Микромицеты (отдел ascomycota порядки …...1.1 Антибиотики –...

1

Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова

Федеральное государственное бюджетное научное учреждение Научно-

исследовательский институт по изысканию новых антибиотиков имени Г.Ф. Гаузе

На правах рукописи

Куварина Анастасия Евгеньевна

Микромицеты (отдел Ascomycota порядки Eurotiales и

Hypocreales) с антигрибной активностью и отбор

продуцента антибиотиков-пептаиболов

Специальности:

03.01.06 – Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

03.02.12 – Микология

Диссертация на соискание учёной степени кандидата

биологических наук

Научные руководители:

доктор биологических наук,

зав. кафедрой микологии и альгологии

МГУ имени М.В. Ломоносова А.В. Кураков

доктор биологических наук,

ведущий научный сотрудник ФГБНУ НИИНА

В.С. Садыкова

Москва - 2016

2

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ………………………………………………………………………..5

ГЛАВА 1. Обзор литературы…………………………………………………...11

1.1 Антибиотики – определение, общее представление об их роли,

продуцентах и проблеме поиска новых веществ………………………………11

1.2 Антибиотики, продуцируемые микроскопическими грибами……………15

1.3 Грибы, образующие соединения с антимикотической активностью…….22

1.4 Нерибосомальные антимикробные пептиды грибов с антифунгальной

активностью и антибиотики на их основе……………………………………..26

1.5 Подходы скрининга и идентификации грибных антибиотиков………….45

ГЛАВА 2. Объекты и методы исследований…………………………………..56

2.1 Объекты………………………………………………………………………56

2.2 Методы исследований……………………………………………………….58

2.2.1 Методы выделения чистых культур грибов……………………………..58

2.2.2 Оценка антимикотической активности микромицетов и первичный

отбор штаммов 59

2.2.3 Проверка продукции штаммами антигрибных соединений в жидкой

среде и вторичный отбор штаммов с высокой антибиотической

активностью ……………………………………………………………………..60

2.2.3.1 Оценка антибиотической активности методом дисков……………….60

2.2.4 Молекулярно-генетическая идентификация выделенных штаммов,

активных продуцентов антибиотических веществ……………………………62

2.2.5 Определение спектра усваиваемых соединений активными

продуцентами антимикотиков…………………………………………………..64

2.2.6 Оптимизация выхода антибиотика для штамма Trichoderma сitrinoviride

ВКПМ F-1228………………………………………………………………….65

2.2.7 Выделение и изучение свойств антибиотических веществ,

продуцируемых штаммом T. сitrinoviride ВКПМ F-

1228……………………………………………………………………………….67

3

2.2.8 Определние токсичности активной фракции штамма T.сitrinoviride

ВКПМ F-1228………….………………………………………......................71

2.2.9 Определение цитотоксической активности активной фракции

T. сitrinoviride ВКПМ F-1228………………..………………………………..72

2.2.10 Обработка данных и повторности………………………………………73

ГЛАВА 3. Распространенность среди микроскопических грибов способности

к образованию антимикотиков и отбор активных продуцентов……………...74

3.1 Общая оценка антимикотической активности грибных культур………...74

3.2 Антимикотическая активность микроскопических грибов, выделенных из

почв различных природных зон………………………………………………...75

3.3 Антимикотическая активность микроскопических грибов из разных

экотопов…………………………………………………………………………..76

3.4 Антимикотическая активность микроскопических грибов различных

таксонов отдела Ascomycota…………………………………………………….79

ГЛАВА 4. Отбор активного продуцента антимикотиков……………………..84

4.1 Оценка способности к синтезу антимикотиков у наиболее активных

культур микромицетов в жидкой среде………………………………………...84

4.2 Характеристика спектра антибиотической активности и утилизации

соединений у отобранных штаммов рода Trichoderma……………………….87

4.3 Оптимизация условий культивирования штамма T. citrinoviride ВКПМ

F-1228 – продуцента антимикотических веществ……………………………..93

4.4 Оптимизация содержания С и N в среде для накопления антибиотиков

T. citrinoviride ВКПМ F-1228 методом полнофакторного эксперимента…….96

ГЛАВА 5. Выделение, идентификация и характеристика антибиотического

комплекса T. сitrinoviride ВКПМ F-1228……………………………………...102

5.1. Спектр антимикробной активности экстрактов T. сitrinoviride ВКПМ

F-1228……………………………………………………………………………102

5.2 Очистка и разделение антибиотического комплекса и оценка токсичности

T. сitrinoviride ВКПМ F-1228…………………………………………………..104

4

5.3 Антимикробная активность пептаиболов T. citrinoviride ВКПМ

F-1228……………………………………………………………………………110

Глава 6. Лабораторный регламент получения комплекса антимикотических

веществ - пептаиболов из T. citrinoviride ВКПМ F-

1228……………………………………………………………………………114

6.1 Область применения……………………………………………………….114

6.2 Характеристика препарата…………………………………………………114

6.3 Субстраты и материалы……………………………………………………115

6.4 Технология и экономические затраты на производство препарата в

