Nitrate Reductase (NADH)EC 1.7.1.1

Oleh: Dita Ayu Pratiwi (10506054)Sofi Siti Shofiyah (10506063)

PRESENTASI ENZIMOLOGI KI- 5162

Agenda Presentasi •Tata nama enzim •Kofaktor•Mekanisme katalisis•Manfaat enzim •Struktur enzim •Tahap isolasi dan pemurnian enzim•Aplikasi Industri

IUBMB Enzyme

Nomenclature

EC 1.7.1.1

Sumber :Springer Handbook of Enzymes

Kofaktor Nitrate Reductase (NR)

Mekanisme Katalisis NR

Sumber: Fischer, et. al. 2005 . The Plant Cell.

Cleland Plot NR

Sumber: Howard, et. al. 1981. Journal Biological Chemistry

Asimilasi Nitrogen

Stuktur 3D NR

Sumber: Fischer, et. al. 2005 . The Plant Cell

Sisi Aktif Enzim dan Muatan Permukaan NR

Sumber: Fischer, et. al. 2005 . The Plant Cell

Arabidopsis thaliana• Tanaman berbunga kecil

yang hidup di dataran eropa, asia, barat laut afrika

• Tumbuh di musim semi

• Mempunyai siklus hidup yang relatif singkat

• Populer sebagai model organisme untuk memahami biologi molekul banyak tanaman

Produksi Rekombinan NR

NR diekspresika

n •Diekspresikan di methylaptrophic yeast Pickia pastoris strain GS115 dari Arabdopsisi NIA NR cDNA pAtc-4

Pertumbuhan kultur •Di kultur 500mL yang mengandung UPD media (1% yeast

ekstrak, 2%peptone, dan 2% Glc, a11 w/v)

Induksi ekspresi NR

•Sel log phase dicuci dan diresuspensi ke dalam 1L media MM yang dimodifikasi (2,8% [w/v yeast basa nitrogen dengan ammonium sulfate, 100mM potassium phosphate, pH 6, 4x 10-5 % biotin, 0,2 mM Na-Molibdat, 1% metanol

Sumber: Wenpei Su, et. al. 1997. Plan Physiology.

Produksi Rekombinan NR (Lanjt)

Kultur sel•Ditambahkan methanol 1% (v/v) dan Na-Mo (0,2 mM)

setiap 24 jam•Setelah 72 jam periode induksi cel dikumpulkan,

disentrifuga dan diresuspensi kembali,

Diresuspensi

•Extraction buffer mengandung 50mM sodium phospate , pH 7,3, 1 mM EDTA, dan 5% (v/v) gliserol.

•Sel dipecahkan dengan Bead Beater menggunakan 0,5-pm glass beads selama 5 menit

Ekstrak kasar •Disentrifuga pada 15.000 g selama 20 menit pada 4oC

•Diuji aktifitas ekstrak kasar dan dimurnikan

Sumber: Wenpei Su, et. al. 1997. Plan Physiology.

Permunian NR

Ekstrak kasar •Pengendapan 30-45% amonium sulfat

Pelet•dilarutkan padan 50mM Natrium fosfat, ph 7,3, dan

1mM EDTA (bufferA) dialirkan ke Blue-Sepharose•Blue Sepharose yang berikatan dengan NR

dikumpulkan dengan filtrasi vakum yang dicuci dengan kolom 1,5 cm

Kolom kromatogr

afi •Dielusi dengan 0,1 mM NADH dalam buffer A

Sumber: Wenpei Su, et. al. 1997. Plan Physiology.

Pemurnian NR (Lanjt)

Fraksi NR •Dipekatkan dengan 25mM Mops (ultrapure grade, Calbiochem), pH 7,0 menggunakan Centriprep 30 concetrator

Sampe setengah

murni

•Dialirkan ke 1,5 mL kolum 5’-AMP sepharose•Kolum dicuci dengan buffer B ( 50mM Mops, pH 7, dan

1 mM EDTA. •Dielusi dengan 0,1 mM NADH dalam Buffer B.

Fraksi NR •Yang mengandung aktifitas 2 unit/mL disatukan dan dikonsetrasikan dengan pertukaran buffer 25 mM Mops, pH 7,0

Sumber: Wenpei Su, et. al. 1997. Plan Physiology.

Pengujian Kinetik NR

Sampel NR murni

• Eksperimen dilakukan pada 25oC dalam 1 mL buffer yang mengandung 50 mM Mops, pH 7,0 dengan pengukuran A340 dengan kuvet 1 cm dan UV /Vis Spektrofotometry

Konsterasi Subtrat

• Divariasikan dari 0,5-20 μM untuk NADH dan 2,5-60 μM untuk KNO3

Analisis

• Kecepatan awal reaksi dianalisis dengan Enzpack software

• Spektrum dari oksidasi sampel dan NADH(red) ditentukan pada 25oC menggunakan UV/Vis dioda array spectofotometer

Sumber: Wenpei Su, et. al. 1997. Plan Physiology.

Aplikasi NR di Industri •NR memiliki peran penting dalam

bioteknologi lingkungan.

•Digunakan sebagai metode pengujian komersial kandungan nitrat dalam air (detektor elektronik berbasiskan enzim yang akan memonitoring secara kontinu kandungan nitrate dalam air)

•Pengujian reduks nitrate

Referensi Wenpei Su, Jeffrey A. Mertens, Kengo Kanamaru, Wilbur H.

Campbell, and Nigel M. Crawford. 1997. Analysis of Wild-Type and Mutant Plant Nitrate Reductase Expressed in the Methylotrophic Yeast Picha pastoris’. Plant Physiology.

William D. Howard4 and Larry P. Solomonsonf. 1981. Kinetic Mechanism of assimilatory NADH: Nitrate Reductase from Chlorella. Journal of Biological Chemistry

Lawrie Skipper, Wilbur H. Campbell, Jeffrey A. Mertens, and David J. Lowe. 2001. Pre-steady-state Kinetic Analysis of Recombinant Arabidopsis NADH:Nitrate Reductase. JBC Papers.

Katrin Fischer, Guillaume G. Barbier, Hans-Juergen Hecht, Ralf R. Mendel, Wilbur H. Campbell, and Guenter Schwarza. 2005 . Structural Basis of Eukaryotic Nitrate Reduction: Crystal Structures of the Nitrate Reductase Active Site. The Plant Cell.

http://www.chem.qmul.ac.uk/iubmb/http://www.plantphysiol.org/cgi/reprint/61/4/611http://www.uniprot.org/uniprot/P11832

Terima kasih

Program Studi Kimia Institut Teknologi Bandung 2009