do conjugado IgG-FITC Titulação 1:2.000 do conjugado IgG-FITC
Diluição do Soro
PP
F
Titulação 1:4.000 do conjugado IgG-FITC Titulação 1:8.000 do conjugado IgG-FITC
0
20
40
60
80
100
0
20
40
60
80
100
0
20
40
60
80
100
0
20
40
60
80
100
Titulação 1:1.000 do conjugado IgG-FITC Titulação 1:2.000 do conjugado IgG-FITC
Diluição do Soro
PP
F
Titulação 1:4.000 do conjugado IgG-FITC Titulação 1:8.000 do conjugado IgG-FITC
0
20
40
60
80
100
0
20
40
60
80
100
0
20
40
60
80
100
0
20
40
60
80
100
KER, H.G. RESULTADOS
39
microesfera−proteína A4−rLci1A (nos títulos de 1:1.000 e 1:2.000 do conjugado), quanto
no E4−rLci2B (no título de 1:8.000 do conjugado), seria possível selecionar distintas
faixas com excelente reatividade diferencial entre os pool de soros CNI e INF. No
entanto, as condições de 1:4.000 do conjugado e 1:1.600 do soro foram selecionadas
no sentido de propiciar um arranjo comum entre A4−rLci1A e E4−rLci2B que fosse mais
favorável à criação de um ensaio do tipo multiplex posteriormente. Em outras palavras,
optou-se por estudar inicialmente um ponto de excelente reatividade diferencial comum
entre dois sistemas, do que considerar outras opções que abordariam uma validação
individual do respectivo sistema antigênico.
Assim, sob as condições de reação sorológica com aplicação do conjugado no
título de 1:4.000, e dos soros no título de 1:1.600, seguiram-se os ensaios com as
amostras que mostraram exame parasitológico negativo no grupo CNI e positivo dentre
os cães do subconjunto INF para determinação do ponto de corte de acordo com os
valores estabelecidos neste trabalho (PPF≥20, PPF≥30, PPF≥40, PPF≥50 e PPF≥60).
Respectivamente para os sistemas A4−rLci1A e E4−rLci2B, os resultados do ensaio
sorológico para construção da curva ROC e determinação do ponto de corte ideal
encontram-se representados na Figuras 14 e 15.
Figura 14: Obtenção do ponto de corte empregando o sistema A4−rLci1A. (A) Reatividade das
amostras dos cães do grupo controle não infectado (CNI = ) e do subconjunto de cães
infectados (INF = ) nas diluições de 1:1.600 do soro e 1:4.000 do anticorpo conjugado com
isotiocianato de fluoresceína (FITC). Os resultados estão expressos como percentual de
partículas fluorescentes (PPF). (B) Curvas ROC construídas a partir da representação gráfica da
sensibilidade (verdadeiro-positivo) no eixo vertical, e o complemento da especificidade (taxa de
falso-positivo) no eixo horizontal. Os resultados estão determinados pela área sob a curva (AUC).
O sombreado cinza representa o ponto de corte selecionado.
PPF ≥ 20 PPF ≥ 30 PPF ≥ 40 PPF ≥ 50 PPF ≥ 60
100 - Especificidade
Se
ns
ibil
ida
de
0
20
40
60
80
100
0 20 40 60 80 100
AUC = 0,983
0 20 40 60 80 100
AUC = 0,986
0 20 40 60 80 100
AUC = 0,943
0 20 40 60 80 100
AUC = 0,943
0 20 40 60 80 100
AUC = 0,986
CNI INF CNI INFCNI INF CNI INF CNI INF
0
20
40
60
80
100
PP
F
B
A
96.7%
100.0%
96.7%
97.1%
100.0%
97.1%
100.0%
91.4%
100.0%
91.4%
KER, H.G. RESULTADOS
40
Figura 15: Obtenção do ponto de corte empregando o sistema E4−rLci2B. (A) Reatividade das
amostras de cães do grupo controle não infectado (CNI = ) e do subconjunto de cães infectados
(INF = ) nas diluições de 1:1.600 do soro e 1:4.000 do anticorpo conjugado com isotiocianato
de fluoresceína (FITC). Os resultados estão expressos como percentual de partículas
fluorescentes (PPF). (B) Curvas ROC construídas a partir da representação gráfica da
sensibilidade (verdadeiro-positivo) no eixo vertical, e o complemento da especificidade (taxa de
falso-positivo) no eixo horizontal. Os resultados estão determinados pela área sob a curva (AUC).
O sombreado cinza representa o ponto de corte selecionado.
Como pode ser observado, tanto os testes conduzidos com o sistema A4−rLci1A
(Figura 14), quanto pelo sistema E4−rLci2B (Figura 15), apresentaram excelente
performance nas condições de ponto de corte avaliadas. Neste estudo, todos os pontos
de corte avaliados apresentaram valores de AUC superiores a 0,943
independentemente do sistema microesfera-proteína empregado, indicando que ambos
podem constituir um teste sorológico de elevada acurácia. Diante deste cenário, visando
a escolha do ponto de corte ideal de um teste diagnóstico para LVC, optou-se pela
utilização da faixa correspondente ao PPF≥40. Esta escolha, esta calcada no fato que
o PPF≥40 representou o primeiro ponto de corte que alcançou valor de especificidade
de 100.0%, e que manteve o valor máximo da sensibilidade (97.1%), para ambos os
sistemas antigênicos.
Sob esta condição de ponto de corte, o panorama geral do desempenho
diagnóstico do teste sorológico por citometria de fluxo utilizando o sistema A4−rLci1A
está apresentado na Figura 16. Este teste foi capaz de inferir 100,0% (30/30) dos cães
CNI como negativos, enquanto que 90,0% (54/60) das amostras do subconjunto INF
foram consideradas positivas (Figura 16A). Ao dividir o grupo de cães INF de acordo
com a classificação clínica (Figura 16B), observou-se que 80,0% (16/20) dos cães
assintomáticos foram positivos no teste, enquanto que 95,0% (19/20) dos cães
oligossintomáticos e sintomáticos foram considerados positivos. Ao analisar o grupo de
0
20
40
60
80
100
0 20 40 60 80 100
AUC = 0,952
0 20 40 60 80 100
AUC = 0,986
0 20 40 60 80 100
AUC = 0,986
0 20 40 60 80 100
AUC = 0,971
0 20 40 60 80 100
AUC = 0,986
PPF ≥ 20 PPF ≥ 30 PPF ≥ 40 PPF ≥ 50 PPF ≥ 60
100 - Especificidade
Sen
sib
ilid
ad
eP
PF
B
A
0
20
40
60
80
100
CNI INFCNI INF CNI INF CNI INF CNI INF
90.0%
100.0%
96.7%
97.1%
100.0%
97.1%
100.0%
97.1%
100.0%
94.3%
KER, H.G. RESULTADOS
41
cães infectados com outros patógenos caninos (Figura 16C), todos as amostras de
grupo L. braziliensis apresentaram resultado negativo no teste com sistema A4−rLci1A.
Nas amostras de animais infectados com E. canis observou-se 30.0% (3/10) de
resultados negativos, enquanto que para B. canis correspondeu a apenas 20,0% (2/10).
Em relação aos cães imunizados (Figura 16D), o sistema A4−rLci1A mostrou que 70,0%
(7/10) das amostras de cães vacinados com Leish-Tec® e Leishmune® apresentaram
resultados negativos, e pela vacinação com LBSap observou-se 80,0% (8/10) de
resultados considerados negativos.
Figura 16: Avaliação de desempenho do sistema A4-rLci1A em ensaio sorológico por citometria
de fluxo no diagnóstico da LVC. Através do perfil de dispersão individual de cada amostra, e
considerando o ponto de corte de PPF≥40, os resultados foram obtidos empregando a diluição
padronizadas dos soros de 1:1.600 e do conjugado de 1:4.000. Os resultados estão expressos
como percentual de partículas fluorescentes (PPF). (A) Controle não infectado (CNI = ) e cães
infectados (INF = ) portadores de diferentes formas clínicas; (B) Cães do subconjunto INF
divididos de acordo com a classificação clínica da doença em: cães assintomáticos (CA = ),
cães oligosintomáticos (CO = ) e cães sintomáticos (CS = ); (C) Cães infectados com outros
patógenos caninos: L. braziliensis ( ), Ehrlichia canis ( ) e Babesia canis ( ); (D) Cães
vacinados contra a LVC: Leish-Tec® ( ), Leishmune® ( ) e LBSap ( ).
A Figura 17 ilustra o desempenho diagnóstico do sistema E4-rLci2B no
diagnóstico da LVC. Observou-se que 100,0% (30/30) dos cães CNI foram considerados
negativos, enquanto que nas amostras do subconjunto INF, 95,0% (57/60) mostraram
resultados positivos (Figura 17A). A divisão do subconjunto INF (Figura 17B) de acordo
com a classificação clínica revelou que 85,0% (17/20) das amostras dos cães
assintomáticos, e 100,0% (20/20) das amostras dos cães oligossintomáticos e
sintomáticos, revelaram resultado positivo. Os animais infectados com L. braziliensis
CA CO CS
PP
F
0
20
40
60
80
100
PP
F
CNI INF
0
20
40
60
80
100 A
B C D
L. braziliensis E. canis B. canis Leish-Tec® Leishmune® Lbsap
95.0% 95.0%
100.0% 30.0% 20.0%
100.0%
90.0%
80.0%
70.0% 70.0% 80.0%
KER, H.G. RESULTADOS
42
assim como E. canis mostraram resultados negativos em 80,0% (8/10) das amostras,
enquanto que para B. canis observou-se em 60,0% (6/10) (Figura 17C). Nos animais
vacinados com Leish-Tec® e Leishmune®, a condição de teste com o sistema E4−rLci2B
revelou que 90,0% (9/10) das amostras apresentaram resultado negativo, ao passo que
nos cães vacinados com LBSap, 50,0% (5/10) das amostras foram negativas (Figura
17D).
Figura 17: Avaliação de desempenho do sistema E4-rLci2B em ensaio sorológico por citometria
de fluxo no diagnóstico da LVC. Através do perfil de dispersão individual de cada amostra, e
considerando o ponto de corte de PPF≥40, os resultados foram obtidos empregando a diluições
padronizadas dos soros de 1:1.600 e do conjugado de 1:4.000. Os resultados estão expressos
como percentual de partículas fluorescentes (PPF). (A) Controle não infectado (CNI = ) e cães
infectados (INF = ) portadores de diferentes formas clínicas; (B) Cães do subconjunto INF
subdivididos de acordo com a classificação clínica da doença em: cães assintomáticos (CA =
), cães oligosintomáticos (CO = ) e cães sintomáticos (CS = ); (C) Cães infectados com
outros patógenos caninos: L. braziliensis ( ), Ehrlichia canis ( ) e Babesia canis ( ); (D) Cães
vacinados contra a LVC: Leish-Tec® ( ), Leishmune® ( ) e LBSap ( ).
Visto a importância de se buscar melhor entender o desempenho do teste
LeishPlex, a Tabela 3 sumariza os resultados expressos pelos índices de sensibilidade,
especificidade e acurácia. O sistema A4−rLci1A mostrou sensibilidade de 91,7%,
especificidade de 74,4%, e a acurácia alcançou 80,7%. O sistema E4−rLci2B, por sua
vez, revelou desempenho superior, com sensibilidade de 95,0%, especificidade de
83,3%, e a proporção geral de acertos medidos pela acurácia foi de 88.0%.