лабораторных условиях………………………………………………………..117

6.4.1 Стадия подготовки……………………………………………………….119

6.4.2 Ферментационная стадия………………………………………………...120

6.4.3 Стадия выделения и очистки…………………………………………….120

6.4.4 Побочные продукты……………………………………………………...123

6.5 Экономические затраты……………………………………………………124

6.6 Технические требования…………………………………………………...125

6.7 Упаковка и маркировка…………………………………………………….126

6.8 Требования безопасности………………………………………………….126

6.9 Приемка……………………………………………………………………..126

6.10 Методы контроля………………………………………………………….127

6.11 Хранение…………………………………………………………………..130

ЗАКЛЮЧЕНИЕ………………………………………………………………...131

ВЫВОДЫ……………………………………………………………………….134

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ……………………………….136

ПРИЛОЖЕНИЕ 1………………………………………………………………159

Таксономическая принадлежность штаммов

ПРИЛОЖЕНИЕ 2………………………………………………………………164

Утилизация субстратов штаммами рода Trichoderma

5

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Ограниченное число антимикотиков, их

довольно высокая стоимость и токсичность, возникновение резистентных

форм возбудителей, ухудшение экологической обстановки и снижение

защитного статуса иммунной системы у пациентов приводит к серьезным

проблемам в лечении многих болезней существующими лекарственными

препаратами. Все это обусловливает стремительный рост заболеваемости

глубокими (инвазивными) микозами, характеризующимися высокой

смертностью и тяжестью течения, вызываемыми в том числе резистентными

формами патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. Поэтому

необходимо постоянное совершенствование и разработка новых

лекарственных средств, которые были бы более успешны в доставке,

специфичности, эффективности, менее токсичные и способные преодолевать

резистентность микробных возбудителей к антибиотикам. Развитие микозов

часто сопутствует раковым заболеваниям, в связи с этим перспективно

наличие у новых антимикотиков способности ингибировать рост опухолевых

клеток.

Микроскопические грибы, в частности, порядков Eurotiales и

Hypocreales представляют особый интерес как продуценты антигрибных

антибиотиков. Широко известны штаммы Penicillium chrysogenum,

Tolypocladium inflatum, на основе которых созданы антибактериальные

препараты и иммуносупрессоры, совершившие революцию в медицине.

Среди этих грибов обнаружены штаммы, которые синтезируют антибиотики,

подавляющие дрожжевые и мицелиальные грибы (Penicillium nigricans -

гризеофульвин, Aspergillus aculeatus и A.nidulans эхинокандины,

Emericellopsis salmosynnemata - зервамицин IIB).

Применение в последние годы методов анализа геномов и метаболомов

дали новые сведения о богатстве вторичного метаболизма этих грибов,

6

способности их к образованию разнообразных антибиотиков, в том числе с

антигрибной активностью. В частности, были расшифрованы области

геномов нерибосомальных пептидсинтетаз (NRPSs), поликетидных синтаз

(PKSs) и терпеновых синтаз (ТЭС), ответственные за синтез антимикотиков

[124]. Новые физиологически-активные соединения обнаружены среди

метаболитов штаммов родов Acremonium, Emericellopsis, Cordyceps,

Trichoderma и ряда других. Интересны для поиска антимикотиков

представители рода Trichoderma, среди которых установлены продуценты

новых мембранно-активных пептидов – пептаиболов (триховиринов,

трихорзинов, сузуказилинов), которые позволяют преодолеть

антибиотикорезистентность возбудителей [55].

Все это указывает на перспективность скрининга среди грибов-

микромицетов указанных таксономических групп продуцентов соединений,

активных в отношении условно-патогенных и патогенных грибов и

разработке на их основе новых лекарств.

Целью работы была оценка распространенности среди

микроскопических грибов порядков Eurotiales и Hypocreales способности к

продукции соединений – антимикотиков, отбор и оптимизация условий

культивирования перспективного штамма-продуцента пептаиболов,

выделение и первичная очистка этих антибиотиков.

Задачи исследования

1. Оценка распространенности среди микроскопических грибов отдела

Ascomycota c акцентом на представителей порядков Hypocreales и Eurotiales,

способности образовывать соединения с антимикотическими свойствами и

выявление наиболее активных штаммов.

2. Определение спектра биологической активности, идентификация и

физиолого-биохимическая характеристика штаммов, обладающих

наибольшей ингибирующей активностью в отношении условно-патогенных

и патогенных грибов.

7

3. Оптимизация условий культивирования для одного из лучших

штаммов, образующего антигрибные соединения, характеристика спектра его

биологической активности.

4. Выделение и очистка антибиотических веществ, образуемых наиболее

активным штаммом, установление их принадлежности к конкретной группе

химических соединений.

