nta: anlama Ölçüm yapılır - atomikateknik.com · videolar proses edilir 5. sonuçlar ve...
TRANSCRIPT
NTA:
Tekniği Anlama
Nasıl Ölçüm Yapılır?
NTA Eğitimi
2015
Genel Bakış• Part 1
• NTA Teknolojisi
• Görüntüleme
• Boyut Ölçümü
• Konsantrasyon
• Işık Yoğunluğu
• Eklenen Özellikler
• Floresan
• Zeta potansiyel
• Part 2
• Numune hazırlama
• Video çekimi
• Analiz
• Sonuşlar ve Raporlar
• Part 3
• Data analizi
NanoSight Teknolojisi
Lazer numune haznesinin şeması
NanoSight:
• Lazer diyot
• Metalize yüzeyli Cam
prizma (açılı) ve Üst
tabaka
• Likid (numune) tabakası
• Mikroskop objektifi
› Ekstrasellüler
vesiküller (Exosomes
ve microvesicles)
› İlaç taşınımı
› Protein Agregatları
› Virüs ve VLP
numuneleri
› Nanopartikül
Toksikolojisi
› Polimerler ve koloidler
› Ink jet mürekkepleri ve pigmentler
› Manyetik nanopartiküller
› Quantum dots (Qdots)
› Nanobubbles
› Seramik
› Yakıt katkı maddeleri
› Çok duvarlı karbon nanotüpler
› Kozmetik
› Gida maddesi
NTA geniş bir nanopartikül aralığı için uygulanabilir
Biy
oaplik
asyonla
r
Non
-biy
oaplik
asyonla
r
NanoSight Sistemi Çalışırken…
Thumbprint (parmak izi) –
Işının numuneye giriş noktası
Optimum gözlem bölgesi
(LM10)
Not: Şekil numunedeki
partikülleri göstermemektedir
Lazer ışınının numuneden geçişi; istenilen görüntüleme alanınayakınlaştırılması
NTA Görüntüleme ve Ölçüm Limitleri
Minimum Boyut limiti:• Materyal tipine (RI oranı)
• Lazer dalga boyu ve gücüne
• Kameranın hassasiyetine
10 - 40nm
Maximum Boyut limiti:• Brownian hareket
• Viskozite
1000-2000nm
Minimum konsantrasyon limiti:
• Yeterli sayıda partikül olmaması = istatistikiolarak zayıf data
yaklaşık 107/ml
Maximum konsantrasyon limiti:
• Komşu partikülleri ayırt edememe
• Partiküller çok yakın olduğundan haretmesafeleri kısalıyor
yaklaşık 109/ml
Boyut Konsantrasyon
Boyut Ölçümü: 3 Aşamalı Proses
Analizİz sürmeYakalama
1. Görüntüleme ve Yakalama: Software Brownian hareket halindeki partiküllerin bir
videosunu çeker
2. İz süreme: Çekilen videodan yararlanarak her bir partikülün izi sürülür ve hepsinin
teker teker MSD’leri (mean squared displacement) for each particle hesaplanır
3. Analiz: Stokes Einstein denkleminden yararlanarak bireysel partiküller için Rh elde
edilir
• Partiküllerin MSD’ları (mean square displacement) hesaplanır
• Ölçülen parametre partikülünhidrodinamik yarıçapıdır (sphere equivalent hydrodynamic diameter)
• Sıcaklık ölçülür ve uygun viskozitekullanılır
• Kütle, RI, material tipinden bağımsızdır
• Absolut metod – kalibrasyongerektirmez
Boyut Ölçümü: Stokes-Einstein
KB = Boltzmann ConstantT = temperature
ts = sampling time= viscosity
dh = hydrodynamic diameter
<x,y>2 = KBTts
3dh
2-D Stokes-Einstein equation
Konsantrasyon Ölçümü
• Hacim biliniyor
• Partikül sayısı biliniyor
• 106 to 109 partikül/mL aralığında ölçüm yapılabilir
80 µm~10 µm
100 µm
Numune içeriği hakkında bilgi verir!