Tabela 3: Desempenho dos sistemas antigênicos A4−rLci1A e E4−rLci2B no diagnóstico da LVC
CNI INF
PP
F
0
20
40
60
80
100
CA CO CS
0
20
40
60
80
100
Leish-Tec® Leishmune® LBSapL. braziliensis E. canis B. canis
PP
F
A
B C D
85.0% 100.0% 100.0%
80.0% 80.0% 60.0% 90.0% 90.0% 50.0%
100.0%
95.0%
KER, H.G. RESULTADOS
43
Teste Sensibilidade
(IC 95%) Especificidade
(IC 95%) Acurácia (IC 95%)
A4−rLci1A 91,7%
(81,9−96,4%) 74,4 %
(64,5−82,3%) 81,3 %
(74,3−86,8%)
E4−rLci2B 95,0%
(86,3−98,3%) 83,3 %
(74,3−89,6%) 88,0%
(81,8−92,3%)
IC, intervalo de confiança
A Tabela 4 ilustra os resultados dos valores preditivos calculados em diferentes
cenários de prevalência da LVC. Tomando-se em consideração a prevalência da doença
deste estudo (40%), os valores preditivos positivos (VPPs) indicam valores de 70,5% e
79,2% nos sistemas A4−rLci1A e E4−rLci2B respectivamente. Ou seja, sob esta
condição, pode-se inferir que 29,5% dos resultados positivos pelo sistema A4−rLci1A
poderiam ocorrer em animais que não têm a doença, e aproximadamente 20,8% pelo
sistema E4−rLci2B. Já os valores preditivos negativos (VPNs) sinalizam que a
probabilidade de um cão com teste negativo realmente não ter a doença é de 93,1% e
96,2% nos sistemas A4−rLci1A e E4−rLci2B respectivamente. Isto é, um resultado
negativo vaticina a não ocorrência da LVC com uma probabilidade superior a 90,0%
pelos dois sistemas antigênicos.
Tabela 4: Valores preditivos negativo (VPNs) e positivo (VPPs) da análise dos sistemas
antigênicos A4−rLci1A e E4−rLci2B em diferentes cenários de prevalência
Probabilidade Pré-Teste
A4−rLci1A E4−rLci2B
VPP VPN VPP VPN
40%* 70,5% 93,1% 79,1% 96,1%
35% 65,8% 94,3% 75,4% 96,8%
30% 60,5% 95,4% 70,9% 97,5%
25% 54,4% 96,4% 65,5% 98,0%
20% 47,2% 97,3% 58,7% 98,5%
15% 38,7% 98,1% 50,1% 98,9%
10% 28,5% 98,8% 38,7% 99,3%
5% 15,8% 99,4% 23,0% 99,7%
VPP, valor preditivo positivo; VPN, valor preditivo negativo; * Prevalência deste estudo
Adicionalmente, a interpretação dos cálculos dos valores preditivos em
diferentes cenários artificiais de prevalência da LVC é essencial para a compreensão do
KER, H.G. RESULTADOS
44
possível comportamento dos sistemas antigênicos em situações comumente notadas
nas áreas endêmicas. Assim, assumindo quaisquer prevalência entre 5% e 40%, a
probabilidade de um cão com teste positivo apresentar a doença medida pelo VPP,
encontra-se entre 15,8% a 70,5% no sistema A4−rLci1A, e entre 23,0% e 79,1% no
E4−rLci2B. Por outro lado, o valor preditivo negativo (VPN) que indica a probabilidade
de um cão com teste negativo realmente não ter a doença encontra-se entre 93,1% e
99,4% no sistema A4−rLci1A, e entre 96,1% e 99,7% no E4−rLci2B. Diante do exposto,
é verificado que o sistema E4−rLci2B foi superior ao A4−rLci1A em todos os pontos
assumidos entre 5% e 40%, apresentando tanto maior VPP, quanto maior VPN. A figura
18 ajuda a melhor visualizar e interpretar as considerações acima.
Figura 18: Análise dos valores preditivos em cenários artificiais da doença. (A) Sistema
microesfera−proteína A4−rLci1A: Valores Preditivos Positivos ( ) e Valores Preditivos
Negativos ( ) ; (B) Sistema microesfera−proteína E4−rLci2B: Valores Preditivos Positivos ( )
e Valores Preditivos Negativos ( ). Os retângulos cinzas consideram os intervalos de
probabilidade pré-teste (prevalência) entre 5% e 40%.
Além das análises de desempenho expressas em porcentagem descritas, foi
também realizado uma análise de indicadores expressos em chance, as razões de
verossimilhança (Tabela 5). As razões de verossimilhança expressam quantas vezes
mais provável (ou menos) se encontra um resultado de um teste diagnóstico. As razões
de verossimilhança positivas dos sistemas antigênicos A4−rLci1A e E4−rLci2B foram,
de 3,59 e 5,70 respectivamente. A razão de verossimilhança negativa dos sistemas
antigênicos A4−rLci1A e E4−rLci2B revelaram valores de 0,112 e 0,060
respectivamente.
Prevalência
Va
lore
s p
red
itiv
os
1001 10 20 30 40 50 60 70 80 90
0
20
40
60
80
100
A
1 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
0
20
40
60
80
100
B
KER, H.G. RESULTADOS
45
Tabela 5: Razões de verossimilhança (RVs) e probabilidade pós-teste dos sistemas antigênicos A4−rLci1A e E4−rLci2B
Teste RV+ (IC 95%) RV− (IC 95%)
A4−rLci1A 3,59 (3,28 – 3,92) 0.112 (0,075 – 0,167)
E4−rLci2B 5,70 (4,99 – 6,51) 0.06 (0,032 – 0,127)
IC, intervalo de confiança; RV+, Razão de Verossimilhança Positiva; RV−, Razão de
Verossimilhança Negativa
7.3.3. A construção do novo teste por citometria de fluxo LeishPlex pela
combinação dos sistemas microesfera−proteína rLci1A e rLci2B
O ensaio LeishPlex é caracterizado por combinar igual proporção dos sistemas
A4−rLci1A e E4−rLci2B, formando a matriz antigênica de um ensaio sorológico único.
Os experimentos foram realizados de acordo com as mesmas condições determinadas
para os ensaios que empregaram os sistemas antigênicos de forma individual, todavia,
torna-se interessante ressalvar os seguintes aspectos:
O protocolo experimental de reação sorológica: soro (1:1.600), conjugado FITC
(1:4.000), tempo das incubações (90 minutos, à temperatura ambiente),
centrifugações (10 minutos, à 2.200rpm).
A quantidade total de microesferas utilizadas por poço da placa:
aproximadamente 4.500 microesferas, sendo metade referente ao sistema
A4−rLci1A e a outra metade a E4−rLci2B.
A leitura de 2.000 eventos por amostra avaliada.
A análise dos dados do LeishPlex, que ocorreu de forma similar ao que foi
descrito para os sistemas antigênicos isolados (Figuras 7 e 8), está aqui representada
na Figura 19. Inicialmente, selecionou-se a população da matriz antigênica composta
pelos sistemas A4−rLci1A e E4−rLci2B em gráfico de densidade bidimensional de SSC
versus FSC (Figura 19A). Visto que cada sistema utiliza-se de um modelo de
microesfera funcional distinto, empregando intensidade de fluorescência vermelha
única, torna-se possível diferenciar cada sistema antigênico, através do canal de
fluorescência FL3 do citômetro de fluxo. Os gráficos da intensidade média de
fluorescência FL3, em função da granulosidade (SSC) evidenciam a diferenciação das
populações de microesferas distintas que compõem os sistemas A4−rLci1A e E4−rLci2B
(Figura 19B). Diante desta diferenciação, torna-se possível determinar a intensidade de
fluorescência FL1 para cada sistema antigênico da matriz. Os histogramas da
intensidade de fluorescência FL1 dos sistemas A4−rLci1A e E4−rLci2B foram então
KER, H.G. RESULTADOS
46
obtidos com o controle do conjugado da reação (Figura 19C), após a incubação com
pool de soro de cão CNI (Figura 19D) e após incubação com pool de soro de cão INF
(Figura 19E).
A partir de então, a análise de intensidade de fluorescência FL1 foi obtida de
forma independente entre os dois sistemas da matriz antigênica. As figuras referentes
ao controle do conjugado da reação, após a incubação com pool de soro de cão CNI, e,
após a incubação com pool de soro de cão INF estão representadas nas Figuras 19F,
19G e 19H para A4−rLci1A, e nas Figuras 19I, 19J e 19L para E4−rLci2B
respectivamente. Tanto para um sistema, quanto o outro, em primeiro lugar foi
determinado um limiar de negatividade (marcador M) no controle do conjugado da
reação, que seguiu o critério de limiar de reatividade de no máximo 1% de PPF (Figura
19F [A4−rLci1A]; e 19I [E4−rLci2B]). A partir da determinação do marcador de
reatividade, e com a manutenção do mesmo, foram obtidos os valores de PPF para a
matriz antigênica incubada com o pool de soro CNI [Figura 19G (A4−rLci1A); e 19J
(E4−rLci2B)] e com o pool de soro INF [Figura 19H (A4−rLci1A); e 19L (E4−rLci2B)].
KER, H.G. RESULTADOS
47
Figura 19: Representação esquemática da sequência da análise dos dados o teste LeishPlex
empregando a matriz antigênica composta pelos sistemas microesfera-proteína A4−rLci1A e
E4−rLci2B. (A) Seleção da população de microesferas utilizando-se os parâmetros de tamanho
(FSC) e granulosidade (SSC). Diferenciação das populações de microesferas em gráficos da
intensidade de fluorescência FL3 versus SSC. A intensidade de fluorescência FL1 do conjunto
A4−rLci1A e E4−rLci2B obtidas para o controle do conjugado da reação (C), após a incubação
com pool de soro CNI (D) e após incubação com pool de soro INF (E). Respectivamente aos
sistemas A4−rLci1A e E4−rLci2B, os histogramas individuais para a determinação do limiar de
negatividade e o percentual de partículas positivas (PPF) foram obtidos com o controle do
conjugado da reação (F e I); após a incubação com pool soro CNI (G e J) e após incubação com
pool de soro INF (H e L).
Intensidade de fluorescência FL1
SS
C
FSC
Gate
99,6%
A
SS
C
Intensidade de fluorescência FL3
E4−rLci2B
51,5%
A4−rLci1A
47,8%
B
C D E
# d
e e
ven
tos
M – A4–rLci1APPF = 0.140%
M – A4–rLci1APPF = 1.68%
M – A4–rLci1APPF = 97.1%
F G H
M – E4–rLci2BPPF = 0.648%
M – E4–rLci2BPPF = 98.3%
M – E4–rLci2BPPF = 1.40%
I J L
KER, H.G. RESULTADOS
48
De forma a conferir o melhor ponto de corte do teste LeishPlex, foi realizado o
ensaio sorológico com as amostras com exames parasitológicos negativos e positivos
do grupo CNI e subconjunto INF respectivamente, tomando-se em consideração os
pontos de corte arbitrários de PPF≥20, PPF≥30, PPF≥40, PPF≥50 e PPF≥60 (Figura
20A). Visto que o LeishPlex trata-se de um teste que usa de dois sistemas antigênicos
para o diagnóstico de uma única doença, o cálculo do ponto de corte foi determinado
em função da média (Ȳ) dos valores de PPF obtida para cada amostra nos sistemas
A4−rLci1A e E4−rLci1A. A curva ROC para o teste LeishPlex (Figuras 20B), revelou
acurácia de 98,6% (AUC = 0,986) para todas condições de ponto de corte, o que
correspondeu a especificidade de 100,0% e a sensibilidade de 97.1%.
Figura 20: Obtenção do ponto de corte empregando o teste LeishPlex. (A) Reatividade das
amostras de cães do grupo controle não infectado (CNI = ) e do subconjunto de cães infectados
(INF = ) nas diluições de 1:1.600 do soro e 1:4.000 do anticorpo conjugado com isotiocianato
de fluoresceína (FITC). Os resultados estão expressos como média (Ȳ) do percentual de
partículas fluorescentes (PPF) dos sistemas A4−rLci1A e E4−rLci2B. (B) Curvas ROC
construídas a partir da representação gráfica da sensibilidade (verdadeiro-positivo) no eixo
vertical, e o complemento da especificidade (taxa de falso-positivo) no eixo horizontal. Os
resultados estão determinados pela área sob a curva (AUC).
Os resultados evidenciam que todos os pontos de corte traçados (PPF≥20,
PPF≥30, PPF≥40, PPF≥50 e PPF≥60) podem conferir uma elevada acurácia diagnóstica
ao novo teste por citometria de fluxo. Visto que os ensaios do teste LeishPlex foram
realizados nas mesmas condições experimentais verificadas nos sistemas antigênicos
A4−rLci1A e E4−rLci2B testados individualmente, e considerando que o ponto de corte
de PPF≥40 também apresentou-se como um ótimo ponto discriminatório (AUC=0.986),
optou-se por sustentar o ponto de corte de PPF≥40 para a classificação dos resultados.