5. Проверка эффективности этих соединений in vitro на условно-

патогенных и патогенных штаммах грибов и бактерий, включая

антибиотикоустойчивые культуры, и оценка их токсического действия на

клетки млекопитающих и опухолевые клетки.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Среди микромицетов отдела Ascomycota наиболее широко высокой и

умеренной антигрибной активностью обладают представители отдела

Hypocreales, меньше -порядка Eurotiales и других таксонов. Среди культур

аскомицетов высокая антигрибная активность обнаружена у 2% штаммов,

умеренная у 38%, в порядке Hypocreales, 9% и 52% и роде Trichoderma

(анаморфа Hypocrea) - 13% и 59%. Для поиска активных продуцентов

антимикотиков перспективными являются экониши, богатые органическим

веществом (растительные остатки и верхние гумусовые горизонты, торфяные

почвы, буровая мука).

2. Максимальную антигрибную активность продемонстрировали штаммы

Trichoderma (T. citrinoviride, T. viride, T. gamsii, T. asperellum, T. koningii,

T. harzianum), среди которых наиболее высокой антимикробной активностью

и широким спектром утилизации различных соединений обладает штамм

T.citrinoviride ВКПМ F-1228.

3. Оптимальным способом культивирования штамма T.citrinoviride ВКПМ F-

1228 для синтеза антимикотиков является поверхностное выращивание на

жидкой среде Сабуро с содержанием глюкозы – 30,0 г и пептона – 12,5 г в 1

л, при температуре 28оС, рН – 7,5 в течение 12-14 суток.

8

4. Штамм T. citrinoviride ВКПМ F-1228 образует комплекс внеклеточных

антибиотиков-пептаиболов с антибактериальным, фунгицидным и

цитотоксическим действием, при этом нетоксичен для клеток

млекопитающих. В этот комплекс антибиотических соединений входят

трихорзин и четыре неизвестных ранее пептаибола.

Научная новизна.

Проведен анализ распространенности способности к образованию

антигрибных соединений среди микромицетов с акцентом на представителей

порядков Hypocreales и Eurotiales. Из 914 штаммов микроскопических грибов

умеренная и высокая антимикотическая активность в отношении тест-

культуры A.niger 2К установлена у 38% и 2% штаммов. Cреди

представителей порядка Eurotiales (288 штаммов) умеренной и высокой

антигрибной активностью обладали 39% и 1%, а - порядка Hypocreales (197

штаммов), соответственно, 52% и 9%.

Наиболее активные штаммы порядка Hypocreales обнаружены среди

видов рода Trichoderma. Они были выделены из разлагающихся

растительных субстратов и верхних гумусовых горизонтов почв. Из образцов

экстремальных местообитаний высокоактивные штаммы не были выявлены,

но есть перспективные изоляты с умеренной активностью родов

Emericellopsis и Acremonium.

Установлено, что штамм T. citrinoviride TYVI 4/11, продуцирует

пептаиболы с антимикотической, антибактериальной и цитотоксической

активностями. Обнаружено, что наряду с описанным пептаиболом -

трихорзином штамм синтезирует по предварительным данным четыре новых,

не известных гидрофобных соединения пептидной природы, не имеющих

аналогов в интерактивной базе

https://peptaibioticsdatabase.boku.ac.at/www/index.html [207].

https://peptaibioticsdatabase.boku.ac.at/www/index.html

9

Практическая значимость работы.

В результате скрининга 914 природных изолятов отобрано 9 штаммов 6

видов рода Trichoderma, продуцирующих внеклеточные антибиотики

гидрофобной природы в отношении условно-патогенных грибов, которые

могут быть использованы в дальнейших разработках новых лекарственных

препаратов.

Для поиска высокоактивных штаммов перспективно использовать

образцы почв южных регионов (черноземных и темно-каштановых),

интразональных торфяных почв или верховых болот и разлагающихся

растительных (древесных) остатков и местообитаний, ассоциированных с

беспозвоночными.

Один из наиболее активных из отобранных штаммов - T. сitrinoviride

TYVI 4/11 депонирован во Всероссийскую коллекцию промышленных

микроорганизмов под номером ВКПМ F-1228 как продуцент мембранно-

активных пептидов, обладающих антибактериальной, антигрибной и

цитотоксической активностью в отношении раковых клеток. Показано

отсутствие токсичности образуемого этим штаммом антибиотического

комплекса по отношению к клеткам млекопитающих.

Подобраны оптимальные параметры культивирования штамма

T.сitrinoviride ВКПМ F-1228 для синтеза комплекса антибиотических

веществ, и на основе этого штамма разработан лабораторный регламент

получения антибиотиков – пептаиболов. Продуцент может быть использован

в разработках новых медицинских препаратов для лечения микозов, в том

числе у онкобольных, и при инфекциях резистентными формами бактерий.

