Observación microscópica

Examen Directo:

• Es la base del diagnóstico microbiológico

• Pone en evidencia la presencia de gérmenes, permite evaluar sus características morfológicas y su reacción a las diferentes coloraciones.

1. En fresco

2. Coloraciones

Examen Directo en fresco

• Permite ver las estructuras microscópicas sin alteraciones producto de los colorantes,

• Observar la movilidad de los gérmenes y estudiar la presencia de organismos viables que suelen destruirse con las coloraciones (Ej: trofozoitos).

– Montaje en solución salina

– Montaje en iodo

– Montaje en KOH

– Técnica de la tinta china

– Examen en campo oscuro

Coloraciones

• Distinguen los diferentes tipos de gérmenes gracias a la composición de su pared celular, sirviendo de orientación para el diagnóstico y tratamiento.

Morfología bacteriana

• La forma más sencilla de iniciar una identificación del microorganismo que se desea estudiar es realizar una coloración o tinción de Gram.

• La tinción de Gram es una tinción diferencial porque no todas las células se tiñen de la misma manera y permite discriminar entre dos grandes grupos de eubacterias, las eubacterias Gram (+) y Gram (-).

• El tercer grupo de eubacterias es el de los Bacilos Acido-Alcohol Resistentes (BAAR) que pueden ser diferenciados utilizando la coloración de Ziehl-Neelsen

Estructura de los Gram (+)

El

peptidoglicano

• Este peptidoglicano es una macromolécula gigante formada por cadenas de un dímero compuesto por N-acetilglucosamina y N-acetilmurámico

• Estas cadenas se encuentran unidas entre sí mediante péptidos, que son pequeñas cadenas de aminoácidos que se entrecruzan

• Rigidez: evita que la célula estalle en medios hipotónicos

• Porosidad: permite el paso de nutrientes desde el exterior y el movimiento de enzimas catalíticas y productos de secreción hacia el exterior de la célula

Estructura de los Gram (-)

Las bacterias Gram (+) son células con una gruesa pared celular de peptidoglicano.

Las bacterias Gram (-) son células con una delgada capa de peptidoglicano y una segunda envoltura denominada membrana externa

Preparación de los portaobjetos

• Hervir en detergente 10 minutos

• Enjuagar con agua destilada

• Enjuagar con alcohol

• Secar con un paño limpio que no deje pelusa.

• Almacenar en cajas cerradas

• Para reciclar los portaobjetos se los debe hervir en detergente 20 minutos y continuar con el proceso similar al de los portaobjetos nuevos.

COLORACIÓN DE GRAM

• Fijar la muestra

• Cubrir con cristal violeta durante 3 minutos

• Enjuagar con agua

• Cubrir con lugol durante 2 minutos

• Enjuagar con agua

• Decolorar con alcohol acetona

• Enjuagar con agua

• Cubrir con fucsina diluida 1 minuto

• Enjuagar con agua

Para tener en cuenta:

• Los extendidos de materiales compactos deben ser delgados

• Se debe distribuir el material de manera uniforme por toda la superficie del vidrio.

• No poner dos muestras en un mismo preparado.

• En materiales líquidos dejar secar al aire antes de fijar, no acelerar el proceso de secado.

• Identificar los vidrios del lado opuesto al de la coloración.

• Todas las bacterias, luego de la aplicación del colorante primario cristal de violeta aparecen violetas.

• Todas las células se tiñen con el colorante básico debido a que este interacciona con las cargas negativas del ADN.

• El mordiente lugol prepara a la célula para una coloración diferencial.

• El yodo entra por los poros de la pared celular y forma un complejo con el cristal de violeta.

• Este complejo es muy grande para atravesar los poros de la pared celular luego del lavado.

• El decolorante alcohol acetona, disuelve los lípidos de la pared celular

• La gran cantidad de lípidos que contiene la pared celular conforma grandes poros luego de la aplicación del colorante, por lo que el complejo cristal violeta-yodo es lavado.

• Hasta este punto las células pueden aparecer sin color Gram negativas o violetas Gram positivas.

• El colorante de contraste fucsina es usado para colorear células Gram negativas

Precauciones en Coloración de Gram

• Al fijar los extendidos a la llama se los debe flamear suavemente

• Antes de colorear con cristal violeta el preparado debe de estar frío.

• El cristal violeta y la fucsina deben de ser filtrados antes de usar.

• Respetar los tiempos de coloración en cada una de las etapas.

• Dejar secar los preparados al aire

¿Como mirar una coloración de Gram?

• Se debe realizar una observación macroscópica para determinar el lugar preciso del portaobjetos en el que se encuentra la muestras

• Se debe establecer si se ha decolorado excesivamente o si el extendido es demasiado grueso o delgado.

• Observar a menor aumento

• Un extendido excesivamente grueso es fácilmente reconocido porque resiste la decoloración, mostrando masas oscuras en las que no se pueden reconocer estructuras celulares.

• Ante la presencia de un problema, una forma de controlar la técnica de coloración y la efectividad de los reactivos usados, es hacer coloraciones de la flora bucal (saliva) en donde se encuentra habitualmente gran cantidad de gérmenes Gram (+) y Gram (-) así como también células epiteliales

¡Cuidado con los artefactos!

• Formas cocoides o bacilares de estructuras Gram (+) pueden confundir con gérmenes.

• Los gérmenes pueden tener sus características alteradas.

• Los gérmenes Gram (+) suelen aparecer como Gram variable o Gram (-) si sus paredes están alteradas.

• Examine la matriz de fondo.

• Cuando la muestra tiene muchos restos celulares, no se suelen ver bacilos gram (-) delgados.

• Sucede lo mismo, cuando hay predominancia de gérmenes Gram (+)