Todavia, vale aqui salientar, que por tratar-se de um teste que usa de dois sistemas
antigênicos para o diagnóstico de uma única doença, o resultado final foi tratado sob o
seguinte critério:
0 20 40 60 80 100
AUC = 0,986
0
20
40
60
80
100
100 - Especificidade
Se
ns
ibil
ida
de
BA
(Ȳ)
PP
F
0
20
40
60
80
100
CNI INF
100.0%
97.1%
PPF ≥ 20
PPF ≥ 30
PPF ≥ 40
PPF ≥ 50
PPF ≥ 60
KER, H.G. RESULTADOS
49
─ O resultado do teste LeishPlex foi considerado positivo quando pelo menos
um dos sistemas antigênicos exibiu PPF≥40, e somando-se a isso, se o resultado da
média do PPF dos dois sistemas antigênicos foi maior do que 40.
A Figura 21 ilustra o desempenho diagnóstico teste LeishPlex, e os resultados
foram apresentados em função da média (Ȳ) dos valores de PPF. O novo teste foi capaz
de discriminar 100,0% (30/30) dos cães CNI como negativos, enquanto que nas
amostras do subconjunto INF, 95.0% (57/60) foram consideradas positivas (Figura 21A).
A divisão do subconjunto INF de acordo com a forma clínica do animal revelou que e
85,0% (17/20) do grupo de cães assintomáticos, e 100,0% (20/20) dos cães
oligossintomático e sintomáticos obtiveram resultados positivos (Figura 21B). No grupo
de cães infectados com outros patógenos caninos, observam-se resultados negativos
em 100,0% (10/10) das amostras de L. braziliensis, 70,0% (7/10) nas de E. canis, e
60,0% (6/10) em B. canis (Figura 21C). O grupo de cães vacinados mostrou resultados
negativos em 100,0% (10/10) das amostras de cães imunizados com Leish-Tec®,
Leishmune® e LBSap (Figura 21D).
Figura 21: Avaliação do desempenho do teste LeishPlex em ensaio sorológico por citometria de
fluxo no diagnóstico da LVC. Através do perfil de dispersão individual de cada amostra, e
considerando o ponto de corte de PPF≥40, os resultados foram obtidos empregando a diluição
padronizadas dos soros de 1:1.600 e do conjugado de 1:4.000. (A) Controle não infectado
(CNI = ) e cães infectados (INF = ) portadores de diferentes formas clínicas; (B) Cães do grupo
INF divididos de acordo com a classificação clínica da doença em: cães assintomáticos (CA = ),
cães oligosintomáticos (CO = ) e cães sintomáticos (CS = ); (C) Cães infectados com outros
patógenos caninos: L. braziliensis ( ), Ehrlichia canis ( ) e Babesia canis ( ); (D) Cães vacinados
contra a LVC: Leish-Tec® ( ), Leishmune® ( ) e LBSap ( ).
CA CO CS
0
20
40
60
80
100
ῩP
PF
B C D
L. braziliensis E. canis B. canis Leish-Tec® Leishmune® LBSap
ῩP
PF
0
20
40
60
80
100
100.0%
95.0%
100.0% 70.0% 60.0% 100.0% 100.0% 100.0%
100.0% 100.0%85.0%
KER, H.G. RESULTADOS
50
No que diz respeito aos resultados da avaliação exploratória do teste LeishPlex,
vale destacar o ganho substancial de especificidade, evidenciando uma menor
proporção (nos grupos do controle de reação cruzada), ou mesmo eliminação de
resultados errôneos (nos grupos do controle vacinado). Na Tabela 6 estão
representados os resultados dos índices de desempenho expressos em porcentagem.
Foram observados valores de sensibilidade de 95.0%, especificidade de 92.2%, e a
proporção geral de acertos medidos pela acurácia alcançou 93.3%, remetendo a um
desempenho superior àquele anteriormente mostrado pela avaliação individual dos
sistemas antigênicos A4−rLci1A e E4−rLci2B.
Tabela 6: Desempenho do teste LeishPlex no diagnóstico da LVC
Teste Sensibilidade
(IC 95%) Especificidade
(IC 95%) Acurácia (IC 95%)
LeishPlex 95,0%
(86,3−98,3) 92,2%
(84,9−96,2) 93,3%
(88,2−96,3)
IC, intervalo de confiança
A Tabela 7 ilustra os resultados dos valores preditivos calculados em diferentes
cenários de prevalência da LVC. Levando em consideração a prevalência da doença
obtida na soroteca deste estudo (40%), os VPPs indicam que a probabilidade de um cão
com teste positivo realmente apresente a doença é de 89.0%. Já os VPNs sinalizam
que a probabilidade de um cão com teste negativo não ter a doença é de 96.5%.
Tabela 7: Valores preditivos negativo (VPNs) e positivo (VPPs) da análise do teste por citometria
de fluxo LeishPlex em diferentes cenários artificiais de prevalência
Probabilidade Pré-Teste
LeishPlex
VPP VPN
40%* 89,0% 96,5%
35% 86,8% 97,1%
30% 83,9% 97,7%
25% 80,2% 98,2%
20% 75,3% 98,6%
15% 68,2% 99,0%
10% 57,5% 99,4%
5% 39,0% 99,7%
VPP, valor preditivo positivo; VPN, valor preditivo negativo; * Prevalência deste estudo.
Juntamente com a Tabela 7, a figura 22 ajuda a melhor visualizar e interpretar
as considerações sobre os valores preditivos em diferentes cenários de prevalência da
KER, H.G. RESULTADOS
51
LVC. Assim, assumindo quaisquer prevalência entre 5% e 40%, a probabilidade de um
cão com teste positivo pelo LeishPlex apresentar a doença encontra-se entre 39,0% a
89,0%. Por outro lado, o valor preditivo negativo (VPN) que indica a probabilidade de
um cão com teste negativo realmente não ter a doença encontra-se entre
aproximadamente 96,5% e 99,7%.
Figura 22: Análise dos valores preditivos em cenários artificiais da doença utilizando o teste
LeishPlex: Valores Preditivos Positivos ( ) e Valores Preditivos Negativos ( ). O retângulo
cinza considera o intervalo de probabilidade pré-teste (prevalência) entre 5% e 40%.
Após as análises de desempenho expressas em porcentagem, foi também
analisado os indicadores expressos em chance, as razões de verossimilhança (RVs)
(Tabela 8). O uso do LeishPlex proporciona um diagnóstico seguro, visto que a elevada
RV Positiva (12.2) indica que um resultado positivo é mais provável de ser verdadeiro
positivo do que falso-positivo. Além disso e RV Negativa bem próxima do valor 0 (0.054)
sugere que um resultado negativo é mais provável de ser um verdadeiro negativo do
que um falso-negativo.
Tabela 8: Razões de verossimilhança (RVs) e probabilidade pós teste.
Teste RV+ (IC 95%) RV− (IC 95%)
LeishPlex 12,2 (9,21 – 16,2) 0,054 (0,028 – 0,104)
IC, intervalo de confiança; RV+, Razão de Verossimilhança Positiva; RV−, Razão de
Verossimilhança Negativa
1 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
0
20
40
60
80
100
Prevalência
Va
lore
s p
red
itiv
os
KER, H.G. RESULTADOS
52
7.4. Avaliação comparativa entre os testes sorológicos LeishPlex,
LeishFlow, DPP, ELISA e RIFI
O índice Kappa mostrou concordância classificada como “excelente” entre o
LeishPlex e LeishFlow, assim como entre o LeishPlex e o DPP. Uma concordância
classificada como “boa” foi observada entre os pares LeishPlex e ELISA e LeishPlex e
RIFI (Tabela 9).
Tabela 9: Avaliação da concordância entre as metodologias sorológicas.
Teste LeishPlex
Kappa (IC 95%) Concordância Positivo Negativo Total
LeishFlow
Positivo 56 03 59
0,86 (0,78−0,94) 93,3% Negativo 08 83 91
Total 64 86 150
DPP
Positivo 57 17 74
0,89 (0,82−0,96) 94,7% Negativo 07 69 76
Total 64 86 150
ELISA
Positivo 59 20 79
0,68 (0,56−0,80) 84,0% Negativo 05 66 71
Total 64 86 150
RIFI
Positivo 57 01 58
0,67 (0,55−0,79) 83,3% Negativo 07 85 92
Total 64 86 150
KER, H.G. DISCUSSÃO
53
8. DISCUSSÃO
A LV tem se espalhado para muitos centros urbanos do Brasil, assim como é
atualmente observado em diversas partes do mundo. Especialmente em nosso país, os
cães são considerados o principal reservatório da LV e a detecção e eutanásia de cães
sorologicamente positivos é uma das medidas de controle da LV. Visto a crescente
discussão no que diz respeito a eutanásia de animais de companhia, torna-se cada vez
mais complexo a sustentação desta medida em campanhas de controle. Neste contexto
é fundamental prezar pela elevada especificidade diagnóstica visando evitar a remoção
errônea de cães não infectados. Por outro lado, dada a importância em se reduzir o
número de cães infectados expostos como reservatórios nas áreas endêmicas, torna-
se oportuno privilegiar elevada sensibilidade do teste diagnóstico, de forma a restringir
a expansão do ciclo de transmissão. Diante deste cenário, o atual panorama para o
controle seguro e eficaz da LVC demanda a disponibilização de testes de diagnóstico
que apresentem uma elevada acurácia.
Neste sentido, este trabalho buscou atender às atuais necessidades do sistema
de diagnóstico e controle da LVC no Brasil. Amparando-se em um amplo espectro de
soros caninos, inicialmente se buscou apurar os acertos e esclarecer os possíveis
desacertos referentes à especificidade dos testes recomendados pelo Ministério da
Saúde (DPP, ELISA e RIFI). Posteriormente, os esforços foram concentrados no
desenvolvimento e avaliação de testes sorológicos por citometria de fluxo,
nomeadamente LeishFlow e LeishPlex.
Em relação à primeira parte deste estudo, compreendida pela avaliação da
especificidade dos testes recomendados pelo Ministério da Saúde, os dados revelaram
especificidade de 99,4%, 89,9% e 72,5% respectivamente ao DPP, ELISA e RIFI. Assim,
a implementação do DPP de fato apresenta-se como um impacto positivo sobre a
acurácia diagnóstica, contribuindo com elevada especificidade. Cabe aqui ressaltar, que
o teste rápido DPP foi capaz de evitar potenciais resultados falso-positivos tanto nas
amostras de animais infectados com outros patógenos caninos, assim como em cães
vacinados com os imunoprofiláticos Leishmune®, Leish-Tec® e LBSap.
Em relação às reações cruzadas com anticorpos decorrentes de outras
infecções caninas, poucos estudos empregando o DPP foram realizados com este foco
(Laurenti et al., 2014). No presente trabalho, apenas uma amostra de E. canis
apresentou um potencial resultado falso-positivo e, mesmo assim, esta amostra também
foi positivo em RIFI, sugerindo tratar-se de um caso falso-negativo. Vale destacar que o
DPP não apresentou resultados falsos-positivos potenciais em soros de L. braziliensis,
T. cruzi, e B. canis. No entanto, em estudos anteriores, um pequeno número de reações
KER, H.G. DISCUSSÃO
54
cruzadas foi encontrado em amostras de cães infectados por L. braziliensis e B. canis
(Grimaldi et al., 2012; Laurenti et al., 2014). Diante desses fatos, podemos verificar que
DPP vem contribuindo no sentido de evitar a eutanásia equivocada em áreas onde L.
infantum pode ser co-endêmica a outras infecções caninas.