Апробация работы. Основные положения, выводы и предложения

диссертационного исследования прошли апробацию на Всероссийской

научно-практической конференции по медицинской микробиологии и

клинической микологии (XVI Кашкинские чтения) (Санкт-Петербург, 2012),

на VI Всероссийском конгрессе по медицинской микологии (Москва, 2013),

10

на Всероссийском симпозиуме с международным участием «Современные

проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов»

(Москва, 2014).

Личный вклад автора. Проведение опытов, анализ

экспериментальных данных и оформление полученных результатов

осуществлено автором самостоятельно, в соответствии с планом,

согласованным с научными руководителями. Масс-спектрометрический

анализ и обращено-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография

активных фракций отобранного штамма выполнен совместно с к.х.н., н.с.

Е.А. Рогожиным и д.х.н., зав. отдела В.А. Коршуном в ИБХ РАН.

Цитотоксичность оценена на линиях опухолевых клетках совместно с к.б.н.,

с.н.с. Свирщевской Е.В. в ИБХ РАН. Токсичность к клеткам млекопитающим

определяли в лаборатории экотоксикологического анализа почв МГУ им.

М.В. Ломоносова при консультировании зав. д.б.н., Тереховой В.А.

Исследования фунгицидной активности индивидуальных пептаиболов

проводили на клинических аспергиллах совместно с в.н.с., к.б.н. Кулько А.Б.

в ГКУЗ «МНПЦ борьбы с туберкулезом».

Публикация результатов. На основе полученных результатов было

подготовлено и опубликовано 10 научных публикаций, в том числе 4 статьи в

журналах перечня ВАК и 1 патент.

Структура и объём работы. Диссертация изложена на 181 странице

компьютерного текста, состоит из введения, глав, заключения, выводов,

лабораторного регламента и приложений, включает таблиц 27, 20 рисунков, 2

приложения. Список использованной литературы состоит из 207 источников,

в том числе 195 иностранных.

11

ГЛАВА 1. Обзор литературы

1.1 Антибиотики – определение, общее представление об их роли,

продуцентах и проблеме поиска новых веществ

Антибиотики - биологически активные соединения, образуемые

различными организмами, имеющие высокое, с определенным спектром,

действие на живые организмы. Существуют антибиотики, созданные на

основе природных, которые называют полусинтетические и антибиотические

соединения, созданные на основе химического синтеза. Образование

антибиотических веществ является наследственно закрепленным признаком. К

настоящему времени описано свыше 14000 антибиотических веществ у разных

таксономических групп микро- и макроорганизмов.

На начало 2016 года был составлен единый Справочник антибиотиков

Ч.В. Джонстоном с соавторами, уточненные и дополненные на основе

предыдущих версий Дж. Берди [30,31] и электронная база данных

(Antibioticome) и обширных литобзоров, насчитывающие 10 343 соединения

для микроорганизмов, список которых пополняется практически ежемесячно

[95]. Аннотации по специфичности и спектру действия каждого соединения

показали, что 7184 молекулы имеют антибактериальную активность

широкого спектра действия, в то время как 3159 соединения характеризуются

специфической антибактериальной активностью. Антибиотики широкого

спектра действия были найдены из грибов (35) и бактерий (66%), в то время

как специфические антибактериальные агенты были значительно обогащены

бактериальных производителей (96%), в отличие от грибов (4%).

Антибиотики относятся к различным классам химических соединений –

от довольно простых ациклических до сложных полипептидов.

Классифицируют антибиотики по спектру биологической активности,

химической структуре и механизму действия [107]. По химической структуре

12

это могут быть аминогликозиды, рибосомальные и нерибосомальные

пептиды и их производные, азолы, в-лактамы, поликетиды, углеводные

производные, макролиды, сульфаниламиды, тетрациклины. По спектру

биологической активности, часто преимущественному, антибиотики

подразделяют на антигрибные, антибактериальные, противоопухолевые,

антималярийные.

По механизму действия антибиотики могут быть ингибиторами синтеза

белка, нуклеиновых кислот, синтеза клеточной стенки (пептидогликана,

глюканов, хитина), функционирования цитоплазматической мембраны

(пептаиболы), синтеза пуринов и пиримидинов, ингибирование работы

ферментов дыхательной цепи.

Способность микроорганизмов к образованию веществ, обладающих

антибиотическими свойствами, является результатом функционирования в

микробных клетках процессов, объединяемых понятием вторичного

метаболизма. Реакции вторичного метаболизма не связаны непосредственно с

процессами получения энергии и строительством компонентов клетки.

Образование вторичных метаболитов в значительной степени зависит от

первичного метаболизма, поскольку последний, определяя основные

биохимические процессы, предоставляет необходимый «строительный

материал» для создания антибиотиков. Антибиотики синтезируются из

продуктов первичного метаболизма, таких как органические кислоты,

аминокислоты, сахара [4,31].

