nghien cuu su dung song sieu am de trich ly pro tein tu dpf
DESCRIPTION
su dung song sieu am ho tro qua trinh trich ly protetinkhao sat su anh huong cua cac yeu to den qua trinh trich ly proteinTRANSCRIPT
NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN HƢỚNG DẪN
...............................................................................................................................................
...............................................................................................................................................
...............................................................................................................................................
...............................................................................................................................................
...............................................................................................................................................
...............................................................................................................................................
...............................................................................................................................................
...............................................................................................................................................
...............................................................................................................................................
...............................................................................................................................................
...............................................................................................................................................
...............................................................................................................................................
...............................................................................................................................................
...............................................................................................................................................
...............................................................................................................................................
...............................................................................................................................................
...............................................................................................................................................
...............................................................................................................................................
...............................................................................................................................................
...............................................................................................................................................
...............................................................................................................................................
...............................................................................................................................................
...............................................................................................................................................
...............................................................................................................................................
TP.HCM, ngày tháng 01 năm 2011
NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN PHẢN BIỆN
...............................................................................................................................................
...............................................................................................................................................
...............................................................................................................................................
...............................................................................................................................................
...............................................................................................................................................
...............................................................................................................................................
...............................................................................................................................................
...............................................................................................................................................
...............................................................................................................................................
...............................................................................................................................................
...............................................................................................................................................
...............................................................................................................................................
...............................................................................................................................................
...............................................................................................................................................
...............................................................................................................................................
...............................................................................................................................................
...............................................................................................................................................
...............................................................................................................................................
...............................................................................................................................................
...............................................................................................................................................
...............................................................................................................................................
...............................................................................................................................................
...............................................................................................................................................
...............................................................................................................................................
TP.HCM, ngày tháng 01 năm 2011
i
ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
BKTP HCM
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC
ẢNH HƢỞNG CỦA SÓNG SIÊU ÂM VÀ
ENZYME TRONG QUÁ TRÌNH TRÍCH
LY PROTEIN ĐẬU PHỘNG
SVTH : VŨ BẢO TRÂN
MSSV : 60602611
GVHD : ThS. NGUYỄN THỊ HIỀN
ThS. CHÂU TRẦN DIỄM ÁI
TP Hồ Chí Minh, 1/2011
ii
LỜI CẢM ƠN LỜI CẢM ƠN
Em xin gửi lời cảm ơn đến tất cả các thầy, các cô trong Bộ môn
Công nghệ Thực phẩm đã tận tình truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm và tạo
mọi điều kiện thuận lợi để em hoàn thành tốt luận văn và trong suốt hơn 4
năm học vừa qua.
Em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô Nguyễn Thị Hiền và cô
Châu Trần Diễm Ái đã tận tình giúp đỡ em, chỉ dạy em trong suốt quá trình
thực hiện Luận văn tốt nghiệp.
Em xin chân thành cám ơn chị Nguyễn Thị Thu Hà đã luôn nhiệt
tình chia sẽ kinh nghiệm quý báu cho em.
Con cảm ơn ba mẹ và gia đình đã luôn là chỗ dựa vững chắc cho
con, động viên, khuyến khích và tạo mọi điều kiện cho con học tập tốt.
Đồng thời, mình cũng cảm ơn tất cả các bạn lớp HC06TP đã luôn
bên cạnh, giúp đỡ mình, đóng góp ý kiến cho mình trong suốt thời gian qua.
Một lần nữa em xin chân thành cảm ơn sự quan tâm của tất cả mọi
người để em có được bài luận văn như ngày hôm nay.
Cuối cùng, em xin chúc quý thầy cô và các bạn luôn mạnh khỏe, vui
vẻ và thành đạt trong cuộc sống.
TP.HCM, ngày 06 tháng 01 năm 2011
Vũ Bảo Trân
iii
TÓM TẮT LUẬN VĂN
Mục đích của luận văn “Nghiên cứu ảnh hưởng của sóng siêu âm và enzyme
trong quá trình trích ly protein đậu phộng” nhằm khảo sát ảnh hưởng của quá trình
xử lý bằng enzyme, xử lý kết hợp sóng siêu âm và enzyme lên khả năng trích ly
protein trong bột đậu phộng tách béo, nhằm xác định các thông số công nghệ để trích
ly một cách có hiệu quả và triệt để hàm lượng protein trong nguyên liệu.
Các nội dung chính thực hiện trong luận văn bao gồm:
Tổng quan tài liệu về đậu phộng, các phương pháp sản xuất PC/PI từ đậu
phộng, ảnh hưởng cùa sóng siêu âm đến hoạt tính enzyme, ứng dụng kỹ thuật siêu âm
và chế phẩm enzyme cellulase trong quá trình trích ly protein.
Nghiên cứu thực nghiệm:
− Khảo sát quá trình trích ly protein đậu phộng sử dụng chế phẩm enzyme
cellulase IndiAge Neutra L.
− Khảo sát ảnh hưởng của siêu âm đến hoạt tính enzyme cellulase IndiAge
Neutra L.
− Khảo sát quá trình trích ly protein đậu phộng sử dụng sóng siêu âm kết hợp
với chế phẩm enzyme IndiAge Neutra L.
− Tối ưu hóa quá trình trích ly protein đậu phộng dưới sự hỗ trợ của enzyme, kết
hợp siêu âm và chế phẩm enzyme IndiAge Neutra L.
iv
MỤC LỤC
TRANG BÌA ......................................................................................................................... i
NHIỆM VỤ LUẬN VĂN .......................................................................................................
LỜI CẢM ƠN .............................................................................................................ii
TÓM TẮT LUẬN VĂN ............................................................................................ iii
MỤC LỤC .................................................................................................................. iv
DANH MỤC HÌNH ..................................................................................................viii
DANH MỤC BẢNG ................................................................................................... x
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .................................................................................. xii
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 1
1.1. Giới thiệu đề tài ................................................................................................ 1
1.2. Nguyên liệu đậu phộng ..................................................................................... 2
1.2.1. Tình hình sản xuất đậu phộng trên thế giới và Việt Nam ........................ 2
1.2.2. Đặc điểm sinh thái của đậu phộng .......................................................... 3
1.2.3. Thành phần hóa học của đậu phộng ........................................................ 5
1.3. Tính chất chức năng của protein đậu phộng: ................................................... 10
1.3.1. Khả năng hòa tan và hấp phụ nước ....................................................... 10
1.3.2. Khả năng tạo bọt .................................................................................. 11
1.3.3. Khả năng nhũ hóa................................................................................. 11
1.3.4. Khả năng tạo gel và tạo nhớt ................................................................ 12
1.4. Bột đậu phộng tách béo (DPF) ........................................................................ 13
1.5. Các phương pháp truyền thống trích ly protein đậu phộng .............................. 13
1.5.1. Phương pháp trích ly bằng cồn ............................................................. 13
1.5.2. Phương pháp dùng acid ........................................................................ 14
1.5.3. Phương pháp dùng kiềm ....................................................................... 15
1.5.4. Nhược điểm trích ly protein bằng phương pháp truyền thống ............... 16
1.6. Phương pháp dùng kỹ thuật membrane ........................................................... 17
1.7. Phương pháp dùng sóng siêu âm ..................................................................... 18
v
1.7.1. Khái quát chung về sóng siêu âm ......................................................... 18
1.7.2. Phân loại .............................................................................................. 19
1.7.3. Cơ chế của sóng siêu âm ...................................................................... 20
1.7.4. Các thông số ảnh hưởng đến quá trình siêu âm ..................................... 21
1.7.5. Ứng dụng sóng siêu âm trong một số quá trình chế biến thực phẩm ..... 23
1.7.6. Một số ứng dụng của siêu âm trong lĩnh vực trích ly ............................ 23
1.8. Ứng dụng enzyme để tăng khả năng trích ly protein ........................................ 27
1.8.1. Cơ chế sử dụng enzyme để trích ly protein đậu phộng ......................... 27
1.8.2. Enzyme cellulase .................................................................................. 28
1.8.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng của enzyme ....................... 29
1.9. Ảnh hưởng của siêu âm đến các quá trình xử lý bằng enzyme: ........................ 33
1.9.1. Ảnh hưởng của siêu âm đến hoạt tính enzyme ...................................... 33
1.9.2. Tác dụng khác của siêu âm đến quá trình xử lý sinh học bằng enzyme . 33
1.10. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình trích ly protein ........................................ 34
1.10.1. Tỉ lệ bột : nước của huyền phù ............................................................. 34
1.10.2. Kích thước mẫu .................................................................................... 35
1.10.3. Tính chất nguyên liệu ........................................................................... 35
1.10.4. pH ........................................................................................................ 36
1.10.5. Nhiệt độ ............................................................................................... 37
1.10.6. Thời gian trích ly .................................................................................. 37
CHƢƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 38
2.1. Nguyên liệu..................................................................................................... 38
2.2. Enzyme ........................................................................................................... 38
2.3. Hóa chất sử dụng ............................................................................................ 38
2.4. Thiết bị sử dụng .............................................................................................. 39
2.5. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................. 39
2.5.1. Mục đích nghiên cứu ............................................................................ 39
2.5.2. Nội dung nghiên cứu ............................................................................ 40
2.6. Các phương pháp phân tích ............................................................................. 48
vi
2.6.1. Xác định độ ẩm .................................................................................... 48
2.6.2. Xác định độ tro ..................................................................................... 48
2.6.3. Xác định hàm lượng lipid ..................................................................... 48
2.6.4. Xác định hàm lượng protein tổng ......................................................... 48
2.6.5. Hiệu suất trích ly protein ...................................................................... 49
2.6.6. Xác định hoạt tính enzyme cellulase ..................................................... 49
2.6.7. Phương pháp xử lý số liệu .................................................................... 50
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .............................................................. 51
3.1 Khảo sát thành phần của nguyên liệu đậu phộng ............................................. 51
3.2 Khảo sát thành phần của bột đậu phộng tách béo ............................................ 51
3.3. Khảo sát quá trình trích ly protein đậu phộng sử dụng chế phẩm enzyme
cellulase hỗ trợ........................................................................................................... 52
3.3.1. Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng chế phẩm enzyme IndiAge Neutra L
sử dụng đến hiệu suất trích ly protein đậu phộng ....................................................... 52
3.3.2. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian xử lý enzyme đến hiệu suất trích ly
protein đậu phộng ...................................................................................................... 56
3.3.3. Tối ưu hóa hàm lượng enzyme và thời gian xử lý enzyme đến hiệu suất
trích ly protein đậu phộng .......................................................................................... 57
3.4. Khảo sát ảnh hưởng của sóng siêu âm đến hoạt tính chế phẩm enzyme cellulase
IndiAge Neutra L ....................................................................................................... 61
3.4.1. Khảo sát ảnh hưởng của cường độ siêu âm đến hoạt tính chế phẩm
enzyme cellulase IndiAge Neutra L ........................................................................... 61
3.4.2. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian siêu âm đến hoạt tính enzyme
cellulase IndiAge Neutra L ........................................................................................ 63
3.5. Khảo sát quá trình trích ly protein khi kết hợp sóng siêu âm và enzyme .......... 67
3.5.1. Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng chế phẩm enzyme sử dụng đến hiệu
suất trích ly protein từ dịch trích đã xử lý bằng sóng siêu âm ..................................... 67
3.5.2. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian xử lý enzyme đến hiệu suất trích ly
protein từ dịch trích đã xử lý bằng sóng siêu âm ........................................................ 69
3.5.3. Tối ưu hóa hàm lượng enzyme và thời gian xử lý enzyme đến hiệu suất
trích ly protein từ dịch trích đã xử lý bằng sóng siêu âm ............................................ 72
CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................... 77
vii
4.1. Kết luận .......................................................................................................... 77
4.2. Kiến nghị ........................................................................................................ 77
TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................... 79
PHỤ LỤC ................................................................................................................. 88
1. Xác định độ ẩm ............................................................................................... 88
2. Xác định độ tro ............................................................................................... 88
3. Xác định hàm lượng lipid ................................................................................ 88
4. Xác định hàm lượng protein tổng .................................................................... 89
5. Xác định hoạt tính enzyme cellulase ............................................................... 90
6. Kĩ thuật điện di ............................................................................................... 93
viii
DANH MỤC HÌNH
Hình 1. 1:Đậu phộng (Arachis hypogaea) .................................................................... 3
Hình 1. 2: Quy trình sản xuất PPC theo phương pháp trích ly bằng cồn ..................... 14
Hình 1. 3: Quy trình sản xuất PPC theo phương pháp trích ly bằng acid .................... 15
Hình 1. 4: Quy trình sản xuất PPI theo phương pháp dùng kiềm ............................... 16
Hình 1. 5:Quy trình sản xuất PPI/PPC sử dụng membrane ......................................... 18
Hình 1. 6: Khoảng tần số của sóng siêu âm (Doktor-Ingenieur, 2002). ....................... 19
Hình 1. 7: Hình dao động của sóng siêu âm ............................................................... 20
Hình 1. 8: Ảnh hưởng của biên độ dao động đến tế bào đậu nành ở các thời gian khác
nhau ........................................................................................................................... 22
Hình 1. 9: Cấu trúc của Lignocellulose ...................................................................... 27
Hình 1. 10: Cơ chế thủy phân của enzyme cellulase ................................................... 29
Hình 1. 11: Ảnh hưởng nồng độ cơ chất với tốc độ xúc tác ban đầu Vmax ................... 29
Hình 1. 13: Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme cellulase (tại 50oC) ................. 30
Hình 1. 12: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme cellulase (pH=4.8) .......... 32
Hình 1. 14: Ảnh hưởng của tỷ lệ bột nước đến khả năng hòa tan và độ thu hồi protein
đậu phộng tại pH 10. .................................................................................................. 35
Hình 1.
/n c =1/20 (w/v) ................................................................................................. 37
Hình 2. 1: Sơ đồ nghiên cứu ...................................................................................... 40
Hình 2. 2: Quy trình chuẩn bị bột đậu phộng tách béo................................................ 41
Hình 2. 3: Quy trình ứng dụng chế phẩm enzyme hỗ trợ quá trình trích ly protein đậu
phộng ......................................................................................................................... 42
Hình 2. 4: Quy trình khảo sát ảnh hưởng của sóng siêu âm đến hoạt tính chế phẩm
enzyme IndiAge Neutra L .......................................................................................... 44
Hình 2. 5: Quy trình trích ly protein khi kết hợp sóng siêu âm và enzyme.................. 46
Hình 3. 1: Ảnh hưởng của hàm lượng enzyme sử dụng đến hiệu suất trích ly protein. 53
ix
Hình 3. 2: Cơ chế thủy phân cellulose thành glucose của enzyme cellulase................ 55
Hình 3. 3: Ảnh hưởng của thời gian xử lý enzyme đến hiệu suất trích ly protein ........ 56
Hình 3. 4: Ảnh hưởng của hàm lượng và thời gian xử lý enzyme lên hiệu suất trích ly
protein ....................................................................................................................... 60
Hình 3. 5: Hình chiếu bề mặt biểu diễn phương trình hồi quy trên mặt phẳng tọa độ . 60
Hình 3. 6: Ảnh hưởng của cường độ siêu âm đến hoạt tính chế phẩm enzyme IndiAge
Neutra L .................................................................................................................... 62
Hình 3. 7: Ảnh hưởng của thời gian siêu âm đến hoạt tính chế phẩm enzyme IndiAge
Neutra L .................................................................................................................... 64
Hình 3. 8: Kết quả điện di khi xử lý siêu âm ở các mức năng lượng và thời gian khác
nhau đối với chế phẩm enzyme cellulase IndiAge Neutra L ....................................... 66
Hình 3. 9: Ảnh hưởng của hàm lượng chế phẩm enzyme sử dụng đến hiệu suất trích ly
protein từ dịch trích sau khi xử lý bằng sóng siêu âm ................................................. 68
Hình 3. 10: Ảnh hưởng của thời gian xử lý chế phẩm enzyme đến hiệu suất trích ly
protein từ dịch trích sau khi xử lý bằng sóng siêu âm ................................................. 70
Hình 3. 11: Ảnh hưởng của hàm lượng và thời gian xử lý chế phẩm enzyme lên hiệu
suất trích ly protein từ dịch trích bột đậu phộng tách béo sau khi đã xử lý siêu âm. .... 75
Hình 3. 12: Hình chiếu bề mặt biểu diễn phương trình hồi quy trên mặt phẳng tọa độ 75
x
DANH MỤC BẢNG
Bảng 1. 1: Diện tích, năng suất, sản lượng đậu phộng trên thế giới từ 2005 – 2009 ...... 2
Bảng 1. 2: Diện tích, năng suất, sản lượng đậu phộng của Việt Nam từ 2005-2009 ...... 2
Bảng 1. 3: Phân loại khoa học cây đậu phộng .............................................................. 3
Bảng 1. 4: Thành phần hóa học của hạt đậu phộng ....................................................... 5
Bảng 1. 5: Thành phần các amino acid có trong đậu phộng .......................................... 6
Bảng 1. 6: Thành phần các acid béo có trong đậu phộng .............................................. 7
Bảng 1. 7: Thành phần các polysaccharide có trong đậu phộng .................................... 8
Bảng 1. 8: Hàm lượng một số vitamin trong 100 g hạt đậu .......................................... 9
Bảng 1. 9: Hàm lượng flavonoids và polyphenols có trong đậu phộng ......................... 9
Bảng 1. 10: Thành phần các nguyên tố khoáng trong đậu phộng ................................ 10
Bảng 1. 11: Một số ứng dụng của siêu âm năng lượng cao trong công nghiệp thực
phẩm (Alex Patist và Darren Bates, 2008) ................................................................. 23
Bảng 1. 12: Một số nghiên cứu chiết xuất các chất có hoạt tính sinh học hỗ trợ bằng
siêu âm (Kamaljit Vilkhu và cộng sự, 2008) .............................................................. 25
Bảng 1. 13: Ảnh hưởng của sóng siêu âm lên quá trình trích ly protein liên tục và gián
đoạn từ bã đậu nành ................................................................................................... 26
Bảng 1. 14: Thành phần hóa học của bột đậu phộng tách béo (%) và bã thu được sau
khi tách protein, trước và sau khi xử lý enzyme (hemicellulase) ................................ 28
Bảng 1. 15: Hàm lượng protein trích ly được khi xử lý bằng các chế phẩm enzyme
khác nhau (S. Jung và cộng sự - 2006) ....................................................................... 31
Bảng 1. 16: Ảnh hưởng của NSI đến hiệu suất thu hồi sản phẩm ............................... 36
Bảng 3. 1: Thành phần hóa học của mẫu đậu phộng ................................................... 51
Bảng 3. 2: Thành phần hóa học của bột đậu phộng tách béo ...................................... 51
Bảng 3. 3: Ảnh hưởng của hàm lượng chế phẩm enzyme sử dụng đến hiệu suất trích ly
protein ....................................................................................................................... 53
Bảng 3. 4: Ảnh hưởng của thời gian xử lý enzyme đến hiệu suất trích ly protein ....... 56
Bảng 3. 5: Ma trận quy hoạch thực nghiệm bậc hai tâm xoay, hai yếu tố và kết quả
thực nghiệm ............................................................................................................... 58
xi
Bảng 3. 6: Ảnh hưởng của các biến độc lập đến hiệu suất trích ly protein .................. 59
Bảng 3. 7: Ảnh hưởng của cường độ siêu âm đến hoạt tính chế phẩm enzyme IndiAge
Neutra L .................................................................................................................... 61
Bảng 3. 8: Ảnh hưởng của thời gian siêu âm đến hoạt tính chế phẩm enzyme IndiAge
Neutra L .................................................................................................................... 64
Bảng 3. 9: Ảnh hưởng của hàm lượng chế phẩm enzyme sử dụng đến hiệu suất trích ly
protein từ dịch trích sau khi xử lý bằng sóng siêu âm ................................................. 68
Bảng 3. 10: Ảnh hưởng của thời gian xử lý chế phẩm enzyme đến hiệu suất trích ly
protein từ dịch trích sau khi xử lý bằng sóng siêu âm ................................................. 70
Bảng 3. 11: Ma trận quy hoạch thực nghiệm bậc hai tâm xoay, hai yếu tố và kết quả
thực nghiệm ............................................................................................................... 73
Bảng 3. 12: Ảnh hưởng của các biến độc lập đến hiệu suất trích ly protein ................ 74
xii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
PC : Protein concentrate
PI : Protein isolate
PPC : Peanut protein concentrate
PPI : Peanut protein isolate
SPC : Soy protein concentrate
SPI : Soy protein isolate
WPC : Whey protein concentrate
WPI : Whey protein isolate
DPF : Defatted peanut flour – bột đậu phộng tách béo
CE : Catechin equivalent – tính theo hàm lượng catechin
MF : Microfiltration – vi lọc
UF : Ultrafiltration – siêu lọc
NF : Nanofiltration – lọc nano
RO : Reverse osmosis – thẩm thấu ngược
NSI : Nitrogen solubility index – chỉ số Nitơ hòa tan
EA : Emulsifying activity – chỉ số hoạt tính tạo nhũ
ES : Emulsifier stability – độ bền nhũ
UAE : Ultrasound assisted extraction – siêu âm hỗ trợ trích ly
Chƣơng 1: Tổng quan tài liệu
Trang 1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu đề tài
Protein là một hợp chất rất phổ biến trong các nguyên liệu và sản phẩm thực
phẩm. Có những thực phẩm protein là thành phần chính, có những thực phẩm protein
được thêm vào với vai trò là phụ gia. Protein thực vật được xem là nguồn nguyên liệu
thay thế protein động vật trong công nghiệp thực phẩm bởi khả năng bảo quản dễ
dàng, nguồn nguyên liệu phổ biến và đa dạng (đặc biệt là nguồn nguyên liệu từ cây họ
đậu, ngũ cốc và hạt có dầu). Hiện nay, ngành công nghiệp thực phẩm rất quan tâm đến
các chế phẩm từ protein như protein concentrate và protein isolate.
− Protein concentrate (PC): được sản xuất từ nguồn nguyên liệu giàu protein,
đã loại đi phần lớn các tạp chất phi protein, sản phẩm thường chứa 65% protein trở
lên (tính trên hàm lượng chất khô). (Uzzan, 1988).
− Protein isolate (PI): là sản phẩm protein đã qua tinh chế. PI được sản xuất từ
nguồn nguyên liệu giàu protein, nhưng đã loại đi gẩn như toàn bộ các tạp chất phi
protein, sản phẩm chứa tối thiểu từ 90% protein trở lên (tính trên hàm lượng chất
khô). (Uzzan, 1988).
PC và PI được ứng dụng rộng rãi trong các sản phẩm thực phẩm như thức ăn
dinh dưỡng, sữa, các sản phẩm từ thịt và cá, các loại soup, bánh mì…nhằm nâng cao
giá trị dinh dưỡng cho thực phẩm cũng như tận dụng các tính chất chức năng của
protein: khả năng hòa tan, khả năng tạo bọt, khả năng tạo gel, tạo nhũ …
− Nguyên liệu sản xuất protein concentrate và protein isolate
Một số nguyên liệu thực vật sử dụng để sản xuất PC và PI đã được nghiên cứu
như đậu nành, lúa mì, nấm, các loại hạt có dầu khác như đậu phộng, cải dầu, mè,
hướng dương… Đậu nành, hạt cải dầu, hạt bông, hạt hướng dương và đậu phộng cung
cấp 69% ; 12,4% ; 6,9% ; 5,3% và 2,8% lượng bột protein trên thế giới.
Trong đó đậu nành là loại hạt có dầu được trồng nhiều nhất trên thế giới. Ở Việt
Nam, nhìn chung sản lượng đậu nành vẫn chưa đủ đế đáp ứng nhu cầu tiêu thụ mà
hàng năm phải nhập khẩu nguyên liệu từ 1 – 1,2 triệu tấn. Trong khi đó sản lượng đậu
phộng cao, đáp ứng được nhu cầu trong nước và xuất khẩu. Tuy hàm lượng protein
trong đậu phộng (20 – 30%) không cao bằng đậu nành nhưng có thể đáp ứng nhu cầu
sản xuất PC và PI. Hầu hết lượng đậu phộng dùng để sản xuất dầu phộng, bơ đậu
phộng, bánh kẹo và các sản phẩm snack. Quá trình sản xuất dầu phộng cho ra bột đậu
phộng tách béo. Bột đậu phộng tách béo là một sản phẩm phụ giàu protein, rẻ tiền.
Chƣơng 1: Tổng quan tài liệu
Trang 2
Bột đậu phộng tách béo chứa 47 – 55% protein bao gồm một lượng lớn các acid amin
thiết yếu (Basha và Pancholy, 1982; USDA-NAL, 2005). Do đó cần tận dụng nguồn
nguyên liệu này để sản xuất PPC và PPI.
