ngs mlstを使った病原菌タイピングと今後の微生 …...2016/02/16 · sample to...

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NGS MLSTを使った病原菌タイピングと今後の微生物ゲノム解析開発プランについて

キアゲンバイオインフォマティクス宮本真理 Ph.D

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アジェンダ

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• CLC Microbial Genomics Module 内容

• Typing ツール概要

• Typingツール解析フローとその詳細

• デモ

• サルモネラデータを使ったタイピングと解析例

• 関連製品

• 今後の開発プラン

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CLC Microbial Genomics Module内容

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CLC Microbial Genomics Module

CLC Microbial Genomics Module はCLCGenomics Workbench/Biomedical Genomics Workbench 用のアドオンモジュールです。

• メタゲノム解析ツール

• 病原菌タイピングと疫学的解析ツール

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16S rRNA解析 (18S rRNA解析なども可)

Filgen WebEx seminar, 2015/07/16 (2015/07/30) 4

ワークフローとインタラクティブなビジュアライゼーション

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CLC Microbial Genomics Module内容

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CLC Microbial Genomics Module

メタゲノム用解析ツールタイピング・疫学解析ツール

メタゲノム用解析パイプラインタイピング・疫学用解析パイプライン

これらが全て含まれます。

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NGSを使ったMLSTの現状

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Pérez-Losada M, Cabezas P, Castro-Nallar E, Crandall K a.: Pathogen typing in the genomics era: MLST and the future of

molecular epidemiology. Infect Genet Evol 2013, 16(June 2015):38–53.

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CLC Microbial Genomics Module 1.1 BETA –特徴

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病原菌のタイピング、微生物の分子疫学研究に必要な機能の搭載

特徴

• 病原菌の特定、確認• タイピングフローを解析パイプラインとして搭載、カスタマイズも可能。

• サンプル採取場所、アウトブレイクの有無といったメタデータを使用したビジュアライゼーション

• メタデータ情報の追加などに対応した柔軟なデータ管理• 系統樹解析など疫学用解析ツールも搭載

利点

• あらかじめ設定された解析パイプラインに沿って解析することでOutbreakから菌の特定までの時間の短縮。

• 分離された微生物が既知の病原菌かどうかをMLSTによるタイピング、k-mer系統樹を用いて迅速に確認

• 公衆衛生の現場で利用されている信頼されたツールを搭載

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o MLST (multi locus sequence type)

o 既知の耐性菌の情報との比較

o 最もよく類似する菌の特定

o 参照するゲノムに対する分類

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Analysis results

• 抗菌抵抗性の検出• MLST

• もっとも類似する菌の特定

Routine workflow analysis複数の菌の比較

関連するデータの

クイック表示

additional analysiso メタデータを使った検索やフィルタリングo “Quick filtering”と”With selected”ツールによる

次の解析ステップの示唆.

Metadata

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解析の流れの一例

Title, Location, Date 10

Import

Meta DataImport

Associate Data

Run workflow

K-mer tree

Map to close reference genome

Variant Detection

SNP tree

• 配列データ• MLST schema

• 抗菌剤耐性に関するデータベース• RefSeqのデータ

• 配列データとの紐付け

• MLST、類似する菌の同定、抗菌耐性菌の特定

• MLST, K-mer treeの結果から類似するゲノムを特定

• マッピング

• 変異検出

• SNP tree

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CLC MicrobialGenomics Module

ワークフロー例


解析例:

