novembre, 2008 adapté de bruce bagwell (verity software house, usa) compensation gérald grégori...
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Novembre, 2008
Adapté de Bruce Bagwell (Verity Software House, USA)
CompensationCompensation
Gérald GrégoriGérald Grégori
Laboratoire de Microbiologie, Géochimie et Ecologie Marines Laboratoire de Microbiologie, Géochimie et Ecologie Marines CNRS UMR 6117 CNRS UMR 6117
163 Avenue de Luminy - Case 901- Bât TPR1 - Entrée F 163 Avenue de Luminy - Case 901- Bât TPR1 - Entrée F 13288 Marseille cedex 9 (France)13288 Marseille cedex 9 (France)
Responsable de la Plateforme Régionale de Cytométrie pour la MicrobiologieResponsable de la Plateforme Régionale de Cytométrie pour la Microbiologiewww.com.univ-mrs.fr/PRECYM www.com.univ-mrs.fr/PRECYM
[email protected]@univmed.fr
Novembre, 2008
Cytométrie en FluxCytométrie en Flux
La cytométrie en flux La cytométrie en flux mesure :mesure :• La lumière diffusée par les cellules dans 2 directions (diffusion La lumière diffusée par les cellules dans 2 directions (diffusion
aux petits angles et à 90°)aux petits angles et à 90°)• La fluorescence produite par les cellules et induite par la La fluorescence produite par les cellules et induite par la
source d’excitation lumineuse. source d’excitation lumineuse.
La fluorescence peut être naturelle (autofluorescence) ou La fluorescence peut être naturelle (autofluorescence) ou induite (colorants fluorescents - fluorochromes)induite (colorants fluorescents - fluorochromes)
Différence avec la Différence avec la spectrophotométriespectrophotométrie : mesure la fraction : mesure la fraction de lumière absorbée ou transmise dans un volume de lumière absorbée ou transmise dans un volume d’échantillon (méthode globale). d’échantillon (méthode globale).
Mesure (-métrie) des propriétés optiques de cellules (cyto-) transportées par un liquide vecteur (flux) jusq’à une source d’excitation lumineuse (le plus souvent un laser).
Novembre, 2008
Spectres d’absorption et d’émission Spectres d’absorption et d’émission d’un composé organiqued’un composé organique
La fluorescence d’un composé organique est toujours spectrale. Exemples de fluorochromes. (Practical Flow Cytometry, Third Edition, Howard M. Shapiro. P. 245).
Chaque fluorescence mesurée par un cytomètre en flux est spectrale, c’est à dire étalée sur une gamme de longueurs d’ondes (plusieurs nm).
Novembre, 2008
Composés inorganiques (Nanoparticules)Composés inorganiques (Nanoparticules)
10 types de nanocristaux excités en UV (lampe à arc). De gauche à droite (bleu rouge), émissions centrées sur 443, 473, 481, 500, 518, 543, 565, 587, 610, et 655 nm.
Novembre, 2008
Propriétés optiques des nanocristauxPropriétés optiques des nanocristaux
Nature biotechnology • VOLUME 21 • JANUARY 2003 • www.nature.com/naturebiotechnology
• Large spectre d’absorption
• Spectre d’émission étroit
• Faible photo-blanchiement
Novembre, 2008
Problème quand plusieurs fluorochromes sont Problème quand plusieurs fluorochromes sont utilisés simultanémentutilisés simultanément
Le recouvrement des spectres d’émission des molécules rend la COMPENSATION nécessaire
(From Practical Flow Cytometry, Third Edition, Howard M. Shapiro)
Novembre, 2008
Que signifie « compensation »?Que signifie « compensation »?
La compensation est le processus par lequel le débordement La compensation est le processus par lequel le débordement spectral de fluorescence provenant d’un fluorochrome autre spectral de fluorescence provenant d’un fluorochrome autre que celui spécifié pour un détecteur donné est soustraite des que celui spécifié pour un détecteur donné est soustraite des signaux des autres détecteurs.signaux des autres détecteurs.
