’13年06月

Contents - 2 -

• 유전체 분석 과정 Basic Ⅰ

• NIPT 원리 및 과정 Ⅱ

• NIPT 상용 서비스개발 과정 및 소요 기간 산출 Ⅲ

• 결론 Ⅳ

• 첨부 – NIPT Provider별 기술 Ⅴ

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Ⅰ: 유전체 분석 과정 Basic

전체 과정 요약

Sample Preparation

Sample Preparation 장비 FLOW

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샘플 준비-데이터 분석-고도화 분석 과정은 상호 매우 밀접한 관계가 있으며, 진단과 분석 기법 종류에 따라 그에 맞게 세 부분(샘플준비-데이터분석-고도화 분석)을 같이 최적화가 반드시 필요. 따라서,특정 고도화 분석/진단 분야에 일반 Bioinformatics 전문가를 통해 상용 확보하고자 한다면 ,세 부분에 대해 많은 시간과 반복 시도를 통한 보정과 최적화 작업은 기본적으로 필요하며, 또한 , 이런 과정을 거쳤다고 하더라도 정확하고 신속한 상용 수준의 고도화 분석/진단 확보 여부를 보장 할 수 없는 어려운 진입 장벽이 있음.

Ⅰ. 유전체 분석 과정 Basic 1. 전체 과정 요약

1Primer: 대상 DNA의 복제 시작 부분을 표시해 주기 위한 시발체로 DNA Fragment 끝에 붙임. 2dNTP(deoxy-Nucleoside-Tri Phosphate): DNA가 합성될때 필요한 물질로서 dATP, dCTP, dGTP, dTTP 4가지 있음.

샘플 준비 과정

①DNA 추출 ②DNA Library 제작 (DNA에 1Primer 부착) ③증폭

시퀀싱 과정

①Lib에 형광2dNTP결합 ②촬영> 이미지 파일 ③이미지 > 염기문자

데이터 분석

① 염기문자파일upload ② 분석 Pipe-line -매핑/정렬->변이후보 ③ 분석 결과 레포트

고도화 분석 ① 1차 데이터 분석과 외부 통계 DB(질병/변이) 연동. ② 진단/확률 알고리즘 통해 진단/확률 결과 도출

고도화 분석(통계)

외부 통계 DB

변이DB 질병DB ….

진단 / 확률

알고리즘

매핑 정렬 분류

Pipe-line(분석 Tool) NGS-시퀀서

사진 촬영

염기문자 인식

문자 파일 변환

샘플 준비 작업 장비

DNA 추출

정확성 확인/ 보정

증폭 작업

Ⅰ. 유전체 분석 과정 Basic

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Cluster Generation

군집 증 폭(Sequencer마다 상이)

Library Preparation

Primer를 절개된 DNA Fragment 양쪽부착.

Primer + DNA Fragment = Library하며,

이 형태로 증폭-> Sequencing 처리를 함.

DNA Shearing (DNA 절삭)

① 혈액/타액->DNA만 적출

② 일정한 크기로 절단(DNA Fragment)

약 6시간 소요

약 4시간 소요

2. Sample preparation

Covaris 사의 Acoustic Disruptor를 이용한 DNA shearing 로, 원하는 크기로 균일하게 DNA shearing이 가능

각 Sequencing 종류 별, 별도의 Kit 가 있으며, Primer가 포함되어 있음.

Flowcell이란 기판에 Library를 놓고 기기별 다른 증폭방식으로 증폭. (향후, 시퀀싱 장비로 Flowcell 기판 자체를 Insert)

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DNA 절삭-> DNA Library 제작 -> 증폭

극소 정량 DNA 절삭/추출과 primer 결합을 통한 Library를 제작하는 샘플 제작 과정임. (전용기기 이용)

선별된 DNA Library를 증폭(Clustering)하는 과정임.(PCR 장비)

증폭된 최종 DNA Library가 다량 Clustering(군집)을 이루고 있는 시퀀싱 장비에 삽입 용 판넬

3. Sample Preparation 장비 Flow Ⅰ. 유전체 분석 과정 Basic

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Ⅱ. NIPT 원리 및 과정

NIPT 정의 및 기존 방식과 비교

NIPT 전체 Flow

Vendor별 알고리즘 비교

전체 기법 분류

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NIPT(Non-Invasive Prenatal Testing)은 임신초기(9~10주) 산모의 혈액 속에 있는 태아의 cffDNA(cell free fetal DNA)를 분석해 다운증후군(trisomy 21)· 에드워드 증후군(trisomy 18), 파타우 증후군(trisomy 13), 터너 증후군(monosomy X),클라인펠터 증후군(XXY) 등의 염색체 이상을 판별하는 비 침습 식 산전 유전자 검사.