Характерная особенность антибиотических веществ – избирательность

действия. Каждый антибиотик проявляет свое биологическое действие по

отношению к определенным организмам, не оказывая заметного эффекта на

другие виды. В этом состоит отличие антибиотических веществ от

общебиологических высокоэффективных ядов (сулемы, фенолов) и

антисептиков (этанола и др.), которые действуют на микроорганизмы не

13

избирательно и предназначены для тотального уничтожения микроорганизмов

вне живого организма (для дезинфекции поверхностей и предметов).

Синтез антибиотиков микроорганизмами в природных условиях можно

рассматривать как инструмент для адаптации и изменения структуры

сообщества [17]. Действие антибиотика на организмы сообщества связано с

его концентрацией, временем экспозиции и изменением физико-химических

условий (появлением новых субстратов и т.д.). Даже антибиотики широкого

спектра действия в природных экосистемах имеют селективное воздействие, в

результате которого изменяется относительное обилие одних видов

микроорганизмов, что впоследствии может модифицировать взаимодействиям

между различными видами. Кроме влияния на видовой состав микробного

сообщества, различные антибиотики могут изменять пул их биомассы,

оказывать ингибирующее действие на ферменты и интенсивность дыхания

почвы [103,192,204].

Помимо ингибирующего действия и модификации структуры

почвенного микробного сообщества, антибиотики в природе могут играть

роль сигнальных молекул и влиять на процессы транскрипции в клетках –

мишенях. Природные антибиотики, в отличие от синтетических, представляют

собой преимущественно небольшие молекулы, эффективно воздействующие

на функционирование клетки в концентрациях, близких к ингирибующим

(sub-MIC) [79,116].

Несмотря на грандиозные успехи в лечении инфекционных заболеваний

благодаря антибиотикам, потребность в создании новых антибиотических

препаратов остается чрезвычайно высокой. Инфекционные заболевания по-

прежнему основная причина смертности людей в развивающихся странах и

серьезная проблема для передовых стран [9]. Она обусловлена появлением

резистентности, включая множественную резистентность патогенных

микроорганизмов к обычно используемым антибиотикам у многих

бактериальных и грибных патогенов. Наблюдается стремительный рост

14

заболеваний глубокими (инвазивными) микозами, протекающими крайне

тяжело и характеризующимися высокой смертностью. Это привело

некоторых ведущих ученых даже к предположению, что начался закат эры

антибиотиков [15].

К настоящему времени общее количество существующих препаратов,

используемых в терапии человека, около 3500 соединений, что составляет

менее 0,01% от всех известных химических веществ. Количество

антибиотиков, применяемых в медицинской практике и зарегистрированных

в России, не превышает трех сотен препаратов. Примерно 50% антибиотиков

являются природными соединениями, получаемых только микробным

синтезом или же их химическая модификация происходит на стадиях

очистки [31].

Наибольшее число известных на сегодняшний день природных

микробных антибиотиков продуцируется мицелиальными грибами (45% от

всех антибиотиков). Из них базидиальные макромицеты образуют 11%, а

микромицеты, преимущественно аскомицетного аффинитета, такие как

Penicillium, Aspergillus, Trichoderma, Tolypocladium - 33% от микробных

антибиотиков. Представители этих родов продуцируют почти 99% всех

грибных метаболитов, используемых в медицине и агробиотехнологиях.

Грибы с дрожжевым ростом, а также представители отдельной группы

организмов - миксомицетов, производят в целом менее 400 соединений, что

составляет 1,5% от всех метаболитов, и среди них не столь широко

распространены продуценты антибиотических веществ [203].

Систематическое изучение вторичных метаболитов грибов началось

под руководством Харольда Райстрика, который ко второй половине ХХ века

охарактеризовал более 200 метаболитов микроскопических грибов [146]

Фармацевтические компании в это же время инициируют обширные

программы скрининга новых грибных метаболитов. В результате к 1950 году

были обнаружены продуценты с антимикробными метаболитами, имеющими

15

прикладное значение. Поиск новых биологически активных вторичных

метаболитов был продолжен, и были открыты тысячи соединений,

ингибирующих рост бактерий, грибов, вирусов, простейших, гельминтов,

насекомых и опухолевых клеток человека. Были обнаружены многие новые

молекулы с цитотоксическими и мутагенными, карциногенными,

тератогенными, иммуносупрессивными свойствами, обладающие

способностью ингибировать ключевые для функционирования патогенов

ферменты, а так же вещества с аллелопатическими и другими

биологическими эффектами.

Поиск новых соединений из разных групп грибов не утратил своей

актуальности и на сегодня, несмотря на значительное снижение количества

природных антибиотиков, внедряемых в последние десятилетия в

клиническую практику. Возможности грибов как продуцентов антибиотиков

еще далеко не исчерпаны. Предполагаемое биоразнообразие грибов

превышает число известных видов более чем на порядок. Эти организмы

обладают способностью адаптироваться к практически всем эконишам, и

вместе с тем гигантские территории Земли, по-прежнему, остаются не

изученными. Поэтому шансы выявить среди грибов новых продуцентов и

новые биологически активные вещества очень высоки.