50nm Gold + 100nm Latex 100nm + 200nm Latex
**Partikül kompozisyonunun belirlenmesini sağlar
Floresan Ölçümler
405nm 488nm 532nm 642nm
• Lazer diyotu floroforları ve quantum dot’ları uyarabilir
• Synchronization cable to pulse the laser in time with the camera
shutter and high background
• Uzun geçiren ve ya Bant geçiren filtre seçenekleriyle spesifik
nanopartiküllerin iz sürümünü gerçekleştirebilir
Zeta Potansiyel Ölçümü
• Numuneye voltaj uygulanır
• Electroforez ve electroozmoz gözlenir
• Kararlılık göstergesidir – partiküller yeterince
yüklü iseler birbirlerini itme eğilimi gösterirler
• Sadece NS500 ile ölçülebilir
Part 2
NTA Software – Ölçüm nasıl alınır?
Numune Hazırlama
• Numune likid süspansiyon içinde hazırlanmalıdır
• Sonikasyon, filtrasyon vs. gibi gereklilikler numuneye özgü ve
müşteriye bağlıdır
• Numune gözle görülür biçimde konsantire olmamalıdır
1. Numune* numune haznesine doldurulur
2. Görüntü optimize edilir
o Konsantrasyon
o Lazer ışını pozisyonu belirlenir
o Fokus ayarlanır
o Kamera ayarı yapılır
3. Ölçüm yapılır
4. Videolar proses edilir
5. Sonuçlar ve raporlar alınır
Ölçüm Alınması
* İlk yüklenen numunenin “size standart bead”leri olması tavsiye edilir
NTA software’I üzerinde
gerçekleştirilir
Görüntünün Optimize Edilmesi
Kamera seviyesi (Camera Level), Numune konsantrasyonu
(Sample Concentration), Lazer ışını pozisyonu (Beam Position),
ve Focus arasında iterative bir prosestir
Camera Level ve Focus → auto-setting opsiyonu var
Camera Control panel
Script Panel
Temperature display
Live display from camera
Status InformationAnalysis tab
Hardware tab
SOP tab
Camera Start
İlk canlı görüntünün elde edilmesi (1)
İlk canlı görüntünün elde edilmesi (2)
Başta yüksek kamera
seviyesi seçin ve bireysel
patiküller seçilebilir hale
gelene kadar seviyeyi
azaltın
Likely to be line Optimal viewing Too far
Işın Pozisyonu: LM10 - ‘Thumbprint’
Thumbprint
Işın Pozisyonu: NS300 ve NS500
SOL fare tuşunu
kullanarak ekran hereket
ettirilir
Işıma yapan partiküller
görüntüleme alanını
doldurmalıdır
Fokus
Partiküller sürekli hareket halinde
olduğundan eş dğılmış, küresel fukus
elde etmek zor olabilir
İdeal görüntü (b) deki gibi olmalıdır.
Bulanık partiküller (a) yanlış sonuçlar
verecektir
Ulaşılabilen en iyi görüntü (c) ise o da
kabul edilebilir – küçük ve geride görünen
partikülleri görünür kılmak önemlidir
a) b) c)
LM10: Manuel focus dümenini
kullanılır
NS300: Cihazın yanındaki
düğmeden başlangıç fokusu
seçilir, software üzerinden
ayarlanır
NS500: Software üzerinden
ayarlanır
Kamera Ayarı
Kamera seviyesi ayarı, partiküller açıkça
görünene kadar ayarlarlanır. (20%’den fazla
renkli pixel görmemek kaydı ile)
Good Polydisperse Sample ImagePoor Polydisperse Sample Image
Good Monodisperse Sample Image Poor Monodisperse Sample Image
En hızlı hareket eden ve en mat
(en küçük) olan partiküllerin
görünür olduğundan emin olunuz
Konsantrasyon
Çok yüksek konsantrasyonlar
doğru iz sürmeyi engeller
Düşük konsantrasyonlar daha
uzun süreli görüntü yakalama ve
analiz zamanı gerektirir
*Düşük konsantrasyonlar için
NanoSight şırınga popasını
kullanmak örneklemeyi
artırdığından daha doğru sonuç
alınmasına yardımcı olur.