Protein trong thực vật tồn tại dưới dạng liên kết với các thành phần khác như các
polysaccharide, cellulose, hemicellulose ... Một số nghiên cứu đã cho thấy xử lý sóng
siêu âm, enzyme có thể làm tăng khả năng trích ly protein. Dưới tác dụng của sóng
siêu âm, sự sủi bong bóng được hình thành, là nguyên nhân phá vỡ tế bào, làm lộ các
protein và các liên kết háo nước, tăng khả năng hòa tan của protein. Các enzyme
thường sử dụng là hỗn hợp của nhiều loại enzyme khác nhau có thể cắt đứt các liên
kết của protein với các saccharide, lipid... trong tế bào, giải phóng protein, từ đó tăng
khả năng trích ly protein. Để tăng hiệu suất thu nhận protein mà vẫn giữ được các tính
chất chức năng của protein chúng tôi tiến hành nghiên cứu trích ly protein từ bột đậu
phộng tách béo sử dụng kỹ thuật siêu âm và chế phẩm enzyme.
1.2. Nguyên liệu đậu phộng
1.2.1. Tình hình sản xuất đậu phộng trên thế giới và Việt Nam
1.2.1.1. Tình hình sản xuất đậu phộng trên thế giới
Trong số các loại cây hạt có dầu trồng hàng năm trên thế giới, đậu phộng
đứng thứ năm về diện tích trồng và thứ tư về sản lượng.
Bảng 1. 1: Diện tích, năng suất, sản lượng đậu phộng trên thế giới từ 2005 – 2009
Chỉ tiêu 2005 2006 2007 2008 2009
Diện tích (triệu ha) 24,04 21,551 22,306 23,793 23,507
Năng suất (tấn/ha) 1,594 1,533 1,689 1,606 1,511
Sản lượng (triệu tấn) 38,326 33,047 37,681 38,216 35,52
Nguồn: FAOSTAT, 2010
1.2.1.2. Tình hình sản xuất đậu phộng ở Việt Nam
Bảng 1. 2: Diện tích, năng suất, sản lượng đậu phộng của Việt Nam từ 2005-2009
Chỉ tiêu 2005 2006 2007 2008 2009
Diện tích (triệu ha) 0,269 0,247 0,254 0,256 0,255
Năng suất (tấn/ha) 1,815 1,875 2,006 2,085 2,085
Sản lượng (triệu tấn) 0,489 0,463 0,51 0,534 0,551
Nguồn: FAOSTAT, 2010
Chƣơng 1: Tổng quan tài liệu
Trang 3
1.2.2. Đặc điểm sinh thái của đậu phộng
1.2.2.1. Cây đậu phộng
Cây đậu phộng có tên khoa học Arachis hypogaea, là một loại cây thực phẩm
thuộc họ Đậu có nguồn gốc tại Nam Mỹ.
Hình 1. 1:Đậu phộng (Arachis hypogaea)
Bảng 1. 3: Phân loại khoa học cây đậu phộng
Giới (regnum) Plantae
Ngành (divisio) Magnoliophyta
Lớp (class) Magnoliopsida
Bộ (ordo) Fabales
Họ (familia) Fabaceae
Phân họ (subfamilia) Faboideae
Tông (tribus) Aeschynomeneae
Chi (genus) Arachis
Loài (species) A. hypogaea
Chƣơng 1: Tổng quan tài liệu
Trang 4
1.2.2.2. Phân loại
Dựa vào đặc tính phân cành phân thành 2 nhóm:
Nhóm phân cành xen kẽ (Virginia): dạng bụi, chu kì sinh trưởng 110 - 160
ngày.
Nhóm phân cành liên tục (Valencia và Spanish): cây đứng, thời gian sinh
trưởng 85 - 110 ngày ở nhiệt đới và xích đạo, gồm 2 dòng:
− Spanish: thân cao ngang cành, lóng ngắn, dạng cây đứng, ít nghiêng ngả; lá
chét bé, màu xanh đậm.
− Valencia: thân cao hơn cành, thân tím nhạt; quả thường có 2 - 3 hoặc 4 hạt.
1.2.2.3. Cấu tạo quả đậu phộng
Vỏ quả:
Vỏ quả dày từ 0,3 – 2mm, gồm 3 lớp: vỏ ngoài, vỏ giữa có mô cứng và vỏ trong
có mô mềm. Khi quả chín, trên vỏ quả có các đường gân ngang, dọc hình mạng lưới.
Quá trình hình thành quả chia làm 2 giai đoạn: giai đọan hình thành vỏ quả và giai
đoạn hình thành hạt. Vỏ quả chiếm 25-28% khối lượng quả.
Hạt đậu phộng
Hạt đậu phộng có nhiều hình dạng khác nhau: tròn, bầu dục… Về màu sắc cũng
khác nhau như đỏ tím, đỏ nâu nhạt, nâu… Hạt đậu phộng có 3 bộ phận là vỏ lụa, tử
diệp và phôi. Hạt đậu phộng là nguồn thực phẩm vừa cung cấp đạm vừa cung cấp dầu.
Khối lượng 1000 hạt nặng khoảng 400 ÷ 750gram.
Vỏ lụa
Vỏ lụa rất mỏng ở ngoài cùng bao lấy tử diệp và phôi. Khi sấy khô, để nguội vỏ
dễ tách ra khỏi tử diệp. Tử diệp gồm hai phiến, có màu trắng sữa hoặc trắng ngà.
Chƣơng 1: Tổng quan tài liệu
Trang 5
1.2.3. Thành phần hóa học của đậu phộng
Bảng 1. 4: Thành phần hóa học của hạt đậu phộng
Thành phần Khoảng dao động (%) Trung bình (%)
Ẩm 3,9 – 13,2 5,0
Protein 21,0 – 36,4 28,5
Lipid 35,8 – 54,2 47,5
Cellulose 1,2 – 4,3 2,8
Tro 1,8 – 3,1 2,9
Đường khử 0,1 – 0,3 0,2
Disaccharide 1,9 – 5,2 4,5
Tinh bột 1,0 – 5,3 4,0
Pentosan 2,2 – 2,7 2,5
Nguồn: Journal of Agriculture and Food Chemistry,1, 1953
1.2.3.1. Protein
Đậu phộng chứa 26 – 29% protein có giá trị dinh dưỡng cao mặc dù các amino
acid như lysine, tryptophan, methionine và threonine có hàm lượng thấp (theo mức độ
tiêu thụ protein cần thiết hàng ngày). Protein đậu phộng gồm hai loại: 90% protein là
các globulins gồm 2 phân đoạn chính là arachin (nằm trong lớp aleurone), conarachin
(nằm trong tế bào chất) 10% là các albumin (Daussant J và cộng sự, 1969).
− Arachin được phân làm 2 loại: monomer (arachin I) và dimer (arachin II).
− Conarachin cũng được phân làm 2 loại: conarachin I và conarachin II với các
subunit khác nhau. (T. Yamada và cộng sự, 1980).
Chƣơng 1: Tổng quan tài liệu
Trang 6
Bảng 1. 5: Thành phần các amino acid có trong đậu phộng
Amino acid Hàm lượng (mg/g protein)
Alanine 33.80 ± 3.09
Arginine 132.90 ± 12.16
Aspartic acid 107.95 ± 9.52
Cysteine 15.12 ± 1.39
Glutamic acid 188.35 ± 17.23
Glycine 51.85 ± 4.74
Histidine 20.47 ± 1.88
Isoleucine 28.88 ± 2.65
Leucine 56.43 ± 5.02
Lysine 32.03 ± 2.93
Methionine 12.01 ± 1.10
Phenylalanine 45.61 ± 4.17
Proline 48.89 ± 4.47
Serine 48.56 ± 4.44
Threonine 25.66 ± 2.35
Tryptophan 11.95 ± 1.09
Tyrosine 35.11 ± 3.21
Valine 34.78 ± 3.18
Nguồn: Journal of Agriculture and Food Chemistry 1997,45
1.2.3.2. Lipid:
Đậu phộng có hàm lượng lipid rất cao (45 – 55%). Acid béo chủ yếu trong đậu
phộng là acid oleic. Đặc biệt dầu phộng có khoảng 7% các acid béo mạch dài C-20
archidic, C-22 behenic, C-24 lignoceric là những acid béo đặc trưng chỉ có chủ yếu
trong dầu phộng. (Lihua Jiang và cộng sự, 2010)
Dầu đậu phộng là một hỗn hợp glycerid gồm: 80% acid béo no và 20% acid béo
không no. Thành phần acid béo thay đổi tùy theo giống và điều kiện trồng trọt.
Các acid béo chính trong đậu phộng: acid oleic, acid linoleic, acid palmitic.
Chƣơng 1: Tổng quan tài liệu
Trang 7
Hai acid bão hòa có trong dầu đậu phộng là acid arachidic (C20) và acid
lignoceric (C24). Ở trạng thái bình thường, dầu đậu phộng là một chất lỏng màu vàng
nhạt, có độ nhớt thấp, có hương thơm và mùi vị như hạt dẻ.
Bảng 1. 6: Thành phần các acid béo có trong đậu phộng
Thành phần acid béo Khoảng dao động (%) Trung bình (%)
Myristic (C-14:0) <0,1 0,1
Palmitic (C-16:0) 8,3 – 14,0 11,1
Palmitoleic (C-16:1) <0,2 0,2
Magaric (C-17:0) - 0,1
Magaroleic (C-17:1) - 0,1
Stearic (C-18:0) 1,9 – 4,4 2,4
Oleic (C-18:1) 36,4 – 67,1 46,7
Linoleic (C-18:2) 14,0 – 43,0 32,0
Linolenic (C-18:3) <0,1 –
Arachidic (C-20:0) 1,1 – 1,7 1,3
Gadoleic (C-20:1) 0,7-1,7 1,6
Behenic (C-22:0) 2,1- 4,4 2,9
Erucic (C-22:1) <0,3 –
Lignoceric (C-24:0) 1,1 – 2,2 1,5
Nervonic (C-24:1) <0,3 –
Nguồn: Fats and Oils
1.2.3.3. Carbohydrate
Hàm lượng monosaccharide trong đậu phộng khoảng 5%, trong đó D – glucose
chiếm 2,9% và D – fructose chiếm 2,1%. Hàm lượng oligosaccharide chỉ khoảng
3,3%; bao gồm 0,9% sucrose; 1% raffinose; 0,8% stachyose và 0,3% verbascose
(E.W. Lusas, 1979). Trong khi đó, polysaccharide trong đậu phộng chủ yếu gồm: tinh
bột, glucan, galactoaraban, hemicellulose và cellulose.
Chƣơng 1: Tổng quan tài liệu
Trang 8
Bảng 1. 7: Thành phần các polysaccharide có trong đậu phộng
Polysaccharide Hàm lượng (%)a Cấu trúc Liên kết
Arabinan 0,15 – –
Galactoaraban – Mạch thẳng -1,4-
Glucan – Mạch thẳng -1,4-
Glucomannan 0,15 Mạch thẳng -1,4-
Xylan 0,25 Mạch nhánh -1,4- (mạch chính);
-1,2- và -1,3- (mạch nhánh)
Acidic
polysaccharide
1,8 – –
a dựa trên khối lượng bột đậu phộng đã tách béo
Nguồn: Journal of the Science of Food and Agriculture1979, 30
1.2.3.4. Các thành phần khác
Acid phytic và muối phytate có trong lá mầm, là nguồn dự trữ phosphate. Bột
đậu phộng sau khi tách béo chứa 1,5 – 1,7% phytate. Nếu những chất này hiện diện
trong thực phẩm thì sẽ kết hợp với các cation hóa trị 2 như Ca, Fe, Zn, Mg… và làm
giảm giá trị dinh dưỡng của thực phẩm (A. Seo, C.V. Morr, 1985). Sự hiện diện của
acid phytic sẽ gây ra một số vấn đề trong quá trình sản xuất protein từ đậu phộng vì
phytate có khả năng tương tác với protein và làm giảm khả năng hòa tan của protein
trong nước.
Ngoài ra, trong đậu phộng còn có một hàm lượng đáng kể các hợp chất phenolic.
Những hợp chất phenolic thường gặp trong đậu phộng là: acid phenolic (caffeic,
vanillic, syringic, coumaric) hoặc tannin thường tồn tại dưới dạng tự do, ester hoặc
các dạng liên kết khác. Trong 1g bột đậu phộng tách béo, hàm lượng acid phenolic và
các hợp chất phenolic khác lần lượt là 1756 – 2033 μg và 50 – 120 μg (A. Seo, C.V.
Morr, 1985). Các hợp chất phenolic này có khả năng tác dụng với protein. Phương
pháp làm giảm hàm lượng phenolic chủ yếu tập trung vào việc tối thiểu hóa sự tương
tác giữa phenolic và protein, sau đó loại phenolic ra khỏi protein do sự khác nhau về
khả năng hòa tan cũng như kích thước.
Đậu phộng giàu vitamin nhóm B (trừ B12) như thiamin (B1), riboflavin (B2), acid
pantotenin (B3), B6, acid nicotinic (PP).
Chƣơng 1: Tổng quan tài liệu
Trang 9
Bảng 1. 8: Hàm lượng một số vitamin trong 100 g hạt đậu
Vitamin Hàm lượng vitamin trong 100g hạt
Beta-carotene 10,00 (mcg)
B1 (Thiamine) 0,44 (mg)
B2 (Riboflavin) 0,12 (mg)
PP (Niacine) 16,00 (mg)
Nguồn: Journal of the Science of Food and Agriculture1979, 30
Bảng 1. 9: Hàm lượng flavonoids và polyphenols có trong đậu phộng
Phân loại Hàm lượng flavonoids
(mg CE/g)*
Hàm lượng polyphenols
(mg CE/g)
Đậu phộng sống 0,01 ± 0,00 25,71 ± 0,41
Đậu phộng sống (có vỏ lụa) 0,05 ± 0,00 28,71 ± 1,91
Đậu phộng rang khô 0,01 ± 0,00 27,33 ± 0,83
Đậu phộng rang với dầu 0,01 ± 0,00 28,61 ± 1,44
Đậu phộng luộc 0,06 ± 0,00 36,42 ± 1,39
(*) CE: catechin equivalent – tính theo hàm lượng catechin
Nguồn: Journal of Agriculture and Food Chemistry 2007, 55
Chƣơng 1: Tổng quan tài liệu
Trang 10
Bảng 1. 10: Thành phần các nguyên tố khoáng trong đậu phộng
Thành phần Hàm lượng (mg/100g đậu phộng)
Ca 51,59 ± 0,32
K 867,52 ± 21,10
Mg 227,97 ± 2,69
P 568,16 ± 7,97
Al 0,11 ± 0,04
B 2,50 ± 0,01
Cu 0,05 ± 0,01
Fe 1,17 ± 0,01
Mn 1,86 ± 0,04
Mo 2,01 ± 0,02
Na 10,26 ± 2,40
Zn 2,99 ± 0,03
Nguồn: Journal of Agriculture and Food Chemistry 1997,45
1.3. Tính chất chức năng của protein đậu phộng:
1.3.1. Khả năng hòa tan và hấp phụ nƣớc
Khả năng hòa tan của protein phụ thuộc vào thành phần các amino acids có
trong phân tử. Khả năng hòa tan sẽ tăng khi số gốc kị nước giảm và ngược lại.
P.V. Monteiro (1994) khi nghiên cứu về khả năng hòa tan của protein đậu
phộng trong nước và dung dịch NaCl 0,2 M đã cho thấy rằng: tại các pH khác nhau thì
protein đậu phộng, cũng như hầu hết các cây có dầu khác sẽ hòa tan thấp nhất xung
quanh điểm đẳng điện pH 3,5 – 4,5 và cao nhất là ở pH 9 – 10.
Chƣơng 1: Tổng quan tài liệu
Trang 11
(A): Khả năng hòa tan của protein đậu phộng trong nước; (B): khả năng hòa tan của
protein đậu phộng trong dung dịch NaCl 0,2 M; (a) protein tổng, (b) arachin, (c) conarachin
II, (d) conarachin I.
Hình 1.3: Khả năng hòa tan của protein đậu phộng tại các pH khác nhau
1.3.2. Khả năng tạo bọt
Khả năng tạo nhũ và tạo bọt tăng khi hàm lượng phytate và các hợp chất
polyphenolic giảm vì phytate và các hợp chất polyphenolic có khả năng tương tác với
protein đậu phộng, làm giảm khả năng tạo nhũ và tạo bọt của protein (Pawar và cộng
sự, 2001). Khả năng tạo bọt của protein đậu phộng được sắp xếp như sau: protein tổng
> conarachin I > arachin > conarachin II và khả năng bền bọt được sắp xếp conarachin
I > conarachin II ≥ protein tổng > arachin.
1.3.3. Khả năng nhũ hóa
Tổng protein của đậu phộng có chỉ số hoạt tính tạo nhũ là 1,11 (EA) trong khi
arachin, conarachin II và conarachin I có giá trị lần lượt là 0,9; 1,05 và 1,11. Và độ
bền nhũ của chúng (ES) có giá trị được sắp sếp từ 72 đến 300 giây.
P.V. Monteiro (1994) đã nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ protein, pH và nồng
độ NaCl đến khả năng tạo nhũ của protein đậu phộng thông qua phương pháp đo độ
hấp thu (bước sóng 500 nm) tại thời điểm ban đầu và tại thời điểm hệ nhũ giảm một
nửa độ bền. Nghiên cứu cho thấy khả năng nhũ hóa của protein đậu phộng thấp nhất
tại pH = 5 – 6. Khả năng nhũ hóa và độ bền nhũ cũng giảm khi nồng độ NaCl tăng từ
0,05 M đến 0,3 M, tuy nhiên khi nồng độ NaCl tiếp tục tăng thì khả năng nhũ hóa sẽ
tăng trở lại.
Chƣơng 1: Tổng quan tài liệu
Trang 12
A - Thời gian, B - Nồng độ protein, C – pH, D - Nồng độ NaCl; (a) protein tổng, (b)
arachin, (c) conarachin II, (d) conarachin I
Hình 1.6: Ảnh hưởng của các yếu tố thời gian, nồng độ protein, pH, nồng độ NaCl
lên khả năng tạo nhũ của protein đậu phộng
1.3.4. Khả năng tạo gel và tạo nhớt
Độ nhớt của PC và PI phụ thuộc vào sự tương tác giữa những protein hòa tan,
protein không hòa tan với nước và các phân tử đã hydrate hóa. Độ nhớt sẽ gia tăng
theo hàm mũ khi hàm lượng protein tăng lên. Ngoài ra pH kiềm cũng sẽ làm gia tăng
độ nhớt.
Protein có khả năng tạo gel tốt vì kích thước phân tử lớn và có khả năng hình
thành những mối liên kết theo không gian 3 chiều. Một số yếu tố ảnh hưởng đến khả
năng tạo gel của protein như pH, nhiệt độ, các thành phần không phải protein và các
quá trình cơ học trong quá trình sản xuất. Gel không thể được hình thành tại vùng pH
gần điểm đẳng điện của protein. Ta có thể làm tăng độ cứng của gel khi bổ sung thêm
muối nhưng tính đàn hồi của mạng lưới gel vẫn rất kém khi hàm lượng các hợp chất
phytates và phenolics cao do những hợp chất này có khả năng tương tác và tạo phức
với protein. (Pawar và cộng sự, 2001).
Chƣơng 1: Tổng quan tài liệu
Trang 13
1.4. Bột đậu phộng tách béo (DPF)
DPF là sản phẩm chứa hàm lượng protein từ 47-55% (Basha và Pancholy, 1982;
USDA-NAL, 2005) tính theo hàm lượng chất khô và hàm lượng béo còn rất ít.
Nguyên liệu đậu phộng có thể được tách béo bằng phương pháp ép hoặc trích ly.
Bột đậu phộng tách béo được sử dụng để thu nhận protein trong quá trình sản
xuất PPC, PPI vì hàm lượng protein cao và hàm lượng dầu còn lại thấp (dưới 5%).
Tuy nhiên hiện nay, nguồn khô đậu phộng rất nhiều từ các nhà máy sản xuất dầu do
đó có thể thu nhận protein đậu phộng từ nguồn nguyên liệu đó. Nhưng với sản phẩm
khô đậu phộng trong công nghiệp nếu đem đi sản xuẩt PC và PI còn nhiều điểm hạn
chế. Do trong quy trình sản xuất dầu, người ta không tách lớp vỏ lụa, do đó trong khô
đậu phộng còn lẫn vỏ lụa có chứa nhiều chất màu rất khó xử lý. Nếu dùng khô đậu
phộng để sản xuất protein thì có màu sậm đen, không thể loại sắc tố ra ngoài sản
phẩm. Ngoài ra, khi dùng nguyên liệu khô đậu phộng từ các nhà máy sản xuất dầu, dễ
bị nhiễm mốc sinh độc tố aflatoxin. Độc tố này rất khó xử lý, bền vững với nhiệt. Nếu
kiểm soát được mức độ nhiễm độc tố aflatoxin trong khô đậu phộng, xử lý được
chúng và loại được chất màu của vỏ thì khô đậu phộng thực sự là nguồn nguyên liệu
cho sản xuất protein ở quy mô công nghiệp có giá trị.
1.5. Các phƣơng pháp truyền thống trích ly protein đậu phộng
1.5.1. Phƣơng pháp trích ly bằng cồn
Phương pháp này dựa trên tính chất
.
–
.
được
tách nhưng
k ,
4 – 6%
. (Uzzan,1988; Aluko và Yada,1995)
Chƣơng 1: Tổng quan tài liệu
Trang 14
Hình 1. 2: Quy trình sản xuất PPC theo phương pháp trích ly bằng cồn
1.5.2. Phƣơng pháp dùng acid
Phương pháp acid dựa trên nguyên tắc kết tủa protein tại pH đẳng điện để tách
protein ra khỏi dịch đậu phộng tách béo.
DPF được trộn với
- , 40o
. Phư
65 – 70%. (Vioque và cộng sự, 1999; Aluko và Yada,1995; Aluko và
Yada,1995).
Bột đậu phộng tách béo
Cồn và nước Trích ly
Tách dung môi
PPC
Sấy
Rắn
Chƣơng 1: Tổng quan tài liệu
Trang 15
Hình 1. 3: Quy trình sản xuất PPC theo phương pháp trích ly bằng acid
1.5.3. Phƣơng pháp dùng kiềm
Phương pháp dựa trên khả năng hòa tan của protein (protein hòa tan nhiều nhất
tại pH 9 – 10) để tách protein ra khỏi dịch huyền phù của bột đậu phộng tách béo.
DPF được hòa tan trong nước, sau đó c 50o
60 phút
– 90% (Jianmei Yu và cộng
sự, 2007).
Bột đậu phộng tách béo
Kiềm, nước
Phối trộn
Ly tâm
Hòa tan
Sấy
PPC
Nước, acid
Kết tủa
Chƣơng 1: Tổng quan tài liệu
Trang 16
Hình 1. 4: Quy trình sản xuất PPI theo phương pháp dùng kiềm
1.5.4. Nhƣợc điểm trích ly protein bằng phƣơng pháp truyền thống
− ,
- (Berardi và cộng sự, 1972).
−
60-70% protei ).
− i khi rất nghèo protein hòa tan, tính chất chức năng
của sản phầm giảm do protein có thể biến tính trong điều kiện khắc nghiệt (trích ly
với cồn hay kiềm, xử lý nhiệt, kết tủa hay ly tâm) (Liener, 1994)
Bột đậu phộng tách béo
Kiềm, nước
Acid
Hòa tan
Ly tâm
Acid hóa
Ly tâm
Rửa khối đông
Trung hòa
Sấy phun
PPI
Nước, kiềm
Lỏng
Chƣơng 1: Tổng quan tài liệu
Trang 17
).
− PPC và PPI thu được
-
- -phy
.
− Cuối cùng, một thể t
(Lin và cộng sự, 1974).
1.6. Phƣơng pháp dùng kỹ thuật membrane
Đ , n
(UF) (RO) PC và PI
(các chất như oligosaccharides và phytate có
thể được loại bỏ một cách hiệu quả nhờ phương pháp này).
Tiến hành: DPF 1:10, chỉnh pH 9 bằng
NaOH, kh , 43o
43o
63o
.
65o
4,
–
.
(S.S. Koseoglu và E.W. Lusas, 1988; Ashwani Kumar, 2006; T. V. R. Alicieo và
cộng sự, 2002; Sabine Baumgartner và cộng sự, 2003).
Chƣơng 1: Tổng quan tài liệu
Trang 18
Hình 1. 5:Quy trình sản xuất PPI/PPC sử dụng membrane
1.7. Phƣơng pháp dùng sóng siêu âm
1.7.1. Khái quát chung về sóng siêu âm
Sóng siêu âm là dạng năng lượng được tạo ra bởi sóng âm (thực chất là áp suất
âm) có tần số lớn hơn giới hạn trên ngưỡng nghe của con người (16-20kHz). Theo M.