1.2 Антибиотики, продуцируемые микроскопическими грибами

У представителей царства Mycota, разнообразие которых на сегодня

составляет 98000 описанных видов [100], установлена продукция 30000

различных соединений, из которых 15000 являются биоактивными. Из них

подавляющую часть, около 11250 соединений, способны образовывать

микроскопические грибы [31]. Микроскопические грибы были первыми

микроорганизмами, у которых обнаружили антагонистические проявления в

отношении бактерий, и с их помощью был получен первый в истории

16

антибиотик в 1868 году. Сообщения об антагонистических свойствах

бактерий и актиномицетов появились позднее, в 1877 и 1890 гг. [3]

С открытия первого β-лактамного антибиотика ˗ пенициллина грибы

рассматривают как важные источники новых биологически активных

соединений, включая антибиотики для лечения инфекционных заболеваний.

Фармацевтические компании с начала эры антибиотиков исследуют большое

количество коллекций грибов с целью обнаружения новых антибиотических

веществ [47]. Так, после открытия у Penicillium notatum Westling 1911 (P.

chrysogenum Thom 1910) продукции пенициллина, тысячи изолятов рода

Penicillium были проверены в рамках программ скрининга природных

источников соединений, и они продолжают оставаться предметом интереса,

что указывает на их текущее значение для фармацевтической

промышленности. Всего к настоящему времени (2015 г) известно свыше 1200

зарегистрированных товарных лекарственных форм антибиотиков,

продуцируемых микроскопическими грибами.

За последние 80 лет на основе вторичных метаболитов грибов

совершен ряд революционных успехов в медицине и создано много

лекарственных средств. В промышленных масштабах из грибов получают

пенициллины (продуценты – P. chrysogenum, P. brevicompactum Dierckx 1901,

P. nigricans K.M. Zaleski 1927, Aspergillus flavus Link 1809, A. flavipes (Bainier

and R. Sartory) Thom and Church 1926, A. nidulans (Eidam) G. Winter 1884),

цефалоспорины (Acremonium acremonium Corda 1839), фумагиллин

(A. fumigatus Fresen. 1863), гризеофульвин (P. nigricans K.M. Zaleski 1927,

P. urticae Bainier 1907, P. griseofulvum Dierckx 1901), трихотецин

(Trichothecium roseum (Pers.) Link 1809).

Продуцентами β-лактамных антибиотиков являются грибы

P. chrysogenum (пенициллинов) и A. acremonium (Cephalosporium

acremonium) (цефалоспоринов). β-лактамные антибиотики, в основном

пенициллины и цефалоспорины до сих пор являются одними из мировых

17

лидеров медицинского рынка. Их доля достигает 65% всего объема

продаваемых в мире антибиотиков, уровень дохода от их продаж в 2002 году

составил около 15 миллиардов долларов. Попытки повысить продуктивность

продуцирования микроорганизмами этих антибиотиков, например, P.

chrysogenum, а так же ферментные технологии привели к значительному

снижению затрат на производство по сравнению с прошлым десятилетием

[67].

Капитал биофармацевтических предприятий оценивается в 41 млрд

долларов. Его рост составил 21% в период с 2004 по 2008 года. Прибыль за

лекарства, полученные из грибов, составляют значительную долю.

Например, за указанный период времени на долю амоксициллина и

циклоспорина приходится 1,7 млрд и 1,4 млрд долларов, соответственно

[166].

Новая эра в иммунофармакологии и трансплантации органов началась

с открытия циклоспорина. Циклоспорины - циклические полипептиды,

состоящие из 11 аминокислотных остатков и образуемые мицелиальными

грибами Tolypocladium inflatum W. Gams 1971, Trichoderma polysporum (Link)

Rifai 1969, Cylindrocarpon lucidum C. Booth 1966. Впервые эти антибиотики

были описаны в конце 70-х гг прошлого столетия. Представители этих видов

образуют ряд близких по структуре циклоспоринов – циклоспорины А, В, С,

….U, V, W.

Интерес к этой группе антибиотиков связан не с их антимикробной

активностью, которая не столь высокая, а тем, что циклоспорины обладают

специфическим иммуносупрессорным действием. Они специфически и

обратимо ингибируют G0 и G1 фазы клеточного цикла иммунокомпетентных

лимфоцитов, особенно Т-хелперов, подавляют образование и выход из

клеток интерлейкина−2 и его связывание со специфическими рецепторами.

Нарушают дифференцировку и пролиферацию Т-клеток, участвующих в

отторжении трансплантата. Циклоспорины применяют при пересадке

18

различных органов (для предотвращения отторжения трансплантата, лечение

реакции отторжения), костного мозга (профилактика реакции отторжения,

профилактике и лечении болезни «трансплантат против хозяина»),

хроническом гломерулонефрите, сопровождающимся развитием

нефротического синдрома, ревматоидном артрите с высокой степенью

активности, псориазе, тяжелых форм ахатопического дерматита.