• Exemple : Le recouvrement entre les spectres de fluorescence Exemple : Le recouvrement entre les spectres de fluorescence du FITC et du PE signifie que des photons émis par le FITC (FL1) du FITC et du PE signifie que des photons émis par le FITC (FL1) sont collectés par le détecteur du PE (FL2), et inversement. sont collectés par le détecteur du PE (FL2), et inversement.
La quantité de photons émis par le FITC La quantité de photons émis par le FITC qui qui «bave» dans le détecteur de PE doit être «bave» dans le détecteur de PE doit être
prise en considération c’est-à-dire prise en considération c’est-à-dire compensée. compensée.
Novembre, 2008
Avez-vous besoin de compensation?Avez-vous besoin de compensation?
Pas nécessairement :
- Pour discriminer des groupes La compensation n’est pas obligatoire
- Pour distinguer entre cellule positive et négative Besoin de compensation
Novembre, 2008
Est-ce que la compensation est correcte?Est-ce que la compensation est correcte?
Novembre, 2008
Comment la compensation est-elle calculée?Comment la compensation est-elle calculée?
(adapté du site internet de Mario Roderer)
Novembre, 2008
Contrôle (cellule non fluorescente)Contrôle (cellule non fluorescente)
Paramètre 1 – FL1 (ua)
Par
amèt
re 2
– F
L2
(ua)
Cellule contrôle
Xu
Yu
Cytogramme théorique d’une cellule non marquée analysée par cytométrie en flux.
Dans le repère défini par les 2 fluorescences mesurées, la cellule est positionnée selon ses coordonnées x et y.
Novembre, 2008
Débordement du signal (cross-over)Débordement du signal (cross-over)
Paramètre 1 – FL1 (ua)
Par
amèt
re 2
– F
L2
(ua)
Cellule contrôle
Xu
Yu
Cellule avec un certain nombre de molécules fluorescentes
(anticorps fluorescents ou colorant)
Xu+dx
Yu+dy
+ dx + dy
Exemple d’une cellule marquée par un colorant fluorescent qui émet principalement dans
le Paramètre 1 (fluorescence verte) mais aussi dans le Paramètre 2 (fluorescence orange)
Nous assumons que les Paramètres 1 & 2 sont linéaires sur la gamme dynamique de fluorescence du colorant
et qu’il n’y a pas de masquage de fluorescence (transfert d’énergie de fluorescence par résonance FRET).
Novembre, 2008
Notion de recouvrement linéaire de Notion de recouvrement linéaire de fluorescence (cross-over trace line)fluorescence (cross-over trace line)
Xu
Yu
Xu+dx
Yu+dy
+ 2dx
+ 2dy
Exemple de cellules marquées par différentes quantités d’une molécule fluorescente
qui émet principalement dans le vert (paramètre 1)
Xu+2dx
Yu+2dyDroite de recouvrement
La droite de recouvrement
débute à XuYu
et sa pente est K12
Paramètre 1 – FL1 (ua)
Par
amèt
re 2
– F
L2
(ua)
Cellule contrôle
Cellule avec n molécules
fluorescentes
Cellule avec 2n molécules fluorescentes
) K12
Novembre, 2008
Généralisation à plusieurs cellulesGénéralisation à plusieurs cellules
Xu
Yu
Xu+dx
Yu+dy
Exemple de cellules marquées par des quantités variables d’une même molécule
qui émet principalement dans le vert (paramètre 1)
Toutes les droites de recouvrement présentent la
même pente mais ont des origines différentes
Cellules contrôles présentant différentes intensités d’autofluorescence
Paramètre 1 – FL1 (ua)
Par
amèt
re 2
– F
L2
(ua)
Novembre, 2008
Généralisation à une population de cellulesGénéralisation à une population de cellules
Xu
Yu
Cellules marquées avec des quantités variables
d’1 molécule fluorescente Groupe de
Cellules contrôle
Droite de recouvrement moyenne
Groupe de cellules non marquées mais incubées avec la molécule fluorescente
Paramètre 1 – FL1 (ua)
Par
amèt
re 2
– F
L2
(ua)
Novembre, 2008
Incubation de 2 populations avec 2 Incubation de 2 populations avec 2 molécules fluorescentesmolécules fluorescentes
Xu
Yu
Droite de recouvrement
Cellules marquées par un colorant orange.
