objetivo : conocer las técnicas básicas para el análisis de fertilidad microbiana del suelo
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PRÁCTICO N° 3. Análisis de fertilidad de los suelos. Objetivo : Conocer las técnicas básicas para el análisis de fertilidad microbiana del suelo. Técnicas mas utilizadas Abundancia de microorganismos Biomasa total - PowerPoint PPT PresentationTRANSCRIPT
Objetivo: Conocer las técnicas básicas para el análisis de fertilidad microbiana del suelo
Técnicas mas utilizadas
Abundancia de microorganismos
• Biomasa total
• Determinación de grupos funcionales (fijadores de nitrógeno, celulolíticos, nitrificadores, amonificadores, etc.)
Actividad microbiana
• Heterótrofa total (producción de CO2, consumo de O2)
• Enzimas especificas( nitrogenasa, sacarosa, ureasa, amilasa)
PRÁCTICO N° 3Análisis de fertilidad de los suelos
Recuento de células totales Método directo (visualización al microscopio, "camara de recuento")
Método por turbidez (Fotómetro)
Técnicas para determinar abundancia de microorganismos
Recuento de células viables
En medios sólidos: formación de colonias en caja de Petri (UFC)
Rango entre 30 – 300 colonias
En medios líquidos: número mas probable (NMP) Detección del crecimiento por consumo de sustrato o formación de productos
Grupo funcional: microorganismos que tienen procesos metabólicos semejantes, independientemente de su taxonomía
Recuento de células viables: grupos funcionales
Procedimiento para determinar abundancia de grupos funcionales
1) Suspensión y dilución de suelo
2) Siembra en medios selectivos
3) Determinación del crecimiento (lectura)
4) Cálculo de abundancia
Análisis de grupos funcionales
X g suelo
Recuento en medio sólido (Cajas Petri)
Recuento en medio líquido (NMP)
10° Agitar 3 minutos
9 ml H2Odestiladapor tubo
1 ml1 ml 1 ml1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml
10-1 10-310-2 10-610-5 10-810-710-4
Organismos fijadores de N Nitrificadores Celulolíticos Amonificadores
X ml H2O destilada
+
1- Suspensión
2- Diluciones decimales
3- Siembra de cada grupo funcional
4- Incubación y crecimiento
5- Lectura y cálculosLECTURA
ESTUFA
Material de trabajo
Agregar 1 g de suelo en 100 ml de H2O destilada Tapar y agitar durante tres minutos
Suspensión de suelo
Suspensión de suelo
Extraer una pipeta estéril
Flamear un porta-pipeta
Preparación de las diluciones
Extraer 1ml de la suspensión de suelo
Poner el ml en el tubo 10-1
Mezclar y extraer 1 ml
Poner el ml en el tubo 10-2 Continuar igual con todos los tubos
Preparación de las diluciones
1 2 3 4 5 6 7 8
0
Siembra en medios específicos: Amonificadores
Diluciones: -8, -7, -6
Siembrar en medio con asparagina
Incubación 28-30°C, 7días
Siembra en medios selectivos: Celulolíticos
1 2 3 4 5 6 7 8
0
Sembrar en medio líquido con papel de filtro
Incubación 28-30°C, 15 días
Diluciones: -5,-4,-3
Dilución: -3
Siembra en medios selectivos: Fijadores
1 2 3 4 5 6 7 8
0
Sembrar en medio sólido sin N
Incubación 28-30°C, 5 días
Siembra en medios selectivos: Nitrificadores
1 2 3 4 5 6 7 8
0
Dilución: -3,-2,-1
Sembrar en medio líquido con sulfato de amonio
Incubación 28-30°C, 21 días
Siembra de grupos funcionales
Batería de grupos funcionales
•suspensión de suelo
•gradilla de diluciones
•gradilla de nitrificadores
•gradilla de celulolíticos
•gradilla de amonificadores
•caja de fijadores de N
Estufa de incubación
Síntesis del análisis de grupos funcionales
Recuento en medio sólido (Cajas Petri)
