obtención de los gametos

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Unidad Temática Nº 9

Obtención de los Gametos

13 Abril 2010

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TABLA DE CONTENIDOS

• Metodología y Frecuencia de Palpaje

• Selección del Macho y Hembra madura

• Técnicas de desove, extracción de ovas

• Técnicas de frezado, extracción de semen

• Criterio de calidad de los gametos

• Evaluación del semen (calidad y cantidad)

• Bioseguridad asociada a la extracción de gametos

• Medición de la Fertilidad ( microscopía) , patologías de las gónadas.

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Selección• Personal especializado• Separar maduros de inmaduros (macho y hembras)• Buenas condiciones sanitarias

Palpaje• Definir grupos de avance• Peces sedados y con oxígeno• Separar maduros y desovar en lapso de tiempo de 4 días• Hembras

– Dilatación poro genital– Liberación ovas– Vientre blando

• Machos– Coloración– Liberación semen

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Cultivo Reproductores• Dieta para reproductores 6-8 meses pre desove• Densidad de cultivo 10 kg/m3• Retiro mortalidad diaria• Cámaras (comportamiento y alimentación)• Alimentación manual• Evitar manejos• IGS

Control sanitario• Visita Veterinario • Evitar caligus• Tratamientos profilácticos

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Desove

PROCESO Descripción Materiales Necesarios

Objetivo Riesgo Asociado Duración

RIESGO ALTOANESTESIADO Se traslada un máximo de 30 hembras

desde los estanques de mantención a la tina que contiene agua con anestésico, con la

cola hacia arriba, en mangas de cámara de neumático.

Anestésico BZ 20 a una concentración de

40 ml/Litro.

Facilitar la matanza de la hembra.

Si se sobrepasa la concentración de anestésico o el tiempo de

anestesiado, la hembra muere por el efecto del anestécico; lo cual no

es conveniente.

No más de 5 min por batch

RIESGO MEDIOTRASLADO Consiste en trasladar la hembra desde el

lugar de anestesiado, al de desangre, cerrando el poro genital con una pinza.

Pinza. Medio de transporte, carro de traslado o colgador

manual.

Llevar la hembra al lugar de desangre

EL traslado debe realizarse lo más suave posible de modo de evitar la

salida natural de ovas.


RIESGO MEDIODESANGRE Consiste en un corte a nivel del pedúnculo

caudal, para permitir la máxima evacuación de sangre posible, la que causará la muerte

de la hembra.

Cuchillos de desangre, tina de

desangre. Se requiere un area sucia,

separada completamente de la

zona de desove.

Dar muerte al pez con el fin de ser desovado y evitar la contaminación

de ovas con sangre.

Si no se usa una pinza, se corre el riesgo de que ovas caigan en forma natural con la consiguiente pérdida

de ovas. Si el desangre es incompleto, puede contaminarse las ovas con sangre, disminuyendo la

calidad de la fecundación.


RIESGO BAJOLAVADO Y SECADO Antes de ingresar a la zona de desove, la

hembra debe ser lavada y secada.Manguera con

regador. Toalla nova o pañales.

Eliminar exceso de sangre y agua.

Si restos de sangre y agua caen en balde de recepción de ovas, baja la

calidad de fertilización


RIESGO ALTOIDENTIFICACIÓN Consite en poner una marca en la aleta de la

hembra con la identificación de la hembra.Marca, corchetera Identificar la hembra

con el fin de poder hacer su seguimiento

futuro.

Si se comete un error en el marcaje, se pueden generar

problemas de identificación futura de reproductores.


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Obtención de los GametosPROCESO Descripción Materiales

NecesariosObjetivo Riesgo Asociado Duración

RIESGO BAJOMEDICIÓN DE PARÁMETROS

Consiste en pesar y medir el largo de la hembra.

Balanza, Ictiómetro Registrar los principales parámetros

del reproductor.

Con el fin de registrar bien la información es necesario calibrar la

balanza a lo menos 1 vez al día.


RIESGO ALTODESOVE Se realiza un corte ventral, desde el poro

genital hacia la cabeza, recibiendo las ovas en el balde con la bolsa de recepción de

ovas.

Cuchillo curvo de desove. Balde limpio y

seco. Bolse de recepción de ovas.

Extraer las ovas Un balde contaminado o con agua puede producir la pérdida de la

totalidad de las ovas o la transmisión de enfermedades.


Este manejo debe ser realizado por dos operadores, obteniendo solo las ovas que se

encuentren liberadas en la cavidad abdominal, sin forzar la salida de ovas

retenidas en los ovarios.

Facilitar la manipulación de los peces. No incorporar ovas inmaduras o de

mala calidad.

Ovas retenidas en los ovarios no se encuentran en estado óptimo de

madurez.

RIESGO ALTOSCREENING Consiste en extraer una muestra del

reproductor con el fin de hacer el análisis de laboratorio par determinar la existencia o no

de patologías.

Material de Laboratorio Externo

Chequear condición sanitaria de los peces.

Debe registrarse adecuadamente la correlación entre el N° de

reproductos y el N° de la muestra.

Igual Timming que el desove.