Le signal bave dans le détecteur 1.
Xu’
Yu’
Cellules non marquées
Cellules marquées par un colorant vert.
Le signal bave dans le détecteur 2.
Paramètre 1 – FL1 (ua)
Par
amèt
re 2
– F
L2
(ua)
Novembre, 2008
CompensationCompensation
Xu
Yu
Cross_over trace line
Xu’
Yu’
La compensation est le processus par La compensation est le processus par lequel le débordement spectral de lequel le débordement spectral de
fluorescence provenant d’un fluorescence provenant d’un fluorochrome autre que celui spécifié fluorochrome autre que celui spécifié
pour un détecteur donné est soustraite pour un détecteur donné est soustraite des signaux des autres détecteurs.des signaux des autres détecteurs.
Il semble que chaque population subit une rotation autour d’un pivot défini par les
cellules non marquées Problème : ce point pivot n’est pas clairement défini.
Paramètre 1 – FL1 (ua)
Par
amèt
re 2
– F
L2
(ua)
Novembre, 2008
Deux types de compensationDeux types de compensation
Compensation matérielle (Hardware) Compensation matérielle (Hardware) • Pendant l’acquisition Pendant l’acquisition Les données brutes sont Les données brutes sont
modifiées (« anciens » cytomètres en flux).modifiées (« anciens » cytomètres en flux).
Compensation par le logiciel (Software)Compensation par le logiciel (Software)• La compensation est faite La compensation est faite a posteriori, a posteriori, après l’acquisitionaprès l’acquisition
Les données brutes ne sont pas modifiées Les données brutes ne sont pas modifiées (nouvelles générations de cytomètres en flux)(nouvelles générations de cytomètres en flux)
Novembre, 2008
Compensation matérielle (Hardware )Compensation matérielle (Hardware )
Xu
Yu
Xu’
Yu’
La compensation consiste à soustraire un certain % de signal à un autre signal:
Icomp paramètre 1 = Iparamètre 1 – 0.2*Iparamètre 2
Icomp paramètre 2 = Iparamètre 2 – 0.3*Iparamètre 1 !
Droite de recouvrement
Cellules marquées par un colorant orange.
Le signal bave dans le détecteur 1 (i.e., 20%).
Cellules non marquées
Cellules marquées par un colorant vert.
Le signal bave dans le détecteur 2 (i.e. 30%).
Paramètre 1 – FL1 (ua)
Par
amèt
re 2
– F
L2
(ua)
Novembre, 2008
Géométrie de la compensationGéométrie de la compensation
Données non compensé
Données compensé (hardware)
- La compensation aboutit à 2 droites orthogonales
- Les intensités sont décalées ver l’origine
- L’origine des lignes avant et après compensation n’est pas la même
Il n’y a plus de pivot! La compensation n’est donc pas qu’une simple rotation.
Paramètre 1 – FL1 (ua)
Par
amèt
re 2
– F
L2
(ua)
Novembre, 2008
Avec une échelle logarithmiqueAvec une échelle logarithmique
I I0 I00 I000 I0000I
I0
I00
I000
I0000
- En échelle logarithmique les droites de recouvrement deviennent des courbes,
- Elles redeviennent des droites après compensation (droites orthogonales)
K21
K12
Paramètre 1 – FL1 (ua)
Par
amèt
re 2
– F
L2
(ua)
Données non compensé
Données compensé (hardware)
Novembre, 2008
Compensation matérielle: Compensation matérielle: une approche « incorrecte » une approche « incorrecte »
Xu
Yu
Xu’
Yu’
- Définir les intensités de fluorescence médiane Xmed et Y med
de la population non marquée ( )
- Ajuster la compensation (soustraction de signal) jusqu’à ce que les
intensités médianes de chaque population ( ), marquée par un seul
fluorochrome, soient égales à X med ou Y med.