Por outro lado, os testes de ELISA e RIFI mostraram um elevado número de
reações cruzadas T. cruzi e L. braziliensis. Resultados semelhantes obtidos pelos testes
sorológicos oficiais ELISA e RIFI já foram demonstrados em estudos anteriores (Ferreira
et al., 2007; Laurenti et al., 2014). Inclusive, o estudo de Ferreira et al. (2007) também
demonstra a ocorrência de 100,0% de reatividade cruzada obtida pela RIFI em amostras
de cães infectados pelo T. cruzi. Além disso, os testes de ELISA e RIFI também
apresentaram potenciais resultados falso-positivos considerando infecções por E. canis
e B. canis em outros estudos (Lira et al., 2006; Ferreira et al., 2007; Laurenti et al., 2014).
Assim, de acordo com as pesquisas anteriores, e de acordo com os dados obtidos neste
trabalho, reitera-se a necessidade de atenção quanto à baixa especificidade destes
testes em animais infectados com outros patógenos caninos, mas o destaque especial,
neste caso, deve-se à sorologia por ELISA, que ainda é um ensaio empregado nas
campanhas de controle do Brasil.
Como uma parte importante deste estudo dos métodos sorológicos oficialmente
empregados em campanhas de controle no Brasil, foi também investigado a
possibilidade de soroconversão desencadeada pela imunização profilática utilizando
três diferentes vacinas contra a LVC. Em resumo, o DPP foi o único que não apresentou
potenciais resultados falso-positivos nas três vacinas, ao passo que, os testes por ELISA
e RIFI, demonstraram potenciais resultados falso-positivos em ambos testes nas
diferentes amostras de soros de cães imunizados com Leishmune®, Leish-Tec® e
LBSap.
De fato, a possibilidade do DPP apresentar resultados potencialmente falso-
positivos em amostras de soro de cães vacinados é mínima, e foi comprovada por outros
estudos recentes (Marcondes et al., 2013; Testasicca et al., 2014; Ribeiro et al., 2015).
No entanto, para melhor entender os resultados falso-positivos potenciais determinados
pelos testes ELISA e RIFI, algumas considerações importantes devem ser feitas. Em
primeiro lugar, deve-se recordar sobre a natureza dos antígenos vacinais. Assim,
observa-se que a Leishmune® é composta por uma proteína purificada (Ligante de
Fucose e Manose – FML) da superfície de L. donovani, a Leish-Tec® é composta por
uma proteína recombinante (A2) específica às formas amastigotas de L. donovani, e a
LBSap por uma preparação de antígeno (heterólogo) solúvel de L. braziliensis.
Adicionalmente, a composição antigênica dos testes sorológicos ELISA e RIFI também
é importante nesta interpretação. Estes testes usam de antígenos brutos de
KER, H.G. DISCUSSÃO
55
promastigotas de L. major em suas composições, buscando assim anticorpos IgG
gênero-específico o que certamente aumenta a sensibilidade podendo então levar a
resultados falso-positivos.
Diante deste panorama, torna-se razoável especular que resultados
potencialmente falso-positivos seriam mais cabíveis pela vacinação com Leishmune® e
principalmente pela LBSap. No primeiro caso, apesar do antígeno vacinal ser derivado
de L. donovani e antígeno dos testes diagnósticos provenientes de L. major, devido a
similaridade genética entre estes parasitos, não poderia ser descartado que alguma
porção dos anticorpos anti-FML sejam capazes de reconhecer determinados epítopos
na superfície dos antígenos de L. major-like (suporte antigênico empregado nas técnicas
de ELISA e IFAT) pela Biomanguinhos (FIOCRUZ, RJ). No caso da LBSap, o
reconhecimento de anticorpos produzidos após a vacinação pelos antígenos de L. major
dos testes sorológicos seria ainda mais esperado, visto que tratam-se de parasitos do
mesmo gênero cuja complexidade genômica e proteômica parecem ser muito
semelhantes.
Neste contexto, diante da análise dos trabalhos que buscaram verificar a
possibilidade de soroconversão pela vacinação anti-LVC através dos testes sorológicos
oficiais ELISA e RIFI, é notório que a vacinação por Leishmune® gerou um considerável
número de resultados potencialmente falso-positivos (Marcondes et al., 2013; Ribeiro et
al., 2015). Apesar de uma fonte escassa de investigações sobre a soroconversão por
Leish-Tec® verificada pela sorologia oficial, o estudo de Coelho et al. (2009) mostrou
ausência de resultados potencialmente falso-positivos por meio de um ensaio de ELISA
empregando antígeno bruto de L. infantum. Por outro lado, no presente trabalho, o cão
reativo pelo teste oficial de ELISA (EIE-LVC®) também foi reativo pela RIFI (IFI-LVC®),
fortalecendo a conjectura de que o antígeno de L. major-like empregado nos testes
oficiais podem eventualmente inferir um resultado falso-positivo em cães vacinados com
Leish-Tec®.
Até o presente momento, a especificidade dos testes serológicos oficiais
brasileiros era abordada em um número restrito de amostras de cães com outras
infecções caninas e, somando-se a isso, a questão da vacinação/soroconversão não
havia sido amplamente abordada e compreendida frente diferentes imunoprofiláticos.
Desta forma, características importantes deste estudo com os testes sorológicos oficiais
podem ser destacadas.
Apesar da RIFI ter sido removido das campanhas de controle e vigilância na
população canina, este estudo contribuiu para clarificar a importância da sua
substituição. Além disso, vale mencionar que apesar da produção e comercialização
Leishmune® estar temporariamente suspensa no Brasil (Nota Técnica
KER, H.G. DISCUSSÃO
56
038/2014/DFIP/DAS/MAPA), acreditamos que as considerações tratadas no presente
estudo podem ser úteis aos profissionais que trabalham junto ao controle e vigilância da
LVC em áreas endêmicas no Brasil. Por fim, considerando que o DPP é atualmente
aplicado para o rastreamento de cães infectados e o ELISA para a confirmação dos
casos, a possibilidade de ocorrência da eutanásia de cães de forma indevida tornou-se
minimizada frente a estratégia anterior que empregava ELISA e RIFI. Ou seja, apesar
da sorologia por ELISA proporcionar um número considerável de resultados falso-
positivos em cães infectados com outros patógenos, ou vacinados contra LVC, estas
amostras seriam em sua maioria evitadas após o rastreamento com o DPP.
Apesar do ganho alcançado pela implementação do DPP, vale ressaltar que
ainda há muito a ser melhorado, visto que estudos recentes mostram que o teste rápido
apresenta baixa sensibilidade na detecção de casos assintomáticos da LVC (Grimaldi
et al., 2012; Schubach et al., 2014). Diante deste fato, em primeira mão, poderia ser
oportuno a alteração do DPP como teste de confirmação, enquanto que a ELISA
passaria a ser novamente utilizada no rastreamento. Entretanto, já é sabido que a
alternação dos testes de rastreamento/confirmação (DPP/ELISA ─ ELISA/DPP) não
afeta a taxa de prevalência da doença e, portanto, o número de animais a ser eliminado
pelo Programa de Controle seria o mesmo independente da sequência dos testes
(Coura-Vital et al.,2014). Além disso, o remanejo do teste de ELISA para o rastreio de
amostras poderia perpetuar a carência relacionada à detecção dos animais
assintomáticos, visto que são comuns os relatos de deficiência desta metodologia na
detecção desses casos (Lira et al., 2006; Fonseca et al., 2014; Faria et al., 2015).
Assim sendo, a procura por novas metodologias que atendam à evidente
necessidade de um acréscimo em sensibilidade, principalmente relativos aos casos
assintomáticos, é ainda crucial para o Programa de Controle. É importante ressaltar que
apesar da necessidade de um teste com superior sensibilidade, este não pode ocorrer
em detrimento da especificidade, uma vez que o DPP não ausenta por completo a
possibilidade de resultados falso-positivos.
A proposição de inovações metodológicas empregando citometria de fluxo (CF)
constituem uma tendência mundial para o desenvolvimento de novas abordagens
diagnósticas de elevado desempenho. Tal tecnologia utiliza um sistema de leitura a
laser, que viabiliza um aumento substancial na capacidade de detecção de
biomoléculas, conferindo uma sensibilidade superior aos ensaios. Adicionalmente, o
sistema de leitura a laser permite o uso de microdiluições da amostra, favorecendo um
ganho em especificidade. As tecnologias por CF foram recentemente apontadas como
uma conquista no âmbito do diagnóstico sorológico de infecções por L. infantum (Paiva-
Cavalcanti et al., 2015).
KER, H.G. DISCUSSÃO
57
Tanto na Europa quanto no Brasil, no caso da sorologia por CF para LVC,
podemos tratar sobre o desenvolvimento dos novos testes por CF sob duas categorias.
Uma primeira geração de testes que se baseia no emprego de formas íntegras do
parasito L. infantum como matriz antigênica, e uma segunda geração que se caracteriza
pelo emprego de microesferas acopladas a antígenos recombinantes.
O teste sorológico por CF para diagnóstico da LVC de primeira geração na
Europa foi desenvolvido por um grupo de pesquisadores de Portugal e Espanha, e se
baseia no uso de formas amastigotas de L. infantum como matriz antigênica (Silvestre
et al., 2008). Esta técnica mostrou sensibilidade de 96.0% e especificidade de 93.2%
em um ensaio que avaliou tanto cães sintomáticos quanto os assintomáticos.
Por sua vez, foi no Brasil e por nosso grupo de pesquisa que os testes por CF
de primeira geração foram desenvolvidos e propostos. Estes ensaios de sorologia por
citometria de fluxo se caracterizam pelo uso de promastigotas fixadas de L. infantum
como matriz antigênica do teste (Carvalho-Neta et al., 2006; Andrade et al., 2007;
Andrade et al., 2009; Ker et al., 2013a; Ker et al., 2013b). Em relação à tecnologia
Europeia, o uso de formas promastigotas íntegras e fixadas é vantajoso devido a maior
facilidade de obtenção dos antígenos para execução do teste. Além disso, sobre o
desempenho diagnóstico, o uso de promastigotas como matriz antigênica do teste
favorece sensibilidade e especificidade iguais ou superiores a 95.0% (Carvalho-Neta et
al., 2006; Andrade et al., 2007; Ker et al., 2013b). No entanto, um capítulo à parte que
representa um considerável ganho biotecnológico dos testes por CF que empregam
promastigotas de L. infatum diz respeito à padronização da preparação da matriz
antigênica descrita em Ker et al. (2013a). Com os resultados obtidos nesse trabalho
através da investigação dos aspectos morfológicos, microbiológicos e de reatividade
sorológica da preparação antigênica, assegurou-se a estabilidade dos antígenos por 12
meses, viabilizando o emprego em larga escala do teste que hoje denomina-se
LeishFlow.
O teste LeishFlow despontou-se como uma promissora metodologia diagnóstica
que, mesmo utilizando uma matriz antigênica composta por antígenos totais
(promastigotas integras) de L. infantum, proporcionou uma reatividade cruzada mínima
com amostras de cães infectados por outros patógenos caninos, e confirmou uma
habilidade anteriormente destacada por Andrade et al. (2009), e certificada por Ker et
al. (2013b), que trata da discriminação da soroconversão vacinal. O teste LeishFlow
mostrou completa ausência de resultados falso-positivos em cães vacinados com
Leishmune®, Leish-Tec® e LBSap. Estas verificações permitiram a consolidação do
protótipo de kit de diagnóstico (Figura 23).
KER, H.G. DISCUSSÃO
58
Figura 23: Protótipo do teste sorológico LeishFlow desenvolvido e exibido no encontro Grand
Challenges in Global Health 2013 organizado pela Bill & Melinda Gates Foundation em parceria
com o Ministério da Saúde do Brasil.
Diante dos resultados conferidos pela sorologia por CF na Europa (Silvestre et
al,, 2008), e pelos avanços alcançados com a proposta do LeishFlow no Brasil (Ker et
al., 2013a), tornou-se um estímulo ainda maior seguir na busca pelo aprimoramento
biotecnológico da sorologia por CF aplicada ao diagnóstico da LVC.
