Caracterización de una ciclodextrina glucosiltransferasa recombinante en un sistema GRAS y su potencial aplicación en panificados libres de gluten

Soledad Caminata Landriel1, Julieta dlM Castillo1, Carla R Martínez2, Jorgelina Rodríguez Gastón1, Hernán Costa1,3*

1Laboratorio de Química Biológica y 2División Estadística, Departamento de Ciencias Básicas, Universidad Nacional de Luján, Ruta 5 y Avenida

Constitución (6700) Luján, Buenos Aires, Argentina. 3Instituto de Ecología y Desarrollo Sustentable (INEDES)-CONICET, Universidad Nacional de Luján, Ruta 5 y Avenida Constitución (6700) Luján, Buenos Aires, Argentina. * hcosta@unlu.edu.ar

Introducción

La enzima ciclodextrina glucosiltransferasa (CGTasa) utiliza el almidón como sustrato para producir oligosacáridos cíclicos con diferentes grados de polimerización, denominados ciclodextrinas (CDs).

Estos compuestos tienen una estructura de cono truncado, cuya cavidad interna es hidrófoba y la superficie externa es hidrófila. Dada su estructura, las CDs pueden formar complejos de inclusión

con otras moléculas, modificando sus propiedades físico químicas. Por este motivo, las CDs tienen gran aplicación en las industrias farmacéutica, alimentaria y textil, entre otras. En particular, en la

industria panadera, estos compuestos podrían actuar como miméticos del gluten, favorecerían la retención de humedad de las masas y disminuirían el efecto de retrogradación asociado al deterioro

de la calidad del pan.

En el Laboratorio de Química Biológica de la Universidad Nacional de Luján se aisló y caracterizó una bacteria productora de CGTasa, clasificada mediante filogenia molecular como Paenibacillus

barengoltzii DF 9R. El gen de esta enzima fue expresado en Pichia Pastoris, un microorganismo GRAS que produce y libera al medio extracelular la enzima recombinante. Esta enzima fue purificada

mediante cromatografía de afinidad e intercambio iónico y, además, se secuenció su extremo amino terminal. Por último, se determinó la producción de CDs por acción de la CGTasa recombinante

purificada sobre diferentes almidones libres de gluten, así como la producción de CDs en las diferentes temperaturas del proceso de elaboración de panificados, empleando almidón de mandioca

como sustrato.

Materiales y métodos Producción heteróloga de la CGTasa en P. pastoris SMD1168 Las células de P. pastoris transformadas con la construcción pPICzαA/CGTasa fueron crecidas en medio BMGY. Posteriormente, se inocularon en el medio de producción BMMY y se incubaron a 29 °C y 215 rpm con el agregado diario de diferentes concentraciones de metanol, como inductor de la producción de la enzima, durante 7 días. Determinación de la concentración de metanol y del tiempo óptimos para la producción enzimática Se evaluaron diferentes concentraciones de metanol: 0,5; 1; 2 y 3 % (v/v) y se colectaron alícuotas del medio de producción durante 7 días. Se midió la actividad CGTasa, de los sobrenadantes obtenidos, por el método de la fenolftaleína (Goel y Nene, 1995. Starch 47: 399-400). Los ensayos se realizaron por triplicado y el análisis estadístico se realizó con el programa InfoStat (v. 2017.1.2). La variable actividad CGTasa se analizó teniendo en cuenta la combinación de los factores tiempo y concentración de metanol. Para poder analizar las diferencias significativas entre los distintos tratamientos se utilizó la prueba de Kruskal-Wallis con un nivel de significancia del 5 %. Purificación y caracterización de la CGTasa recombinante El sobrenadante de cultivo, libre de restos celulares, fue purificado mediante cromatografía de afinidad a -CD. A las fracciones eluídas se les determinó la actividad amilolítica por el método de Fuwa modificado (Ferrarotti y col., 1996. Cell Mol Biol 42: 653-657). Aquellas que presentaron mayor actividad, se colectaron y purificaron posteriormente por cromatografía de intercambio iónico mediante FPLC. Se empleó una columna MonoQ 5/50 GL equilibrada con buffer Tris-HCl 50 mM pH 7,4 eluída con gradiente de NaCl 1M pH 7,4 con un flujo de 0,5 ml/min. Las fracciones que presentaron actividad, fueron analizadas mediante SDS-PAGE y posterior tinción con plata. Las fracciones purificadas a homogeneidad fueron microsecuenciadas desde su extremo amino, mediante la técnica de degradación de Edman. Producción y análisis de CDs obtenidas con la CGTasa salvaje y recombinante sobre distintos almidones libres de gluten Para determinar la producción de CDs, una suspensión de almidón libre de gluten de distinto origen vegetal al 5 % fue gelatinizada y luego se incubó con 15 U de cada una de las CGTasas por gramo de almidón. Los productos de reacción fueron analizados mediante HPLC empleando una columna para análisis de glúcidos y detección mediante índice de refracción. Producción y análisis de CDs obtenidas con la CGTasa recombinante a las diferentes temperaturas del proceso de panificación Con el propósito de evaluar la formación de CDs por acción de la CGTasa sobre el almidón durante el proceso de elaboración de panificados, 15 U de enzima por gramo de almidón de mandioca al 5 % se incubaron durante 30 min en un rango de temperatura de entre 20 y 90 °C. Se evaluaron dos tratamientos: uno con el agregado de la enzima al almidón sin gelatinizar y otro con el agregado de la enzima al almidón previamente gelatinizado. Los productos de reacción fueron analizados mediante HPLC.