Droite de recouvrement
Cellules non marquées
Paramètre 1 – FL1 (ua)
Par
amèt
re 2
– F
L2
(ua)
Novembre, 2008
Principales sources d’erreurPrincipales sources d’erreur
Le centre du groupe de cellules autofluorescentes Le centre du groupe de cellules autofluorescentes n’est pas le point de pivot des droites de n’est pas le point de pivot des droites de recouvrement (recouvrement ( aboutit à une sous- ou sur- aboutit à une sous- ou sur-compensation)compensation)
Le groupe de cellules autofluorescentes est le Le groupe de cellules autofluorescentes est le plus souvent localisé près de l’origine (première plus souvent localisé près de l’origine (première décade) là ou le bruit électronique (pré-amp; décade) là ou le bruit électronique (pré-amp; ampli-log) est le plus important.ampli-log) est le plus important.
Novembre, 2008
Une alternative : La technique « High-Low »Une alternative : La technique « High-Low »
Xu
Yu
Xu’
Yu’
-Diviser chaque groupe en 2 sous-groupes (high et low)
- Déterminer les intensités médianes de fluorescence
pour chaque sous-groupe ( )
- Ajuster la compensation jusqu’à ce que ces médianes
soient égales.
Cette méthode ne prend plus en compte
la population autofluorescente
High
High
Low
Low
Cellules non marquées
Paramètre 1 – FL1 (ua)
Par
amèt
re 2
– F
L2
(ua)
Novembre, 2008
Compensation par logicielCompensation par logiciel
Xu
Yu
Xu’
Yu’
1- Estimation des pentes des droites de
recouvrement :
. Technique High-Low (FloJo)
. Algorithme d’ajustement (WinList)
2- Création d’une matrice
1 kP1P2
K = kP2P1 1
3- Inversion de la matrice K K-1
K-1 est la matrice de compensation
4- Multiplication par la matrice de compensation
Paramètre compensé = Paramètre * K-1
kP1P2= 0.3
kP2P1 = 0.2
Cellules non marquées
Paramètre 1 – FL1 (ua)
Par
amèt
re 2
– F
L2
(ua)
Novembre, 2008
Avantage de la compensation Avantage de la compensation par le logicielpar le logiciel
Applicable à n’importe quel nombre de paramètresApplicable à n’importe quel nombre de paramètres
Peut être automatiséePeut être automatisée
Novembre, 2008
Sources d’erreur qui affectent la Sources d’erreur qui affectent la compensationcompensation
Erreur de comptage des photons collectésErreur de comptage des photons collectés
cellule
Source lumineuse d’excitation
Direction de la détection
Le nombre « N » de photons collectés est un nombre fini.
Le signal est stochastique et sa variance est soumise à la distribution de POISSON
Photodétecteur (PMT)
L’erreur commise sur N est +/- = √N
Novembre, 2008
Erreur de comptage (suite)Erreur de comptage (suite)
Si l’efficacité d’ un cytomètre (Q) est définie par Si l’efficacité d’ un cytomètre (Q) est définie par le nombre de photons collectés par unité de le nombre de photons collectés par unité de fluorescence (e.g. MESF)fluorescence (e.g. MESF)
• Alors plus Q est faible, plus grande est l’erreur de Alors plus Q est faible, plus grande est l’erreur de comptagecomptage
Paramètre 1 (linéaire)
Pa
ram
ètr
e 2
(li
né
air
e)
Forte Q
Faible Q
Novembre, 2008
Conversion du signal Analogique-DigitalConversion du signal Analogique-Digital
Erreurs induite par le convertisseur Erreurs induite par le convertisseur analogique-digitalanalogique-digital
Troncature du signal provenant l’amplificateur logarithmique analogique
en une valeur entière.
100 101 102Canal
Paramètre 1 (linéaire)
Pa
ram
ètr
e 2
(li
né
air
e)
Forte résolution de l’ADC
Faible résolution de l’ADC
Cette erreur est amplifiée par la transformation Log.
Novembre, 2008
Influence de ces erreurs Influence de ces erreurs sur la compensationsur la compensation
Données non compensées
Données compenseés
Values négatives
• La combinaison des erreurs (de comptage et de conversion) crée une distribution
symétrique de part et d’autre des droites de recouvrement.
• Quand la compensation est correcte la distribution devient symétrique par rapport aux axes.
• Ceci est un problème quand les données sont en échelle Log car il n’y pas de valeur
négative ou nulle.