Ⅱ. NIPT 원리/ 과정 1. NIPT 정의/기존 방식과 비교

침습 식 방식 (기존 방식) 비 침습 식 방식 (NIPT)

검사 유형

CVS(chorionic villous sampling: 융모)

Amniocentesis (양수 검사)

검사가능시기 임신 11-13 주 임신 16-20주 임신 9~10주

검사 위험 성 유산이나 태아 사지 기형 위험도: 0.5~1%

유산 위험도 0.1~1% 없음

소요 시간: (결과 확인 기간)

2~3일 소요 다운,에드워드,파타우 증후군만 확인은 1~2일 소요. 전체 검사 기간 10~14일

10일

정확도 •true positive rate = 100% •false negative rate >0%

•true positive rate = 100% •false negative rate >0%

•True positive rate =99% • false negative rate > 1%

장/단점 정확성이 높음.

검사의 위험성이 존재,

검사 위험요소가 없음. 조기 검진 가능 (First Trimester) 정확성은 침습 식과 유사함

Ⅱ. NIPT 원리/ 과정

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EDTA Tube에 산모 혈액 5~10mL 체취(임신 9~10주)

혈액체취

Dry ice 밀폐 박스에 혈액 Tube를 냉동 보관하여 연구실로 배송

혈액 배송

병 원 NIPT-실험실

•단기 보관(1주일 내) -영하 20도에 보관. •장기 보관(1주일 이상) -영하 80도에 보관. 기온변화(해동-결빙) X

혈액 보관

영상 4도에서 8시간 이내 즉시 혈장 분별 진행

DNA 체취 시약 •Target 방식 시, -> 타겟 염색체용 Probe 포함됨. • MPSS 방식 시, -> 전체 DNA 체취

DNA체취/절삭 DNA Library 제작

•Lib 제작 시약 -시약 내 포함된 Primer가 DNA에 결합됨. - Quality 점검 .

PCR(증폭)

Sequencing

고도화 분석(통계)

통계 DB

외부 DB

내부 DB

….

진단 / 확률

알고리즘

(업체 마다 상이,

Black Box)

분류 정렬 매핑

Data 분석 Pipe-line

NIPT-Bioinformatics/Static 연구실 회사명/브랜드 지원 가능 진단 /정확도 방식

Sequenom /MaterniT21 PLUS

T13(91.7%),T18(99.9%),T21(99.9%), XY(99.4%)

MPSS/ 정량

Verinata/Verifi T13(87.5%),T18(97.4%),T21(99.9%), XY(97.6%)

MPSS/ 정량

Ariosa/Harmony T18(97.4%),T21(99.86%), Target/ 정량

Natera /Panorama

T13(100%),T18(100%),T21(100%), XY(92%)

Target/ SNP

BGI NIFTY

T13(100%),T18(100%),T21(100%), XY(100%),지중해 빈혈 등

MPSS/ 정량

BerryGenome /BamniTest

T13(99.9%),T18(99.9%),T21(99.9%), XY(99.9%),지중해 빈혈 등

MPSS/ 정량

결과 통보

업체마다 독자 진단/확률 알고리즘이 있으며, 기본 개념은 유사하나 높은 정확도와 빠른 처리가 가능한 고도화 부분은 Blackbox(비공개)이고, 이런 고성능 상용 수준이 가능한 이유는 샘플작업->Data 분석->고도화 분석을 지속적으로 수없이 반복하며 알고리즘을 최적화 한 결과 확보가 가능했음.

2. NIPT 전체 Flow

혈액 분별

▣ Vendor 별 알고리즘 비교

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알고리즘 or 위험 측정 방식 평가 기준 측정 가능 시기 소요 시간

(Turn around Time)

Sequenom 알고리즘 명 비 공개

Z-Score 방식 Z-score < 3 (정상)

Z-score > 3 (비정상) 임신 9주

7일 (working time)

Verinata 알고리즘 명 비 공개

NCV 방식 (Normalized chromosome value)

NCV < 4 (정상) 2.4 < NCV< 4(의심) NCV > 4 (비정상)

임신 10주 8~10일

(working time)

Ariosa FORTE 알고리즘

High-Low Risk 방식 Low Risk<1%(정상)

HighRisk>99%(비정상) 임신 10주

8~10일 (working time)

Natera

NATUS 알고리즘 태아SNP를 외부SNP DB와 비교

하고, 통계 기법(Bayesian & Maximum Likelihood Estimation)

을 활용한 기법.

해당 염색체 번호의 추정치 이수성과 분석 결과 이수성 일치 율 %

임신 9주 8~10일

(working time)

BGI 알고리즘 명 비 공개

T-Score / L Value 방식 미 공개 임신 10주

8~10일 (working time)

BerryGenomics 비 공개

미 공개 임신 10주

8~10일 (working time)

3. Vendor별 알고리즘 비교 Ⅱ. NIPT 원리/ 과정

4. 전체 기법 분류

MPSS(Massive Parallel Shotgun Sequencing) - 전체 염색체를 모두 Sequencing 하는 방식

Target Sequencing - 특정 염색체만 선택 Sequencing하는 방식

Target Sequencing or DANSR(Digital Analysis SNP Regions) - 특정 염색체만 선택 Sequencing하는 방식

기법 분류

Quantitative read Counting -표준 전체 염색체(산모+태아) 정량과 대상 전체 염색체 정량을 비교하여 이상 유무를 판독하는 기법.