O início da segunda geração de testes se deu em um trabalho pioneiro realizado
por um grupo de pesquisadores de Portugal em associação com pesquisadores do
nosso grupo de pesquisa. O trabalho de Sousa et al. (2013), pela primeira vez mostrou
a construção de um teste sorológico do tipo multiplex por CF. Foram empregadas
microesferas poliméricas magnéticas revestidas com o antígeno clássico rK39 e com
uma proteína recombinante de L. infantum, a enzima citosólica triparedoxina peroxidase
(LicTXNPx) descrita por Cordeiro-da-Silva et al. (2003), e avaliada no contexto de
diagnóstico da LVC por Santarém et al. (2010) que empregaram a técnica de ELISA. A
combinação dos antígenos rK39 e LicTXNPx em um estudo clínico por CF demonstrou
uma sensibilidade de 98.8% com uma especificidade de 94.4% (Sousa et al., 2013).
Apesar do notável desempenho diagnóstico obtido, o uso de microesferas magnéticas
requer placas de ensaio sorológicas específicas, que aumentam consideravelmente o
custo, e podem inviabilizar a aplicação deste teste em larga.
Não obstante a este obstáculo, para aprofundar as investigações sorológicas
multiplex, é importante observar que o mercado de insumos biotecnológicos oferece
uma ampla variedade de modelos de microesferas e inclui diversas empresas que
disponibilizam microesferas poliméricas que se distinguem por meio de características
físico-químicas, tais como, a propriedade do polímero, o tamanho da microesfera, a
fluorescência, bem como pelo revestimento da superfície por variados grupos químicos
que permitem a ligação específica de certos analitos.
Há aproximadamente uma década os ensaios multiplex por CF através da
tecnologia CBA constituem uma realidade seja na pesquisa científica, seja como na
prática da rotina clínica de diversas doenças. Segundo Morgan et al. (2004), esta nova
KER, H.G. DISCUSSÃO
59
tecnologia possui como principais vantagens: (I) a avaliação de vários analitos numa
única amostra; (II) a requisição de pequeno volume da amostra para a realização dos
ensaios; (III) a reprodutibilidade dos ensaios; (IV) a comparabilidade com ensaios
existentes; (V) e a rápida avaliação de uma amostra por múltiplos componentes
analíticos em uma plataforma de ensaio único.
Inicialmente estudou-se o perfil individual de cada sistema antigênico
microesfera−proteína para, a partir de então, definir os possíveis candidatos à
combinação e consequente constituição do ensaio multiplex, batizado por nós de
LeishPlex. Os sistemas antigênicos montados foram compostos por antígenos
recombinantes já bem caracterizados previamente e que, por características
intrínsecas, apresentaram alguma propriedade ressaltante aplicada a construção de
novas plataformas de testes para o diagnóstico sorológico da LVC.
As proteínas multiepítopos C1 e PQ20 foram selecionadas sob a ótica de que
poderiam representar um antígeno potente para a detecção de casos assintomáticos da
LVC como demonstradas anteriormente ao serem empregados em ELISA (Fonseca et
al., 2014; Faria et al., 2015). Ainda não se sabe ao certo o que pode ter levado à não
funcionalidade dos sistemas antigênicos com estas proteínas, mas é possível ponderar
sobre duas pressuposições.
Uma delas cai sobre uma possível incompatibilidade no arranjo espacial das
proteínas C1 e PQ20. Após a ligação às microesferas, poderia ser inviabilizado a
exposição de alguns epítopos fundamentais no reconhecimento de anticorpos e assim
comprometer a adequada diferenciação entre o pool de soros CNI e INF.
Outro pressuposto, e provavelmente o mais provável, remete a questões
bioquímicas. Visto que a carga elétrica de uma proteína pode variar em função do pH o
qual se encontra solubilizada, e que o grupo sulfidrila encontrado na superfície das
microesferas tem caráter ácido (carga elétrica positiva), torna-se racional efetuar a
solubilização da proteína de tal maneira que proporcione uma carga líquida negativa na
molécula. Ou seja, para atingir esta condição eletronegativa, as proteínas devem ser
solubilizadas em pH acima do seu ponto isoelétrico (PI).
Diante disso, levando-se em consideração que as proteínas C1 e PQ20
apresentam PI entre 9,0 e 9,5, a solubilização destas proteínas deveriam ocorrer em pH
acima de 9,5 para a constituição de uma carga líquida negativa favorável à ligação das
proteínas ao grupo sulfidrila da microesfera. Neste sentido, o pH empregado na
solubilização de todas as proteínas avaliadas neste estudo (pH = 7.9) pode ter sido um
importante motivo para não funcionalidade dos sistemas antigênicos E7−C1 e
C6−PQ20, o que nos permite hipotetizar que uma adequação sutil no protocolo de
acoplamento poderia assegurar o funcionamento destes dois sistemas. Por fim, vale
KER, H.G. DISCUSSÃO
60
aqui salientar que o fortalecimento do presente trabalho passa pelo desenvolvimento de
uma proposta emoldurada às atuais necessidades do diagnóstico sorológico, da qual a
identificação dos cães assintomáticos é fundamental. Assim, a continuidade dos
estudos com os antígenos C1 e PQ20 ainda permanece como pretensão deste trabalho.
Portanto, o seguimento das investigações para construção de sistemas
antigênicos microesfera−proteína funcionais focalizou as proteínas recombinantes
rLci1A e rLci2B. Estes antígenos foram qualificados para o presente trabalho diante dos
resultados promissores evidenciados em testes por ELISA (Oliveira et al., 2011; Souza
et al., 2012), bem como por um teste rápido baseado na mesma tecnologia do DPP
(Fraga et al., 2014).
Tanto rLci1A quanto rLci2B, conferiram sistemas antigênicos
microesfera−proteína funcionais. Vale aqui observar que o PI das duas proteínas são
próximos do valor 6.0 e, portanto, a solubilização em pH de 7,9 mostrou-se apropriada
para o estabelecimento de uma carga elétrica líquida negativa favorável ao acoplamento
e consequentemente a funcionalidade dos sistemas.
Quanto a etapa inicial de determinação das condições ideais para reação
sorológica, o critério utilizado para tal decisão seguiu os mesmos preceitos
estabelecidos por Ker et al. (2013a). Diante desse critério, a titulação do soro de 1:1.600
e do conjugado de 1:4.000 mostraram-se adequadas para a sorologia empregando o
sistemas A4−rLci1A assim como o E4−rLci2B. Este fato se mostrou bastante
interessante para constituição de uma tecnologia multiplex, visto que, neste caso, os
dois sistemas poderiam ser combinados em um ensaio único.
No entanto, se fossem considerados cada sistema antigênico individualmente, e
mantendo-se a mesma diluição do soro em 1:1.600, o sistema A4−rLci1A poderia ser
também testado na diluição do conjugado em 1:2.000, enquanto que o E4−rLci2B
poderia ser testado na diluição de 1:8.000 do mesmo. Estas observações poderiam
possivelmente determinar alguma diferença no desempenho diagnóstico individual dos
sistemas A4−rLci1A e E4−rLci2B. Apesar disso, visto que a hipótese deste trabalho se
pauta na combinação de antígenos recombinantes em um ensaio multiplex por CF, a
verificação destas alternativas para a reação sorológica a princípio não foi investigada
no presente trabalho. Contudo, é de extrema importância reforçar que os resultados
obtidos pelas curvas de titulação evidenciam uma vantajosa flexibilidade dos sistemas
A4−rLci1A e E4−rLci2B para a combinação com outros sistemas antigênicos que por
ventura possam ser incorporados em testes multiplex futuros.
A fase seguinte do desenvolvimento tratou da determinação do ponto de corte
dos sistemas antigênicos A4−rLci1A e E4−rLci2B. É interessante aqui destacar que
quando se deseja realizar um diagnóstico qualquer, e o resultado deve ser apresentado
KER, H.G. DISCUSSÃO
61
por sentenças dicotômicas do tipo "positivo-negativo", há de se ter a consciência de que
existirão variadas formas de sentenciar sobre isto. O presente trabalho delineou a sua
sentença em um ponto discriminatório dentro de uma variável contínua, o PPF. A
determinação deste ponto discriminatório, ou ponto de corte, seguiu o preceito de
proporcionar uma máxima precisão dessas sentenças.
Dada esta condição, a certificação do melhor ponto de corte foi realizada em um
ensaio sorológico com amostras comprovadamente positivas ou negativas por exames
parasitológicos. Assim, o ponto de corte de PPF≥40 foi o primeiro ponto a atingir
especificidade de 100,0% mantendo-se o valor máximo da sensibilidade (97,0%), o que
promoveu um elevado valor de acurácia (AUC = 0,986) em ambos os sistemas
antigênicos. Entretanto, apesar deste resultado claramente indicar que os sistemas
A4−rLci1A e E4−rLci2B podem constituir um teste de diagnóstico de elevada acurácia,
a avaliação individual dos sistemas antigênicos em uma ampla variedade de amostras
de soros torna-se fundamental para o entendimento do valor diagnóstico de um teste.
A avaliação do sistema antigênico A4−rLci1A revelou uma sensibilidade de
91,7%, especificidade de 74,4% e acurácia de 81,3%. Esses resultados são bem
semelhantes aos obtidos em um ensaio por ELISA com este mesmo antígeno, que
mostrou sensibilidade de 93,0%, especificidade de 76,1% e acurácia de 84,3% (Oliveira
et al., 2011). Em relação a outros estudos que também avaliaram o antígeno rLci1A, os
resultados encontrados no presente estudo mostraram-se semelhantes ao que foi obtido
por ELISA – que alcançou 96,0% (Souza et al., 2012), e superior ao relatado em ensaio
DPP – que atingiu os 75,3% (Fraga et al., 2014). Adicionalmente, a especificidade do
sistema A4−rLci1A foi inferior à alcançada por ensaio do tipo ELISA – de 92,0% (Souza
et al., 2012), e também em ensaio DPP – que atingiu os 100,0% (Fraga et al., 2014).
Diante dos valores de sensibilidade relacionados ao antígeno rLci1A obtidos por
diferentes metodologias sorológicas, pode-se inferir que o ensaio por CF utilizando o
sistema A4−rLci1A mostrou um desempenho satisfatório. Por sua vez, o valor reduzido
da especificidade obtida no presente trabalho, pode ser atribuído essencialmente à
reatividade cruzada com amostras de E. canis e B. canis. Vale lembrar que apesar do
sistema antigênico A4−rLci1A mostrar alguns resultados falso-positivos em amostras de
cães vacinados, a reatividade dessas respectivas amostras mostraram-se mais
próximas ao ponto de corte estabelecido. Além disso, é possível verificar que a
reatividade média do grupo vacinado encontrou-se abaixo do ponto de corte PPF≥40.
Do outro lado, nos grupos E. canis e B. canis, verificou-se maior reatividade das
amostras potencialmente falso-positivas e, assim, a média de reatividade dos
respectivos grupos ficou um pouco acima do ponto de corte.
KER, H.G. DISCUSSÃO
62
A variação da especificidade do antígeno rLci1A pode ser explicada com base
na organização genética do locus da proteína hsp70, que é uma região bem conservada
entre as espécies de Leishmania (com exceção de L. braziliensis), mas que também
evidencia algum grau de conservação de sequências com a proteína homóloga de
outros protozoários, dentre eles, parasitos do gênero Trypanossoma e Babesia (Quijada
et al., 1996a; Quijada et al., 1996b; Folgueira et al., 2007). Não há estudos na literatura
que comprovam algum grau de similaridade genética entre L. infantum e parasitos do
gênero Ehrlichia. Diante deste panorama, a especificidade do sistema A4−rLci1A
mostrou-se coerente frente as possíveis relações de similaridade genética. Por esta
razão, acredita-se que o resultado observado no presente estudo, assim como notado
em Oliveira et al., (2011), pode ter sido inferior ao constatado por outros trabalhos,
provavelmente devido à pureza do antígeno empregado nos ensaios. Além disso, vale
aqui ressaltar, que nossos resultados confirmam a especificidade do antígeno frente à
infecção por L. braziliensis.