J.W. Povey và T. J. Mason (1998), sóng âm cơ bản được chia thành:
− Sóng tai người nghe được: 16Hz-18kHz
Bột đậu đã tách béo
NaOH, nước
NaOH, nước
Hòa tan
Ly tâm
Hòa tan
Ly tâm
Thanh trùng
Lọc UF
Sấy phun
PPC/PPI
Rắn
Lỏng
Chƣơng 1: Tổng quan tài liệu
Trang 19
− Sóng siêu âm năng lượng cao: 20kHz-100 kHz
− Dãy năng lượng mở rộng: 20kHz-2MHz
− Sóng siêu âm chẩn đoán: 5MHz-10MHz
Hình 1. 6: Khoảng tần số của sóng siêu âm (Doktor-Ingenieur, 2002).
Xử lý siêu âm trong môi trường lỏng là áp đặt một áp suất âm (Pa) bổ sung vào
áp suất thủy tĩnh đã tác động lên môi trường. Áp suất âm có dạng hình sin và phụ
thuộc vào thời gian t, tần số f và biên độ dao động sóng cực đại Pa max. Biên độ áp suất
cực đại của sóng (Pa,max) tỉ lệ thuận với năng lượng đầu vào của máy biến năng
(Doktor-Ingenieur, 2002).
P2 = Pa max sin (2πft)
1.7.2. Phân loại
Sóng siêu âm có thể được chia thành 3 loại theo tần số: (Doktor-Ingenieur, 2002;
Alex Patist và Darren Bates, 2008)
Sóng siêu âm tần số cao năng lượng thấp (tần số lớn 100KHz – 1MHz), cường
độ nhỏ hơn 1 W/cm 2
): loại sóng này không làm thay đổi những tính chất lý hóa của
nguyên liệu khi truyền qua, do khi ở tần số cao vùng sủi bong bóng trở nên ít hơn.
Được ứng dụng trong công nghiệp thực phẩm như một kỹ thuật phân tích nhằm xác
định các tính chất hóa lý của thực phẩm cũng như thành phần, cấu trúc và trạng thái
vật lý của sản phẩm.
Sóng siêu âm có tần số thấp, năng lượng cao (tần số từ 18 – 100KHz, cường độ
lớn hơn 1W/cm2): Loại sóng này tạo ra sự sủi bong bóng nhiều dẫn đến nhiệt độ và áp
suất cao trong vùng sủi bong bóng làm cho tế bào dễ bị phá vỡ, có thể làm thay đổi
tính chất lý hóa của nguyên liệu. Sóng siêu âm có tần số thấp năng lượng cao được
dùng để phá vỡ tế bào tăng hiệu quả trích ly các chất ra khỏi tế bào, tạo hệ nhũ, điều
khiển quá trình kết tinh, loại khí khỏi thực phẩm dạng lỏng, vô hoạt enzyme…
Siêu âm chuẩn đoán (tần số từ 1-10MHz): không có hiện tượng sủi bong bóng.
Siêu âm trong khoảng này được dùng để đo hệ số hấp thụ và tốc độ của sóng trong
môi trường, được dùng trong scan y học hay hóa phân tích.
Chƣơng 1: Tổng quan tài liệu
Trang 20
1.7.3. Cơ chế của sóng siêu âm
Hiện nay, người ta tin rằng hầu hết sự tăng hiệu quả các quá trình được xử lý với
sóng siêu âm chủ yếu được gây ra do sự sủi bong bóng vì sự sủi bong bóng sẽ làm gia
tăng quá trình truyền nhiệt và truyền khối. Trong suốt quá trình truyền âm, những gợn
sóng truyền theo chiều dọc được hình thành. Khi một sóng âm gặp chất lỏng sẽ tạo ra
những chu kì nén và giãn liên tục. Các chu kỳ nén tác động một áp suất dương lên
chất lỏng, đẩy các phân tử chất lỏng lại gần nhau, các chu kỳ giãn tác động một áp
suất âm, kéo các phân tử chất lỏng ra xa nhau. Các phân tử chất lỏng được liên kết với
nhau nhờ các lực hấp dẫn mà tạo ra sức mạnh liên kết của chất lỏng. Trong suốt chu
kỳ giãn, sóng âm phải tạo ra một áp suất âm lớn hơn các lực hấp dẫn của chất lỏng.
Điều này dẫn đến sự xuất hiện của một số bong bóng.
Khi bong bóng được hình thành. Trong những chu kì giãn tiếp theo khí bên
ngoài có sự khuếch tán vào bên trong bong bóng, tới chu kì nén, bong bóng sẽ bị co
rút lại và khí bên trong bị hấp thu trở lại vào trong lòng chất lỏng. Nhưng ở giai đoạn
này, bong bóng đã có diện tích bề mặt lớn hơn nên lượng khí hấp thu vào lòng chất
lỏng sẽ ít hơn lượng khí lúc vào bên trong bong bóng. Do đó qua nhiều chu kì bong
bóng sẽ lớn dần lên (Moholkar và cộng sự, 2000).
Hình 1. 7: Hình dao động của sóng siêu âm
Sự tăng dần kích thước của bong bóng còn phụ thuộc nhiều vào cường độ của
sóng siêu âm. Đối với sóng siêu âm có cường độ năng lượng thấp, bong bóng được
hình thành với kích thước nhỏ, ít thay đổi trong quá trình nén và giãn, hiện tượng này
được gọi là sự sủi bong bóng khí ổn định (stable cavitation).
Đối với sóng siêu âm có cường độ năng lượng cao, những bong bóng được hình
thành và lớn dần lên. Sau nhiều chu kì, bong bóng sẽ đạt đến một kích thước tới hạn
mà năng lượng của sóng siêu âm không thể giữ pha hơi bên trong bong bóng. Đến chu
trình nén tiếp theo, hơi bất chợt ngưng tụ và những bong bóng sẽ vỡ. Những phân tử
xung quanh bong bóng va chạm nhau một cách mãnh liệt, tạo ra những vùng có nhiệt
Chƣơng 1: Tổng quan tài liệu
Trang 21
độ và áp suất cao. Hiện tượng này gọi là sự sủi bong bóng nhất thời (transient
cavitation). Trong suốt quá trình siêu âm, sự sủi bong bóng ổn định có thể trở thành sự
sủi bong bóng nhất thời và cũng có thể đồng thời xảy ra (Atchley và Crum, 1988).
Thông qua hiện tượng các bong bóng sủi bong bóng, năng lượng cơ học của sóng siêu
âm được biến đổi và truyền qua dung dịch lỏng (Suslick, 1988; Laborde và cộng sự,
1998).
Khi tần số gia tăng, khu vực sủi bong bóng bong bóng trở nên ít dữ dội hơn và
khi tần số cao (1 MHz) thì sự sủi bong bóng bong bóng rất khó xảy ra và nếu trên 2,5
MHz thì hiện tượng sủi bong bóng là không thể (Alliger, 1975).
1.7.4. Các thông số ảnh hƣởng đến quá trình siêu âm
1.7.4.1. Biên độ dao động:
Sự sủi bong bóng phụ thuộc nhiều vào số lượng bong bóng được hình thành và
cường độ của sự vỡ bong bóng. Số lượng bong bóng gia tăng khi ngưỡng sủi bong
bóng giảm và khi biên độ của sóng siêu âm tăng.
Ngưỡng sủi bong bóng sẽ giảm khi nhiệt độ tăng và ngưỡng là zero tại nhiệt độ
sôi. Trong khi đó, cường độ của sự vỡ bong bóng phụ thuộc vào tỷ lệ giữa kích thước
lớn nhất và kích thước ban đầu của bong bóng. Tỷ lệ này được quyết định bởi năng
lượng sóng siêu âm và chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố.
Sóng siêu âm tác động lên nguyên liệu nhờ cơ chế tạo sủi bong bóng, tác dụng
lên bề mặt nguyên liệu và tạo ra các tia nước nhỏ xuyên vào bề mặt nguyên liệu. Tuy
nhiên ở các biên độ dao động của sóng khác nhau, thời gian siêu âm khác nhau mà
mức độ tác động lên nguyên liệu là nhiều hay ít.
Bishnu Karki (2009) tiến hành trích ly protein đậu nành bằng sóng siêu âm ở
các biên độ dao động và thời gian khác nhau. Bishnu Karki thí nghiệm ở các biên độ
dao động là 0; 21; 42; 63; 84 m, thời gian khảo sát là 15; 30; 60; 120 giây cho mỗi
biên độ dao động. Kết quả cho thấy, hàm lượng protein tăng so với mẫu đối chứng
13%; 23%; 27% và 46% tương ứng với việc xử lý ở các biên độ 21; 42; 63; 84 m
trong 120 giây. Bên cạnh đó, kết quả nghiên cứu còn cho thấy thời gian siêu âm càng
dài thì hàm lượng trích ly càng cao. Thời gian siêu âm càng dài thì tế bào được phá vỡ
càng nhiều, làm cho dung môi thấm dễ dàng vào nguyên liệu và trích ly protein tốt
hơn.
Chƣơng 1: Tổng quan tài liệu
Trang 22
Xử lý siêu âm ở biên độ 42 ( m) và 63 ( m .(a), (b), (c), (d) lần lượt là không xử lý siêu âm, xử lý ở
15 giây, 60 giây, 120 giây.
Hình 1. 8: Ảnh hưởng của biên độ dao động đến tế bào đậu nành ở các thời gian
khác nhau
.
1.7.4.2. Nhiệt độ và độ nhớt của môi trƣờng
Nhiệt độ sẽ ảnh hưởng đến áp suất hơi, sức căng bề mặt và độ nhớt của môi
trường lỏng (Muthukumaran và cộng sự, 2006). Sự gia tăng nhiệt độ sẽ làm gia tăng
số lượng bong bóng tạo thành tuy nhiên cường độ sự vỡ bong bóng sẽ bị giảm do ảnh
hưởng của áp suất hơi tăng lên – đóng vai trò như lớp đệm, ngăn cản sự va chạm của
các phân tử xung quanh khi bong bóng vỡ (Alliger, 1975). Ngược lại, sự vỡ bong
bóng sẽ khó khăn khi nhiệt độ giảm vì độ nhớt môi trường tăng cao. Sự gia tăng nhiệt
độ sẽ làm giảm độ nhớt, cho phép sự vỡ bong bóng diễn ra mạnh mẽ hơn. Do đó nhiệt
độ phải được điều chỉnh để độ nhớt đủ thấp làm gia tăng độ mạnh của sự vỡ bong
bóng, tuy nhiệt độ cũng phải đủ thấp để không làm giảm độ mạnh của sự vỡ bong
bóng bởi áp suất hơi cao.
1.7.4.3. Áp suất ngoài
Khi tăng áp suất bên ngoài sẽ làm tăng ngưỡng sủi bong bóng, chính vì thế làm
giảm số lượng bong bóng hình thành (Muthukumaran và các cộng sự, 2006). Mặt
khác, khi tăng áp suất bên ngoài cũng kéo theo tăng áp suất bên trong các bong bong
ở thời điểm nổ, kết quả là sự vỡ bong bóng sẽ diễn ra nhanh chóng hơn, nhưng không
mãnh liệt (Lorimer và Mason, 1987). Chính vì thế, sự tăng áp suất bên ngoài có thể là
một phương pháp hiệu quả để đẩy mạnh quá trình mà không phải tăng biên độ sóng
(Hielsher, 2005)
Chƣơng 1: Tổng quan tài liệu
Trang 23
1.7.5. Ứng dụng sóng siêu âm trong một số quá trình chế biến thực phẩm
Bảng 1. 11: Một số ứng dụng của siêu âm năng lượng cao trong công nghiệp thực
phẩm (Alex Patist và Darren Bates, 2008)
Ứng dụng Cơ chế - lợi ích.
Trích ly Gia tăng sự truyền khối, phá vỡ nguyên liệu tế bào thực vật
làm tăng hiệu suất chiết xuất.
Đồng hóa Sự vỡ những bong bóng khí tạo năng lượng làm xáo trộn 2
pha, làm dung dịch đồng nhất.
Kết tinh Điều khiển kích cỡ và tốc độ phát triển của những tinh thể đá.
Hình thành những tinh thể nhỏ, giảm mối nguy với tế bào, sản
phẩm giữ được nguyên dạng trong thời gian bảo quản.
Thay đổi độ nhớt Sự sủi bong bóng gây nên sự trượt phân tử, từ đó gây ra những
tính chất lưu biến chất lỏng làm giảm độ nhớt, Cải thiện các
đặc tính chế biến.
Phá bọt Sóng siêu âm phá vỡ lớp màng mỏng trên bọt. Gia tăng sản
lượng, giảm lượng hóa chất phá bọt, giảm mất mát trong quá
trình đóng chai.
Vô hoạt enzyme,
vi khuẩn
Sự vỡ những bong bóng khí sẽ ảnh hưởng lên thành tế bào vi
sinh vật. Vô hoạt vi sinh vật ở nhiệt độ thấp hơn, giúp cải thiện
chất lượng sản phẩm.
Lên men Tăng cường vận chuyển cơ chất và sản phẩm. Gia tăng sản
lượng các chất trao đổi, thúc đẩy quá trình lên men.
Truyền nhiệt Tăng quá trình truyền nhiệt do sự vỡ bong bóng, làm tăng sự
gia nhiệt.
1.7.6. Một số ứng dụng của siêu âm trong lĩnh vực trích ly
1.7.6.1. Trích ly chế phẩm dƣợc
Sóng siêu âm là một ứng dụng hết sức tiềm năng trong công nghiệp dược khi
được sử dụng để hỗ trợ trích ly các thành phần thảo dược. Việc cải thiện hiệu quả
trích ly khi ứng dụng sóng siêu âm so với các phương pháp cổ điển khi trích ly trong
nước đối với các hợp chất có hoạt tính sinh học trong cây thì là, hublong, cúc vạn thọ
và bạc hà lần lượt tăng 34%, 18%, 2% và 3%. So sánh với phương pháp cổ điển khi
Chƣơng 1: Tổng quan tài liệu
Trang 24
trích ly trong rượu thì hiệu suất trích ly có sử dụng sóng siêu âm lần lượt tăng 34%,
12%, 3% và 7% (Vinatoru, 2001).
Trong nghiên cứu khác, Jian – Bing và công sự (2006) chiết xuất Geniposide từ
trái Gardenia (chi tử) bằng siêu âm trong môi trường nước. Khi sử dụng sóng siêu âm
ở cường độ 0,15 W/cm2, hiệu suất chiết xuất được gia tăng 16,5% so với quá trình
tĩnh dùng 40ml dung môi trên một gam quả.
1.7.6.2. Trích ly acid tartaric và acid malic:
Acid tartaric có trong trái cây và được tìm thấy nhiều trong nho và me
(Springett, 2001). Khoảng 90% tổng lượng acid hữu cơ trong nho là acid tartaric và
acid marlic. Acid tartaric là một sản phẩm phụ trong công nghiệp sản xuất rượu vang,
do một lượng lớn acid tartaric từ bã được tách ra từ rượu sau khi lên men. Palma và
Barroso (2002) đã tối ưu hóa điều kiện UAE để thu hồi acid tartaric từ phụ phẩm chế
biến rượu vang. Những nghiên cứu của Viện khoa học thực phẩm Australia dùng
UAE chiết xuất acid tartaric từ bã nho đỏ đã chỉ ra hiệu suất thu hồi gia tăng từ 16 –
23% từ hai loại nho khác nhau.
1.7.6.3. Trích ly các hợp chất polyphenol
Bã nho là chất thải rắn của quá trình làm rượu vang, bao gồm vỏ, hạt và một
lượng nhỏ lá. Bã nho đã được dùng cho sản xuất cồn, acid tartatric và gần đây hơn
dùng để khai thác các hợp chất phenolic.
Viện khoa học thực phẩm Australia đã nghiên cứu dùng hệ thống siêu âm năng
lượng cao để chiết xuất các chất có hoạt tính sinh học. Đối tượng thu nhận là
polyphenol và carotenoids. Kết quả xử lý siêu âm bã nho làm gia tăng hàm lượng chất
phenolic thu nhận từ 11-35% (bảng 1.12)
Khi sử dụng siêu âm để trích ly polyphenol từ lá trà thì hiệu suất trích gia tăng
15 – 20% (Mason và Zhao, 1994)
1.7.6.4. Trích ly hợp chất màu Anthocyanin
Anthocyanin đang được nhiều nhà nghiên cứu quan tâm do tiềm năng có thể
thay thế các chất màu tổng hợp và có lợi cho sức khỏe. Một nghiên cứu đã được thực
hiện dùng vi sóng và siêu âm để chiết xuất các hợp chất màu từ dâu. Điều kiện chiết
xuất tối ưu đạt được khi dùng vi sóng (624W, thời gian xử lý 60s) kết hợp với quá
trình siêu âm (thời gian xử lý 40s) và tỷ lệ nguyên liệu và dung môi chiết xuất là 1: 6
(Cai và cộng sự, 2003).
Chƣơng 1: Tổng quan tài liệu
Trang 25
Bảng 1. 12: Một số nghiên cứu chiết xuất các chất có hoạt tính sinh học hỗ trợ bằng
siêu âm (Kamaljit Vilkhu và cộng sự, 2008)
Mục tiêu
chiết xuất
Nguyên
liệu
Dung
môi
Phương pháp Nhiệt độ Lượng gia
tăng hiệu suất
thu hồi (%)
Beta-carotene Carrot Nước
Phòng thí nghiệm,
24 kHz, 20 – 75
Ws/ml
Bình
thường
15 – 25
Polyphenols Bã nho
đỏ
Nước Phòng thí nghiệm,
24 kHz, 20 – 75
Ws/ml
Bình
thường
11 – 35
Polyphenols Trà đen Nước Phòng thí nghiệm,
24 kHz, 20 – 75
Ws/ml
900C 6 – 18
Polyphenols Táo Nước Phòng thí nghiệm,
40 kHz, 20 – 75
Ws/ml
800C 6
1.7.6.5. Hợp chất hƣơng
Siêu âm cũng có thể được dùng để trích ly những hợp chất hương có tác động
lớn đến hương vị của rượu vang. Hỗn hợp dung môi n-pentane và diethyl-ether (1:2)
và dichloromethane được dùng để nghiên cứu điều kiện tối ưu cho trích ly UAE. UAE
làm tăng hiệu quả với hầu hết các hợp chất hương so với phương pháp thông thường
(Kamaljit Vilkhu và cộng sự, 2008).
Đánh giá UAE cho isoflavone từ đậu nành được thực hiện bởi Rostagno và cộng
sự (2003), hiệu quả trích ly tăng 15%.
Sóng siêu âm còn được dùng để trích ly các hợp chất hương khác như: trích ly
rutin từ nụ hoa Chinese Scholar Tree (Sophora japonica) – Paniwynk và cộng sự
(2001); trích ly phycocyanin từ Spirulina platensis (Arthrospira platensis) – Furuki và
cộng sự, 2003.
1.7.6.6. Trích ly protein
Một nghiên cứu của Haizhou Li và cộng sự (2004) cho thấy sự ảnh hưởng của
sóng siêu âm lên bề mặt nguyên liệu, thí nghiệm được tiến hành trên đậu nành, sau khi
xử lý siêu âm, quan sát thấy trên bề mặt nguyên liệu xuất hiện nhiều vết nứt nhỏ. Điều
Chƣơng 1: Tổng quan tài liệu
Trang 26
này được giải thích là do sự vỡ bong bóng trên bề mặt nguyên liệu làm xuất hiện các
tia nước nhỏ xuyên thẳng vào bề mặt rắn tạo ra các vết nứt gãy. Tóm lại năng lượng
sóng siêu âm làm cho nguyên liệu bị rạn nứt, tăng sự tiếp xúc của tế bào với dung
môi, làm tăng sự khuếch tán bên trong phân tử của các chất hòa tan, nhờ đó tăng động
lực học quá trình trích ly (Kamaljitvilichu, 2008).
Moulton và Wang (1982) đã tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của sóng siêu âm
lên quá trình trích ly protein liên tục và gián đoạn từ bã đậu nành. Kết quả được trình
bày trong bảng 1.13
Bảng 1. 13: Ảnh hưởng của sóng siêu âm lên quá trình trích ly protein liên tục và
gián đoạn từ bã đậu nành
Quá trình* Thời gian
siêu âm
(phút)
Nước cất Dung dịch kiềm
Hiệu suất thu
hồi protein
(%)
Năng lượng
(W/g
protein)
Hiệu suất
thu hồi
protein (%)
Năng lượng
(W/g
protein)
Liên tục 2,5 37 1,64 49 1,29
Gián đoạn 2,5 24 1,24 44 0,68
Gián đoạn 5 29 2.01 44 1,34
Gián đoạn 60 46 15.4 53 13,44
(*) Tỷ lệ bột:nước là 1:10
Nguồn: Journal of Food Science 47, 1982
Nguyên nhân chính của việc ứng dụng siêu âm làm tăng khả năng hòa tan của
protein là trong suốt thời gian xử lý siêu âm đã gây ra một số lượng lớn các bong
bóng, các bong bóng lớn dần trong vùng nhiệt độ và áp suất xung quanh gây nên sự
vỡ bong bóng. Điều này dẫn đến làm lộ các protein và làm lộ các liên kết với nước
của các liên kết peptide. Cường độ sóng siêu âm cao làm tăng khả năng trích ly do tác
động lên cấu trúc của protein làm các acid amin háo nước được tiếp xúc với nước
(Moulton và Wang, 1982).
Anet Rezek và cộng sự (2009) tiến hành thí nghiệm trên SPC, khảo sát ở tần số
20 kHz trong 15 phút và 30 phút hàm lượng protein hòa tan lần lượt là 64,3 %- 74%
và 78%, ở tần số 40 kHz bể xử lý ở 15 và 30 phút hàm lượng protein tăng 64,3% -
78% và 82% tương ứng.
Chƣơng 1: Tổng quan tài liệu
Trang 27
1.8. Ứng dụng enzyme để tăng khả năng trích ly protein
1.8.1. Cơ chế sử dụng enzyme để trích ly protein đậu phộng
Vì protein trong thực vật tồn tại dưới dạng liên kết với các thành phần khác như
các polysaccharide, cellulose, hemicellulose… do đó cần phải phân cắt các liên kết
của phân tử protein với các thành phần khác làm xuất hiện nhiều nhóm ưa nước, tăng
khả năng hòa tan của protein. Theo nghiên cứu của Ismail (1993), sử dụng enzyme
thủy phân có thể làm tăng khả năng hòa tan protein từ bột đậu phộng vào dung dịch
trích ly. Nhiều enzyme được sử dụng để hỗ trợ quá trình thủy phân protein đậu phộng:
hemicellulase, cellulase, glucanase, amyloglucosidase…
Cellulose không phải là thành phần chính của bột đậu phộng tách béo nhưng nó
đóng vai trò chủ đạo trong việc tách protein. Màng cellulose chỉ có ở tế bào thực vật,
là màng bảo vệ, còn gọi là vách tế bào. Thành phần hóa học của màng cellulose khá
phức tạp, nước chiếm 60% được chứa trong các khoảng tự do của màng, 30%
cellulose, các sợi cellulose liên kết với nhau tạo thành các mixen (khoảng 100 sợi
cellulose bện lại với nhau tạo nên một mixen với kích thước 5nm, cứ 20 mixen kết với
nhau lại tạo nên một sợi bé (microfibrin) Với kích thước khoảng 10- 20 nm, và cứ 250
sợi bé lại tạo nên sợi lớn (macrofibrin). Các sợi đan chéo với nhau theo nhiều hướng
làm cho màng cellulose rất bền vững, nhưng lại có khả năng đàn hồi. Nhờ cấu trúc
trên, màng cellulose vừa bền vừa mềm dẻo thích ứng với chức năng bảo vệ của nó.
Màng này đã giúp cho tế bào có hình dạng ổn định.
Lignocellulose có cấu trúc vững chắc, dày đặc rất khó phân cắt. Về mặt hóa học,
chúng gồm 2 polymer mạch thẳng cellulose và hemicellulose và một polymer có cấu
trúc không gian ba chiều lignin. Cellulose được bao quanh bởi hemicellulose và
lignin.
Hình 1. 9: Cấu trúc của Lignocellulose
Nguồn: Jeremy C. Smith, ORNL Center for Molecular Biophysics, 2008
Hemicellulose
Chƣơng 1: Tổng quan tài liệu
Trang 28
bằng phương pháp sử dụng chế phẩm enzyme :
− enzyme
.
−
.
Nghiên cứu của Rudrapatnam N. và cộng sự (1975) đã chứng minh việc dùng
enzyme hemicellulase làm tăng hiệu quả trích ly protein, hàm lượng protein còn sót
trong bã rất ít 10,2%.
Bảng 1. 14: Thành phần hóa học của bột đậu phộng tách béo (%) và bã thu được sau
khi tách protein, trước và sau khi xử lý enzyme (hemicellulase)
Thành phần Bột Bã (trước khi xử lý
enzyme)
Bã (sau khi xử lý
enzyme)
Sản lượng 100,0 44,8 29,7
Độ ẩm 4,5 3,3 3,2
Tro 2,9 4,8 4,9
Protein thô (Nx6,25) 53,9 36,4 10,2
Nguồn: Groundnut Carbohydrates-a Review,1979.