Иммунодепресантные свойства циклоспорина впервые были

обнаружены у почвенного изолята микроскопический гриба сотрудниками

фирмы Сандос. Штамм был определен как T. polysporum, переопределен как

T. inflatum и депонирован в коллекцию Департамента Сельского Хозяйства

(США) под номером NRRL 8044. Несмотря на открытие и введение в

практику новых иммунодепрессантов циклоспорины уже более 20 лет

является одними из наиболее распространенных препаратов

иммуносупрессивной терапии при трансплантации органов [196].

Нодилуспоровая кислота и ее аналоги являются структурно

сложными инсектицидными метаболитами грибов, выделенные из

Nodulisporium sр. - эндофита растения Bontia daphnoides с Гавайских

островов [86,140]. Было установлено, что исходное соединение,

нодулиспоровая кислота, обладает системным эффектом в отношении блох,

где оно модулирует специфический глутамат ионный канал беспозвоночных.

Цифостатин был обнаружен как компонент мицелия экстракта Trichopeziza

mollissima Fuckel 1870 в 1997 году [135,173]. Сначала гриб был

идентифицирован как Dasyscyphus mollissimus (Fuckel) Nannf. 1956, но

впоследствии идентификация была пересмотрена и в настоящей таксономии

в качестве родового названия Dasyscyphus больше не применяется [135].

Соединение представляет собой впервые выделенный низкомолекулярный

ингибитор мембраносвязанной нейтральной сфингомиелиназы (N-SMase) –

фермента, обнаруженного либо из природных источников, либо путем

химического синтеза. Кроме того, цифостатин является самым мощным

19

среди немногих известных низкомолекулярных ингибиторов этого фермента,

IC50 концентрация составляет 1.0μM [135,136]. Такая высокая активность

привлекла внимание учёных, так как такие ингибиторы потенциально могут

быть использованы при лечении воспалительных, аутоиммунных

заболеваний и рака [102,162].

Другие важные соединения для медицины и сельского хозяйства,

продуцируемые грибами, включают пептидные антибиотики - статины,

эхинокандины и стробилурины.

В обзоре К.Р. Ранадива с соавторами (2013) был составлен детальный

список представителей разных таксонов грибов, для которых к настоящему

времени получены сведения об антимикробных свойствах. В нем приведены

данные о 316 видах из 150 родов и 64 семейств (из которых 45 семейств

принадлежит к отделу Basidiomycota и 21 семейство к отделу Ascomycota (6

лихенизированных и 15 нелихенизированных), представители которых

проявляют антибиотическую активность в отношении 32 видов 18 родов

патогенных бактерий и 22 видов 13 родов фитопатогенных,

энтомопатогенных и условно – патогенных грибов [147].

Из отдела Ascomycota (Non-Lichenised) были исследованы следующие

представители:

1) Из семейства Cordycipitaceae был исследован 1 род Cordyceps,

включающий следующие виды (всего 1): Cordyceps sobolifera (Hill ex

Watson) Berk. and Broome 1873 [91].

2) Из семейства Morchellaceae был исследован 1 род Morchella,

включающий следующие виды (всего 1): Morchella conica Pers. 1818

[179].

3) Из семейства Xylariaceae был исследован 1 род Daldinia, включающий

следующие виды (всего 1): Daldinia concentrica (Bolton) Ces. and De

Not. 1863 [78].

20

4) Из семейства Chaetomiaceae был исследован 1 род Chaetomium,

включающий следующие виды (всего 1): Chaetomium atrobrunneum

L.M. Ames 1950, Chaetomium globosum Kunze 1817, Chaetomium funicola

Cooke 1873, Chaetomium strumarium (J.N. Rai, J.P. Tewari and Mukerji)

P.F. Cannon 1986 [168].

5) Из семейства Pezizaceae было исследовано 3 рода Terfezia, Tirmania,

Sordariomycetes. Род Terfezia включает следующие виды (всего 1):

Terfezia boudieri Chatin 1892. Род Tirmania включает следующие виды

(всего 1): Tirmania sp. Род Sordariomycetes включает следующие виды

(всего 1): Sordariomycetes O.E. Erikss and Winka 1997 [14,63].

6) Из семейства Nectriaceae был исследован 1 род Fusarium, включающий

следующие виды (всего 2): Fusarium solani (Mart.) Sacc. 1881, Fusarium

graminearum Schwabe 1839 [144,174].

7) Из семейства Diaporthaceae был исследован 1 род Diaporthe,

включающий следующие виды (всего 1): Diaporthe sp. [63]

8) Из семейства Pleosporaceae был исследован 1 род Alternaria,

включающий следующие виды (всего 1): Alternaria sp. [63]

9) Из семейства Glomerellaceae был исследован 1 род Colletotrichum,

включающий следующие виды (всего 1): Colletotrichum sp. [63]

10) Из семейства Amphishaeriaceae был исследован 1 род

Pestalotiopsis, включающий следующие виды (всего 1): Pestalotiopsis

sp. [63]

11) Из семейства Botryosphaeriaceae был исследован 1 род

Guignardia, включающий следующие виды (всего 1): Guignardia

vaccinii Shear 1907 [63].