Em relação ao sistema antigênico E4−rLci2B, foi constatado uma sensibilidade
de 95,0%, especificidade de 83,3% gerando uma proporção geral de acertos medida
pela acurácia de 88,0%. Por um breve comparativo sobre a sensibilidade e
especificidade do antígeno rLci2B, observa-se uma certa variação dentre os estudos
que aplicaram este antígeno em ensaios sorológicos distintos. Enquanto que em Oliveira
et al. (2011) e Fraga et al. (2014), os valores observados foram respectivamente de
83,7% e 82,5%, a sensibilidade alcançada no presente estudo esteve mais próxima dos
achados de Souza et al. (2012), que mostrou um valor de 100.0%. Por outro lado, a
especificidade do sistema E4−rLci2B mostrou-se semelhante à observada por Oliveira
et al. (2011) que correspondeu a 84,8%, e inferior ao encontrado nos demais estudos
de Souza et al. (2012) e Fraga et al. (2014), que atingiram 93,0% e 100,0%
respectivamente.
É sabido que os ensaios sorológicos que utilizam o antígeno K39, do qual o
rLci2B é homólogo, proporcionam elevados valores de sensibilidade quando o cão
apresenta sinais clínicos da LVC, mas que pode às vezes ser falho nos casos de cães
assintomáticos (Quinnell et al., 2013). Portanto as variações da sensibilidade
observadas nos diferentes estudos sobre rLci2B pode ser atribuída à proporção de
animais assintomáticos empregadas nos ensaios. Independente disso, o ensaio
sorológico por CF utilizando o sistema antigênico E4−rLci2B mostrou poucas falhas de
detecção, e estas ocorreram essencialmente em poucas amostras de animais
assintomáticos. Por fim, vale aqui destacar que o uso da CF proporcionou maior
sensibilidade do que outras metodologias que utilizaram o K39 (Mettler et al., 2005;
Porrozzi et al., 2007; Lemos et al., 2008).
KER, H.G. DISCUSSÃO
63
O antígeno K39 é caracterizado por apresentar elevada especificidade (Mettler
et al., 2005; Porrozzi et al., 2007; Lemos et al., 2008) o que também foi verificado em
estudos prévios com o homólogo rLci2B (Oliveira et al., 2011; Souza et al., 2012; Fraga
et al., 2014; Oliveira et al., 2015). Neste estudo, apesar desta premissa, o sistema
antigênico E4−rLci2B evidenciou alguns resultados falso-positivos seja em animais do
grupo CRC (L. brazilensis, B. canis e E. canis) ou do grupo VAC (Leish-Tec®,
Leishmune® e LBSap). Embora isto tenha sido observado, a grande maioria dos falso-
positivos apresentam-se de uma certa forma próximos ao ponto de corte. Assim,
ressalva-se que outros estudos seriam necessários para a confirmação destas
observações.
Os valores preditivos são indicadores utilizados para complementar a
interpretação do resultado de um teste diagnóstico. Constituem variáveis dependentes
da sensibilidade e especificidade da técnica e também da prevalência da doença ou
infecção numa determinada região. A prevalência atual da LVC no Brasil oscila, em
diferentes regiões endêmicas, basicamente entre 5 e 40% (Barata et al., 2013; Coura-
Vital et al., 2014; Lopes et al., 2014; Barbosa et al., 2015; Pimentel et al., 2015). Nessa
faixa de prevalência foi possível observar que tanto o sistema antigênico A4−rLci1A,
quanto o E4−rLci2B, apresentaram excelentes valores preditivos negativos, gerando
assim, minimização de resultados falso-negativos. Quanto aos valores preditivos
positivos, observa-se que os resultados relativos aos sistemas antigênicos A4−rLci1A e
E4−rLci2B apresentaram valores superiores ao ensaio sorológico com DPP (Schubach
et al., 2014). Entretanto, cabe aqui observar, que o presente trabalho se trata de um
estudo clínico laboratorial com amostras estudadas em diferentes trabalhos. Portanto,
para sabermos a real dimensão dos valores preditivos, são necessários a avaliação
desses sistemas antigênicos em estudos clínico epidemiológicos bem definidos,
preferencialmente multicêntricos.
Adicionalmente, a análise da razão de verossimilhança (RV) permitiu a
interpretação dos dados como uma medida de chance da presença da doença depois
de um resultado de teste diagnóstico. Visto que quanto maior a RV positiva (mais
distante de 1), e quanto menor a RV negativa (mais próximo de 0), melhor é o teste, os
resultados obtidos no presente estudo constataram que o sistema E4−rLci2B mostrou-
se superior ao A4−rLci1A. Em outras palavras, sob o uso de E4−rLci2B é mais provável
de se obter um resultado verdadeiro positivo (maior RV positiva), bem como da obtenção
de um resultado verdadeiro negativo (menor RV negativa).
Em resumo, dentre todos sistemas microesfera−proteína empregados neste
trabalho, os sistemas antigênicos A4−rLci1A e E4−rLci2B foram aqueles que
inicialmente mostraram-se apropriados para o desenvolvimento biotencológico de uma
KER, H.G. DISCUSSÃO
64
nova plataforma de diagnóstico sorológico por CF. Nestes dois sistemas as condições
padronizadas de 1:4.000 do conjugado e 1:1.600 do soro canino se mostraram
favoravelmente aplicáveis para a realização dos ensaios sorológicos, resultando em
testes com um considerável desempenho diagnóstico. Desta forma, e sob estas
condições, a combinação dos sistemas A4−rLci1A e E4−rLci2B configurou a inovação
denominada LeishPlex.
A combinação dos sistemas A4−rLci1A e E4−rLci2B determinou um elevado
desempenho no diagnóstico sorológico da LVC, com uma sensibilidade de 95,0%,
especificidade de 92,2% gerando uma proporção geral de acertos medida pela acurácia
de 93,3%. Somando-se a esses achados, verificou-se o maior valor preditivo positivo e
valor preditivo negativo considerando todo intervalo de probabilidade pré-teste de 5 a
40%. Além disso, a maior razão de verossimilhança positiva e a menor razão de
verossimilhança negativa ratificam o superior desempenho.
A relação de concordância entre todas as metodologias de diagnóstico
sorológico do presente estudo apontam que o teste LeishPlex apresentou “excelente”
concordância com os testes DPP e LeishFlow, enquanto que a concordância entre o
LeishPlex com as tradicionais ELISA e RIFI foram classificadas como “boa”.
Estes achados sugerem três pontos capitais que possivelmente se relacionam
com os valores de especificidade obtidos pelos testes sorológicos deste estudo.
Primeiramente, pode-se inferir a “excelente” concordância do LeishPlex com o DPP
devido ao uso de antígenos recombinantes como fonte antigênica do teste sorológico.
Em segundo lugar, a “excelente” concordância entre o LeishPlex e o LeishFlow pode
ser atribuída ao sistema de leitura do citômetro de fluxo, que permite o uso de uma micro
titulação dos reagentes. E por fim, concordância “boa” entre o LeishPlex e as sorologias
ELISA e RIFI deve-se à soma do uso de antígenos brutos Leishmania com o sistema de
leitura destes testes. No entanto, é importante ressalvar que o valor de Kappa depende
da prevalência da doença, e, sob esta óptica, se faz necessário a realização de um
estudo clínico epidemiológico idealmente projetado para certificar estas observações.
Baseando-se nas informações geradas no presente estudo, podemos inferir que
o teste LeishPlex formado pela combinação dos dois sistemas antigênicos permitiu a
avaliação de uma amostra por múltiplos componentes analíticos em uma plataforma de
ensaio sorológico único. Este fato conferiu um ganho de desempenho em relação ao
verificado pela avaliação individual dos sistemas, e ainda certificou a tecnologia CBA
multiplex como potente ferramenta biotecnológica para construção de novas
plataformas de diagnóstico sorológico.
No Brasil, o Plano Institucional de Indução à Ciência, Tecnologia e Inovação em
Saúde (PCTIS) da FIOCRUZ, Ministério da Saúde, foi planejado e está estruturado para
KER, H.G. DISCUSSÃO
65
contribuir com o desenvolvimento de diversos insumos para saúde, dentre eles, novas
ferramentas de diagnóstico. Com a promoção crescente da citometria de fluxo como
uma alternativa para o estabelecimento de testes sorológicos não convencionais
ultrassensíveis e com desempenho diagnóstico robusto, anseia-se que os testes
LeishFlow e LeishPlex possam integrar um novo protocolo de diagnóstico da LVC em
um futuro não muito distante.
KER, H.G. CONCLUSÕES
66
9. CONCLUSÕES
Considerando o conjunto de resultados obtidos, conclui-se que os testes
sorológicos por citometria de fluxo apresentam elevado desempenho no diagnóstico
sorológico da LVC.
No presente trabalho, empregou-se um conjunto de quatro potenciais proteínas
recombinantes, das quais duas, a princípio, se mostraram funcionais e eficazes na
criação de um teste sorológico por citometria de fluxo. Em suma, o sistema antigênico
A4−rLci1A apresentou considerável sensibilidade no diagnóstico da LVC em cães de
diferentes formas clínicas, além de especificidade marcada pela ausência de resultados
falso-positivos em cães infectados por L. braziliensis, assim como por uma moderada
proporção de resultados falso-positivos em cães vacinados. Por sua vez, o sistema
antigênico E4−rLci2B apresentou acentuada sensibilidade no diagnóstico da LVC em
cães de diferentes formas clínicas, além de especificidade marcada por uma moderada
proporção de resultados falso-positivos em cães infectados com outros patógenos
caninos, assim como em cães vacinados com imunoprofiláticos estudados no Brasil.
A combinação dos sistemas antigênicos A4−rLci1A e E4−rLci2B que originou o
teste denominado LeishPlex resultou em um ganho no desempenho diagnóstico da
sorologia por citometria de fluxo. Foi constatado uma elevada sensibilidade no
diagnóstico da LVC em cães de diferentes formas clínicas, além de especificidade
caracterizada pela ausência de resultados falso-positivos em cães infectados por L.
braziliensis, assim como em cães vacinados. Mediante estes aspectos, o LeishPlex
determinou sensibilidade de 95,0%, especificidade de 92,2% e acurácia de 93,3% em
um ensaio sorológico com uma ampla variedade de amostras.
Cabe ainda ressaltar que a inovação LeishPlex apresentou excelente
concordância com o teste por citometria de fluxo LeishFlow e com o teste convencional
DPP, e boa concordância com os tradicionais ELISA e RIFI. Desta forma, assegurou-se
que a nova metodologia apresenta potencial diagnóstico compatível com outras técnicas
já bem documentadas.
Por fim, e mediante o conjunto de dados exibidos neste trabalho, destaca-se que
a sorologia por citometria de fluxo representa um novo conceito de diagnóstico
sorológico da LVC, marcado pela promoção de elevada acurácia diagnóstica.