NanoSight ~107-109 particles/ml* aralığında ölçüm alabilir.
Bu görüntü alanında 20-100 tane partiküle denk gelir.
Concentration too low
1 particles identifiedConcentration too high
208 particles identified
Ideal concentration
44 particles identified
Oto-ayarlar (Auto-settings)
› NTA3.1 ve üzeri
› Auto-camera seviyesi Tüm cihazlarda mevcut
› Auto-focus Sadece NS300 ve NS500’de mevcut
› Numune oto-ayara uygun değilse system
kullanıcıyı uyaracaktır
Auto-Setup NS300 ve NS500
1. Sets an initial camera level
2. Focuses image 3. Sets capturecamera level
› Polidisperse olmayan numuneler için optimize
edilmiştir
Auto-camera seviyesi (-only) opsiyonu
› Tüm cihazlarda mevcuttur
› Polidisperse olmayan numuneler için optimize
edilmiştir
› Numune ful auto-setup’a uygun olmadığında
kullanılır
Görüntüyü finalize etmek
› Bunun bir iteratif proses olduğunu hatırlayın
› Optimum görüntüyü yakalamak için birden fazla
seçilmiş ayarı değiştirmek gerekebilir
Ölçüm yapmak (1)
‘Scripts’ are sets of
instructions that control
the software for each
measurement.
Raporda görmek istiyorsanız
seyreltme faktörü girilebilir
Su kullanılmadığı zaman viskozite
girilmelidir
Okumalar arasında ısı
birikimini önlemek için bu
kutuları işaretleyin
Ölçüm yapmaya
hazırsınız
Videoların sayı ve uzunluğunu seçin
Dosya adı ve yerini seçin (default -
folder of the date/Capture)
Ölçüm yapmak (2)
Sistem kullanıcıyı uyarır:
• Image/camera level ile
ilgili son kontrol
• Numune detaylarının
video ve çıktı
dosyalarında yer
almasını sağlayabilirsiniz
Yakala ve Başla…
Videoları Proses Etmek
› Video çekimi
tamamlandığında
“Process” alanine geçilir
› Bu ekran canlı imaj
yerine çekilen videoyu
gösterir. (Bu ekran daha
parlak görünecektir)
› Prosese başlanmadan
önce “Detection
Threshold”
ayarlanmalıdır. (OK’e
sonar basınız)
Detection Threshold (1)
› Slider veya + / – düğmelerini kullanarak
ayarlanır
› Gözle görülür şekilde, her frame’de her
bir partikül merkezinde kırmızı çarpı
olacak şekilde ayarlanır
› Mavi çarpılar olası yanlış patikülleri
(Noise) ifade eder ve minimumda
tutulmalıdır
› Slider’ı kullanarak farklı frame’lerdeki
görüntülerin doğruluğundan emin olun
Düşük sayıda yanlış merkez ve küçük
detection threshold, yüksek threshold ve
kaçırılan partiküllerden daha iyidir.
Detection Threshold (2)
Yüksek Detection Threshold
Düşük Detection ThresholdAlt soldaki görüntüdeki kırmızı çarpılarınsayısının 10 ile 100 arasında olması gerekir.
Videoların Prosesi
› Doğru Detection
Threshold seçildiğinde
OK’e basarak prosesi
başlatabilirsiniz
Proses
Software videoları proses ettikçe
görüntüde, Brownian Motion’dan
kaynaklı kırmızı “track”ler oluşur
Boyut (nm) vs Konsantrasyon
(particles/ml) ölçümleri mavi grafikte
gösterilir (default),
Aynı zamanda ölçümler; scatter plot
(Size (nm) vs Intensity (a.u.)), ve 3D
plot (Size (nm) vs Concentration
(particles / ml) vs Intensity (a.u.))
şeklinde de verilir
Örnek data – n=5 ölçüm
Export – Rapor Aktarımı
Proses tamamlandığında
Export Settings
opsiyonları penceri
otomatik olarak açılır
Default’lar PDF grafikleri ve
toplu özetleridir.
CSV dosyaları, ham datayı
içerir. Ve istenildiğinde
tekrar proses edilebilir.