El tipo de muestra y análisis dependerá de la unidad de incubación. Incubación individual:

muestra de riñón y bazo en el desove. Incubación en bateas y zoug-jar: muestra de sangre después del traslado a agua dulce.

RIESGO MEDIOMARCAJE DE

BALDES

Consiste en marcar en el balde la identificación de la hembra.

Marcadores, Scotch o Etiquetas

Permitir continuar el proceso de

seguimiento del reproductor.

Si se comete un error en el marcaje, se pueden generar errores

de identificación futura de reproductores.


RIESGO ALTOREPOSO Una vez que las ovas están el el balde, son

almacenadas en la sala de fertilización.Dar el tiempo necesario para fertilizar las ovas.

Si no se respetan los límites de tiempo puede producirse pérdida de

calidad.


Una vez extraidas las ovas se da inicio al proceso de fertilización que consiste en producir la mezcla de semen con ova.

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Extracción de semenPROCESO Descripción Materiales

NecesariosObjetivo Riesgo Asociado Duración

ANESTESIADOSe traslada un máximo de 20 machos desde

los estanques de manteción a la tina que contiene agua con anestésico.

Anestésico BZ 20 a una concentración de

40 ml/Litro.

Facilitar la matanza del macho.

Si se sobrepasa la concentración de anestésico o el tiempo de

anestesiado, se puede matar tempranamente el macho causando

deterioro a su semen.

Máximo 5 min por batch

RIESGO MEDIO

MATANZAConsiste en dar un golpe seco en la cabeza

del pez.Palo tipo luma.

Dar muerte al pez con el fin de poder extrae el

semen.


RIESGO MEDIO

TRASLADO

Consiste en trasladar el macho desde el lugar de matanza al lugar de extracción del

semen. El traslado debe realizarse en posición horizontal y nunca con la cabeza

hacia abajo.

Medio de transporte, normalmente

carretilla.

Llevar el macho al lugar de extracción del

semen.

EL traslado debe realizarse con el abdomen hacia arribade modo de evitar la salida natural de semen.


RIESGO MEDIO

IDENTIFICACIÓN Consite en poner una marca en la aleta del macho con su identificación.

Marca

Identificar el macho con el fin de poder

hacer su seguimiento futuro.

Si se comete un error en el marcaje, se pueden generar errores

de identificación futura de reproductores.


RIESGO BAJO

MEDICIÓN DE PARÁMETROS

Consiste en pesar y medir el largo del macho.

Balanza - HuinchaRegistrar los

principales parámetros del reproductor.

Con el fin de registrar bien la información es necesario calibrar la balanza a lo menos antes de cada

batch.


RIESGO BAJO

COLGADOUna vez en el lugar de extracción de semen

el macho es colgado con la cabeza hacia arriba.

Atril con ganchos para colgar.

Facilitar la extracción de semen.

MenorMáximo 5 min por

batch

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Extracción de semen

PROCESO Descripción Materiales Necesarios

Objetivo Riesgo Asociado Duración

RIESGO ALTO

SECADOUna vez colgado el macho éste debe ser

secado.Toalla nova o

pañales.Evitar que agua pueda contaminar el semen.

Si el semen entra en contacto con agua se activa y pierde su

capacidad fertilizadora.


RIESGO ALTO

EXTRACCIÓNUna vez seco el macho, se introduce un

cateter en el orificio genital unos 2 cm, hasta que aparezca el semen.

Cánula Extraer el semen.

Si se introduce inadecuadamente el cateter se puede producir sangramiento y posible

contaminación del semen.


Frasco para semen, limpio y seco.

Un frasco contaminado o con agua puede producir la pérdida de la

totalidad del semen o la transmisión de enfermedades.

RIESGO ALTO

SCREENING

Consiste en extraer una muestra del reproductor con el fin de hacer el análisis de laboratorio par determinar la existencia o no

de patologías.

Material de Laboratorio Externo

Chequear condición sanitaria de los peces.

Debe registrarse adecuadamente la correlación entre el N° de

reproductos y el N° de la muestra.

Igual Timming que el desove.

El tipo de muestra y análisis dependerá de la unidad de incubación. Incubación individual:

muestra de riñón y bazo en el desove. Incubación en bateas y zoug-jar: muestra de sangre después del traslado a agua dulce.

RIESGO MEDIO

MARCAJE Consiste en marcar en el frasco la identificación del macho.

Marcadores

Permitir continuar el proceso de

seguimiento del reproductor.

Si se comete un error en el marcaje, se pueden generar

problemas de identificación futura de reproductores.

Máximo 2 min

RIESGO ALTO

ALMACENAJEUna vez que el semen está en el frasco, se debe almacenar cerrado a una temperatura no mayor de 4°C y sin exposición a la luz.

Esperar el desove.

Si no se respetan los límites y temperaturas. de tiempo puede

producirse mortalidad de espermios.

Máximo 24 horas.

Si se va a trasladar semen a otra pisicultura o si éste va a ser usado dentro de un rango

de 6 a 24 horas post extracción, es necesario agregar oxígeno humedecido al

frasco.