KER, H.G. PERPECTIVAS
67
10. PERSPECTIVAS
O conjunto de resultados alcançados prontamente abrem precedentes para novos
estudos. Dentre os possíveis desdobramentos deste trabalho, destacam-se:
Aperfeiçoar o teste LeishPlex através da funcionalização dos sistemas
microesfera−proteína E7−C1 e C6−PQ20;
Expandir os estudos para aplicação da sorologia por citometria de fluxo
LeishPlex na LV humana;
Pesquisar novos sistemas antigênicos pelo emprego de peptídeos construídos
por bioinformática a partir do genoma de L. braziliensis e L. infantum em uma
plataforma multiplex por citometria de fluxo;
Pesquisar novos sistemas antigênicos pelo emprego de proteínas
recombinantes da saliva de Lutzomyia longipalpis para avaliar a exposição ao
vetor em populações caninas e humanas;
Pesquisar novos sistemas antigênicos microesfera−proteína pelo emprego de
proteínas recombinantes de outros agentes patogênicos caninos para avaliar
coinfecções (babesiose, erlichiose, leishmanioes, toxoplasmose, e doença de
chagas canina) em áreas endêmicas da LVC;
Pesquisar novas abordagens de marcação pelo emprego de conjugados mais
sensíveis para avaliar a possibilidade de detecção de cães assintomáticos I
(PCR+/Sorologia−);
Pesquisar novas abordagens de diagnóstico por citometria de fluxo pela
construção de sistemas antigênicos de captura direta de antígenos de L.
infantum em distintas amostras biológicas;
KER, H.G. ANEXO A
68
11. ANEXOS
KER, H.G. ANEXO B
69
KER, H.G. ANEXO B
70
KER, H.G. ANEXO B
71
KER, H.G. APÊNDICE A
72
12. APÊNDICES
Title: The specificity of canine visceral leishmaniasis diagnosis in Brazil: a report of
laboratory investigation about the cross-reactivity to other canine infections and
seroconversion by vaccination
Henrique Gama Ker1,2, Wendel Coura-Vital1,2, Bruno Mendes Roatt1,2, Nádia das Dores
Moreira1,2, Rodrigo Dian Oliveira Aguiar-Soares1,2, Evandro Marques de Menezes
Machado2, Rodolfo Cordeiro Giunchetti3, Rodrigo Corrêa-Oliveira1,4, Mariângela
Carneiro5, and Alexandre Barbosa Reis1,2,+
1Laboratório de Pesquisas Clínicas, Programa de Pós Graduação em Ciências
Farmacêuticas, Universidade Federal de Ouro Preto, Morro do Cruzeiro, Ouro Preto,
Minas Gerais, CEP 35400-000, Brazil
2Laboratório de Imunopatologia, Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas,
Universidade Federal de Ouro Preto, Morro do Cruzeiro, Ouro Preto, Minas Gerais, CEP
35400-000, Brazil
3Laboratório de Biologia das Interações Celulares, Instituto de Ciências Biológicas,
Universidade Federal de Minas Gerais, Av. Antônio Carlos, 6627, Pampulha, Belo
Horizonte, Minas Gerais, CEP 31270-901, Brazil
4Laboratório de Imunologia Celular e Molecular, Centro de Pesquisas René Rachou,
Fundação Oswaldo Cruz, Av. Augusto de Lima, 1715, Belo Horizonte, Minas Gerais
CEP: 30.190-002, Brazil
5Laboratório de Epidemiologia de Doenças Infecciosas e Parasitárias, Instituto de
Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais, Av. Antônio Carlos, 6627,
Pampulha, Belo Horizonte, Minas Gerais, CEP 31270-901, Brazil
KER, H.G. APÊNDICE A
73
+Corresponding author: Laboratório de Imunopatologia, Núcleo de Pesquisas em
Ciências Biológicas, Instituto de Ciências Exatas e Biológicas, Universidade Federal de
Ouro Preto, Morro do Cruzeiro, Ouro Preto, Minas Gerais, CEP 35400-000, Brazil.
Tel.: +55-21-31-3559-1036. e-mail address: [email protected] (A.B. Reis)
RESUMO
Os cães vem sendo considerado o principal reservatório do agente causador da
leishmaniose visceral (LV) e, especialmente, no Brasil, o diagnóstico dos animais
soropositivos é parte do Programa de Vigilância e Controle da Leishmaniose Visceral e
(PVCLV). Durante anos, este programa determinou a triagem sorológica por ELISA, e
confirmação por RIFI. Recentemente, uma alteração no diagnóstico foi instituído e RIFI
foi substituído pelo teste rápido da plataforma Dual-Path (DPP). Além dessa substituição,
por sua vez, a sorologia por ELISA foi transferida para a confirmação dos resultados
triados pelo DPP. Neste contexto, o objetivo do presente estudo foi verificar quão
vantajosa foi esta mudança em relação à especificidade do diagnóstico. Um conjunto de
198 amostras de soro foram avaliadas com estes três testes oficiais brasileiros: DPP (DPP-
LVC®), ELISA (EIE-LVC®) e RIFI (IFI-LVC®). As amostras de soros compreende
controles não endêmicas (n = 30); controles de área endêmica (n = 40); cães com outras
doenças caninas (n = 88), incluindo Leishmania braziliensis, Trypanosoma cruzi, Babesia
canis e Ehrlichia canis; e cães vacinados (n = 40) usando Leishmune®, Leish-Tec® ou
LBSap. Em relação a este painel de amostras, a especificidade global foi de 99,4%, 89,9%
e 75,2% em relação ao DPP, ELISA e RIFI respectivamente. Assim, a implementação do
DPP mostrou um impacto positivo na especificidade do diagnóstico e contribui
diretamente para a melhoria da PVCLV no Brasil.
Palavras Chave: Leishmania infantum; Leishmaniose Visceral; Leishmaniose Visceral
Canina; Sorodiagnóstico.
KER, H.G. APÊNDICE A
74
ABSTRACT
Dogs are the main reservoir of the causative agent of Visceral Leishmaniasis (VL) and
especially in Brazil, the diagnosis of seropositive animals is part of the Visceral
Leishmaniasis Control and Surveillance Program (VLCSP). For years, this program
determined the serological screening by ELISA and confirmation by IFAT. Recently, an
alteration in dog’s diagnosis was instituted and IFAT was replaced by the rapid test Dual-
Path Platform (DPP). Besides this substitution, in turn, the serology by ELISA was
relocated for confirmative test and DPP for screening. In this context, the aim of the
present study was verify if this change was advantageous regarding the diagnosis
specificity. A set of 198 sera samples were assessed with these three Brazilian official
tests: DPP (DPP-LVC®), ELISA (EIE-LVC®), and IFAT (IFI-LVC®). The sera samples
comprises nonendemic controls (n=30); endemic controls (n=40); dogs with other
diseases (n=88) including Leishmania braziliensis, Trypanosoma cruzi, Babesia canis,
and Ehrlichia canis; and vaccinated dogs (n=40) using Leishmune®, Leish-Tec® or
LBSap. Concerning this panel of samples, the overall specificity were 99.4%, 89.9% and
75.2% regarding DPP, ELISA and IFAT respectively. The implementation of DPP
showed a positive impact in the diagnostic specificity and directly contributes to the
improvement of Brazilian VLCSP.
Keywords: Leishmania infantum; Visceral Leishmaniasis; Canine visceral leishmaniasis;
Serodiagnosis.
KER, H.G. APÊNDICE A
75
INTRODUCTION
Visceral leishmaniasis is a worldwide public health problem and is currently
highlighted as one of the major neglected diseases. In Brazil, to control the disease, the
Ministry of Health through the Visceral Leishmaniasis Control and Surveillance Program
(VLCSP) follows three central recommendations comprising, the early diagnosis and
prompt treatment of human cases, vector control by insecticide spraying, and the
serological screening and culling of seropositive dogs in endemic areas (Ministério da
Saúde, 2006). However, regarding the last control measure, the stamping-out approach
on companion animals like the domestic dogs brings further complexities particularly
linked to social costs by the misdiagnosis (Costa et al., 2013). In the context, the wide
comprehension about the specificity of the diagnostic tests applied in canine surveys turns
crucial. Despite this issue have greater importance in Brazil where the removal of infected
dogs is undertaken systematically since the 1960s (Romero and Boelaert, 2010), this
strategy is eventually employed in other South American countries (Travi et al., 2014),
turning the issue even more comprehensive.
Thereby, the necessity for specific diagnosis of canine visceral leishmaniasis
(CVL) lead the Brazilian VLCSP to replace the IFAT by an rapid test based on the Dual
Path Platform (DPP) (Ministério da Saúde, 2011). However, the scientific community
strengthen the necessity of complementary studies to comprehend the real value of this
rapid test so that it can be successfully engaged in public health programs (Coura-Vital et
al., 2014; Schuback et al., 2014). One of the fundamental questions that needs to be
answered is the specificity of the rapid test DPP in samples that could potentially cross-
react serologically with CVL. The validation study of the DPP rapid diagnostic tests
employed a limited number of cross-reacting samples (Grimaldi et al., 2012) and few
researches has been done to deepen the investigations of the specificity in CVL official
KER, H.G. APÊNDICE A
76
diagnosis tests. Notwithstanding, an additional concern related to the diagnostic
specificity is associated to the possibility of seroconversion triggered by prophylactic
vaccination (Romero and Boelaert, 2010). The correct distinction of seroreactivity
triggered by vaccination from the L. infantum natural infection remains a serious issue
for public health programs such as the Brazilian VLCSP. In the past 12 years, two
vaccines against CVL (Leishmune® and Leish-Tec®) were already licensed for
commercial use in Brazil. Even so, once the searching for new alternatives are growing,
some candidates turn out to be in evidence, such as LBSap vaccine (Giunchetti et al.,
2007; Roatt et al., 2012). In the context, the search and availability of vaccines endorses
the importance to be specific to achieve the correct distinction of an antibody response
produced after vaccination from to that due natural infection.
According to the above-mentioned foundations, it is remarkable that the
serodiagnosis of CVL in Brazil remains challenging because the current diagnostic tests
might lack satisfactory specificity. Based on the results revealed in this study, we hope to
contribute in the discussion related to the CVL control strategy proposed by the Brazilian
VLCSP within the challenging factor of specific diagnosis considering other canine
infections and vaccination against CVL.
MATERIALS AND METHODS
The canine sera used in the present report of laboratory investigation were selected
in archived samples storage at -80°C at the Clinical Research Laboratory of Pharmacy
School from the Federal University of Ouro Preto. The serology assays were performed
under blind codes and according to the manufacturer's package insert.
Animals and groups
KER, H.G. APÊNDICE A
77
The set of samples were distributed in four major groups: (i) nonendemic control
(NEC: dogs living in areas with no Leishmania transmission); (ii) endemic controls (EC:
dogs living in endemic areas but with negative diagnostic test result for Leishmania
infection); (iii) cross-reactive control (CRC: dogs with confirmed disease that could
potentially cross-react serologically); (iv) vaccinated control (VAC: dogs vaccinated
against CVL with Brazilian vaccines).
The NEC group (n = 30) is composed by dogs born and kept in an area with no L.
infantum transmission located at the animal facility in the Federal University of Ouro
Preto. The EC group (n = 40) is part from epidemiological research during a cross-
sectional study conducted in an endemic area from the northwest sanitary region of Belo
Horizonte, Minas Gerais, Brazil (Coura-Vital et al., 2011). The absence of IgG against
Leishmania in sera samples from both groups were determined using an ‘‘in-house’’
ELISA performed using soluble Leishmania infantum antigen (MHOM/BR/1070/BH46)
described by Reis et al. (2006). Both groups are PCR-negative for L. infantum.
A large set of samples included in the CRC group (n = 88) was used to investigate
the specificity of the Brazilian official tests. The CRC group can be distributed in four
subsets related to other relevant canine infections such as L. braziliensis (n = 30), T. cruzi
(n = 18), E. canis (n = 30) and B. canis (n = 10). These sera samples were provided by
different laboratories, which characterized through specific serology (ELISA) and PCR-
positive results respectively to each infection, as well PCR-negative for L. infantum.
Furthermore, 40 vaccinated control (VAC) composed by dogs from an area with
no L. infantum transmission, vaccinated with Brazilian vaccines: Leishmune® (n = 12),
Leish-Tec® (n = 16), or LBSap (n = 12). These dogs presented negative serology (in house
ELISA [Reis et al., 2006b]) as well PCR-negative for L. infantum. All of the vaccinated
animals received the complete vaccination protocol established by three doses of
KER, H.G. APÊNDICE A
78
respective vaccines with 21 days between each dose. The vaccination was conducted
according to the manufacturer's instructions for the Leishmune® and Leish-Tec® vaccines,
and according Roatt et al., (2012) for the LBSap vaccine. The tested samples were
collected a hundred days after the complete vaccination procedure.
Serological assays
The serological assays were performed according to the manufacturer's package
insert of the official Brazilian serology tests. For the rapid test DPP® (Bio-
Manguinhos/FIOCRUZ, Rio de Janeiro, Brazil), after addition of the sera sample and the
application of running buffers, the reading was performed after 15 minutes and the results
were considered positive when two lines were visualized. The ELISA serology was done
using EIE-LVC® kit (Bio-Manguinhos/FIOCRUZ, Rio de Janeiro, Brazil) and the optical
densities were determined at 450 nm by using an automatic EL 800G microplate reader.