SNP Detection 태아의 SNP와 SNP 통계 DATA를 비교하여 이수성 여부 분석하는 기법.

Sequenom Verinata BGI-Health BerryGenome

Ariosa

Natera

Ⅱ. NIPT 원리/ 과정

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Ⅲ. NIPT 상용 서비스개발 과정 및 소요 기간 산출

핵심 영향 요소

상용화 개발 과정

소요기간 산출

전체 기법 분류

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1. 핵심 영향 요소 Ⅲ . NIPT 상용 서비스개발 과정 및 소요 기간 산출

샘플 준비

• 다수 혈액 샘플 필수(MPSS/Target)

• ex: BGI: 11만개 이상, Sequenom : 약 300 개.

• Target 시, Target 번호의 염색체만 정확히 체취

하는 숙련 경험 필요. (Quality Control Skill)

• GC Rate의 이상 시, 샘플부터 재 작업이 필요

NIPT 알고리즘 확보

• 일반Data 분석에서 쓰이는 Align/Variant 알고리

즘은 많이 공개되어 공유되는 것과는 달리, NIPT

염색체 이상을 분석하는 고도화 분석 Algorithm

은 비공개로 많은 최적화 작업을 통해 완성된 것

으로 미 확보 시, 단 기간에 개발 불가 함.

정확한 Test 결과로 통계 DATA 축적

• 확보된 다수의 샘플들과 알고리즘 판독의 객관적

정확성을 증명하기 위해 일정기간 동안 처리한

정확한 산술 근거와 TEST 통계 축적이 필수

Performance 고도화

• 타 상용 서비스 비교하여, 분석 처리 기간과

정확도 결과가 동일 이상 수준의 성능 확보

위해 반복된 샘플 작업부터 고도화 분석까지

숙련된 성능 고도화가 필수 필수.

상용화 기술 핵심

영향 요소

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2. 상용화 개발 과정

• 방식결정(MPS/Target)

• 전체/단계별 일정 • 샘플검증/확보 방안 - Quality 점검필요 - Probe/Primer 설계

• 목표수준(성능)확정 - 정확도, 처리시간

• 장비 상태 점검 - DNA 절삭/추출 기. - 원심분리/ Lib 제작 기. - PCR/Sequencing - 기본 Pipe-line S/W

계획/준비/설계 Sample 작업 Sequencing 기본 분석 (Align/분류)

NIPT 분석 (고도화 분석)

• 특정번호 염색체 획득 - Target 시, 특정 위치 염색체 획득을 위한 Probe 포함 시약 통해 염색체 고착/구별 시킴.

• DNA 추출/절삭 - 일정 크기 DNA 절삭

• DNA Library 제작 - Primer 포함 시약 통해 Primer + DNA 결합

• DNA Library 증폭 - Sequencing 장비에 맞는 증폭 방식으로 증폭.

• MPSS : 전체 염색체 진행. 약 1천2만 bp Read (염기서열) 산출.

• Target: 특정 염색체,13,18,21, X,Y 등 특정 염색체 서열만 산출.

• MPSS : Mapping(Align) - Reference와 비교/분류

• Target-SNP: - Variant calling 필요 • NIPT 알고리즘 연동

• MPSS: GC Content 확인

염기 서열 정량 분석 ( 알고리즘 구동) • SNP 통계 분석.

• 알고리즘 고도화

• Reporting - 신뢰 수준이 맞는 분석 결과 Reporting.

Ⅲ . NIPT 상용 서비스개발 과정 및 소요 기간 산출

③Sequencing

과정

④기본 분석

과정

⑤고도화 분석

과정 후,

성능 확인

⑥원인 분석

수정 과정

②Sample

Preparation

과정

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일반 전문가 최소 8개월 이상

NIPT 전문가와 알고리즘 확보 시, 이 기간 필요 없음.

①계획/준비 과정

NIPT 전문가와 알고리즘 확보 시, 성능 확인<->보정 작업<->통계 Data 축척을 위한 test 진행(목표 Sample 수)으로 약 7개월 소요

3. 소요기간 산출

【 NIPT 알고리즘 확보 후, 상용화 준비 과정 】

일반 전문가(비 NIPT 전문가) 전체, 최소 20개월 이상 필요

【 NIPT 알고리즘 개발 단계】 【 상용 시작 】

알고리즘 설계

Logic 구현

Code Optimize

Debugging 일반전문가 경우,

약 12 개월 반복 작업

◎ 상용 가능 수준 • 진단 범위 - T13,18,21 모두 지원. - 성 염색체(XX,XY) 이상 진단. 정확 성(모든 종류에서) - Sensitivity :99.9% 이상. - Specificity : 99.9% 이상 Turn around Time(처리속도) -10일 이내

※Sensitivity 높음=false negatives적음 Specificity 높음 =false positive 적음

Ⅲ . NIPT 상용 서비스개발 과정 및 소요 기간 산출

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감사합니다