Combinaison des erreurs de comptage
et de conversion
Paramètre 1 (linéaire)
Pa
ram
ètr
e 2
(li
né
air
e)
Novembre, 2008
Conséquences avec l’échelle LogConséquences avec l’échelle Log
Paramètre 1 (linéaire)
Pa
ram
ètr
e 2
(li
né
air
e)
Les valeurs négatives sont ramenées à 0 Les évènements sont empilés sur l’axe
Les évènements s’accumulent sur l’axe (plus de discrimination possible)
Les données semblent sous-compensées sur-compensation.
Paramètre 1 (linéaire)
Pa
ram
ètr
e 2
(li
né
air
e)
Novembre, 2008
Une solution à ce problèmeUne solution à ce problèmede représentation graphiquede représentation graphique
Transformations Biexponentielle et HyperLogTransformations Biexponentielle et HyperLog• Fonction sin hyperbolique connue sous le nom de bi-exponentielle (Moore and Fonction sin hyperbolique connue sous le nom de bi-exponentielle (Moore and
Parks , 2002).Parks , 2002).• Plus récemment, la transformation HyperLog (Bagwell, Verity Software Plus récemment, la transformation HyperLog (Bagwell, Verity Software
House). House). Les 2 transformations ont des caractéristiques similairesLes 2 transformations ont des caractéristiques similaires(échelle log pour les fortes intensités, échelle linéaire au voisinage de l’origine, des (échelle log pour les fortes intensités, échelle linéaire au voisinage de l’origine, des
données symétriques par rapport à 0.données symétriques par rapport à 0.
Novembre, 2008
Transformation biexponentielleTransformation biexponentielle
Fonction sinus hyperbolique:Fonction sinus hyperbolique:sinh(x) = (esinh(x) = (exx - e - e-x-x)/2)/2
Généralisée en une fonction biexponentielle : Généralisée en une fonction biexponentielle :
f(x) = a ef(x) = a ebxbx - c e - c e-dx -dx
Novembre, 2008
Affichage biexponentielAffichage biexponentiel
0 103 104 105
0
103
104
105
101 102 103 104 105
101
102
103
104
105
101 102 103 104 105
101
102
103
104
105
Uncompensated Compensated
Log
Biexp
0 103 104 105
0
103
104
105
A B
C D
APC (ua)
AP
C-C
y7 (
ua)
Billes contenant 3 niveauxde fluorescence (APC)
Après transformation,les trois populations sont parfaitement alignées. Les évènements ne sont plus empilés sur l’axe.
Novembre, 2008
RésultatsRésultats
Echelle Log dans sa partie supérieure, Echelle Log dans sa partie supérieure, linéaire dans sa partie inférieure, et linéaire dans sa partie inférieure, et symétrique par rapport à 0.symétrique par rapport à 0.
Avec cette transformation l’ensemble du Avec cette transformation l’ensemble du domaine linéaire des données peut être domaine linéaire des données peut être transformé, préservant la symétrie de la transformé, préservant la symétrie de la distribution des erreurs (valeurs négatives distribution des erreurs (valeurs négatives après compensation)après compensation)
Les évènements ne sont plus empilés sur Les évènements ne sont plus empilés sur les axesles axes
Après compensation, chaque groupe Après compensation, chaque groupe apparaît homogène et continu (il n’y a plus apparaît homogène et continu (il n’y a plus de hiatus induit par l’empilement sur l’axe)de hiatus induit par l’empilement sur l’axe)
0 100 1000 10000 1x105
<FITC-A>
0
100
1000
10000
1x105
<PE
-A>
Novembre, 2008
ConclusionConclusion
La compensation est juste une façon visuelle de représenter les données afin de rendre leur analyse plus facile (cellule positive pour un fluorochrome, ou négative pour un autre)
La compensation par le logiciel permet de ne pas modifier les données brutes, de réaliser la compensation après l’acquisition, voire de la réaliser plusieurs fois.
La compensation ne permet pas de rattraper une mauvaise acquisition par le cytomètre car là les données brutes sont affectées
Tranformations HYPERLOG ou BIEXPONENTILLE …à vous de choisir.