Recuento en medio líquido (NMP)
10° Agitar 3 minutos
9 ml H2Odestiladapor tubo
1 ml 1 ml 1 ml1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml
10-1 10-310-2 10-610-5 10-810-710-4
Organismos fijadores de N Nitrificadores Celulolíticos Amonificadores
X g suelo
X ml H2O destilada
+
LECTURA
ESTUFA
Agregar reactivo NesslerEl color ocre detecta presencia de amonio
Lectura: Amonificadores (ejemplo)
+ + + + + - - - +
Número característico 3 2 1
Contar los tubos positivos Buscar el número en la tabla de Mc. Grady
Número Mas Probable (NMP) = 15
6 6 6 7 7 7 8 8 8
Lectura: Celulolíticos (ejemplo)
Observar alteración del papel
Número característico 3 2 1
+ + + + + - - + -
Número Mas Probable (NMP) = 15
Tipos de alteración del papel
3 3 3 4 4 4 5 5 5
Lectura: Fijadores (ejemplo)
Contar colonias (entre 30-300)
Número de colonias (UFC) = 120
(-3)
Lectura: Nitrificadores (ejemplo)
Agregar SO4H2 más difenilanidaEl color azul detecta presencia de nitrato
Contar los tubos positivos Buscar el número en la tabla de Mc. Grady
Número característico 3 2 1
Número Mas Probable (NMP) = 15
+ + + + - + - - + 1 1 1 2 2 2 3 3 3
Tabla de Mc. Grady
Nº Característico NMP Nº Característico NMP Nº Característico NMP
000 ‹0.3 111 1.1 222 3.5
001 0.3 112 1.5 223 4.2
002 0.6 113 1.9 230 2.9
003 0.9 120 1.1 231 3.6
010 0.3 121 1.5 232 4.4
011 0.61 122 2.0 233 5.3
012 0.92 123 2.4 300 2.3
013 1.2 130 1.6 301 3.9
020 0.62 131 2.0 302 6.4
021 0.93 132 2.4 303 9.5
022 1.2 133 2.9 310 4.3
023 1.6 200 0.91 311 7.5
030 0.94 201 1.4 312 12
031 1.3 202 2.0 313 16
032 1.6 203 2.6 320 9.3
033 1.9 210 1.5 321 15
100 0.36 211 2.0 322 21
101 0.72 212 2.7 323 29
102 1.1 213 3.4 330 24
103 1.5 220 2.1 331 46
110 0.73 221 2.8 332 110
Cálculos
Tubos (NMP)
Nº de microorganismos por g de suelo
Nº de colonias (caja de Petri)
X1 en 10 ml de la dilución 10°
X2 en X ml de la solución 10° (volumen de la suspensión)
X2 en X g de suelo de la suspensión
N en 1 ml sembrado en la caja o tubo
X en 10 ml del tubo de la dilución usada (la más concentrada en el NMP)
X en 1 g de suelo
Objetivo: llevar la lectura a expresarla en g de nuestra muestra
Actividades
1. Lectura de amonificadores: reacción de nessler y
manejo de la tabla de Mc.Grady
2. Lectura de fijadores de N: crecimiento de colonias en
caja de Petri
3. Calculo: resolver problemas de abundancia de
microorganismos
Crecimiento bacteriano
N = N0 2n
Log N = log N0 + n log 2
n = log N – log N0
log 2
g = t / n
Cálculos de tiempos de generaciónCrecimiento exponencial
Nt = N0 2n
Representación semilogaritmica
Representación aritmética
N = número final de células
N0 =número inicial de células
n = número de generaciones
g = tiempo de generación
t = horas o minutos de crecimiento exponencial
Curva de crecimiento
Fase
de
latencia
Fase exponencial (logarítmica)
Fase estacionaria
Fase de muerte
Tiempo
Loga
ritm
o de
l núm
ero
de c
élul
as
Productos microbiológicos de carácter industrial
Producto Microorganismo productor
Antibióticos
Penicilina
Tetraciclina
Penicillium chrysogenum
Streptomyces griseus
Bebidas alcohólicas
Vinos
Cervezas
Saccharomyces ellipsoideus
S. cerevisiae y S. caribergensis
Enzimas
Amilasa bacteriana
Pectinasas
Bacillus subtilis
Aspergillus wentii, A aureus
Ácidos orgánicos
Ácido láctico
Ácido acético (vinagre)
Lactobacillus delbruckii
Gluconobacter suboxidans
Bioinsecticida
Proteína paraesporal Bacillus thuriginensis
Fertilizantes biológicos Bradyrhizobium japonicum
Azospirillum spp
Cultivo continuo