1.8.2. Enzyme cellulase
Cellulase dùng để chỉ chung cho các enzyme tham gia phân cắt hợp chất
cellulose. Các enzyme cellulase đều có tác dụng phân cắt liên kết -1,4 giữa 2 đơn vị
glucose và được phân ra làm 3 nhóm chủ yếu sau đây:
− 1,4 -D-glucan cellobiohydrolase (EC.3.2.1.91) (CBH): Enzyme này còn có
một loạt các tên khác như: cellobiohydrolase, cellobiosidase và avicellase.
− 1,4 -D-glucan –4- glucanohydrolase (EC.3.2.1.4) (EG): Enzyme này còn có
một loạt tên khác như: endoglucanase, endo 1,4 -D-glucanase, C-cellulase.
− -D-glucoside glucohydrolase (EC.3.2.1.21): không có khả năng phân hủy
cellulose nguyên thủy. Chúng còn có tên là cellobiase và -glucosidase.
Sự thủy phân cellulose là sự kết hợp của 3 loại enzyme trên. Đầu tiên enzyme EG
tấn công vào giữa mạch cellulose và giải phóng các đầu cuối của chuỗi. Tiếp sau đó
các enzyme CBH tiếp tục phân cắt để tạo sản phẩm cuối là cellobiose. Việc phân cắt
cuối cùng tạo thành glucose là nhờ vào enzyme thứ ba -glucosidase. (Wood, 1992) .
Chƣơng 1: Tổng quan tài liệu
Trang 29
Hình 1. 10: Cơ chế thủy phân của enzyme cellulase
Nguồn: Working Group Molecular Biotechnology
1.8.3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến tốc độ phản ứng của enzyme
1.8.3.1. Nồng độ enzyme
Trong điều kiện thừa cơ chất thì tốc độ phản ứng enzyme tỉ lệ tuyến tính với
nồng độ enzyme. Nhưng khi nồng độ enzyme quá lớn tốc độ phản ứng enzyme cũng
tăng chậm. V= k [E]
Với V: vận tốc phản ứng
[E] : nồng độ enzyme.
1.8.3.2. Nồng độ cơ chất
Mở đầu phản ứng phải tạo thành phức enzyme-cơ chất, sau đó phức enzyme-cơ
chất chuyển hóa tiếp tạo thành sản phẩm cuối cùng của phản ứng enzyme tự do,
enzyme lại kết hợp với phân tử cơ chất khác bắt đầu vòng xúc tác mới. Nồng độ cơ
chất càng cao tốc độ phản ứng càng tăng nhưng nồng độ cơ chất tăng đến mức độ nào
đó thì dù nồng độ cơ chất có tăng nhưng tốc độ phản ứng vẫn không đổi.
Hình 1. 11: Ảnh hưởng nồng độ cơ chất với tốc độ xúc tác ban đầu Vmax
Chƣơng 1: Tổng quan tài liệu
Trang 30
1.8.3.3. pH môi trƣờng
pH môi trường thường ảnh hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất, enzyme và đặc
biệt ảnh hưởng đến độ bền của enzyme. Chính vì thế pH có ảnh hưởng rất mạnh đến
phản ứng của enzyme. Đối với cellulase pH tối thích là 5-6.
(): enzyme từ Streptomyces masaysiensis AMT-3, () enzyme IndiAge Super L
Hình 1. 12: Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme cellulase (tại 50oC)
(R.P. Nascimento và cộng sự, 2009)
Một số thương phẩm cellulase như IndiAge Super L, Puradax HA, Multifect B,
Multifect GC và chế phẩm Multifect pectinase đã được nghiên cứu để ứng dụng cho
việc trích ly protein đậu nành với pH tối ưu khác nhau. Indiage Super L, Puradax HA
hoạt động ở pH 7, pH 5 cho Multifect B và Mutifect GC, Multifect pectinase hoạt
động ở pH 4.
Theo nghiên cứu của S. Jung và cộng sự (2006), hàm lượng protein thu được khi
sử dụng enzyme hoạt động ở pH 4 là 30% bằng một nửa so với khi sử dụng enzyme
hoạt động ở pH 7. Vậy việc trích ly protein bằng enzyme được nhận thấy là trích ly
thu hiệu suất thấp ở pH 4-5 là do có sự đông tụ protein ở những pH này, trong khi đó
pH 7 là pH mà ở đó khả năng protein hòa tan cao.
Chƣơng 1: Tổng quan tài liệu
Trang 31
Bảng 1. 15: Hàm lượng protein trích ly được khi xử lý bằng các chế phẩm enzyme
khác nhau (S. Jung và cộng sự - 2006)
Enzyme Hàm lượng enzyme (%) Hàm lượng protein trích ly (%)
Multifect GC
(pH 4,0)
0 31,4
10 35,5
Multifect B
(pH 5,0)
0 46,0
5 48,2
Multifect pectinase
(pH 4,0)
0 31,8
1 38,5
5 46,6
10 48,2
Puradax HA
(pH 7,0)b
0 55,5
1 60,6
5 59,2
10 60,3
IndiAge Super L
(pH 7,0)
0 53,3
1 58,2
5 62,5
10 62,4
Nguồn: JAOCS 83, 71-78 (2006
Thới gian phản ứng: 3 giờ
1.8.3.4. Nhiệt độ
Mỗi enzyme đều có một nhiệt độ tối thích, tại đó hoạt tính enzyme là cao nhất.
Nếu đưa nhiệt độ cao hơn mức nhiệt độ tối ưu, hoạt tính enzyme sẽ giảm. Nhiệt độ tối
ưu của enzyme phụ thuộc nhiều vào sự có mặt của cơ chất, kim loại, pH, các chất bảo
vệ. Nhiệt độ tối ưu cho enzyme cellulase hoạt động là 45-550C.
Chƣơng 1: Tổng quan tài liệu
Trang 32
(): enzyme từ Streptomyces masaysiensis AMT-3, () enzyme IndiAge Super L
Hình 1. 13: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme cellulase (pH=4.8)
(R.P. Nascimento và cộng sự, 2009)
1.8.3.5. Các chất kìm hãm
Các chất kìm hãm hoạt động của enzyme thường là các chất có mặt trong các
phản ứng enzyme, làm giảm hoạt tính enzyme nhưng lại không bị enzyme làm thay
đổi tính chất hóa học, cấu tạo hóa học và tính chất vật lý của chúng. Các chất gây kìm
hãm hoạt động của các enzyme bao gồm các ion, các chất vô cơ, các chất hữu cơ và
cả protein.
Cơ chế kìm hãm của các chất kìm hãm có thể là thuận nghịch hoặc không thuận
nghịch. Tùy thuộc bản chất tạo phức enzyme – chất kìm hãm mà chia ra thành chất
kìm hãm cạnh tranh và chất kìm hãm không cạnh tranh.
1.8.3.6. Các chất hoạt hóa
Các chất làm tăng hoạt độ xúc tác của enzyme gọi là các chất hoạt hóa enzyme.
Các chất hoạt hóa enzyme có thể là những anion, các kim loại từ ô thứ 11 đến ô thứ
55 trong bảng hệ thống tuần hoàn Mendeleev, các chất hữu cơ phức tạp. Các chất hoạt
hóa chỉ có tác dụng hoạt hóa ở một nồng độ nhất định. Vượt quá nồng độ này, sẽ gây
ức chế hoạt động của enzyme.
Ở nồng độ hoạt hóa, các chất hoạt hóa thường làm nhiệm vụ chuyển nhóm
hydrogen hoặc những chất có khả năng phá vỡ một số liên kết trong phân tử tiền
enzyme hoặc các chất có tác dụng phục hồi các nhóm chức trong trung tâm hoạt động
của enzyme.
Chƣơng 1: Tổng quan tài liệu
Trang 33
1.9. Ảnh hƣởng của siêu âm đến các quá trình xử lý bằng enzyme:
1.9.1. Ảnh hƣởng của siêu âm đến hoạt tính enzyme
Nói chung, khi xử lý siêu âm có hai ảnh hưởng chính: hiện tượng sủi bong bóng
và gia nhiệt. Siêu âm ở tần số thấp làm tiêu mòn hầu hết năng lượng siêu âm thông
qua hiện tượng sủi bong bóng, trong khi siêu âm ở tần số cao tiêu hao một lượng đáng
kể năng lượng thông qua gia nhiệt.
Trong quá trình xử lý sinh học bằng enzyme, ảnh hưởng quan trọng hơn là hiện
tượng sủi bong bóng – hiện tượng hình thành, lớn lên và vỡ mãnh liệt của bong bóng
trong chất lỏng. Bong bóng nổ làm tăng mạnh áp suất và nhiệt độ trong lòng chất
lỏng.
Trong quá trình xử lý siêu âm, phân tử nước sẽ bị phân hủy và tạo ra những chất
trung gian có năng lượng lớn như là H , OH , e-(aq), H2O2, HO2, H2 (Karaboga và cộng
sự, 2007). Sự hình thành những hợp chất trung gian nói trên sẽ ảnh hưởng đáng kể
đến độ bền và hoạt tính xúc tác của đại phân tử enzyme. Tuy nhiên, khi siêu âm được
dùng để vô hoạt enzyme thì hiệu quả thật sự của nó khá thấp do khả năng đại phân tử
enzyme bị mắc vào bong bóng và tiếp xúc với những sản phẩm phân hủy của phân tử
nước có tính oxy mạnh nói trên là rất thấp (Karaboga và cộng sự, 2007).
1.9.2. Tác dụng khác của siêu âm đến quá trình xử lý sinh học bằng
enzyme
Ngoài việc ảnh hưởng đến hoạt tính riêng của enzyme, siêu âm còn ảnh hưởng
đến quá trình xử lý sinh học bằng enzyme, đặc biệt khi xử lý enzyme trong hệ không
đồng nhất. Cơ chế của siêu âm ảnh hưởng đến các quá trình xử lý sinh học bao gồm:
− Tăng hệ số khuếch tán của các phân tử, cải thiện sự di chuyển của các phân
tử chất tham gia phản ứng.
− Siêu âm trực tiếp tham gia vào quá trình xử lý sinh học.
1.9.2.1. Tăng khả năng khuếch tán của các phân tử (Karaboga và cộng sự,
2007)
− Đưa năng lượng siêu âm vào hệ không đồng nhất tạo ra một lượng lớn bong
bóng trong vùng lân cận gần sát của bề mặt rắn-lỏng, trong khi trong hệ đồng nhất,
bong bóng được phân bố bằng nhau trong khối dung dịch.
− Trong trường hợp hệ không đồng nhất hầu hết bong bóng được tạo ra gần bề
mặt của cơ chất, do đó tăng kết quả của sự va chạm cơ học tạo bởi những tia năng
lượng của bong bóng. Mặt khác, dù những cấu trúc được sắp xếp tốt và được gói gọn
gần nhau, đại phân tử enzyme thường không hoàn toàn cứng nhắc và có tính linh động
Chƣơng 1: Tổng quan tài liệu
Trang 34
trong dung dịch giúp cho nó đến vị trí thích hợp, vị trị hoạt động tương ứng với cơ
chất. Do đó, khuấy trộn mãnh liệt của lớp ranh giới không di động của chất lỏng ở bề
mặt rắn-lỏng tạo bởi siêu âm giúp đại phân tử enzyme khuếch tán đến tiếp xúc với cơ
chất nhanh hơn.
- Cuối cùng, một lợi ích khác của khuấy trộn mạnh của lớp biên bởi bong bóng
vỡ là loại bỏ những sản phẩm của phản ứng thủy phân nhanh chóng từ vùng phản ứng
giúp tăng tốc độ phản ứng.
1.9.2.2. Siêu âm trực tiếp tham gia vào quá trình xử lý sinh học
Tự bản thân siêu âm cũng có khả năng thực hiện các phản ứng phân cắt các
mạch cao phân tử polymer, bên cạnh phản ứng phân cắt bởi enzyme. Phân cắt
polymer bởi siêu âm là sự phân cắt ngẫu nhiên và tồn tại một độ dài chuỗi giới hạn mà
khi giới hạn này đạt đến thì quá trình phân cắt bởi siêu âm sẽ dừng lại.
Như đã được trình bày ở phần trước, xử lý siêu âm đối với chất lỏng gây ra hiện
tượng sủi bong bóng. Những bong bóng bị vỡ nhanh sẽ tạo ra gradient áp suất và vận
tốc cục bộ cao của lớp chất lỏng trong vùng lân cận. Hiện tượng này có thể tạo nên
lực cắt và có thể phá vỡ những chuỗi polymer. Đây là hoạt tính hóa cơ của sóng siêu
âm lên polymer. Ngoài ra, trong quá trình xử lý siêu âm, phân tử nước có thể phân ly
hình thành các gốc tự do. Những gốc tự do này khuếch tán ra khỏi lổ hổng đến chất
lỏng xung quanh, tại đây chúng có thể phản ứng với các phân tử hòa tan.
Ngoài hai cơ chế này (hóa cơ và tấn công bởi gốc tự do), polymer trong dung
dịch có thể chịu sự nhiệt phân trong vùng bề mặt tiếp xúc nóng giữa bong bóng khí và
chất lỏng xung quanh (Piotr Ulanski và cộng sự, 2005).
1.10. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình trích ly protein
1.10.1. Tỉ lệ bột : nƣớc của huyền phù
Bản chất của quá trình trích ly là sự khuếch tán, vì vậy sự chênh lệch nồng độ
giữa hai pha chính là động lực của quá trình. Khi chênh lệch nồng độ lớn tức tăng
lượng dung môi thì lượng chất trích ly tăng, thời gian trích ly giảm. Tuy nhiên nếu
lượng dung môi sử dụng quá lớn thì sẽ làm loãng dịch trích, càng nhiều nước dùng để
trích ly thì nồng độ protein trong chất chiết càng thấp và một lượng nhỏ protein còn
lại trong bã chiết. Khi đó cần phải cô đặc hoặc xử lý dịch trích bằng phương pháp
khác để tách bớt dung môi. Song song đó là một lượng lớn nước thải phải được xử lý
trên một lượng protein tạo thành. Điều này có nghĩa là thiết bị trích ly, ly tâm và
lượng thải ra lớn hơn. Tỷ lệ rắn/lỏng được sử dụng trong công nghiệp dao động trong
khoảng 1:5 ÷ 1:20 (Zeki Berk, 1992)
Chƣơng 1: Tổng quan tài liệu
Trang 35
Jianmei Yu và cộng sự (2007) đã nghiên cứu ảnh hưởng của tỉ lệ bột : nước lên
khả năng trích ly của protein đậu phộng. Tác giả tiến hành thí nghiệm ở các tỉ lệ
1:100, 1:50, 1:20, 1:10, các dịch huyền phù được chỉnh về pH 10. Từ thực nghiệm
thấy hàm lượng protein thu hồi cao nhất ở tỉ lệ 1:20. Ở tỉ lệ 1:50, hàm lượng protein
thu hồi không khác nhau có ý nghĩa với hàm lượng thu hồi ở tỉ lệ 1:20. Do đó,
Jianmei Yu đã chọn tỉ lệ 1:20 làm tỉ lệ tối ưu trong quy trình sản xuất PPC, PPI.
(roasted fermented peanut flour).
Hình 1. 14: Ảnh hưởng của tỷ lệ bột nước đến khả năng hòa tan và độ thu hồi protein
đậu phộng tại pH 10.
1.10.2. Kích thƣớc mẫu
Khi nguyên liệu được nghiền nhỏ sẽ tăng diện tích tiếp xúc giữa chúng và dung
môi. Đồng thời còn làm phá vỡ cấu trúc tế bào, thúc đẩy quá trình tiếp xúc triệt để
giữa dung môi và nguyên liệu, nâng cao hiệu suất trích ly.
Hiệu suất trích ly còn phụ thuộc vào độ đồng nhất và độ hòa tan protein ban đầu
của nguyên liệu (Ted và cộng sự, 2007). Do đó, các kết quả về ảnh hưởng của kích
thước hạt đến hiệu suất trích ly thường không giống nhau. Bằng phương pháp thực
nghiệm xác định kích thước phù hợp với nguyên liệu đem trích ly.
1.10.3. Tính chất nguyên liệu
Pro
tein
tan
tron
g d
ịch
tríc
h (%
)
lƣợ
ng
prote
in t
an
(g)
/ 100g b
ột
Chƣơng 1: Tổng quan tài liệu
Trang 36
Tính chất của nguyên liệu cũng ảnh hưởng lớn đến hiệu suất trích ly. Nói chung,
hầu hết các nguồn nguyên liệu dùng trích ly protein đều có chứa một hàm lượng dầu
đáng kể 40-50% (w/w). Đối với nguồn nguyên liệu có chứa dầu như vậy cần phải tách
dầu trước khi tiến hành trích ly protein. Việc loại bỏ dầu sẽ ngăn chặn sự hình thành
nhũ tương trong trích ly. Đồng thời quá trình sản xuất protein không chứa dầu cũng
phù hợp với việc trích ly protein sau này vì dung môi trích ly thường là nước. (Abbot
và cộng sự, 1991; Kumagai và cộng sự, 2002).
Ở một số loại nguyên liệu, thành phần protein có chứa hàm lượng cao các
phytate, các hợp chất phenolic và các chất khác có thể gây hại, ảnh hưởng tới hiệu
suất trích ly protein hoặc làm thay đổi màu, giảm hương vị hoặc chức năng của
protein. Do đó, phải xử lý sơ bộ để loại bỏ các chất không mong muốn.
Ngoài ra hiệu suất trích ly phụ thuộc rất nhiều vào độ hòa tan của nguyên liệu
ban đầu. Nguyên liệu có độ hòa tan càng lớn thì hiệu suất thu hồi sản phẩm càng cao.
Nguyên liệu phù hợp để sản xuất protein phải có độ hòa tan (nitơ hòa tan- NSI) lớn
hơn 80%. Nghiên cứu trên bột đậu nành F.E. Mitidieri, J.R. Wagner (2002) cho thấy
mối quan hệ giữa chỉ số nitơ hòa tan và hiệu suất trích ly sản phẩm, phần trăm protein
thất thoát trong whey và còn lại trong bã.
Bảng 1. 16: Ảnh hưởng của NSI đến hiệu suất thu hồi sản phẩm
NSI (%) Sản phẩm (%) Whey (%) Bã sau khi trích ly protein (%)
84
65
22
75
65
51
11
11
9
14
24
40
1.10.4. pH
Tất cả các protein đều có một điểm đẳng điện mà tại đó các phân tử acid amin
trung hòa về điện, protein sẽ kết tủa xuống.
pH của môi trường trích ly phải phù hợp với từng loại protein nếu không sẽ xảy
ra hiện tượng kết tủa hoặc gây biến tính protein. Ở pH cao thì hàm lượng protein có
thể trích ly càng nhiều. Tuy nhiên, các protein có thể bị biến đổi hóa học trong dung
dịch kiềm mạnh. Các biến đổi này bao gồm sự biến tính protein và các thay đổi hóa
học trong các amino acid. pH cao còn xảy ra sự tương tác giữa protein và
carbohydrate (phản ứng Maillard), kết quả tạo ra các chất sẫm màu và giảm giá trị
dinh dưỡng. Như vậy, pH của dung môi trích ly sẽ ảnh hưởng đến tính hòa tan
protein. Tại pH trên và pH dưới điểm đẳng điện của protein, số nhóm tích điện sẽ tăng
Chƣơng 1: Tổng quan tài liệu
Trang 37
lên, sự tương tác tĩnh điện và hydrate hóa sẽ xảy ra, khả năng hòa tan sẽ tăng lên.
Theo nghiên cứu của Jianmei Yu và cộng sự (2007) đã cho thấy protein đậu hòa tan
kém nhất tại pH 4.5. Tại pH 10 khả năng protein hòa tan là tốt nhất.
(roasted fermented peanut flour). RWU
(raw fermented peanut flour).
Hình 1. 15: đậu phộng
=1/20 (w/v)
1.10.5. Nhiệt độ
Nhiệt độ cao làm cho các phân tử chuyển động nhanh từ đó hình thành các liên
kết hydro của phân tử protein với nước, điều này làm cho các liên kết giữa amino và
carboxyl dễ dàng bị phá vỡ. Nhưng khi nhiệt độ quá cao, là nguyên nhân chính gây
biến tính protein đậu phộng, đặc biệt là arachin. Giải thích cho vấn đề này, khi nhiệt
độ quá cao, nó tác động lên phân tử, có sự xắp xếp lại chuỗi peptide làm lộ ra các liên
kết kị nước điều này làm giảm hàm lượng protein trích ly trong dịch (Neucere, 1972).
1.10.6. Thời gian trích ly
Nếu thời gian quá ngắn thì hiệu quả trích ly không cao. Nếu thời gian dài sẽ tăng
hiệu quả của quá trình, tuy nhiên hiệu suất thu hồi chất chiết sẽ không tăng thêm đáng
kể. Mặc khác, thời gian trích ly quá dài sẽ xảy ra các quá trình không mong muốn như
hòa tan các chất khác vào nước làm cho protein lẫn tạp chất.
Hà
m l
ƣợ
ng
pro
tein
tan
(%
)
Chƣơng 2: Nguyên liệu và phƣơng pháp nghiên cứu
Trang 38
CHƢƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU
2.1. Nguyên liệu
Nguyên liệu đậu phộng sử dụng trong nghiên cứu này là giống đậu phộng VD1
trồng ở Tây Ninh được mua từ Viện nghiên cứu dầu và cây có dầu.
2.2. Enzyme
Chế phẩm enzyme được sử dụng là enzyme IndiAge Neutra L của công ty
Genencor. Enzyme IndiAge Neutra L là chế phẩm cellulase, thành phần chủ yếu là
endoglucanase. Điều kiên hoạt động tối ưu: pH = 4,5 – 6,2; nhiệt độ 50 – 55oC.
2.3. Hóa chất sử dụng
Gồm những hóa chất dưới đây (đạt tiêu chuẩn phân tích)
− DNS
− Potassium sodium tartrate tetrahydrate.
− NaOH
− Đệm citrate 0.05M, pH=4.8
− Đệm photphat pH= 7
− Glucose khan (Merck)
− Carboxymethyl cellulose CMC 2% pha trong đệm citrate 0,05M; pH 4.8
− H3BO3 3%
− Thuốc thử Metyl red Bromcresol
− H2SO4 đậm đặc 98%
− H2O2 30%
− Rượu ethylic 960
− H2SO4 0,1N chuẩn
Chƣơng 2: Nguyên liệu và phƣơng pháp nghiên cứu
Trang 39
2.4. Thiết bị sử dụng
− Thiết bị siêu âm: thiết bị siêu âm dạng thanh Sonicator®, model VC 750.
− Máy đo quang phổ
− Máy khuấy từ
− Máy đo pH
− Máy trộn mẫu ống nghiệm vortex
− Cân điện tử
− Bể điều nhiệt
− Thiết bị trích ly Soxhlet
− Máy ly tâm lạnh Mirko 22R.
− Máy vô cơ mẫu.
− Máy cất đạm Gerhardt.
2.5. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.5.1. Mục đích nghiên cứu
Bài luận văn có 2 phần chính:
Phần 1: Kiểm tra hoạt tính chế phẩm enzyme cellulase IndiAge Neutra L
− Ở điều kiện bình thường.
− Khảo sát ảnh hưởng của siêu âm đến hoạt tính enzyme.
Phần 2: thu nhận protein từ bột đậu phộng:
− Nghiên cứu ảnh hưởng của chế phẩm enzyme cellulase lên khả năng trích ly
protein trong bột đậu phộng tách béo,
− Nghiên cứu ảnh hưởng kết hợp của sóng siêu âm và enzyme lên khả năng trích
ly protein trong bột đậu phộng tách béo,
− Từ đó xác định các thông số công nghệ tối ưu để trích ly một cách có hiệu quả
và triệt để hàm lượng protein có trong nguyên liệu.
Chƣơng 2: Nguyên liệu và phƣơng pháp nghiên cứu
Trang 40
2.5.2. Nội dung nghiên cứu
2.5.2.1. Sơ đồ nghiên cứu
Hình 2. 1: Sơ đồ nghiên cứu
2.5.2.2. Chuẩn bị nguyên liệu
Nguyên liệu ban đầu được sử dụng là nhân đậu phộng và tiến hành tách béo để
sản xuất bột đậu phộng tách béo sử dụng cho quy trình khảo sát ảnh hưởng của sóng
siêu âm và enzyme để thu nhận protein.