Resultados

Conclusiones

La mejor producción de CGTasa recombinante en P. pastoris se obtiene con el agregado de 0,5 % de metanol, durante de 6 días de incubación.

La enzima recombinante resulta activa y biotransforma almidones libres de gluten y de distinto origen vegetal en mezclas identificables de CDs.

La producción de CDs se logra en rangos de temperaturas compatibles con las empleadas en la elaboración de panificados, utilizando almidón de mandioca gelatinizado como sustrato.

Sustrato CGTasa

Concentración de CD (mg/ml) Rendimiento

(%) α- β- γ- Total

Garbanzo Salvaje 4,9 5,8 0,9 11,5 23,1

Recombinante 4,4 5,4 0,8 10,6 21,3

Arveja Salvaje 3,9 6,8 0,8 11,6 23,1

Recombinante 3,6 6,0 0,8 10,4 20,8

Lenteja Salvaje 3,5 5,2 0,7 9,4 18,7

Recombinante 3,2 4,4 0,6 8,2 16,5

Quínoa Salvaje 3,7 4,9 1,4 10,0 20,1

Recombinante 4,0 5,7 1,8 11,5 23,0

Amaranto Salvaje 4,7 6,5 0,9 12,1 24,1

Recombinante 4,8 5,9 1,0 11,7 23,4

Mandioca Salvaje 7,4 12,5 2,5 22,4 44,8

Recombinante 4,0 11,2 2,2 17,4 34,7

Arroz Salvaje 6,4 10,2 2,2 18,7 37,5

Recombinante 5,7 9,2 1,9 16,8 33,7

Maíz Salvaje 6,9 10,6 2,4 20,0 40,0

Recombinante 5,3 10,3 2,2 17,7 35,4

Papa Salvaje 6,3 11,3 2,2 19,8 39,7

Recombinante 3,8 9,4 2,3 15,6 31,1

Gráfico de medias de la actividad CGTasa en función de la interacción tiempo y concentración de metanol. En el eje horizontal se muestran los tratamientos realizados, se indica primero el porcentaje de metanol (0,5; 1; 2 y 3), seguido de los días de crecimiento de la levadura en el medio de producción líquido BMMY.

Cromatograma de CGTasa recombinante obtenido mediante cromatografía de intercambio iónico por FPLC. Las flechas negras indican los picos de mayor actividad amilolítica. En azul se indica la absorbancia en 280 nm y en negro el porcentaje de NaCl 1M.

V o lu m e n (m l)

Ab

so

rb

an

cia

(2

80

nm

)

Na

Cl 1

M (%

)

1 0 1 5 2 0 2 5 3 0

0

1 0 0

2 0 0

3 0 0

4 0 0

5 0 0

0

5 0

1 0 0

1 5 0

T e m p e ra tu ra ( °C )

Co

nc

en

tra

cio

n d

e C

D (

mg

/ml)

20

30

35

40

60

80

90

0

5

1 0

1 5

C D

C D

C D

C D to ta le s

A

T e m p e ra tu ra ( °C )

Co

nc

en

tra

cio

n d

e C

D (

mg

/ml)

20

30

35

40

60

80

90

0

5

1 0

1 5

2 0

C D

C D

C D

C D to ta le s

B

Producción de CDs utilizando almidón de mandioca al 5% en suspensión acuosa (izquierda) y previamente gelatinizado (derecha). Las mezclas fueron incubadas durante 30 min con 15 U de enzima recombinante.

Producción de CDs obtenidas por catálisis de almidones de distinto origen vegetal con la CGTasa producida por P. barengoltzii DF 9R (salvaje) y por P. pastoris (recombinante).

A la izquierda, SDS-PAGE de eluciones obtenidas por intercambio iónico mediante FPLC de la CGTasa recombinante. Las calles 1 y 2 corresponden a las fracciones de mayor actividad indicadas con flechas en el cromatograma. Calle 3: marcador de peso molecular. Calle 4: CGTasa salvaje parcialmente purificada mediante cromatografía de afinidad. Arriba a la derecha, se muestra –subrayado en verde- parte del péptido señal de la construcción pPICzαA/CGTasa. En líneas punteadas se indican los posibles cortes de las endopeptidasas Kex2 (rojo) y Ste13 (azul). Abajo a la derecha se muestran los resultados obtenidos por secuenciación del extremo amino correspondientes a las dos fracciones indicadas con flechas en el cromatograma.

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