The cut-off was determined according to the manufacturer’s recommendations and was
obtained using the negative controls supplied in the kit. The IFAT was conducted using
the IFI-LVC® kit (Bio-Manguinhos/FIOCRUZ, Rio de Janeiro, Brazil) and the slides
were examined using a fluorescent microscope with 40× objective (Olympus BX40). For
positive samples, parasites antigens displayed an intense bright-green stain at titration of
1:40 or more.
Statistical analysis
The results are presented descriptively by an exploratory analysis of data. The
diagnostic specificity analyses were performed at the 95% confidence interval using Stata
software 11.0 (StataCorp LP, College Station, Texas, USA).
Ethical approval
KER, H.G. APÊNDICE A
79
The study was approved by the Ethics Research Committee of the Universidade
Federal de Ouro Preto (protocol number 083/2007).
RESULTS
The general specificity assessed in the 198 samples from NEC, EC, CRC and
VAC together, revealed a pronounced performance of DPP® reaching 99.4% of
specificity. The ELISA serology leads to a specificity of 89.9% while IFAT revealed
greater number of cross-reaction in CRC and VAC and, therefore, showed reduced
specificity of 75.2% (Table I).
In dogs infected with other important canine pathogens (Table II), the DPP®
revealed an outstanding capacity to avoid cross-reactions in L. braziliensis, T. cruzi, E.
canis, and B. canis samples. Only 1.1% (1/88) cross-reaction was observed in CRC,
related to a single sample from E. canis subset. The ELISA serology showed cross-
reactivity in 29.5% (26/88) samples from the CRC set. So, 26.7% (8/30) of L. braziliensis
subset, 22.2% (4/18) regards T. cruzi, and 3.3% (1/30) is E. canis showed false-positive
tests. The ELISA test in B. canis subset shows to be negative. The IFAT showed cross-
reactivity in all subsets from CRC resulting in 40.9% (36/88) of false-positives.
Respectively to L. braziliensis, T. cruzi, E. canis and B. canis, the corresponding
performance was 40.0% (12/30), 100.0% (18/18), 6.6% (2/30) and 40.0% (4/10).
In dogs immunized with Brazilian vaccines (Table III), none [0.0% (0/40)] of
VAC sera samples presented false-positive results in DPP® testing. The ELISA serology
indicated false-positive results in 17.5% (7/40) samples from VAC. It was observed that
8.3% (1/12) of the dogs vaccinated with Leishmune®, 6.3% (1/16) by Leish-Tec®, and
41.6% (5/12) by LBSap, presented false-positive results. Mistaken results were
commonly observed in the IFAT testing, leading to cross-reactions in 32.5% (13/40) from
VAC samples, and respectively to Leishmune®, Leish-Tec® and LBSap subsets, 16.7%
KER, H.G. APÊNDICE A
80
(2/12), 18.7% (3/16) and 66.7% (8/12) of false-positive results were observed.
DISCUSSION
One of the main arguments against the canine intervention of the VLCSP is the
incorrect euthanasia of dogs because erroneous diagnoses (Costa et al., 2013). Our major
result showed that the serology by DPP revealed higher specificity than ELISA and IFAT,
avoiding mistaken diagnosis in dogs with other canine infections and in the vaccinated
ones. It is important to highlight that DPP serology was capable to substantially minimize
the possibility of cross-reactions against antibodies produced by other infectious pictures,
as well provides an absence of false-positive results related to the dogs vaccination
regardless the given vaccine. Regarding these aspects, the substitution of the IFAT
serology by DPP proved to be a correct and prudent change by the Brazilian VLCSP.
Using tests of low specificity may incur in important social costs, putting the
VLCSP strategy for canine visceral leishmaniasis (CVL) diagnosis under hazard. The
official ELISA and IFAT tests are based on crude antigens of promastigote forms of L.
major-like and, although its applicability is assumed for a long time, some questionings
about their specificity performance are arising in the last years (Ribeiro et al., 2013;
Peixoto et al., 2015). One of the most relevant disadvantages relates to the occurrence of
false-positive results due to cross-reactions with other members of Trypanosomatidae
family, such as T. cruzi and L. braziliensis, or even in phylogenetically distant organisms
as E. canis and B. canis (Lira et al., 2006; Ferreira et al., 2007; Laurenti et al., 2014). In
accordance with these studies, and considering the large sampling used in the present
study, we strongly reiterate the urgency to fill this gap of low specificity by ELISA and
IFAT. The DPP, on the other hand, which uses the recombinant antigen K28, minimizes
the number of cross-reactions and could truly lead to diminish euthanasia due false-
KER, H.G. APÊNDICE A
81
positive diagnostic in areas where L. infantum can be endemic along with other canine
infections.
Considering the different nature of the antigens used in Leishmune®, Leish-Tec®
and LBSap vaccines, which are respectively composed by a surface L. donovani protein
Fucose and Manose Ligand (FML), a recombinant amastigote-specific protein A2 (rA2),
and soluble antigens from L. braziliensis, it is likely to expect that ELISA and IFAT may
be less efficient to avoid false-positive than DPP. It should not be discarded that some
antibodies produced by vaccination with Leishmune® and LBSap could recognize some
epitopes in the L. major antigens from ELISA and IFAT, leading to false-positive results.
It is important to highlight that the genome and proteome of L. major, L. braziliensis, L.
infantum and L. donovani are highly similar (Peacock et al., 2007; Smith et a., 2007;
Rezende et al., 2012). The amastigote-specific rA2 antigen used in Leish-Tec®, in turn,
generated the highest number of false-positive results by IFAT probably due to the
titration of 1:40 considered as positive test. Some researchers suggest that a dilution of
1:40 should be considered a suspect result, and a titre four times higher (at
dilutions ≥ 1:160) should be indicated as positive IFAT test (Solano-Gallego et al., 2011;
Ribeiro et al., 2013). On the other hand, and finally, the recombinant antigen K28 used in
DPP proves to be efficient to avoid false-positive results triggered by vaccination against
CVL, regardless their antigenic composition.
In summary, the results of this investigation showed that the DPP® presents
outstanding values of specificity. Their implementation contributes to a reliable
diagnostic of CVL evidenced by excellent capacity to avoid false-positive results in dogs
infected with other canine pathogens commonly encountered in Brazil, as well as in dogs
that undergone vaccination. On the other hand, there was a slighty reduction in the
specificity in ELISA, and markedly by IFAT. Therefore, the implementation of the rapid
KER, H.G. APÊNDICE A
82
test DPP® in substitution to IFAT proves to be advantageous and contributes to the
strengthening of the Brazilian VLCSP.
ACKNOWLEDGMENTS
This work was supported by Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais,
Brazil (FAPEMIG grants CBB–APQ-3073-4.01/07, APQ-02473-10, and APQ-01052-
11), Programa de Pesquisa para o SUS (PPSUS/MS/CNPq/FAPEMIG/SES-MG grant
CBB-APQ-00356-10), Conselho Nacional de Pesquisa (CNPq grants 472554/2007-7 and
473234/2010-6), and Departamento de Ciência e Tecnologia do Ministério da Saúde
(DECIT/MS/CNPq/BR grant 576062/2008-1). A.B.R., M.C., R.C.G., and R.C.O. are
grateful for CNPq fellowships.
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KER, H.G. APÊNDICE A
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TABLE I: Specificity from DPP, ELISA and IFAT
Samples (n) DPP ELISA IFAT
Positive Negative Positive Negative Positive Negative
NEC (30) 0 30 0 30 0 30
EC (40) 0 40 0 40 0 40
CRC (88) 1 87 13 75 36 52
VAC (40) 0 40 7 34 13 27
Total (198) 1 197 20 178 49 149
Specificity 99.4% (97.299.9) 89.9% (84.993.4) 75.2% (68.880.7)
DPP, Dual-Path Platform; ELISA, enzyme-linked immunosorbent assay; IFAT, immunofluorescence
antibody test
Table II: Performance of DPP, ELISA and IFAT in samples from cross-reactive control (CRC)
Set Subset Number of positive samples/total (%)
DPP ELISA IFAT
CRC
L. braziliensis 0/30 (0.0%) 16/30 (53.3%) 12/30 (40.0%)
T. cruzi 0/18 (0.0%) 4/18 (22.2%) 18/18 (100.0%)
E. canis 1/30 (3.3%) 6/30 (20.0%) 2/30 (6.6%)
B. canis 0/10 (0.0%) 0/10 (0.0%) 4/10 (40.0%)
Total 1/88 (1.1%) 26/88 (29.5%) 36/88 (40.9%)
DPP, Dual-Path Platform; ELISA, enzyme-linked immunosorbent assay; IFAT, immunofluorescence
antibody test
Table III: Performance of DPP, ELISA and IFAT in samples from vaccinated control (VAC)
Set Subset Number of positive samples/total (%)
DPP ELISA IFAT
VAC
Leishmune® 0/12 (0.0%) 1/12 (8.3%) 2/12 (16.6%)
Leish-Tec® 0/16 (0.0%) 1/16 (6.3%) 3/16 (18.7%)
LBSap 0/12 (0.0%) 5/12 (41.6%) 8/12 (66.6%)
Total 0/40 (0.0%) 7/40 (17.5%) 13/40 (32.5%)
DPP, Dual-Path Platform; ELISA, enzyme-linked immunosorbent assay; IFAT, immunofluorescence
antibody test
KER, H.G. APÊNDICE B
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KER, H.G. APÊNDICE B
88
KER, H.G. APÊNDICE C
89
KER, H.G. APÊNDICE C
90
KER, H.G. APÊNDICE C
91
KER, H.G. APÊNDICE C
92
KER, H.G. APÊNDICE C
93
KER, H.G. APÊNDICE C
94
KER, H.G. APÊNDICE C
95
KER, H.G. APÊNDICE D
96
KER, H.G. APÊNDICE D
97
KER, H.G. APÊNDICE D
98
KER, H.G. APÊNDICE D
99
KER, H.G. APÊNDICE D
100
KER, H.G. APÊNDICE D
101
KER, H.G. APÊNDICE D
102
KER, H.G. APÊNDICE E
103
KER, H.G. APÊNDICE E
104
KER, H.G. APÊNDICE E
105
KER, H.G. APÊNDICE E
106
KER, H.G. APÊNDICE F
107
Figura Complementar I: Curvas de titulação da reatividade de IgG canino para o teste
sorológico por citometria de fluxo realizado com os sistemas microesfera-proteínas E7−C1
[Painel Superior ‒ pool de soros CNI ( ) e INF ( )] e C6−PQ20 [Painel Inferior ‒ pool de
soros CNI ( ) e INF ( )] incubados com diferentes titulações do anticorpo conjugado com
isotiocianato de fluoresceína (FITC). Foram reduzidos o tempo das incubações com as amostras
de pool de soros e com conjugado para 30 minutos. Os resultados foram expressos como
percentual de partículas fluorescentes (PPF).
Figura Complementar II: Curvas de titulação da reatividade de IgG canino para o teste
sorológico por citometria de fluxo realizado com os sistemas microesfera-proteínas E7−C1
[Painel Superior ‒ pool de soros CNI ( ) e INF ( )] e C6−PQ20 [Painel Inferior ‒ pool de
soros CNI ( ) e INF ( )] incubados com diferentes titulações do anticorpo conjugado com
isotiocianato de fluoresceína (FITC). Foram reduzidos o tempo das incubações com as amostras
de pool de soros e com conjugado para 60 minutos. Os resultados foram expressos como
percentual de partículas fluorescentes (PPF).
Diluição do soro
0
20
40
60
80
100
C6 −
PQ
20
PP
FTitulação 1:100 do
conjugado IgG-FITC
Titulação 1:2.000 do
conjugado IgG-FITC
Titulação 1:500 do
conjugado IgG-FITC
Titulação 1:1.000 do
conjugado IgG-FITC
0
20
40
60
80
100
E7−
C1
Diluição do soro
PP
F
Titulação 1:100 do
conjugado IgG-FITC
Titulação 1:2.000 do
conjugado IgG-FITC
Titulação 1:500 do
conjugado IgG-FITC
Titulação 1:1.000 do
conjugado IgG-FITC
0
20
40
60
80
100
0
20
40
60
80
100
C6 −
PQ
20
E7−
C1
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