Quy trình chuẩn bị bột đậu phộng tách béo như sơ đồ sau:
Xác định thành phần của bột đậu
phộng tách béo
Khảo sát quá trình trích ly protein
sử dụng chế phẩm enzyme hỗ trợ
Khảo sát quá trình trích ly
protein sử dụng sóng siêu âm kết
hợp với chế phẩm enzyme
Khảo sát ảnh hưởng của
sóng siêu âm đến hoạt tính
enzyme
Kiểm tra hoạt tính enzyme ở
điều kiện bình thường
Xác định thành phần của
nguyên liệu đậu phộng
Tối ưu hóa Tối ưu hóa
Chƣơng 2: Nguyên liệu và phƣơng pháp nghiên cứu
Trang 41
Hình 2. 2: Quy trình chuẩn bị bột đậu phộng tách béo
Tách vỏ
Nghiền
Trích ly béo
Làm khô
Rây 355 μm
Bảo quản
Đậu phộng
DPF
NaOH 0.5%
Petroleum ether
Chƣơng 2: Nguyên liệu và phƣơng pháp nghiên cứu
Trang 42
2.5.2.3. Ứng dụng chế phẩm enzyme cellulase trong quá trình trích ly
protein đậu phộng
Hình 2. 3: Quy trình ứng dụng chế phẩm enzyme hỗ trợ quá trình trích ly protein đậu
phộng
Quá trình thủy phân: bột đậu phộng được hòa vào nước theo tỉ lệ 1/20 (w/v).
Được chỉnh về pH 7 rồi đưa lên nhiệt độ 500C. Sau đó bổ sung enzyme và ủ.
Quá trình trích ly: dịch sau thủy phân được chỉnh về pH 9 với NaOH 1N.
Quá trình ly tâm: ly tâm ở 3500 v/phút, 150C trong 20 phút.
Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣởng của hàm lƣợng chế phẩm enzyme đến
hiệu suất trích ly protein đậu phộng
Mục đích: Quá trình sử dụng chế phẩm enzyme cellulase có thể làm tăng khả
năng trích ly protein đậu phộng. Do đó, cần tiến khảo sát xem với chế phẩm enzyme
IndiAge Neutra L thì với các hàm lượng enzyme khác nhau hiệu suất trích ly protein
trong mẫu đậu phộng tăng như thế nào.
Thông số cố định:
− Tỉ lệ bột/nước: 1/20 (w/v).
− Thời gian ủ enzyme: 90 phút.
Bột đậu phộng tách béo
Hòa tan
Ly tâm
Định lượng protein
Nước
Xử lý chế phẩm
enzyme cellulase
Bã
Chƣơng 2: Nguyên liệu và phƣơng pháp nghiên cứu
Trang 43
Thông số khảo sát: hàm lượng enzyme sử dụng: 3%, 4%, 5%, 6% (v/w)
Hàm mục tiêu: hiệu suất trích ly protein (%).
Thí nghiệm 2: Khảo sát thời gian xử lý enzyme đến hiệu suất trích ly
protein đậu phộng
Mục đích: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian xử lý bằng chế phẩm enzyme
IndiAge Neutra L đối với dịch huyền phù bột đậu phộng tách béo lên hiệu suất trích ly
protein.
Thông số cố định:
− Tỉ lệ bột/ nước: 1/20 (w/v).
− Hàm lượng enzyme: là hàm lượng tối ưu được chọn ở thí nghiệm 1.
Thông số khảo sát: thời gian xử lý enzyme: 30 phút, 60 phút, 90 phút, 120
phút.
Hàm mục tiêu: hiệu suất trích ly protein (%).
Thí nghiệm 3: Tối ƣu hóa nhiệt độ và thời gian xử lý enzyme theo phƣơng
pháp quy hoạch thực nghiệm
Mục đích: Để quá trình xử lý đạt hiệu quả hơn nữa, trong phần này, chúng tôi
tiến hành thí nghiệm tối ưu hóa theo phương pháp quy hoach thực nghiêm bậc hai tâm
xoay hai yếu tố, với hàm mục tiêu là hiệu suất trích ly protein, sử dụng phần mềm
Modde 5.0
Thông số cố định: Tỉ lệ bột : nước = 1/20 (w/v)
Thông số khảo sát:
− Yếu tố X1: hàm lượng chế phẩm enzyme (%v/w)
− Yếu tố X2: thời gian xử lý bằng chế phẩm enzyme (phút)
Hàm mục tiêu: hiệu suất trích ly protein (%)
Chƣơng 2: Nguyên liệu và phƣơng pháp nghiên cứu
Trang 44
2.5.2.4. Khảo sát ảnh hƣởng của siêu âm đến hoạt tính enzyme
Hình 2. 4: Quy trình khảo sát ảnh hưởng của sóng siêu âm đến hoạt tính chế phẩm
enzyme IndiAge Neutra L
Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hƣởng của cƣờng độ siêu âm đến hoạt tính
enzyme:
Mục đích: Quá trình xử lý siêu âm có thể làm tăng hoặc giảm hoạt tính của
chế phẩm enzyme. Do đó, cần tiến hành kiểm tra xem với chế phẩm enzyme IndiAge
Neutra L thì siêu âm sẽ làm tăng hay giảm hoạt tính của nó.
Thông số cố định:
- Hàm lượng enzyme (%v/v): hàm lượng tối ưu từ thí nghiệm 1.
- pH siêu âm: 7
- Nhiệt độ siêu âm: t = 30oC
- Thời gian siêu âm: 60 giây
Thông số khảo sát: Cường độ siêu âm: 1,875W/ml; 3,75 W/ml; 5,625W/ml và
7,5W/ml.
Hàm mục tiêu: hoạt tính chế phẩm enzyme IndiAge Neutra L (IU/ml)
Xử lý sóng siêu âm
Chế phẩm Enzyme IndiAge
Neutra L
Pha loãng
So sánh
Đệm
Xác định hoạt tính Xác định hoạt tính
Chƣơng 2: Nguyên liệu và phƣơng pháp nghiên cứu
Trang 45
Thí nghiệm 5: Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian siêu âm đến hoạt tính
enzyme
Mục đích: Quá trình xử lý siêu âm có thể làm tăng hoặc giảm hoạt tính của
chế phẩm enzyme. Do đó, cần tiến hành kiểm tra xem với chế phẩm enzyme IndiAge
Neutra L thì thời gian siêu âm ảnh hường thế nào đến hoạt tính của nó.
Thông số cố định:
- Hàm lượng enzyme (%v/v): hàm lượng tối ưu từ thí nghiệm 1
- pH siêu âm: 7
- Nhiệt độ siêu âm: t = 30oC
- Cường độ siêu âm: 3,75 W/ml
Thông số khảo sát: Thời gian siêu âm: thay đồi từ 10, 20, 30, 40, 50, 60 giây.
Hàm mục tiêu: hoạt tính chế phẩm enzyme IndiAge Neutra L (IU/ml)
Chƣơng 2: Nguyên liệu và phƣơng pháp nghiên cứu
Trang 46
2.5.2.5. Ứng dụng sóng siêu âm kết hợp với chế phẩm enzyme hỗ trợ
quá trình trích ly protein từ dịch trích đã xử lý bằng sóng siêu âm
Hình 2. 5: Quy trình trích ly protein khi kết hợp sóng siêu âm và enzyme
Thí nghiệm 6: Khảo sát ảnh hƣởng của hàm lƣợng enzyme sử dụng đến hiệu
suất trích ly protein từ dịch trích đã xử lý bằng sóng siêu âm
Mục đích: Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng enzyme sử dụng đến hiệu suất
trích ly protein khi kết hợp xử lý sóng siêu âm và chế phẩm enzyme IndiAge Neutra L
vào quá trình trích ly protein đậu phộng.
Thông số cố định:
− Tỉ lệ bột/ nước: 1/20 (w/v).
− Cường độ siêu âm : 30W/g.
− Thời gian siêu âm: là thời gian tối ưu trong thí nghiệm khảo sát quá trình
trích ly protein sử dụng sóng siêu âm : 17 phút
Xử lý sóng siêu âm
Bột đậu phộng tách béo
Hòa tan
Trích ly
Ly tâm
Định lượng protein
Nước
Lỏng
Xử lý enzyme
Chƣơng 2: Nguyên liệu và phƣơng pháp nghiên cứu
Trang 47
− Nhiệt độ siêu âm: là nhiệt độ tối ưu trong thí nghiệm khảo sát quá trình
trích ly protein sử dụng sóng siêu âm: 57oC.
− Thời gian xử lý enzyme : 90 phút.
Thông số khảo sát: Hàm lượng enzyme sử dụng: 0%, 1%, 2%, 3%, 4% (v/w)
Hàm mục tiêu: hiệu suất trích ly protein (%)
Thí nghiệm 7: Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian xử lý enzyme đến hiệu suất
trích ly protein từ dịch trích đã xử lý bằng sóng siêu âm:
Mục đích: Khảo sát ảnh hưởng của thời gian xử lý enzyme đến hiệu suất trích
ly protein khi kết hợp xử lý sóng siêu âm và chế phẩm enzyme IndiAge Neutra L vào
quá trình trích ly protein đậu phộng.
Thông số cố định:
− Tỉ lệ bột/ nước: 1/20 (w/v).
− Cường độ siêu âm: 30W/g.
− Thời gian siêu âm: là thời gian tối ưu trong thí nghiệm khảo sát quá trình
trích ly protein sử dụng sóng siêu âm : 17 phút
− Nhiệt độ siêu âm: là nhiệt độ tối ưu trong thí nghiệm khảo sát quá trình
trích ly protein sử dụng sóng siêu âm: 57oC.
− Hàm lượng enzyme : hàm lượng tối ưu ở thí nghiệm 6.
Thông số khảo sát: Thời gian xử lý enzyme: 30 phút, 60 phút, 90 phút.
Hàm mục tiêu: hiệu suất trích ly protein (%)
Thí nghiệm 8: Tối ƣu hóa hàm lƣợng và thời gian xử lý enzyme đến hiệu
suất trích ly protein:
Thông số cố định:
− Tỉ lệ bột/ nước: 1/20 (w/v).
− Cường độ siêu âm : 30W/g.
− Thời gian siêu âm: là thời gian tối ưu trong thí nghiệm khảo sát quá trình
trích ly protein sử dụng sóng siêu âm : 17 phút
− Nhiệt độ siêu âm: là nhiệt độ tối ưu trong thí nghiệm khảo sát quá trình
trích ly protein sử dụng sóng siêu âm: 57oC.
Chƣơng 2: Nguyên liệu và phƣơng pháp nghiên cứu
Trang 48
Thông số khảo sát:
− Yếu tố X1: hàm lượng chế phẩm enzyme (%v/w)
− Yếu tố X2: thời gian xử lý bằng chế phẩm enzyme (phút)
Hàm mục tiêu: hiệu suất trích ly protein (%).
2.6. Các phƣơng pháp phân tích
2.6.1. Xác định độ ẩm
Nguyên tắc: Sấy mẫu cần phân tích có khối lượng ban đầu là mo đến khối
lượng không đổi m1.
2.6.2. Xác định độ tro
Nguyên tắc: Dùng sức nóng ở 600oC để nung cháy hoàn toàn các hợp chất
hữu cơ. Phần còn lại đem cân và tính ra phần trăm tro trong thực phẩm.
2.6.3. Xác định hàm lƣợng lipid
− Nguyên tắc: dùng dung môi kị nước trích ly hoàn toàn lipid từ nguyên liệu
đậu phộng đã được tách vỏ lụa và nghiền nhỏ. Một số thành phần tan trong chất béo
cũng được trích ly theo bao gồm sắc tố, vitamin tan trong chất béo, các chất mùi… Do
có lẫn tạp chất, phần trích ly được gọi là lipid tổng hay dầu thô.
2.6.4. Xác định hàm lƣợng protein tổng
Nguyên tắc:
Khi đốt nóng mẫu đem phân tích với H2SO4 đậm đặc, các hợp chất hữu cơ
bị oxy hóa. Carbon và Hydro tạo thành CO2 và H2O. Còn Nitơ sau khi được giải
phóng ra dưới dạng NH3 sẽ kết hợp với H2SO4 tạo thành (NH4)2SO4 tan trong dung
dịch. Đuổi NH3 ra khỏi dung dịch bằng NaOH đồng thời cất và thu NH3 bằng một
lượng dư H3BO3 3%. Chuẩn độ bằng H2SO4 0,1N chuẩn sẽ xác định được lượng NH3
sinh ra.
Trước tiên mẫu được vô cơ hóa bằng H2SO4 đậm đặc ở nhiệt độ cao và có
chất xúc tác. Các phản ứng của quá trình oxy hóa xảy ra như sau:
2 4 2 2 22 2 2H SO H O SO O
Chƣơng 2: Nguyên liệu và phƣơng pháp nghiên cứu
Trang 49
Oxy tạo thành lại oxy hóa các nguyên tố khác: Carbon tạo thành CO2,
Hydro tạo thành H2O, còn Nitơ giải phóng ra dưới dạng NH3 kết hợp với H2SO4 dư tạo
thành (NH4)2SO4 tan trong dung dịch:
3 2 4 4 42NH H SO NH SO
Đuổi NH3 ra khỏi dung dịch bằng NaOH:
4 4 2 4 2 322 2NH SO NaOH Na SO H O NH
NH3 bay ra cùng với nước sang bình hứng, trong bình hứng chứa H3BO3:
4 3 3 4 4 7 222 4 7NH OH H BO NH B O H O
Trong dung dịch này, NH3 tồn tại dưới dạng ion NH4+
và giải phóng ra ion
H2BO3-. Chuẩn độ lượng ion này bằng H2SO4 chuẩn sẽ xác định được lượng NH3 sinh
ra. Từ đó, suy ra được lượng đạm trong mẫu nguyên liệu.
2.6.5. Hiệu suất trích ly protein
1002
1
m
mH
H: hiệu suất trích ly protein (%)
m1: khối lượng protein có trong dịch trích thu được.
m2: khối lượng protein có trong nguyên liệu bột đậu phộng tách béo.
2.6.6. Xác định hoạt tính enzyme cellulase
Nguyên tắc: khi enzyme tác dụng trên cơ chất cellulose, dưới tác dụng của phức
hệ enzyme cellulase, cơ chất bị phân giải tạo thành một lượng đường khử. Đường khử
sẽ phản ứng với 3,5-dinitrosalicylic acid DNS . Dùng phương pháp so màu DNS ta xác
định lượng đường khử tạo thành từ đó tính được hoạt độ enzyme.
Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độ đường khử trong
một phạm vi nhất định, được đo bằng máy quang phổ so màu. Dựa theo đồ thị đường
chuẩn của glucose tinh khiết với thuốc thử, ta sẽ tính được hàm lượng đường khử của
mẫu nghiên cứu. Hợp chất tạo thành có độ hấp thu mạnh nhất trong khoảng bước sóng
540-600nm.
Chƣơng 2: Nguyên liệu và phƣơng pháp nghiên cứu
Trang 50
NO2 OH
COOH
NO2
3C6H12O6 + + 4NaOH
NH2 OH
COONa
NO2
3C5H11COONa + 3H 2O
2.6.7. Phƣơng pháp xử lý số liệu
Chúng tôi sử dụng phần mềm ứng dụng STATGRAPHICS 3.0 để xử lý số liệu,
đưa ra bảng so sánh giá trị trung bình giữa các mẫu khác nhau có nghĩa hay không (p <
0,05). Ngoài ra chúng tôi còn sử dụng phần mềm tối ưu hóa Modde 5.0
Chƣơng 3: Kết quả và bàn luận
Trang 51
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1 Khảo sát thành phần của nguyên liệu đậu phộng
Bảng 3. 1: Thành phần hóa học của mẫu đậu phộng
Thành phần Hàm lượng (%)
Protein (N x 5,47) 22,16 ± 0,21
Lipid 48,29 ± 0,75
Tro 2,27 ± 0,09
Ẩm 6,48 ± 0,31
Thành phần khác 20,8 ± 0,59
Theo bảng 3.1, hàm lượng protein, lipid, tro và ẩm của đậu phộng có giá trị trung
bình lần lượt là 22,16%; 48,29%; 2,27% và 6,48%.
Theo nghiên cứu của C.L. Hoffpauir (1953) thì hàm lượng protein là 28,53% khi
tác giả chọn hệ số hiệu chỉnh F trong công thức tính hàm lượng đạm tổng là 6,25.
Trong khi chúng tôi chọn hệ số hiệu chỉnh F là 5,47 (AOAC, 1995).
Các thành phần khác có sự khác nhau nhưng không đáng kể có thể do sự khác
nhau về giống, vào sự biến động của các điều kiện khí hậu giữa các năm, vào vị trí hạt
ở quả, các yếu tố không bình thường như sâu, bệnh…
3.2 Khảo sát thành phần của bột đậu phộng tách béo
Bảng 3. 2: Thành phần hóa học của bột đậu phộng tách béo
Thành phần Hàm lượng (%)
Protein (N x 5,47) 46,12 ± 0,17
Lipid 1,94 ± 0,33
Tro 4,81 ± 0,14
Ẩm 7,91 ± 0,69
Thành phần khác 39,22 ± 0,51
Theo bảng 3.2, hàm lượng protein, lipid, tro và ẩm của mẫu đậu phộng sau khi đã
tách béo có giá trị trung bình lần lượt là 46,12%; 1,94%; 4,81% và 7,91%.
Chƣơng 3: Kết quả và bàn luận
Trang 52
Theo khuyến cáo của S.Jung, (2006) khi nghiên cứu quá trình ứng dụng enzyme
để trích ly protein đậu nành để quá trình trích ly hiệu quả thì hàm lượng lipid còn sót
không quá 2%. Còn K. Suknark và cộng sự (1991) vẫn tiến hành trích ly protein khi
hàm lượng lipid còn sót đến 11,19%. Do đó hàm lượng lipid sót trong bột đậu phộng
tách béo của chúng tôi là 1,94% là thích hợp cho quá trình trích ly protein.
3.3. Khảo sát quá trình trích ly protein đậu phộng sử dụng chế phẩm
enzyme cellulase hỗ trợ
Protein trong thực vật tồn tại dưới dạng liên kết với các thành phần khác như
polysaccharide, hemicellulose….(Ismal, 1987). Để tách protein từ cấu trúc phức tạp
này cần phải phá vỡ cấu trúc mô thực vật. Trong công nghiệp sản xuất PC và PI, quá
trình trích ly protein được bổ sung các chế phẩm enzyme cellulase, hemicellulase,…
để tăng hiệu quả trích ly.
Quá trình sử dụng enzyme để trích ly protein phụ thuộc vào những điều kiện
khác nhau: loại enzyme, hàm lượng enzyme, nhiệt độ, thời gian phản ứng. Do đó,
trong phần nghiên cứu này, chúng tôi khảo sát các thông số công nghệ thích hợp (hàm
lượng enzyme và thời gian xử lý) cho chế phẩm enzyme cellulase IndiAge Neutra L
trong việc ứng dụng vào quá trình trích ly protein từ bột đậu phông tách béo.
3.3.1. Khảo sát ảnh hƣởng của hàm lƣợng chế phẩm enzyme IndiAge
Neutra L sử dụng đến hiệu suất trích ly protein đậu phộng
Dịch trích bột đậu phộng tách béo được xử lý bằng chế phẩm enzyme IndiAge
Neutra L với các hàm lượng 0%, 3%, 4%, 5%, 6% (v/w), thời gian xử lý 90 phút ở
nhiệt độ 500C và pH 7. Từ đó khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng enzyme đến hiệu quả
trích ly protein đậu phộng.
Kết quả hiệu suất trích ly protein thu được ứng với các mẫu xử lý ở các hàm
lượng enzyme khác nhau được trình bày ở bảng 3.3, hình 3.1
Chƣơng 3: Kết quả và bàn luận
Trang 53
Bảng 3. 3: Ảnh hưởng của hàm lượng chế phẩm enzyme sử dụng đến hiệu suất
trích ly protein
Hàm lượng chế phẩm enzyme (% v/w) Hiệu suất trích ly protein (%)
0% 68,80 ± 0,47a
3% 69,76 ± 0,59b
4% 71,68 ± 0,59c
5% 75,70 ± 0,47d
6% 75,89 ± 0,73d
Các giá trị có cùng kí tự (được kí hiệu ở phía trên bên phải mỗi chữ số) trong cùng một cột thì sự khác
nhau giữa chúng không có ý nghĩa (α = 0.05).
Hình 3. 1: Ảnh hưởng của hàm lượng enzyme sử dụng đến hiệu suất trích ly protein
Chƣơng 3: Kết quả và bàn luận
Trang 54
− Kết quả cho thấy, khi tăng hàm lượng chế phẩm enzyme từ 0% (v/w) lên đến
5% (v/w) thì hiệu suất trích ly tăng 10,03% từ 68,80% đến 75,70%.
− Khi tăng hàm lượng chế phẩm enzyme lên cao hơn nữa (6%), hiệu suất trích ly
protein thu được là 75,89% - không khác nhau có ý nghĩa so với hiệu suất trích ly ở
hàm lượng enzyme 5% (p < 0,05).
Mô thực vật có cấu trúc khá vững chắc. Cellulose của thành tế bào được hình
dung như que thép và phiến mỏng chất pectinic như bê tông (Mudgett và cộng sự,
1978). Protein trong thực vật tồn tại dưới dạng liên kết với các thành phần khác như
polysaccharide, hemicellulose….(Ismal, 1987). Phần lớn protein liên kết với các
polysaccharide. Do đó để tách protein từ cấu trúc phức tạp này cần phải phá vỡ cấu
trúc mô thực vật. Enzyme có thể sử dụng để phá vỡ cấu trúc này như cellulase,
hemicellulase, -glucanase, arabanase, xylanase,…Ở đây, chúng tôi sử dụng chế phẩm
enyme cellulase để thực hiện quá trình thủy phân để phá vỡ cấu trúc thành tế bào đậu
phộng.
Enzyme IndiAge Neutra L có hoạt tính cellulase để phá vỡ cấu trúc thành tế bào
đậu phộng. Chế phẩm enzyme IndiAge Neutra L có thành phần chính là:
endoglucanase, ngoài ra còn có cellobiohydrolase và -D-glucoside glucohydrolase.
Khi chế phẩm enzyme IndiAge Neutra L tiếp xúc với cơ chất thì endoglucanase
sẽ tấn công vào giữa mạch cellulose cắt đứt liên kết -1,4 glucoside giải phóng đoạn
đầu và cuối của chuỗi. Tiếp sau đó các cellobiohydrolase tiếp tục phân cắt để tạo sản
phẩm là cellobiose. Cuối cùng là phần tác dụng của enzyme -D-glucoside
glucohydrolase tạo ra sản phẩm cuối cùng là glucose. Sự phân cắt này gây vỡ thành tế
bào, đứt các liên kết trong khung sườn vững chắc, làm lộ các protein và các liên kết
peptide háo nước của phân tử. Đồng thời enzyme này còn thủy phân các
polysaccharide, cắt đứt các liên kết giữa protein với các polysacchride, giải phóng
protein khỏi các liên kết đó làm tăng khả năng hòa tan của protein trong dịch trích.
Chƣơng 3: Kết quả và bàn luận
Trang 55
Hình 3. 2: Cơ chế thủy phân cellulose thành glucose của enzyme cellulase
Nguồn: F.S., P.A. Matson, H.A. Mooney (2002)
Tuy nhiên, hàm lượng cellulose trong tế bào có một giá trị giới hạn, khi cellulose
được phân cắt đến một mức độ nào đó thì việc bổ sung dư lượng chế phẩm enzyme
cũng không làm phá vỡ thêm cấu trúc thành tế bào được nữa thì hiệu suất trích ly
protein cũng không tăng thêm đáng kể. Tương ứng như trong thí nghiệm này khi tăng
hàm lượng chế phẩm enzyme sử dụng lên 6% (v/w) thì hiệu suất trích ly thu được
không khác nhau có ý nghĩa so với khi sử dụng ở hàm lượng 5% (v/w).
Qua thí nghiệm này, ta thấy việc sử dụng chế phẩm enzyme IndiAge Neutra L
làm tăng hiệu suất trích ly protein đậu phộng. Yếu tố hàm lượng enzyme là một trong
những yếu tố quan trọng trong quá trình xử lý. Ở hàm lượng 5% (v/w) thì hiệu suất
trích ly protein đạt được là cao nhất do đó ta chọn hàm lượng enzyme là 5% (v/w) để
khảo sát những thí nghiệm tiếp theo.
Chƣơng 3: Kết quả và bàn luận
Trang 56
3.3.2. Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian xử lý enzyme đến hiệu suất trích
ly protein đậu phộng
Trong thí nghiệm này dịch trích bột đậu phộng tách béo được xử lý bằng chế
phẩm enzyme IndiAge Neutra L ở hàm lượng 5% (v/w); thời gian xử lý từ 0, 30, 60,
90 đến 120 phút tại nhiệt độ 500C và pH 7. Từ đó khảo sát ảnh hưởng của thời gian xử
lý enzyme đến hiệu quả trích ly protein.
Kết quả hiệu suất trích ly protein thu được ứng với các mẫu xử lý bằng chế phẩm
enzyme ở các thời gian khác nhau được trình bày ở bảng 3.4, hình 3.2.