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Criterios de eliminación de ovas.

Alta dispersión en diámetro

Fluido celómico contaminado (fechas, sangre)

Ovas inmaduras (retención en estroma ovárico)

Ovas sobremaduras (polos pigmentados y translúcidas)

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Evaluación del semen (calidad y cantidad)

• Extracción del semen mediante cánulas• Evitar contacto con agua, luz solar directa, calor, y desecación• Traslado de semen en botellas de cultivo celular con oxígeno humedecido a 4ºC• Calidad espermática: color blanco o levemente rosado, de consistencia lechosa a

cremosa• Análisis de motilidad espermática

– 1 parte de semen / 10 partes de fluido ovárico– Activación explosiva y mantenerse por 15 segundos

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Un Plan lógico de bioseguridad en la producción de ovas debe considerar 4 etapas primordiales:

1.- Generación de los reproductores

2.- Desove (screening-desinfección de ova verde)

3.- Incubación (desinfección de ova con ojo)

4.- Seguimiento de alevines de primera alimentación

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1ra etapa: Reproductores: Aspectos importantes al momento de seleccionar los ejemplares.

Origen de los reproductores: Categoría sanitaria de la zona de procedencia, por ejemplo, zonas endémicas, zonas libres, zonas en vigilancia, etc.).

Sistema de producción en que fueron concebidos: Provienen de sistemas abiertos, es decir, con gran parte de su desarrollo en agua de mar o fueron producidos bajo un sistema cerrado, donde no han tenido contacto con el agua de mar.

Condiciones logísticas de la piscicultura de origen y/o de destino: Existe desinfección de los afluentes usados en los estanques de reproducción. Existen otras instalaciones acuícolas a lo largo del curso de sus aguas desde su origen. Qué tipo de agua utiliza (vertiente, pozo, río, lago, mar, estuario, potable).

Condiciones logísticas del centro de mar de origen: Existen condiciones de bioseguridad adecuadas en el centro, tales como barreras sanitarias, aislamiento operativo con centros vecinos, manejo adecuado de la mortalidad.

Si hubo ingreso de peces desde otros centros de cultivo. Verificación de las condiciones sanitarias de estos y análisis de riesgo de acuerdo a la categorización de la zona de procedencia.

Evolución sanitaria de los reproductores durante su período productivo: Verificación de registros sanitarios en cuanto a: % mortalidad del grupo al desove, desglose de la mortalidad por causas, ausencia de casos de enfermedad por causa no explicada en los últimos 3 meses, informes de necropsia, análisis de laboratorio (PVA, PVP, antibiogramas, otros), terapias usadas

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2da etapa: Desove: Una vez elegidos los ejemplares de menor riesgo sanitario se

procede a la extracción de los gametos, en donde debemos observar los siguientes

procedimientos.

Individualización de los reproductores: Con el fin de tener claridad del origen individual de cada batch de ovas y semen utilizado.

Screening individual: Toma de muestra patológica para la realización de pruebas moleculares que detecten enfermedades de posible transmisión vía vertical. En el caso Chileno IPN, BKD e ISA. Se debe verificar la existencia de registros o auditorias del procedimiento de toma de muestras.

Desinfección de la ova verde (recién fecundada) con yodoforos según procedimiento estipulado por la OIE (organización mundial para la salud animal): Orientado a disminuir la posibilidad de transmisión de patógenos asociados a la superficie de la ova. Se debe hacer inmediatamente después del endurecimiento de la ova fertilizada.

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3ra etapa: Incubación: Una vez verificado el procedimiento de desinfección de la ova verde se deberá considerar.

Modalidad de incubación: Individual para cada hembra, en pooles de varias hembras. Verificar la trazabilidad de las ovas de acuerdo a la individualización de los padres.

Eliminación de ovas: Se debe verificar si hay constancia de eliminación de ovas en caso de screening positivo.

Calidad del agua: Si se desinfecta el afluente usado para la incubación de las ovas o en su defecto existe total garantía de ausencia de peces silvestres y/o anádromos en la fuente.

Lay out de la sala de incubación: Si existe separación física adecuada que garantice la ausencia de contaminación cruzada al interior de la sala.

Desinfección con yodoforos de la ova con ojo: Dentro de las 48 horas previas al transporte o traslado de las ovas a otra dependencia o área geográfica, igualmente de acuerdo al procedimiento de la OIE 2003.

Desinfección con yodoforos de la ova con ojo: A la llegada a la piscicultura de destino.

Material de embalaje de primer uso: Si se dispone de este material de manera adecuada y biosegura luego del transporte, independiente de que sea movimiento interno.

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4ta etapa: Seguimiento de alevines de 1ra alimentación: La bioseguridad en la producción de ovas debiese concluir con esta última fase.

Certificación de alevines en etapa de Fry libres de IPN, BKD e ISA: Muestreos dirigidos y seriados, al menos dos o cada 15 días (60 peces en lo posible moribundos u orillados de cada estanque). Si hay algún positivo a RT PCR se deberá eliminar todo el estanque y todos los posibles contactos a nivel de incubación de ovas, si esta no ha sido individual.

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