Import

Meta DataImport

Associate Data

Run workflow

K-mer tree


Variant Detection

SNP tree

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解析例


シークエンスデータインポート

Import

Meta DataImport

Associate Data

Run workflow

K-mer tree


Variant Detection

SNP tree

• シークエンサーのタイプにあわせたインポーター

• インポート後のデータはリードの塩基をクオリティと共に表示。

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解析例


メタデータインポート

Import

Meta DataImport

Associate Data

Run workflow

K-mer tree


Variant Detection

SNP tree

• タブ区切り、エクセルフォーマット、などのフォーマットでインポート可能。

• 文字コードや日付データなどもインポートできる

• メタデータは後からデータの追加や項目の追加も出来るようになっている

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解析例


メタデータにシークエンスデータを紐付け

Import

Meta DataImport

Associate Data

Run workflow

K-mer tree


Variant Detection

SNP tree

• メタデータにシークエンスデータ名など、Keyとなる情報を入れておき、その情報に基づいてシークエンスデータと紐付けできる。

• これによりメタデータが系統樹解析などで利用できるようになる。

メタデータ

シークエンスデータ

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解析例


ワークフロー実行

Import

Meta Datasetting

Associate Data

Run workflow

K-mer tree


Variant Detection

SNP tree

• あらかじめ組み込まれているワークフローをメタデータ、紐付けされたシークエンスデータと関連させ、テーブルから実行できる。

• つまりメタデータの情報を選び、紐づくシークエンスデータを選び、ワークフローを実行という流れがスムーズに行える。

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解析例


ワークフロー実行結果

Import

Meta Datasetting

Associate Data

Run workflow

K-mer tree


Variant Detection

SNP tree

• ワークフロー結果も、メタデータと結果を管理しているテーブル（meta table results）よりメタデータ情報に基づいて検索できる。

• 抗菌剤(Aminoglycoside, Sulphonamide, Tetracycline, Beta-lactam, Phenicol, Macrolide, Streptogramin B, Trimethoprim)耐性も検出。

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解析例


解析例:

Import

Meta Datasetting

Associate Data

Run workflow

K-mer tree


Variant Detection

SNP tree

• 複数の種の比較をk-merを用いた類似度で系統樹を作成できる。

• 系統樹のパターンはPhylogram, Cladogram, Circular Phylogram, Circular Cladogram, Radial で表示可能。

• 系統樹にはラベルとしてメタデータを利用できる。

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解析例


解析例:

Import

Meta DataImport

Associate Data

Run workflow

K-mer tree


Variant Detection

SNP tree

• タイピング結果などから特定の近縁種ゲノムを選択

• 組み込まれたワークフローを使い、近縁種へのマッピング、変異検出を行い、系統樹を作成する。

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解析例

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サルモネラデータのタイピング例

• サルモネラのWhole Genome Sequenceを使ったタイピングの評価。

• 47のサンプルがこの論文では使用され、パルスフィールド電気泳動による血清型、アウトブレイクの有無、などがメタデータとして提供されている。

Leekitcharoenphon P, Nielsen EM, Kaas RS, Lund O, Aarestrup FM: Evaluation

of Whole Genome Sequencing for Outbreak Detection of Salmonella

enterica. PLoS One 2014, 9:e87991.

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解析例

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結果

• サルモネラデータをMultiple SpeciesTypingパイプラインにて解析。

• 1サンプルはリードの63％がE.coliにマップされたため、E. coliと判定されたが、それ以外はサルモネラと判定。

• 血清型について、データベース中に登録されているTyphimurium、Enteritidisについては、Typhimurium32サンプル、Enteritidis8サンプルを正確に判定。

• Derby（5サンプル）、O4型（2サンプル）はデータベース中にゲノムがないため、判定が出来なかった。

47サンプル中40サンプルは血清型までを正しく判定。

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その他のツール群

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ワークフローとは別にMGMに搭載されているツール群

• 一連のワークフローで利用したツール群は、個別に利用することも可能。

• MLSTのスキーマはPubMLSTからダウンロード以外にも、別のMLSTスキーマをインポートすることも出来る。

Genomics Workbenchに搭載されているBLASTやDe novoアセンブリなどで更なる解析も可能

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関連製品

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サンガーシークエンサーを使ったMLST

CLC Genomics Workbench のモジュールとしてサンガーシークエンサーによるMLSTモジュールも販売しています。

こちらも有償モジュールとなるため、価格などは別途フィルジェン様へお問い合わせください。

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Microbiome Analysis

Microbial Typing

Microbial Genome Finishing Module(MGFM)

SeqFlowMTB

Typing

CLC

Microbial

Genomics

Module

Genome

Finishing

Module

(GFM)

今後の開発プラン

➀ Version 1.0: Microbiome Analysis

➁ Version 1.1: Microbial (isolate) Typing

➂ Version 1.2 – 2.0: Metagenomic data support

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まとめ

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• CLC Microbial Genomics Module はマイクロバイオーム、病原菌のタイピング、そして疫学研究に必要な解析ツールを備えたソフトウェアである。

• あらかじめ組み込まれた解析のパイプライン（ワークフロー）を利用できることで、容易に解析を始めることができる。

• メタデータをシークエンスデータに紐付けることで、様々な角度でのデータの選択、解析が容易に実行できるようになる。

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ご清聴ありがとうございました。

Question?

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[email protected]

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Single Species Typing

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Multiple species typing

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