Bảng 3. 4: Ảnh hưởng của thời gian xử lý enzyme đến hiệu suất trích ly protein
Thời gian (phút) Hiệu suất trích ly protein (%)
0 68,71 ± 0,43a
30 69,86 ± 0,43b
60 73,02 ± 0,57c
90 75,51 ± 0,51d
120 76,09 ± 0,64d
Các giá trị có cùng kí tự (được kí hiệu ở phía trên bên phải mỗi chữ số) trong cùng một cột thì sự khác
nhau giữa chúng không có ý nghĩa (α = 0.05).
Hình 3. 3: Ảnh hưởng của thời gian xử lý enzyme đến hiệu suất trích ly protein
Chƣơng 3: Kết quả và bàn luận
Trang 57
− Khi tăng thời gian xử lý enzyme đến 90 phút, hiệu suất trích ly protein thu
được tăng 8,84% từ 68,71% đến 75,51%.
− Khi tăng thời gian xử lý hơn nữa (120 phút), hiệu suất trích ly protein là
76,09% - thay đổi không có ý nghĩa so với hiệu suất trích ly ở 90 phút (p<0,05).
Khi cho enzyme vào dịch huyền phù bột đậu phộng tách béo, cần có thời gian để
đại phân tử enzyme khuếch tán đi qua các mạng lưới vi sợi cellulose, tiếp xúc với cơ
chất, gắn vào cơ chất và xúc tác phản ứng phân cắt cơ chất. Khi tăng thời gian xử lý
enzyme thì hiệu quả xử lý sẽ càng tăng nhưng thời gian này chỉ tăng đến một giá trị
nhất định.
Ngoài ra, theo nghiên cứu của Hatfield và Ralph (1998) các liên kết ngang
diferulate của polysaccharide làm giảm khả năng tiến đến và làm giảm hoạt tính của
enzyme thủy phân đến polysaccharide cấu trúc trong thành tế bào. Do đó, khả năng
xúc tác của enzyme trong thời gian đầu xử lý không cao. Kết quả là mạng lưới khung
thành tế bào chưa phá hủy triệt để nên vẫn còn gây cản trở quá trình khuếch tán các
chất. Do đó trong khoảng thời gian đầu (30 phút đầu) ta thấy hiệu suất trích ly protein
còn thấp.
Khi thời gian xử lý kéo dài đến 120 phút, các trung tâm hoạt động có thể đã bị
bão hòa hay mạch cellulose đã bị phân cắt đến một chiều dài nhất định thì phản ứng
xúc tác của enzyme sẽ dừng lại. Khi đó có tiếp tục kéo dài thời gian xử lý thì hiệu quả
của quá trình cũng không tăng. Ở thí nghiệm này, 90 phút là giá trị thích hợp cho quá
trình trích ly protein đậu phộng bằng chế phẩm enzyme cellulase IndiAge Neutra L để
hiệu suất thu nhận protein đạt giá trị cao nhất.
3.3.3. Tối ƣu hóa hàm lƣợng enzyme và thời gian xử lý enzyme đến hiệu
suất trích ly protein đậu phộng
Để quá trình sử dụng enzyme hỗ trợ quá trình trích ly protein đạt hiệu quả hơn
nữa, trong phần này chúng tôi tiến hành thí nghiệm theo phương pháp quy hoạch thực
nghiệm, bậc hai tâm xoay hai yếu tố, với hàm mục tiêu là hiệu suất trích ly protein.
Ở thí nghiệm này hai yếu tố hàm lượng và thời gian xử lý enzyme đồng thời
được thay đổi, từ đó xác định quy luật ảnh hưởng của hai yếu tố này đến hàm mục tiêu
là hiệu suất trích ly protein và thiết lập phương trình hồi quy. Trên cơ sở đó, chọn ra
các thông số tối ưu của thí nghiệm để đạt được hiệu suất trích ly protein cao nhất.
− Số thí nghiệm tối ưu là N = 12 thí nghiệm trong đó có 4 thí nghiệm ở tâm
phương án.
− Hàm mục tiêu cần tối ưu: hiệu suất trích ly protein (%)
Chƣơng 3: Kết quả và bàn luận
Trang 58
− Các giá trị khảo sát của hai yếu tố tối ưu như sau:
Hàm lượng enzyme: X1 [4; 6]; với tâm là X1 = 5% (v/w)
Thời gian xử lý: X2 [60; 120]; với tâm là X2 = 90 (phút).
− Kết quả của thí nghiệm tối ưu hóa được trình bày trong bảng 3.5
Bảng 3. 5: Ma trận quy hoạch thực nghiệm bậc hai tâm xoay, hai yếu tố và kết quả
thực nghiệm
Số thí
nghiệm
Run
Order X1 X2
X1
(% v/w)
X2
(phút) Y (%)
N1 11 -1 -1 4 60 70,53 ± 0,59
N2 2 +1 -1 6 60 75,7 ± 0,87
N3 10 -1 +1 4 120 75,13 ± 0,94
N4 3 +1 +1 6 120 75,89 ± 0,73
N5 1 - 2 0 3,586 90 70,72 ± 0,63
N6 12 + 2 0 6,414 90 76,47 ± 0,63
N7 8 0 - 2 5 47,58 71,87 ± 0,63
N8 4 0 + 2 5 132,42 76,09 ± 0,47
N9 5 0 0 5 90 75,89 ± 0
N10 7 0 0 5 90 75,51 ± 0,66
N11 9 0 0 5 90 76,28 ± 0,66
N12 6 0 0 5 90 75,7 ± 0,33
Trong đó:
X1 : Hàm lượng chế phẩm enzyme (% v/w)
X2 : Thời gian xử lý enzyme (phút)
Y : Hiệu suất trích ly protein (%)
Theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm bậc hai tâm xoay, phương trình hồi
quy của mỗi hàm mục tiêu được biểu diễn theo dạng sau:
2112
2
222
2
11122110 XXbXbXbXbXbbY
Chƣơng 3: Kết quả và bàn luận
Trang 59
Giải bài toán quy hoạch thực nghiệm cho hàm mục tiêu bằng phần mềm Modde
5.0, ta nhận được các kết quả như trong bảng 3.6
Bảng 3. 6: Ảnh hưởng của các biến độc lập đến hiệu suất trích ly protein
Giá trị Hệ số Sai số chuẩn Giá trị P Khoảng tin cậy (±)
bo 75,8449 0,2628 1,17E-13 0,642975
b1 1,75783 0,1858 7,94E-05 0,454686
b2 1,34484 0,1858 0,0003532 0,454686
b11 -0,9939 0,2078 0,0030527 0,508424
b22 -0,8013 0,2078 0,0083962 0,508424
b12 -1,1025 0,2628 0,0057128 0,642975
Bảng 3.6 cho thấy các tác động của biến đều có ảnh hưởng đến giá trị của Y do P
< 0,05. Từ các hệ số của bảng 3.6, ta thiết lập được phương trình hồi quy:
Từ phương trình hồi quy, ta có nhận xét sau:
− Cà hai yếu tố hàm lượng enzyme và thời gian xử lý enzyme đều ảnh hưởng
đến hiệu suất trích ly protein theo hàm bậc hai.
− Có sự tương tác giữa hàm lượng enzyme và thời gian xử lý.
− Yếu tố hàm lượng enzyme có ảnh hưởng nhiều hơn so với thời gian xử lý.
Phương trình hồi quy biểu diễn trên ba trục tọa độ không gian ba chiều, được mặt
cong như hình 3.4
21
2
2
2
121 1,1801,0994.0344,1758,1845,75 XXXXXXY
Chƣơng 3: Kết quả và bàn luận
Trang 60
Hình 3. 4: Ảnh hưởng của hàm lượng và thời gian xử lý enzyme lên hiệu suất trích ly
protein
Hình 3. 5: Hình chiếu bề mặt biểu diễn phương trình hồi quy trên mặt phẳng tọa độ
Chƣơng 3: Kết quả và bàn luận
Trang 61
Với phần mềm Modde 5.0, chúng tôi tìm ra được điều kiện tối ưu khi ứng dụng
chế phẩm enzyme IndiAge Neutral L hỗ trợ quá trình trích ly protein đậu phộng như
sau:
− Hàm lượng chế phẩm enzyme: 5,69 % (v/w)
− Thời gian xử lý: 100,89 phút
− Hiệu suất trích ly protein thu được: 76,69 % tăng 11,47% so với mẫu không
xử lý enzyme (hiệu suất 68,8 %)
3.4. Khảo sát ảnh hƣởng của sóng siêu âm đến hoạt tính chế phẩm
enzyme cellulase IndiAge Neutra L
3.4.1. Khảo sát ảnh hƣởng của cƣờng độ siêu âm đến hoạt tính chế phẩm
enzyme cellulase IndiAge Neutra L
Chế phẩm enzyme cellulase IndiAge Neutra L được pha trong dung dịch đệm
với hàm lượng 0,25% (v/v). Sau đó, đem xử lý siêu âm ở các mức năng lượng
1,875W/ml; 3,75 W/ml; 5,625W/ml và 7,5W/ml trong thời gian 60 giây để khảo sát
ảnh hưởng của cường độ siêu âm đến hoạt tính chế phẩm enzyme.
Hoạt tính enzyme cellulase IndiAge Neutra L ứng với các mẫu xử lý siêu âm ở
các mức năng lượng khác nhau được trình bày bảng 3.7, hình 3.6
Bảng 3. 7: Ảnh hưởng của cường độ siêu âm đến hoạt tính chế phẩm enzyme IndiAge
Neutra L
Cường độ siêu âm (W/ml) Hoạt tính chế phẩm enzyme (IU/ml)
0 1083,85 ± 2,41a
1,875 1049,73 ± 8,09 b
3,75 942,61 ± 9,46c
5,625 878,4 ± 1,46d
7,5 838,35 ± 2,42e
Các giá trị có cùng kí tự (được kí hiệu ở phía trên bên phải mỗi chữ số) trong cùng một cột thì
sự khác nhau giữa chúng không có ý nghĩa (α = 0.05).
Chƣơng 3: Kết quả và bàn luận
Trang 62
Hình 3. 6: Ảnh hưởng của cường độ siêu âm đến hoạt tính chế phẩm enzyme IndiAge
Neutra L
Khi tăng cường độ siêu âm từ 0 W/ml lên đến 7,5 W/ml thì hoạt tính enzyme
giảm 22,65% (từ 1083,85 IU/ml xuống còn 838,35 IU/ml)
Và khi tăng mức năng lượng cao hơn nữa thì hoạt tính chế phẩm enzyme
cellulase càng giảm nhiều hơn. Ngoài ra khi giảm cường độ siêu âm xuống 1,25 W/ml;
0,75 W/ml thì kết quả là hoạt tính enzyme vẫn giảm có ý nghĩa so với mẫu đối chứng
(kết quả đó không được trình bày ở đây).
So sánh với một số nghiên cứu khác:
Theo các nghiên cứu trước đây, dưới những điều kiện ổn định, sóng siêu âm có
những tác động rất khác nhau đến các chế phẩm enzyme khác nhau. Sóng siêu âm có
thể làm giảm hoạt tính của một số chế phẩm enzyme như β-galactosidase, malate
dehydrogenase, alcohol dehydrogenase (Ozbek và Ulgen, 2000), peroxidase (Gennaro
và cộng sự 1999). Hoặc cũng có thể làm tăng hoạt tính của một số chế phẩm enzyme
khác như invertase (M. Sakakibara và cộng sự, 1996; Vargas và cộng sự, 2004), alpha
amylase (Barton và cộng sự - 1996; M. Yaldagard và cộng sự - 2007), lipase (Babicz
và cộng sự, 2010). Ngoài ra, với enzyme alkaline phosphatase thì hoạt tính lại không
thay đổi dưới tác dụng của sóng siêu âm ở mức năng lượng 7W – 40W, tần số 20 kHz
trong thời gian xử lý siêu âm là 1 phút (Ozbek và Ulgen, 2000).
Chƣơng 3: Kết quả và bàn luận
Trang 63
Ngay cả khi hai chế phẩm enzyme có hoạt tính giống nhau, nhưng được thu nhận
từ các nguồn khác nhau thì sóng siêu âm cũng có những tác động khác nhau. R.
Kadkhodaee và M.J.W. Povey (2006) khi tiến hành nghiên cứu tác động của siêu âm
lên chế phẩm enzyme α-amylase từ Bacillus amyloliquefacients đã cho rằng sóng siêu
âm làm giảm hoạt tính enzyme này. Trong khi theo nghiên cứu của M. Yaldagard và
cộng sự (2007) thì sóng siêu âm lại làm tăng hoạt tính của chế phẩm enzyme α-
amylase từ lúa mạch.
Sóng siêu âm có thể gây ra những tác động khác nhau như vậy đến hoạt tính
enzyme được giải thích là do ảnh hưởng hóa học và vật lý của siêu âm vô hoạt hay
hoạt hóa những enzyme khác nhau phụ thuộc vào trạng thái của enzyme và điều kiện
xử lý (Huihua Huang và cộng sự, 2007). Điều này có thể giải thích những bài trái
ngược về ảnh hưởng của siêu âm lên hoạt độ xúc tác của enzyme. Huihua Huang cũng
cho rằng siêu âm có thể ảnh hưởng lên cấu trúc của enzyme dẫn đến sự thay đổi trung
tâm hoạt động, cũng như thay đổi vị trí tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất .
Kết quả từ thí nghiệm này cho thấy xử lý sóng siêu âm đã làm giảm hoạt tính của
chế phẩm enzyme cellulase IndiAge Neutra L. Mức năng lượng càng cao thì hoạt tính
của chế phẩm enzyme càng giảm. Ngoài bị ảnh hưởng bởi cường độ siêu âm, hoạt tính
enzyme còn bị ảnh hưởng bởi thời gian siêu âm. Ở thí nghiệm kế tiếp chúng tôi sẽ
khảo sát ảnh hưởng của thời gian siêu âm đến hoạt tính chế phẩm enzyme IndiAge
Neutra L.
3.4.2. Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian siêu âm đến hoạt tính enzyme
cellulase IndiAge Neutra L
Chế phẩm enzyme cellulase IndiAge Neutra L được pha trong dung dịch đệm với
hàm lượng 0,25% (v/v). Sau đó, đem xử lý siêu âm ở các mức năng lượng 3,75 W/ml
với thời gian thay đổi từ 10, 20, 30, 40, 50, 60 giây để khảo sát ảnh hưởng của thời
gian siêu âm đến hoạt tính chế phẩm enzyme.
Khi xử lý chế phẩm enzyme cellulase IndiAge Neutra L bằng sóng siêu âm thu
được các hoạt tính enzyme ứng với các mẫu xử lý siêu âm ở các thời gian khác nhau
như kết quả ở bảng 3.8, hình 3.7.
Chƣơng 3: Kết quả và bàn luận
Trang 64
Bảng 3. 8: Ảnh hưởng của thời gian siêu âm đến hoạt tính chế phẩm enzyme IndiAge
Neutra L
Thời gian siêu âm (giây) Hoạt tính chế phẩm enzyme (IU/ml)
0 1083,85 ± 2,41a
10 1064,16 ± 3,31b
20 1013,94 ± 1,69c
30 982,03 ± 5,25d
40 965,31 ± 4,3e
50 953,81 ± 5,84ef
60 942,61 ± 9,46f
Các giá trị có cùng kí tự (được kí hiệu ở phía trên bên phải mỗi chữ số) trong cùng một cột thì sự khác
nhau giữa chúng không có ý nghĩa (α = 0.05).
Hình 3. 7: Ảnh hưởng của thời gian siêu âm đến hoạt tính chế phẩm enzyme IndiAge
Neutra L
Chƣơng 3: Kết quả và bàn luận
Trang 65
− Khi tăng thời gian siêu âm lên từ 0 giây đến 60 giây thì hoạt tính enzyme giảm
13,03% (từ 1083,85 IU/ml xuống còn 942,61 IU/ml).
− Và khi tăng mức thời gian xử lý hơn nữa (2 phút, 5 phút) thì hoạt tính chế
phẩm enzyme càng giảm nhiều hơn (kết quả đó không được trình bày ở đây).
Như vây xử lý sóng siêu âm đã làm giảm hoạt tính của chế phẩm enzyme
cellulase IndiAge Neutra L. Thời gian càng lâu, hoạt tính chế phẩm enzyme cellulase
càng giảm.
Cả hai thí nghiệm trên đều chứng tỏ việc siêu âm chế phẩm enzyme IndiAge
Neutra L trước khi bổ sung vào cơ chất làm giảm hoạt tính của enzyme và thời gian
siêu âm càng lâu, cũng như cường độ năng lượng siêu âm càng cao hoạt tính enzyme
càng giảm. Nguyên nhân của hiện tượng này có thể được giải thích như sau:
− Các loại enzyme bao gồm cả cellulase thường có cấu trúc bậc 4 và không bền
vững, dễ bị tác động bởi điều kiện xử lý.
− Tác dụng của sóng siêu âm lên chất lỏng có hai ảnh hưởng chính: hiện tượng
sủi bong bóng và gia nhiệt. Trong quá trình xử lý sinh học bằng enzyme, ảnh hưởng
quan trọng hơn là hiện tượng sủi bong bóng. Những hiện tượng này sẽ tập trung năng
lượng âm học tạo ra nhiệt độ khí cao (Noltingk và Neppiras, 1951), sóng va chạm
trong cả khí (Vaughan và Leeman, 1986) và môi trường chất lỏng xung quanh
(Rayleigh, 1917) cùng các gốc tự do (Suslick và cộng sự, 1986). Tất cả những yếu tố
này có thể phá hủy đáng kể hoặc ít nhất vô hoạt cấu trúc phức tạp và nhạy cảm của
enzyme vốn có bản chất là protein. Trong thí nghiệm này, enzyme chỉ được hòa với
dung dịch đệm và đem xử lý siêu âm. Đối với dung dịch đệm, quá trình vỡ bong bóng
tạo ra những chất trung gian có năng lượng lớn như là H , OH , e-(aq), H2O2, HO2 , H2
(Karabago và cộng sự, 2007). Do đó, việc enzyme bị giảm hoạt tính là khó tránh khỏi.
Để kiểm chứng điều giải thích này, chúng tôi đã tiến hành điện di mẫu không xử
lý siêu âm và có xử lý siêu âm để xem sóng siêu âm có phá hủy cấu trúc phân tử
protein hay không ?
Đem xử lý chế phẩm enzyme cellulase IndiAge Neutra L với sóng siêu âm ở 3
mức năng lượng 3,75 W/ml; 5,625W/ml và 7,5W/ml (trong thời gian 1 phút). Và 3
mẩu xử lý ở 3,75 W/ml trong thời gian 20, 40, 60 giây. Sau đó đem 6 mẫu này cùng
với mẫu đối chứng tiến hành điện di. Kết quả điện di thu được như sau:
Chƣơng 3: Kết quả và bàn luận
Trang 66
Kết quả từ trái sang: mẫu đối chứng; mẫu xử lý siêu âm ở cường độ 3,75 W/ml; 5,625W/ml;
7,5W/ml (60 giây); mẫu xử lý siêu âm ở 20 giây, 40 giây, 60 giây (cường độ 3,75W/ml)
Hình 3. 8: Kết quả điện di khi xử lý siêu âm ở các mức năng lượng và thời gian khác
nhau đối với chế phẩm enzyme cellulase IndiAge Neutra L
Kết quả điện di cho thấy khi chúng tôi xử lý sóng siêu âm với các mức năng
lượng thấp và trong thời gian ngắn như trên thì phân tử lượng của đại phân tử enzyme
không thay đổi. Điều này nói lên, sóng siêu âm không làm thay đổi cấu trúc bậc một
chế phẩm enzyme IndiAge Neutra L. Nhưng rõ ràng hoạt tính enzyme IndiAge Neutra
L giảm khá nhiều khi chúng tôi đem xử lý siêu âm ở những điều kiện trên. Vậy tại sao
hoạt tính chế phẩm enzyme IndiAge Neutra L lại giảm khi xử lý bằng sóng siêu âm?
Khi xử lý siêu âm với chế phẩm enzyme, có hai khuynh hướng xảy ra:
− Khuynh hướng 1: nhiệt độ tăng làm cắt mạch protein, phá hủy đáng kể hoặc ít
nhất vô hoạt cấu trúc phức tạp và nhạy cảm của enzyme vốn có bản chất là protein của
đại phân tử enzyme từ đó làm giảm hoạt tính và vô hoạt enzyme.
− Khuynh hướng 2: siêu âm ảnh hưởng lên cấu trúc không gian của phân tử
enzyme, dẫn đến sự thay đổi trung tâm hoạt động, cũng như thay đổi vị trí tiếp xúc
giữa enzyme và cơ chất, do đó làm thay đổi hoạt độ xúc tác của enzyme.
Điều này cho thấy tuy sóng siêu âm không làm cắt mạch đại phân tử của chế
phẩm enzyme IndiAge Neutra L nhưng đã làm thay đổi cấu trúc không gian của
enzyme. Đồng thời làm thay đổi trung tâm hoạt động của enzyme theo hướng kìm hãm
Chƣơng 3: Kết quả và bàn luận
Trang 67
trung tâm hoạt động. Theo nghiên cứu của Elpiner (1964) cho biết khi xử lý siêu âm
nhiệt cục bộ tỏa ra bởi hiện tượng sủi bong bóng và những sản phẩm phân hủy của
phân tử nước có tính oxy mạnh được tạo ra có thể làm giảm hoạt tính enzyme. Ở mức
năng lượng siêu âm vừa đủ thấp, sự thay đổi cấu trúc và trao đổi các chất có thể xảy ra
bên trong tế bào mà không cần phá vỡ chúng.
3.5. Khảo sát quá trình trích ly protein khi kết hợp sóng siêu âm và
enzyme
Trong phần này, chúng tôi khảo sát quá trình xử lý chế phẩm enzyme cellulase
IndiAge Neutra L sau khi đã xử lý siêu âm dịch huyền phù bột đậu phộng tách béo
nhằm nâng cao hơn hiệu suất trích ly protein.
Trong thí nghiệm kết hợp sóng siêu âm và chế phẩm enzyme cellulase để hỗ trợ
quá trình trích ly protein đậu phộng, giai đoạn đầu bột đậu phộng tách béo sẽ được
đem xử lý siêu âm với các thông số:
− Tần số 20 kHz - cường độ 30W/g.
− Tỉ lệ bột / nước = 1/20 (w/v).
− pH = 7
− Nhiệt độ siêu âm: 570C.
− Thời gian siêu âm: 17 phút
Sau đó, mới tiến hành đem dịch đã xử lý siêu âm đi xử lý tiếp bằng chế phẩm
enzyme cellulase IndiAge Neutra L để nâng cao hơn nữa hiệu quả trích ly protein đậu.
3.5.1. Khảo sát ảnh hƣởng của hàm lƣợng chế phẩm enzyme sử dụng đến
hiệu suất trích ly protein từ dịch trích đã xử lý bằng sóng siêu âm
Dịch trích bột đậu phộng tách béo sau khi đã xử lý bằng sóng siêu âm được xử lý
bằng chế phẩm enzyme IndiAge Neutra L ở các hàm lượng 0%, 1%, 2%, 3%, 4%
(v/w), thời gian xử lý 90 phút ở nhiệt độ 500C và pH 7. Từ đó khảo sát ảnh hưởng của
hàm lượng enzyme đến hiệu quả trích ly protein và so sánh hiệu suất trích ly protein
thu được với mẫu đối chứng.
Ảnh hưởng của hàm lượng enzyme đến hiệu suất trích ly protein trong dịch trích
của bột đậu phộng tách béo sau khi xử lý bằng sóng siêu âm được trình bày trong
bảng 3.9, hình 3.9.
Chƣơng 3: Kết quả và bàn luận
Trang 68
Bảng 3. 9: Ảnh hưởng của hàm lượng chế phẩm enzyme sử dụng đến hiệu suất trích ly
protein từ dịch trích sau khi xử lý bằng sóng siêu âm
Hàm lượng chế phẩm enzyme (%) Hiệu suất trích ly protein (%)
ĐC 68,61 ± 0,66a
0% 82,41 ± 0,59b
1% 83,18 ± 0,94b
2% 85,86 ± 0,59c
3% 88,16 ± 0,59d
4% 88,35 ± 0,47d
Các giá trị có cùng kí tự (được kí hiệu ở phía trên bên phải mỗi chữ số) trong cùng một cột thì sự khác
nhau giữa chúng không có ý nghĩa (α = 0.05).
Hình 3. 9: Ảnh hưởng của hàm lượng chế phẩm enzyme sử dụng đến hiệu suất trích ly
protein từ dịch trích sau khi xử lý bằng sóng siêu âm
Chƣơng 3: Kết quả và bàn luận
Trang 69
Kết quả cho thấy với hàm lượng chế phẩm enzyme 3% (v/w) hiệu quả trích ly
protein được cải thiện:
- Tăng 28,49% so với mẫu đối chứng (từ 68,61% đến 88,16%).