WMV video dosyaları da aktarılabilir
.PDF ve.CSF dosya örnekleri
The size distribution profile
data are shown over-plotted
Mean ± SEM data are shown, with
the size of the key peaks annotated.
Part 3
Datayı Anlamak
Genel
› Karşılaştırma yapılabilmesi için aynı tipteki numuneler, aynı
parametrelerle ölçülmelidir
› Polidisperse numuneler güvenilir data elde etmek için daha
uzun süre yakalanmalıdır
› Düşük partikül/ml’ye sahip olan numuneler güvenilir data elde
etmek için daha uzun süre yakalanmalıdır
› Yanlış sonuçlara karşı, kullanıcılar PDF ve CSV dosyalarındaki
uyarıları dikkate almalıdır
Tipik Numune Profilleri
Elde edilen profil ölçülen numuneye bağlıdır
Örneğin pürifiye sükroz
gradyanlı extracellular
vesiküller ölçüldüğünde
ana bir peak ve bir ya da
daha fazla küçük peak’in
olması beklenir
Boyutu kontollü bir
numune ölçüldüğünde
e.g. boyut standartları,
extruded liposomes vs.,
tek peak’li dar bir dağılım
profili elde edilmelidir, bu
mono disperse numune
anlanına gelir
Polidisperse numunelerde
(e.g. aggregated protein)
bir çok peak’den oluşan bir
boyut dağılımı beklenir.
Tipik olarak partikül boyutu
arttıkça peak’ler genişler ve
kısalır
Kabul Edilebilir Data
Aynı numunenin biden fazla ölçümü üst üste yerleştirildiğinde polidispersite profillerinin
benzerliği, numuneleme hatasının olmadığını ve ölçümün yeterince uzun yapıldığını gösterir
i.e. Datanın Kabul edilebilir olması için monodisperse nnumune profillerinin birbirine oldukça
benzemesi gerekirken polisperse numune profillerinde daha az tekrarlanabilirlik Kabul
edilebilir.
Monodisperse sample
Polydisperse sample
Dikkat (1)
Proses öncesi
<5 merkez saptaması – zayıf istatistiki data
Olası sebep:
• Orijinal numunenin konsantrasyonu düşük
• Yüksek detection threshold (yeterli partikül saptanamıyor)
• Kamera ayarları en bulanık partikülleri görmek için fazla düşük
>200 merkez saptaması – partikülleri verimli şekilde izlemek için fazla
Olası sebep:
• Orijinal numunenin konsantrasyonu yüksek
• yüksek gürültü (detection threshold çok düşük ayarlanmış olabilir)
Dikkat (2)
Proses esnasında
Yüksek gürültü uyarısı
Olası sebep:
• Düşük detection threshold – gürültü topluyor
• Yüksek konsantrasyon – partiküllerin scatter ettiği ışınlar karışıyor
Partiküllerin izi sürülmüyor
Olası sebep:
• Yüksek detection threshold
• Düşük detection threshold
• Particles flickering (Partiküller titreşiyor)
Proses sonrası
<100/<200 partikül uyarısı – analizde düşük düşük sayıda partikül
izlemesi – zayıf istatistiki data
Olası sebep:
• Düşük konsantrasyon
• Kısa video uzunluğu
• Uygun beirlenmeyen ayarlar – camera level, detection threshold
Vibrasyon uyarısı – boyutun sistematik olarak dikkate alınmaması
• Sarı üçgen <10% hata
• Kırmızı üçgen >10% hata
Dikkat (3)
Özet
• Numune likid süspansiyon içinde olmalıdır ve optimum konsantrasyona ulaşmak
için seyreltmek gerekebilir – Doğru konsantrasyon çok önemlidir
• Doğru görüntüleme pozisyonunu bulun, uygun yakalma seviyesini seçin ve
fokusu ayarlayın ki tüm partiküller gözlenebilsin
• Tüm partikülleri izleyebilmek ve hatalı merkezlerin sayısını limitlemek için uygun
detection threshold’u seçin
• .PDF ve .CSV dosyaları (tüm track’lerin ve intensity datasının özeti) analizden
sonar otomatik olarak aktarılabilir