- Tăng 16,46% (từ 75,7% đến 88,16%) so với khi mẫu được xử lý bằng
enzyme (với hàm lượng 5% (v/w)).
- Tăng 5,75% (từ 82,41% đến 88,16%) so với khi mẫu chỉ được xử lý
bằng sóng siêu âm.
Khi tăng hàm lượng chế phẩm enzyme lên hơn nữa 4% (v/w) thì hiệu suất trích
ly thu được là 88,35% - không khác nhau có ý nghĩa so với hiệu suất trích ly ở hàm
lượng chế phẩm enzyme 3% (p < 0,05)
− Giai đoạn đầu của quá trình xử lý, ta xử lý dịch huyền phù bằng sóng siêu âm.
Với tác dụng của sự sủi bong bóng do xử lý siêu âm đã tạo ra một năng lượng làm tăng
truyền khối của các cấu tử cần trích ly. Ngoài tăng tốc độ truyền khối, siêu âm còn có
khả năng phân cắt nhiều liên kết trong thành tế bào, làm phá vỡ cấu trúc tế bào triệt để
hơn giúp cho protein tiếp xúc nhiều hơn với nước tăng khả năng hòa tan vào dịch của
protein.
− Giai đoạn sau của quá trình: dịch huyền phù sau khi đã xử lý bằng siêu âm tiếp
tục đem xử lý bằng chế phẩm enzyme IndiAge Neutra L. Việc nứt, vỡ thành tế bào ở
giai đoạn đầu giúp cho enzyme dễ dàng khuếch tán vào tế bào chất, tiếp xúc với các cơ
chất, thủy phân các polysaccharide, phá hủy các liên kết của protein với các
polysaccharide còn lại mà sóng siêu âm chưa tác dụng hết, giải phóng thêm một lượng
protein trong dịch trích. Do đó, khi kết hợp xử lý siêu âm và chế phẩm enzyme
IndiAge Neutra L để trích ly protein đậu phộng thì có thể giảm hàm lượng chế phẩm
enzyme sử dụng xuống 3% (v/w) so với khi chỉ xử lý bằng chế phẩm enzyme (khi chỉ
sử dụng chế phẩm enzyme để trích ly protein đậu phộng thì hàm lượng enzyme cần sử
dụng là 5% v/w)
Như vậy, với kết quả khảo sát thu được ta chọn hàm lượng enzyme tối ưu là 3%
(v/w) để sử dụng cho những thí nghiệm tiếp theo.
3.5.2. Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian xử lý enzyme đến hiệu suất trích ly
protein từ dịch trích đã xử lý bằng sóng siêu âm
Trong thí nghiệm này dịch trích bột đậu phộng tách béo sau khi được xử lý bằng
sóng siêu âm sẽ được xử lý tiếp bằng chế phẩm enzyme IndiAge Neutra L với hàm
lượng 3% (v/w), thời gian xử lý từ 30 phút, 60 phút, 90 phút đến 120 phút ở nhiệt độ
Chƣơng 3: Kết quả và bàn luận
Trang 70
500C và pH 7. Từ đó khảo sát ảnh hưởng của thời gian xử lý enzyme đến hiệu quả
trích ly protein và so sánh hiệu suất trích ly protein thu được với mẫu đối chứng.
Ảnh hưởng của thời gian xử lý enzyme đến hiệu suất trích ly protein trong dịch
trích của bột đậu phộng tách béo sau khi xử lý bằng sóng siêu âm được trình bày trong
bảng 3.10, hình 3.10
Bảng 3. 10: Ảnh hưởng của thời gian xử lý chế phẩm enzyme đến hiệu suất trích ly
protein từ dịch trích sau khi xử lý bằng sóng siêu âm
Thời gian (phút) Hiệu suất trích ly protein (%)
ĐC 68,61 ± 0,66a
0 82,03 ± 1,33b
30 84,52 ± 0,63c
60 88,16 ± 0,59d
90 87,97 ± 0,96d
Các giá trị có cùng kí tự (được kí hiệu ở phía trên bên phải mỗi chữ số) trong cùng một cột thì sự khác
nhau giữa chúng không có ý nghĩa (α = 0.05).
Hình 3. 10: Ảnh hưởng của thời gian xử lý chế phẩm enzyme đến hiệu suất trích ly
protein từ dịch trích sau khi xử lý bằng sóng siêu âm
Chƣơng 3: Kết quả và bàn luận
Trang 71
Với thời gian xử lý enzyme trong 60 phút hiệu quả trích ly protein được cải
thiện:
- Tăng 28,49% (từ 68,61% đến 88,16%) so với mẫu đối chứng.
- Tăng 16,75% (từ 75,51% đến 88,16%) so với khi mẫu được xử lý bằng
enzyme (với thời gian xử lý là 90 phút).
- Tăng 6,13% (từ 82,03% đến 88,16%) so với khi mẫu chỉ được xử lý bằng sóng
siêu âm.
Khi tăng thời gian xử lý chế phẩm enzyme lên 90 phút thì hiệu suất trích ly
protein thu được là 87,97% - không khác nhau có ý nghĩa so với hiệu suất trích ly ở
thời gian xử lý enzyme trong 60 phút (p < 0,05).
Như đã trình bày ở trên, khi tăng thời gian xử lý enzyme thì hiệu suất trích ly
protein sẽ tăng lên nhưng thời gian này chỉ tăng đến một giá trị nhất định. Nhờ tác
dụng của sóng siêu âm ở giai đoạn đầu, cấu trúc hạt bị phá bung, giúp lộ ra những vị
trí tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất, do đó enzyme nhanh chóng thực hiện được phản
ứng phân cắt cơ chất. Kết quả là có thể rút ngắn thời gian phản ứng từ 90 phút (thí
nghiệm chỉ dùng enzyme để hỗ trợ quá trình trích ly protein) xuống còn 60 phút đồng
thời làm tăng hiệu suất trích ly protein lên.
Khi thời gian xử lý kéo dài từ 60 phút đến 90 phút thì hiệu suất trích ly khác nhau
không có ý nghĩa so với khi xử lý ở thời gian 60 phút.
Ngoài ra ta cũng nhận thấy rằng siêu âm có tác dụng tăng hiệu suất trích ly
protein lớn hơn và thời gian xử lý ngắn hơn nhiều so với khi chỉ sử dụng chế phẩm
enzyme IndiAge Neutra L. Như ở bàng 3.10 nếu chỉ xứ lý bằng siêu âm, hiệu suất
trích ly protein thu được là 82,03 % tăng 19,56% so với mẫu đối chứng (hiệu suất
68,61 %). Còn khi chỉ xử lý bằng chế phẩm enzyme IndiAge Neutra L thì dù đã tối ưu
hàm lượng và thời gian xử lý enzyme, hiệu suất thu được là 76,69 % chỉ tăng 11,78%
so với mẫu đối chứng (hiệu suất 68,61 %). Điều này có thể được giải thích rằng: chế
phẩm enzyme phân cắt có tính chọn lọc, chỉ phân cắt một số cơ chất nhất định, cắt
những vị trí nhất định, do đó hạn chế sự phá bung triệt để cấu trúc tế bào. Một số
lượng lớn protein vẫn còn kết nối với cấu trúc sợi cellulose và không được trích ly vào
dung dịch. Trong khi đó, siêu âm phân cắt không có tính chọn lọc, thích hợp hơn để
phá vỡ toàn diện tế bào vốn mang cấu trúc phức tạp gồm nhiều đại phân tử khác nhau
như là polysaccharide, protein, …Sự phân cắt này làm cho các hợp chất này cho thể
chuyển vào dung dịch trong quá trình xử lý và kết quả là xử lý bằng siêu âm cho hiệu
suất thu hồi protein cao hơn so với khi chỉ xử lý bằng chế phẩm enzyme. Thêm vào đó,
khi xử lý bằng chế phẩm enzyme cần có thời gian để đại phân tử enzyme khuếch tán
đến vị trí phản ứng trên cơ chất, xúc tác phản ứng, và vận chuyển sản phẩm khỏi trung
Chƣơng 3: Kết quả và bàn luận
Trang 72
tâm phản ứng để quá trình lại được tiếp diễn. Do là hệ tĩnh đồng thời với kích thước
cồng kềnh của đại phân tử enzyme nên thời gian phản ứng kéo dài. Trái với xử lý bằng
chế phẩm enzyme, xử lý bằng siêu âm tạo ra sự khuấy động mạnh mẽ giúp các chất
nhanh chóng di chuyển vào dung dịch và do đó thời gian xử lý ngắn hơn.
Còn khi kết hợp xử lý siêu âm trước, xử lý bằng chế phẩm enzyme sau thì sẽ
càng tăng hiệu quả trích ly protein đồng thời rút ngắn thời gian xử lý bằng enzyme.
3.5.3. Tối ƣu hóa hàm lƣợng enzyme và thời gian xử lý enzyme đến hiệu
suất trích ly protein từ dịch trích đã xử lý bằng sóng siêu âm
Để quá trình sử dụng enzyme hỗ trợ quá trình trích ly protein đạt hiệu quả hơn
nữa, trong phần này chúng tôi tiến hành thí nghiệm theo phương pháp quy hoạch thực
nghiệm, bậc hai tâm xoay hai yếu tố, với hàm mục tiêu là hiệu suất trích ly protein.
Ở thí nghiệm này hai yếu tố hàm lượng và thời gian xử lý enzyme đồng thời
được thay đổi, từ đó xác định quy luật ảnh hưởng của hai yếu tố này đến hàm mục tiêu
và thiết lập phương trình hồi quy. Trên cơ sở đó, chọn ra các thông số tối ưu của thí
nghiệm để đạt được hiệu suất trích ly protein cao nhất.
− Số thí nghiệm tối ưu là N = 12 thí nghiệm trong đó có 4 thí nghiệm ở tâm
phương án.
− Hàm mục tiêu cần tối ưu: hiệu suất trích ly protein (%)
− Các giá trị khảo sát của hai yếu tố tối ưu như sau:
Hàm lượng enzyme: X1 [2; 4]; với tâm là X1 = 3 % (v/w)
Thời gian xử lý: X2 [30; 90]; với tâm là X2 = 60 (phút).
− Kết quả của thí nghiệm tối ưu hóa được trình bày trong bảng 3.11
Chƣơng 3: Kết quả và bàn luận
Trang 73
Bảng 3. 11: Ma trận quy hoạch thực nghiệm bậc hai tâm xoay, hai yếu tố và kết quả
thực nghiệm
Số thí nghiệm Run
Order X1 X2
X1
(% v/w)
X2
(phút)
H
(%)
N1 4 -1 -1 2 30 83,75 ± 0,47
N2 11 +1 -1 4 30 86,82 ± 0,63
N3 5 -1 +1 2 90 85,48 ± 0,31
N4 6 +1 +1 4 90 88,35 ± 0,47
N5 2 - 2 0 1,586 60 83,37 ± 0,63
N6 9 + 2 0 4,414 60 88,73 ± 0,47
N7 8 0 - 2 3 17,58 84,14 ± 0,47
N8 10 0 + 2 3 102,42 87,97 ± 0,63
N9 7 0 0 3 60 87,78 ± 0,66
N10 3 0 0 3 60 87,97 ± 0,57
N11 1 0 0 3 60 87,59 ± 0,33
N12 12 0 0 3 60 88,16 ± 0,66
Trong đó:
X1 : Hàm lượng chế phẩm enzyme (% v/w)
X2 : Thời gian xử lý enzyme (phút)
Y : Hiệu suất trích ly protein (%)
Theo phương pháp quy hoạch thực nghiệm bậc hai tâm xoay, phương trình hồi
quy của mỗi hàm mục tiêu được biểu diễn theo dạng sau:
2
222
2
111211222110 XbXbXXbXbXbbY
Giải bài toán quy hoạch thực nghiệm cho hàm mục tiêu bằng phần mềm Modde
5.0, ta nhận được các kết quả như trong bảng 3.12
Chƣơng 3: Kết quả và bàn luận
Trang 74
Bảng 3. 12: Ảnh hưởng của các biến độc lập đến hiệu suất trích ly protein
Giá trị Hệ số Sai số chuẩn Giá trị P Khoảng tin cậy (±)
bo 87,875 0,2144 1,42E-14 0,524683
b1 1,6901 0,1516 3,11E-05 0,371035
b2 1,0846 0,1516 0,00037653 0,371035
b11 -0,901 0,1696 0,00180814 0,414886
b22 -0,898 0,1696 0,00183376 0,414886
b12 -0,05 0,2144 0,823358 0,524683
Bảng 3.12 cho thấy các tác động của các biến X1 , X2 , X12, X2
2 ảnh hưởng đến
giá trị của Y (P < 0,05). Từ các hệ số của bảng 3.12, ta thiết lập được phương trình hồi
quy của hiệu suất trích ly protein như sau (bỏ qua ảnh hưởng của X1*X2 do P > 0,05):
2
2
2
121 898,0901.0085,169,1875,87 XXXXY
Từ phương trình hồi quy, ta có nhận xét sau:
− Cà hai yếu tố hàm lượng enzyme và thời gian xử lý enzyme đều ảnh
hưởng đến hiệu suất trích ly protein theo hàm bậc hai.
− Không có sự tương tác giữa hàm lượng enzyme và thời gian xử lý.
− Yếu tố hàm lượng enzyme có ảnh hưởng nhiều hơn so với thời gian xử lý
Phương trình hồi quy biểu diễn trên ba trục tọa độ không gian ba chiều, được mặt
cong như hình 3.11
Chƣơng 3: Kết quả và bàn luận
Trang 75
Hình 3. 11: Ảnh hưởng của hàm lượng và thời gian xử lý chế phẩm enzyme lên hiệu
suất trích ly protein từ dịch trích bột đậu phộng tách béo sau khi đã xử lý siêu âm.
Hình 3. 12: Hình chiếu bề mặt biểu diễn phương trình hồi quy trên mặt phẳng tọa độ
Chƣơng 3: Kết quả và bàn luận
Trang 76
Với phần mềm Modde 5.0, chúng tôi tìm ra được điều kiện tối ưu khi ứng dụng
chế phẩm enzyme IndiAge Neutral L để hỗ trợ quá trình trích ly protein từ dịch trích
bột đậu phộng tách béo sau khi đã xử lý siêu âm như sau:
− Hàm lượng chế phẩm enzyme: 3,92 % v/w
− Thời gian xử lý: 77,25 phút
− Hiệu suất trích ly protein thu được: 88,97 % tăng 29,67% so với mẫu đối
chứng (hiệu suất 68,61 %)
Chƣơng 4: Kết luận và kiến nghị
Trang 77
CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
4.1. Kết luận
Qua quá trình nghiên cứu, chúng tôi có những kết luận sau:
Phương pháp ứng dụng chế phẩm enzyme IndiAge Neutra L, ứng dụng kết hợp
sóng siêu âm với xử lý bằng chế phẩm enzyme trên mẫu bột đậu phộng đã tách béo đều
làm tăng hiệu suất trích ly protein.
Qua thí nghiệm và tính toán chúng tôi đã thu được các điều kiện xử lý tối ưu để đạt
hiệu suất trích ly protein cao nhất là:
Phương pháp xử lý bằng chế phẩm enzyme IndiAge Neutra L
− Hàm lượng chế phẩm enzyme: 5,69 %v/w
− Thời gian xử lý: 100,89 phút
Khi đó, hiệu suất trích ly protein thu được: 76.69 % tăng 11,78% so với mẫu đối
chứng (hiệu suất 68,61 %)
Phương pháp kết hợp đồng thời siêu âm với xử lý bằng chế phẩm enzyme
IndiAge Neutra L
− Hàm lượng chế phẩm enzyme: 3,92 %v/w
− Thời gian xử lý: 77,25 phút
Khi đó, hiệu suất trích ly protein thu được: 88,97 % tăng 29,67% so với mẫu đối
chứng (hiệu suất 68,61 %)
4.2. Kiến nghị
Do thời gian thực hiện đề tài có hạn nên không thể khảo sát hết các yếu tố cũng như
tìm ra một quy trình trích ly protein cho hiệu quả cao nhất. Để phát huy được những ưu
điểm và những nhược điểm trong đề tài này, chúng tôi xin đề xuất một số ý kiến sau:
− Tìm hiểu thêm một số enzyme trích ly khác và thực hiện việc trích ly trên một số
loại enzyme để tìm ra được một loại enzyme cho hiệu suất tối ưu nhất.
Chƣơng 4: Kết luận và kiến nghị
Trang 78
− Sử dụng kết hợp sóng siêu âm và tổ hợp nhiều loại chế phẩm enzyme như
hemicellulase, cellulase, … để xử lý bột đậu phộng tách béo nhằm mục đích làm tăng
hiệu suất trích ly protein.
− Khảo sát việc kết hợp giữa sóng siêu âm và membrane, hay enzyme và
membrane hay sự kết hợp của ba phương pháp đó.
− Sản xuất thử và xác định các tính chất chức năng của PPC/PPI.
− Điều cuối cùng nhưng rất quan trọng ở đây là thiết bị, chúng tôi nghĩ thiết bị nên
được cải tiến, bảo dưỡng và sắp xếp hợp lý.
Tài liệu tham khảo
Trang 79
TÀI LIỆU THAM KHẢO
[1] Lê Ngọc Tú (chủ biên) (2002), Hóa sinh công nghiệp, NXB khoa học và kỹ
thuật Hà Nội.
[2] Lê Văn Việt Mẫn, Lại Quốc Đạt, Nguyễn Thị Hiền, Tôn Nữ Minh Nguyệt,
Trần Thị Thu Trà (2009), Công nghệ chế biến thực phẩm, Nhà xuất bản Đại học Quốc
gia Thành phố Hồ Chí Minh.
[3] Nguyễn Đức Lượng (chủ biên) (2004), Công nghệ enzyme, NXB Đại học quốc
gia TP. Hồ Chí Minh.
[4] Nguyễn Đức Lượng, Phan Thị Huyền, Nguyễn Ánh Tuyết, Thí nghiệm Công
nghệ sinh học tập 2, NXB Đại học quốc gia Tp. Hồ Chí Minh.
[5] A. Cavaco-Paulo and G. M. Gübitz (2003), Textile processing with enzymes,
Woodhead Publishing Limited.
[6] A. Rosenthal, D. L. Pyle, and K. Niranjan, Aqueous and enzymatic processes
edible oil extraction for edible oil extraction, Enzyme Microb. Technol., 1996, vol. 19,
403 – 418.
[7] Ahmed, E.M and R.H. Schmidt (1979), Functional properties of peanut and
soy proteins as influenced by processing methods, Peanut Sci., 6, 1 – 6.
[8] Alex Patist, Darren Bates (2008), Ultrasonic innovations in the food industry:
From the laboratory to commercial production, Innovative Food Science and Emerging
Technologies 9, 147 – 154.
[9] Anet Rezek, Vesna Lelas, Timothy J.Mason, Greta Kresic, Marija Badanjak,
Physical properties of ultrasound treated soy proteins, Journal of food engineering 93
(2009), 386 – 393.
[10] Antonio A. Sekul and Robert L. Ory (1977), Rapid Enzymatic Method for
Partial Hydolysis of Oilseed Proteins for Food Uses, Southern Regional Research
Center, 32 – 35.
[11] Aparna Sharma, S.K. Khare, and M.N. Gupta (2002), Enzyme – Assisted
Aqueous Extraction of Peanut Oil, Journal of the American Oil Chemists’ Society, 79
(3), 215 – 218.
Tài liệu tham khảo
Trang 80
[12] B. Adney and J. Baker (2008), Measurement of Cellulase Activities, Technical
Report.
[13] Barton, S., Bullock, C., Weir, D. (1996), The effects of ultrasound on the
activities of some glycosidase enzymes of industrial importance, Enzyme and Microbial
Technology, 18, 190–194.
[14] Bishnu Karki, Buddi P.Lamsal, Stephanie Jung J.(Hans), Van Leeuwen,
Anthony L. PomettoIII, David Grewell, Samir K. Khanal (2009), Enhancing Protein and
Sugar Release From Deffated Soy Flakes Using ultrasound Technology, Journal of food
engineering 96, 270- 278.
[15] Carroll L. Hoffpauir (1953), Peanut Composition, Relation to Processing and
tilization, Journal of Agriculture and Food Chemistry, 1 (10), 668–671.
[16] Chengzhou Li, Makoto Yoshimoto, Haruki Ogata, Naoki Tsukuda, Kimitoshi
Fukunaga, Katsumi Nakao (2005), Effects of ultrasonic intensity and reactor scale on
kinetics of enzymatic saccharification of various waste papers in continuously irradiated
stirred tanks, Ultrasonics Sonochemistry, 12, 373–384.
[17] Combes, D. and Monsan. P. (1983), Sucrose hydrolysis by invertase:
characterisation of products and substrate inhibition, Curbohydr. Rex, 117, 215-228.
[18] Daussant J, Neucere NJ, Conkerton EJ (Apr 1969), Immunochemical Studies
on Arachis hypogaea Proteins With Particular Reference to the Reserve Proteins. II.
Protein Modification During Germination, Plant Physiol.44(4):480–484.
[19] Dietrich Knorr et.al.(2004), Applications and potential of ultrasonics in food
processing, Trends in Food Science & Technology 15, 261 – 266.
[20] Doktor-Ingenieur (27 June 2002), Effect of Ultrasound, Temperature and
Pressure Treatments on Enzyme Activity and Quality Indicators of Fruit and Vegetable
Juices, Tag der wissenschaftliche Aussprache.
[21] Donald Barnett, B.Sc., Brian A. Baldo, Ph.D. , and Merlin E. H. Howden,
Ph.D (7-1983), Multiplicity of allergens in peanuts, Allergens in peanuts Vol.72, No.1,
961-981.
[22] Dora Dienes, 2006, Effect of cellulase enzyme on secondary fiber properties,
3-10.
[23] Dóra Dienes, Anita Egyházi, Zoltán Sárdi, Kati Réczey (2002), Treatment of
recycled fiber, International Congress & Trade Show Green-Tech..
Tài liệu tham khảo
Trang 81
[24] E.S. Rickard, L.U. Thompson (1997), Interactions and Biological Effects of
Phytic Acid, ACS Symposium , Vol.662, pp 294–312.
[25] Edith J. Conkerton and Robert L. ORY (1976), Peanut Proteins as Food
Supplements: A Compositional Study of Selected Virginia and Spanish Peanuts, Southern
Regional Research Center, 754 – 756.
[26] Entezari, H., Nazary, H., & Khodaparast, H. (2004), The direct effect of
ultrasound on the extraction of date syrup and its micro-organisms, Ultrasonics
Sonochemistry, 11, 379-384.
[27] Flavio E. Mitidieri, Jorge R. Wagner (2002), Coalescence of o/w emulsions
stabilized by whey and isolate soybean proteins. Influence of thermal denaturation, salt
addition and competitive interfacial adsorption, Food Research International 35, 547–
557.
[28] G.S.Ladics, J.H.M.Van Bilsen, H.M.H. Brouwer, L.Vogel, S.Vieths,
L.M.J.Knippels (2008), Assessment of three human FceRI-transfected RBL cell-lines for
identifying IgE induced degranulation utilizing peanut-allergic patient sera and peanut
protein extract , Regulatory Toxicology and Pharmacology 51,1, 288–294.
[29] Ghose TK, (1987). Measurement of cellulase activities, Pure & Appl. Chem.,
Vol. 59, pp. 257—268,
[30] Grabber, J. H., Hatfield, R. D., & Ralph, J. , (1998), Diferulate crosslinks
impede the enzymatic degradation of non-lignified maize walls, Journal of the Science of
Food and Agriculture, 77, 193-200.
[31] Haile Maa, Liurong Huang, Junqiang Jia, Ronghai He, Lin Luo, Wenxue Zhu
(2011), Effect of energy-gathered ultrasound on Alcalase, Ultrasonics Sonochemistry 18,
419 – 424.
[32] Haiwen Wua, Qiang Wang, Tiezheng Maa, Jiajia Ren (2009), Comparative
studies on the functional properties of various protein concentrate preparations of peanut
protein, Food Research International 42, 343–348.
[33] Haizhou Li, Lester Pordesimo, Jochen Weiss (2004), High intensity
ultrasound-assisted extraction of oil from soybeans, Food Research International 37, 731
– 738.
Tài liệu tham khảo
Trang 82
[34] Huihua Huang, Kin-Chor Kwok, Han-Hua Liang (2008), Inhibitory activity
and conformation changes of soybean trypsin inhibitors induced by ultrasound,
Ultrasonics Sonochemistry, 15, 724–730.
[35] Ismail Y. S. Rustom, M. H. Lrpez-Leiva & Baboo M. Nair (1991), A Study of
Factors Affecting Extraction of Peanut (Arachis hypogaea L) Solids With Water, Food
Chemistry 42, 153 – 165.
[36] Ismail Y. S. Rustom, Mervat I. Foda and M. H. Lbpez-Leivaa (1998),
Formation of oligosaccharides from whey UF-permeate by enzymatic hydrolysis –
analysis of factors, Food Chemistry, Vol. 62, No. 2, 141- 147.
[37] Ismail Y. S. Rustom, Miguel H. Lopez-Leiva and Baboo M.Nair (1993),
Extraction of peanut solids with water-effect of the process and enzymatic hydrolysis, 72
– 75.
[38] J H Grabber, R D Hatüeld and J Ralph (1998), Diferulate Cross-Links Impede
the Enzymatic Degradation of Non-Lignified Maize Walls, J Sci Food Agric 77, 193 –
200.
[39] J.T.Lawhon, D.Mulsow, C.M.Cater .F.Mattil (1997), Production of
protein isolate and concentrates from oilseed flour extracts using industrial
ultrafiltration and reverse osmosis systems, Journal of Food Science, 42.
[40] Jianmei Yu, Mohamed Ahmedna, Ipek Goktepe (2007), Peanut protein
concentrate: Production and functional properties as affected by processing, Food
Chemistry 103, 121–129.
[41] Ji-Hyun Jang, Kwang-Deog Moon (2011), Inhibition of polyphenol oxidase
and peroxidase activities on fresh-cut apple by simultaneous treatment of ultrasound and
ascorbic acid, Food Chemistry 124, 444–449.
[42] Jing Wang, Yanping Cao, Baoguo Sun, Chengtao Wang, Yingjie Mo (2011),
Effect of ultrasound on the activity of alliinase from fresh garlic, Ultrasonics
Sonochemistry 18, 534–540.
[43] John P. Cherry (1977), Potential Sources of Peanut Seed Proteins and Oil in
the Genus Arachis, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 25 (1), 186 – 193.
[44] John P. Cherry (1990), Peanut Protein and Product Functionality, Journal of
the American Oil Chemists’ Society, 67 (5), 293 – 301.
Tài liệu tham khảo
Trang 83
[45] K. Suknark, R.D. Phillips and M.S. Chinnan (1991), Physical properties of
directly expanded extrudates formulated from partially defatted peanut flour and
different types of starch, Food Research International, Vol. 30, No. 8, pp. 515-583.
[46] K.J.Moulton and L.C. Wang (1982), A Pilot-Plant Study of Continuous
Ultrasonic Extraction of Soybean Protein, Journal of Food Science, 47.
[47] Kamaljit Vilkhu và cộng sự (2008), Applications and opportunities for
ultrasound assisted extraction in the food industry — A review, Innovative Food Science
and Emerging Technologies 9, 161 – 169.
[48] Kamaljit Vilkhu, Richard Manasseh, Raymond Mawson and Muthupandian
Ashokkumar, Food Engineering Series (2011), Ultrasonic Recovery and Modification of
Food Ingredients, 345-368
[49] Karaboga, C., Korlu, A. E., Duran, K., Bahtiyari, M. (2007), Use of Ultrasonic
Technology in Enzymatic Pretreatment Processes of Cotton Fabrics, Fibres and Textiles
in Eastern Europe, 15, 63.
[50] Kay H. McWatters, John P. Cherry and Mac R. Holmes (1976), Influence of
Suspension Medium and pH on Functional and Protein Properties of Defatted Peanut
Meal, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 24 (30), 517 – 523.
[51] L.J. Manak .W.Lusas (1980), Functioning potential of soy,
cottongseed, peanut protein isolates produced by industrial membrane systems, Journal
of food science, 45.
[52] Latham J. Stack, Patricia A. Carney, Henry B. Malone, Thomas K. Wessels
(2005), Factors influencing the ultrasonic separation of oil-in-water emulsions, 153-160.
[53] Li Chuan Wang (1981), Soybean protein agglomeration: promotion by
ultrasonic treatment, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 29 (1), 177 – 180.
[54] Lihua Jiang, Di Hua, Zhang Wang, Shiying Xu (2010), Aqueous enzymatic
extraction of peanut oil and protein hydrolysates, Food and bioproducts processing 88,
233–238.
[55] M. Aliyu, M.J. Hepher (2000), Effects of ultrasound energy on degradation of
cellulose material, Ultrasonics Sonochemistry 7, 265–268.
[56] M. Sakakibara, D. Wang, R. Takahashi, K. Takahashi and S. Mori (1996),
Influence of ultrasound irradiation on hydrolysis of sucrose catalyzed by invertase,
Enzyme and Microbial Technology 18, 444 – 448.
Tài liệu tham khảo
Trang 84
[57] M. Yaldagard, S.A. Mortazavi, F. Tabatabaie (2007), The Effectiveness of
Ultrasound Treatment on the Germination Stimulation of Barley Seed and its Alpha-
Amylase Activity, World Academy of Science Engineering and Technology 34, 154 – 157.
[58] M.K. Bhat (2000), Cellulases and related enzymes in biotechnology,
Biotechnology Advances 18, 355–383.
[59] Mawson, Raymond, Knoerzer, Kai (2007), A brief history of the application of
ultrasonics in food processing, 19th international congress on acoustics madrid.
[60] Mei-Hwa Lee and Chuan-Chuan Lin (2007), Comparison of techniques for
extraction of isoflavones from the root of Radix Puerariae: Ultrasonic and pressurized
solvent extractions, Food Chemistry, Vol. 105, Issue 1, 223-228.
[61] - (2004),
Fuctional properties of Soybean and Lupin protein concentrates produced by
Ultrafiltration- Diafiltration, Journal of the American Oil Chemists’ Society, 81.
[62] Moholkar, V.S., A.B. Pandit and M.M.C.G. Warmoeskerken (1999).
Characterization and optimization aspects of a sonic reactor, Proceedings of the
International Conference and Exhibition on Ultrasonics – 99, 1,17-22.
[63] Muthupandian Ashokkumar và cộng sự (2008), Modification of food
ingredients by ultrasound to improve functionality: A preliminary study on a model
system, Innovative Food Science and Emerging Technologies 9, 155 – 160.
[64] N. J. Neucere and Robert L. ( May 1970), Physicochemical Studies on the
Proteins of the Peanut Cotyledon and Embryonic Axis, Ory Plant Physiol 45(5): 616–
619.
[65] Nelson R. Grosso, Valeria Nepote, and Carlos A. Guzma ´n (2000), Chemical
Composition of Some Wild Peanut Species (Arachis L.) Seeds, Journal of Agricultural
and Food Chemistry, 48, 806 – 809.
[66] Nicolas A. Deak, Lawrence A. Jonhson (2007), Effect of Extraction
Temperature and Preservation Method on Functionality of Soy Protein, 84: 259- 268.
[67] O.N. Donkor and N.P. Shah (2008), Production of β-Glucosidase and
Hydrolysis of Isoflavone Phytoestrogens by Lactobacillus acidophilus, Bifidobacterium
lactis, and Lactobacillus casei in Soymilk, journal of food science, Vol. 73, No. 1, M15 –
M20.
Tài liệu tham khảo
Trang 85
[68] O¨ zbek, B., U¨ lgen, K.O¨. (2000), The stability of enzymes after sonication,
Process Biochemistry 35, 1037–1043.
[69] Ovsianko, S.L., Chernyavsky, E.A., Minchenya, V.T., Adzerikho, I.E.,
Shkumatov, V.M (2005), Effect of ultrasound on activation of serine protease
precursors, Ultrasonics Sonochemistry, 12, 219–223.
[70] P. Vincent Monteiro and V. Prakash (1994), Functional Properties of
Homogeneous Protein Fractions from Peanut (Arachis hypogaea L.), Journal of
Agricultural and Food Chemistry, 42, 274 – 278.
[71] R. Y. Yada (2004), Proteins in food processing, Woodhead Publishing
Limited and CRC Press LLC.
[72] R.P. Nascimento, N.A. Junior, N. Pereira Jr, E.P.S. Bon and R.R.R. Coelho
(2009), Brewer’s spent grain and corn steep liquor as substrates for cellulolytic enzymes
production by Streptomyces Malaysiensis, Letters in Applied Microbiology 48, 529–535.
[73] Rassoul Kadkhodaee, Malcolm J.W. Povey (2008), Ultrasonic inactivation of
Bacillus a-amylase. I. effect of gas content and emitting face of probe, Ultrasonics
Sonochemistry 15, 133–142.
[74] Renata Torrezan, Whye Pin Tham, Alan E.Bell, Richard A.Frazier, Marcelo
Cristianini (2007), Effect of High Pressure on Functional Properties of Soy Protein, Food
chemistry 104, 140 – 170.
[75] Richard W. Baker (2000), Membrane technology and applications, published
by McGraw-Hill.
[76] Rickey Yoshio Yada, (2004),Proteins in food processing, woodhead
publishing limited.
[77] Riera, Y. Golaùs, A. Blanco, J.A. Gallego, M. Blasco, A. Mulet (2004), Mass
transfer enhancement in supercritical fluids extractionby means of power ultrasound,
Ultrasonics Sonochemistry, 11, 241–244.
[78] Rostagno, M. A., Palma, M., and, Barruso, C. G. (2003). Ultrasoundassisted
extraction of soy isoflavones, J. Chromatogr. A. 1012:119-128.
[79] Rudrapatnam N. Tharanathan, Dharmaraj B. Wankhede and Madhava R.
Raghavendra Rao (1979), Groundnut Carbohydrates – a Review, Journal of the Science
of Food and Agriculture, 30, 1077 – 1084.
[80] S.D. Arntfield, 2004, Proteins from oil-producing plants, Woodhead
Tài liệu tham khảo
Trang 86
Publishing Limited and CRC Press LLC.
[81] S. Jung, B.P. Lamsal, V. Stepien, L.A. Johnson, and P.A. Murphy,
Functionality of Soy Protein Produced by Enzyme-Assisted Extraction, JAOCS, Vol. 83,
no. 1, 2006, 71-78.
[82] Sabine Baumgartner, Claudia Hemetsberger, Elisabeth Drs, Harald Pichler,
Rudolf Krska (September 2003), Purification of peanut proteins for further use in affinity
chromatography and as immunogens, Journal of Separation Science, Vol. 26, 1284 –
1286.
[83] Seo, C.V. Morr (January 1985), Activated Carbon and Ion Exchange
Treatments for Removing Phenolics and Phytate from Peanut Protein Products, Journal
of Food Science, Vol. 50, Issue 1, 262–263.
[84] Sheikh M. Basha and Sunil K. Pancholy (1982), Composition and
Characteristics of Basic Proteins from Peanut (Arachis hypogaea L.) Seed, Journal of
Agricultural and Food Chemistry, 30, 1176 – 1179.
[85] Stephen Barton, Clive Bullock, and Deborah Weir (15 February 1996), The
effects of ultrasound on the activities of some glycosidase enzymes of industrial
importance, Enzyme and Microbial Technology, vol. 18, 190 – 194.
[86] Stéven Criquet (2002), Measurement and characterization of cellulase activity
in sclerophyllous forest litter, Journal of Microbiological Methods 50 , 165– 173.
[87] T.S. Kholief (1987), Chemical composition and protein properties of peanuts,
Department of Nutrition, University College for Women , Ain Shams University, Cairo
(Arab Republic of Egypt), 56 – 61.
[88] T.V.R. Alicieo , E.S. Mendes, N.C. Pereira and O.C. Motta (10 September
2002), Membrane ultrafiltration of crude soybean oil, Desalination, Vol. 148, Issues 1 –
3, 99 – 102.
[89] T.J. Mason, L. Paniwnyk, J.P. Lorimer (1996), The uses of ultrasound in food
technology, Ultrasonics Sonochemistry 3, 253 – 260.
[90] Tetsuo Yamada, Shigeo Aibara and Yuhei Morita (1980), Accumulation
pattern of arachin and its subunits in maturation of groundnut seeds, Plant & Cell
Physiol. 21(7): 1217-1226.
Tài liệu tham khảo
Trang 87
[91] Tiezheng Ma, Qiang Wang, Haiwen Wu (2010), Optimization of extraction
conditions for improving solubility of peanut protein concentrates by response surface
methodology, Food Science and Technology 43, 1450 – 1455.
[92] Val G Yachmenev, Noelie R Bertoniere and Eugene J Blanchard, 2002,
Intensification of the bio-processing of cotton textiles by combined enyme/ ultrasound
treatment, Journal Chemical Technology and Biotechnology, 559 – 567.
[93] Xiao, Y., Wu, Q., Cai, Y., Lin, X., (2005) Ultrasound-accelerated enzymatic
synthesis of sugar esters in nonaqueous solvents, Carbohydrate Research, 340 2097–2103.
[94] Yachmenev, Val G., Eugene J. Blanchard, Allan H. Lambert (2004), Use of
ultrasonic energy for intensification of the bio-preparation of greige cotton, Ultrasonics
42, 87–91.
[95] Yachmenev, Val; Condon, Brian; Lambert, Allan. (2007), Technical aspects of
use of ultrasound for intensification of enzymatic bio-processing: new path to ―Green
Chemistry‖, 19th
international congress on acoustics, Marid,.
[96] Yuanyuan Yan, Leiyu Feng, Chaojie Zhang, Hongguang Zhu and Qi Zhou
(22 March 2010), Effect of ultrasonic specific energy on waste activatedsludge
solubilization and enzyme activity, African Journal of Biotechnology Vol. 9 (12), 1776-
1782.
[97] Zaileen Alibhai (2006), Production of soy protein concentrates/isolates:
traditional and membrane technologies, Desalination 191, 351 – 358.
[98] Zhong Min Tian, Ming Xi Wan, Su Pi Wang, Ju Qing Kang (2004), Effects of
ultrasound and aditives on the function and structure of trypsin, Ultrasonics
Sonochemistry 11, 399–404.
Phụ lục
Trang 88
PHỤ LỤC
1. Xác định độ ẩm
Cách tiến hành: Sử dụng thiết bị đo độ ẩm hồng ngoại của hãng Scaltec (Đức)
sản xuất. Cân 1 lượng khoảng 2g mẫu vào đĩa sấy, đặt vào máy, xác lập chế độ sấy ở
130 C, sấy đến khối lượng không đổi. Đọc kết quả độ ẩm của mẫu hiển thị trên máy đo
khi kết thúc.
Công thức tính:
Với: mo: khối kượng mẫu ban đầu
m1: khối lượng mẫu lúc sau
2. Xác định độ tro
Cách tiến hành: Nung chén sứ đã rửa sạch ở lò nung (600oC) đến khối lượng
không đổi. Để nguội ở bình hút ẩm và cân. Cho vào chén m (g) mẫu, cân rồi cho vào lò
nung ở 600oC, nung đến tro trắng. Lấy ra cho vào bình hút ẩm và cân chính xác. Tiếp tục
nung 30 phút rồi lấy ra cho vào bình hút ẩm và cân chính xác cho đến khối lượng không
đổi thì ngừng.
Công thức tính:
Độ tro = 2
1
100G
G
G
G
Với G là khối lượng chén.
G1 là khối lượng chén và mẫu.
G2 là khối lượng chén và tro.
3. Xác định hàm lƣợng lipid
Cách tiến hành:
Phụ lục
Trang 89
− Sấy khô nguyên liệu đến khối lượng không đổi (100 – 105oC).
− Cân M (g) nguyên liệu đã nghiền nhỏ cho vào gói giấy.
− Đặt vào trụ chiết. Lắp trụ vào bình cầu và gắn ống sinh hàn. Qua ống sinh hàn
dùng phễu cho dung môi petroleum ether vào trụ chiết sao cho một lượng dung môi đã
chảy xuống bình cầu, một lượng trên phễu vẫn còn ngập mẫu. Dùng bông làm nút đầu
ống sinh hàn. Mở nước lạnh.
− Mở công tắc đèn.
− Trích ly trong 12 giờ.
− Thử xem hết chất béo chưa ở đầu siphon (không còn vết dầu loang khi dung
môi bay hơi).
− Lấy gói giấy, đặt dưới tủ hotte cho bay hơi dung môi.
− Sấy ở 100 – 105oC trong 1,5 giờ
− Để nguội trong bình hút ẩm.
− Cân xác định khối lượng
Công thức tính:
Lượng lipid tổng : 1 2 100M M
XM
Với M1 : khối lượng gói giấy và mẫu ban đầu.
M2 : khối lượng gói giấy và mẫu sau khi trích ly và sấy.
M : khối lượng mẫu ban đầu.
4. Xác định hàm lƣợng protein tổng
Cách tiến hành:
− Vô cơ hóa mẫu: tiến hành trong máy vô cơ hóa mẫu. Cho một lượng mẫu xác
định vào bình chứa mẫu. Thêm từ từ H2SO4 đậm đặc vào bình chứa mẫu. Đưa bình chứa
mẫu vào máy, bật máy và chỉnh nhiệt độ vô cơ mẫu. Sau khi H2SO4 chảy màng trên
thành bình cho tiếp xúc tác H2O2 cho đến khi mẫu trắng ra.
− Cất đạm bằng máy Kjeldahl: mẫu sau khi vô cơ hóa được đưa vào máy Kjeldahl
để cất đạm. Đồng thời, đưa vào một erlen chứa khoảng 10 ml H3BO3 chứa hỗn hợp thuốc
Phụ lục
Trang 90
thử bromcresol green (0,002%) : methyl red (0,2%) = 5:1(w/w) pha trong cồn để thu mẫu.
Mẫu này sau đó đem đi chuẩn độ bằng H2SO4 0,1N đến khi xuất hiện màu hồng.
Công thức tính:
− Đối với mẫu lỏng:
Hàm lượng nitơ tổng số (Nt) có trong 1l nguyên liệu:
cdvc
tVV
nN
10042,1(mg/ml)
Với n: thể tích H2SO4 0,1N chuẩn độ (ml)
Vvc : thể tích mẫu đem vô cơ (ml).
Vcd : thể tích mẫu vô cơ đem cất đạm (ml).
1,42 số mg nitơ ứng với 1ml H2SO4 0,1N
− Đối với mẫu rắn:
cd
tVm
nN
10042,1 (%).
Với m là khối lượng mẫu ban đầu.
Tính hàm lượng protein bằng cách nhân hàm lượng nitơ tổng với hệ số 5,47
Hóa chất sử dụng:
- Thuốc thử methyl bromcresol:hỗn hợp bromcresol green (0.002%) và methyl
red (0.2%) = 5:1(w/w) pha trong cồn tuyệt đối.
- H3BO3 3%
- H2SO4 0,1 N để chuẩn độ
5. Xác định hoạt tính enzyme cellulase
Cách tiến hành (theo IUPAC, 1987):Chuẩn bị các ống nghiệm sau
− Ống chuấn đo mẫu trắng (spectro zero)
- 0.5 ml CMC
- 50oC, 30 phút
- 3 ml DNS
Phụ lục
Trang 91
- 0.5 ml đệm, trộn đều
- To sôi, 5 phút
- 20ml H2O
- Đo ở bước sóng 540nm
− Ống thử enzyme:
- 0.5 ml enzyme 50oC, 5phút
- 0.5 ml CMC
- 50oC, 30 phút
- 3ml DNS
- To sôi, 5 phút
- 20ml H2O
- Đo ở bước sóng 540nm
− Ống thử không enzyme đối chứng:
- 0.5 ml CMC
- 50oC, 30 phút
- 3ml DNS
- 0.5 ml enzyme
- To sôi, 5 phút
- 20ml H2O
- Đo ở bước sóng 540nm
− 4 ống chuẩn glucose (dựng đƣờng chuẩn)
- 0.5 ml CMC
- 50oC, 30 phút
- 3ml DNS
- 0.5 ml đường chuẩn
- To sôi, 5 phút
- 20ml H2O
Phụ lục
Trang 92
Dung dịch glucose chuẩn được pha với các nồng độ:
- 2 mg/ml (1 mg/0,5ml)
- 1 ml + 0,5 ml đệm = 1:1,5 = 1,33 mg/ml (0,67 mg/0,5l)
- 1 ml + 1 ml đệm = 1:2 = 1mg/ml (0,5 mg/0,5l)
- 1 ml + 3 ml đệm = 1:4 = 0,5 mg/ml (0,25 mg/0,5l)
Phương pháp tính toán:
− Định nghĩa: Một đơn vị hoạt tính IU/ml được định nghĩa là số lượng enzyme cần
thiết để giải phóng ra đường khử (glucose) ở tốc độ µmol/phút dưới các điều kiện thực
nghiệm.
− Xây dựng đường chuẩn glucose y=f(x) với trục tung là mật độ quang, trục hoành
là hàm lượng glucose (mg/0,5ml).
− Dựa vào đường chuẩn, tính nồng độ (mg/0,5ml) glucose trong dung dịch mẫu.
− Chuyển đổi mức độ pha loãng sang nồng độ enzyme:
Nồng độ enzyme = 1/ độ pha loãng
− Tính nồng độ enzyme sao cho phản ứng DNS cho chính xác 0,5 mg glucose (dựa
vào hệ số của phương trình đường chuẩn) trên đồ thị logarith với trục hoàng là hàm
lượng glucose, trục tung là ln( nồng độ enzyme). Độ pha loãng
− Hoạt tính enzyme:
CMC= 0,185/ nồng độ enzyme cho ra 0,5 mg glucose (IU/ml)
Hóa chất sử dụng:
Thốc thử DNS:
- Hòa tan 10g DNS trong nước cất. Khuấy trên máy khuấy từ.
- Hòa tan 300g Natri-Kali tactrate trong nước cất.
- Trộn 2 hỗn hợp trên với nhau
- Hòa tan 16g NaOH vào nước cất
- Cho dung dịch NaOH vào hỗn hợp DNS ở trên, khuấy đều đến khi DNS tan hoàn
toàn. (Sử dụng máy khuấy từ và gia nhiệt không quá 50oC)
- Định mức 1 lít. Lắc đảo đều
Phụ lục
Trang 93
- Dự trữ trong chai thủy tinh có màu tối. Cần phải tránh ánh sáng và CO2.
Đệm citrate 0,05M; pH 4,8:
- Hòa tan 10,5g Acid Citric Monohydrate C6H8O7.H2O trong khoảng 750 ml nước.
- Thêm từ từ 5-6g NaOH trên máy khuấy từ đồng thời chỉnh pH từ từ đến khi được
pH 4,5.
- Định mức 1000ml và kiểm tra pH. Ta được dung dịch đệm citrate 1M; pH 4,8. Cất
trong tủ lạnh.
Dung dịch glucose chuẩn:
- Cân chính xác 0,2g glucose khan, hòa tan trong dung dịch đệm citrate 0,05M.
Định mức lên 100ml. Ta được dung dịch glucose chuẩn 2mg/ml.
Dung dịch cơ chất CMC 2%:
- Khi làm thí nghiệm mới pha dung dịch này trong đệm citrate pH = 4,8
6. Kĩ thuật điện di
Nguyên lý của việc điện di là khi ở trong điện trường, do tích điện âm nên các phân
tử dịch chuyển về phía anode với tốc độ dịch chuyển của chúng khác nhau phụ thuộc vào
khối lượng phân tử. Khối lượng phân tử càng lớn thì dịch chuyển càng chậm. Kết quả là
từ một điểm chung (lỗ hay ―giếng‖ tải mẫu) các phân tử khác nhau dịch chuyển về một
hướng tạo thành một lane, và trên lane đó có các phân tử khác nhau phân bố ở các vị trí –
các band khác nhau tương ứng với độ lớn của chúng.
Các phân tử protein do điện tích bề mặt khác nhau nếu điện di trong gel không gây
biến tính thì dịch chuyển theo các hướng khác nhau với tốc độ khác nhau phụ thuộc cả
khối lượng phân tử lẫn điện tích bề mặt.
Tuy vậy, nếu các protein được xử lý với các chất tẩy ion hóa mạnh như SDS
(sodium dodecyl sulphat) và một hợp chất khử, ví dụ như mercapthoethanol, thì các cấu
trúc bậc 2, và 4 của phân tử protein sẽ bị phá vỡ. Nghĩa là, sau khi xử lý với SDS, protein
trở thành dạng phân tử polymer không có cấu trúc, duỗi mạch hoàn toàn. Đồng thời,
SDS tạo thành lớp vỏ ion và làm phân tử protein trở nên tích điện âm đồng đều hơn.
Mecarptoethanol thì làm giảm các liên kết disulphit hình thành giữa các tiểu phần
cystein. Kết quả là nếu các phân tử protein được gây biến tính bởi SDS và
mecarptoethanol thì sự phân tách của các loại phân tử protein trong điện di chủ yếu là do
Phụ lục
Trang 94
sự khác biệt về trọng lượng và kích thước phân tử. Sau khi điện di, các phân tử protein
được nhuộm với các thuốc nhuộm liên kết protein như Coomassie brilliant blue và quan
sát. Khi không có SDS, điện di vẫn có thể phân tách được các loại protein, nhưng lúc này
còn có các yếu tố khác nhau của các loại protein là trọng lượng phân tử, tổng điện tích và
điểm đẳng điện.
Hình: điện di trên gel polyacrylamide