12) Из семейства Trichocomaceae было исследовано 2 рода

Penicillum, Aspergillus. Род Penicillum включает следующие виды (всего

2): Penicillum sp., P. expansum Link 1809. Род Aspergillus включает

21

следующие виды (всего 2): A. niger Tiegh. 1867, A. flavus Link 1809

[63,144].

Антимикробная активность обнаружена среди представителей 64 видов

семейства Polyporaceae, 22 - из семейства Agaricaceae, 21 - семейства

Hymenochaetaceae, 16 - из семейства Tricholomataceae, 13 - из семейства

Fomitopsidaceae, 12 - из семейства Meruliaceae, 10 - из семейств

Physalacriaceae, Pleurotaceae и Marasmiaceae, 8 - из семейств Stereaceae и

Mycenaceae, 3-х - семейств Amanitaceae, Auriculariaceae, Pezizaceae,

Pluteaceae, Suillaceae и Umbilicariaceae, по 2 - из семейств Bankeraceae,

Gloeophyllaceae, Inocybaceae, Meripilaceae, Nectriaceae, Paxillaceae и

Rhizopogonaceae и по 1 - из семейств Amphishaeriaceae, Arthoniaceae,

Auriscalpiaceae, Botryosphaeriaceae, Clavaridelphaceae, Coniophoraceae,

Cordycipitaceae, Cyphellaceae, Dacrymycetaceae, Diaporthaceae,

Entolomataceae, Fistulinaceae, Glomerellaceae, Gomphaceae, Gomphidiaceae

, Hydnaceae, Hygrophoraceae, Lecanoraceae, Lyophyllaceae, Morchellaceae,

Niaceae, Phallaceae, Phanerochaetaceae, Physciaceae, Pleosporaceae,

Ramalinaceae, Schizophyllaceae, Schizoporaceae, Sparassidaceae и

Xylariaceae. Исследование большего числа видов базидиомицетов

показывает, что и среди таких их таксонов как Polyporaceae, Agaricaceae,

Hymenochaetaceae, Tricholomataceae, Fomitopsidaceae, Meruliaceae, как и

среди аскомицетов, перспективно вести поиск антимикробных

соединений.

Таким образом, грибы являются ценным источником природных

соединений разнообразных структур с различным спектром действия, и пока

их ограниченная изученность явно указывает, что сохраняется их ценность

для скрининга продуцентов и создания новых лекарственных препаратов.

Большинство грибов – продуцентов антибактериальных препаратов,

нашедших применение в медицине, относятся к микромицетом

аскомицетного аффинитета.

22

1.3 Грибы, образующие соединения с антимикотической активностью

Среди антибиотиков одними из наиболее востребованных являются

соединения с фунгицидной и фунгистатической активностью. Разнообразие

применяемых в медицинской практике антимикотиков крайне небольшое,

они дорогие, и довольно токсичные. Поэтому поиск новых

антимикотических препаратов актуальная и пока до конца нерешенная задача

современной медицины.

Одним из перспективных организмов для их поиска являются

микроскопические грибы отдела Ascomycota, и, по-видимому, наиболее

многообещающими могут быть представители порядков Eurotiales и

Hypocreales.

Среди этих грибов обнаружены штаммы, которые синтезируют

антибиотики, подавляющие дрожжевые и мицелиальные патогены.

Гризеофульвин продуцируется P.griseofulvum Dierckx 1901, P. nigricans

Bainier ex Thom 1930, P. patulum Bainier 1906, P. raistrickii G. Sm. 1933,

P. janczewski Zalessky 1927. По химическому строению этот антибиотик

относится к группе гризанов - неполиеновым антибиотикам, обладающим

антимикотическими свойствами. Фунгистатическое действие связано с

влиянием на микротубулярные белки клетки гриба, в результате чего

происходит разрыв веретенообразных митотических структур и остановка

митотического деления клеток гриба в метафазе, нарушается формирование

клеточной стенки. Он активен в отношении дерматомицетов, включая виды

родов Trichophyton, Mycrosporum, Epidemophyton. Фунгистатическая

концентрация для большинства чувствительных к гризеофульвину видов

грибов составляет 0,5–3 мкг/мл. Основным недостатком данного

антибиотика является узкий спектр действия и медленное достижение

клинического эффекта [82].

23

Первые природные стробилурины А и В, были выделены из мицелия

базидиомицета Strobilurus tenacellus (Pers.) Singer 1962, выделенном из

растения Purus. Оба соединения не обладали антибактериальной

активностью, но ингибировали рост мицелиальных и дрожжевых форм

грибов [18]. Стробилурины обнаружены у представителей большого числа

базидиомицетов, включая рода Strobilurus, Oudemansiella, Xerula, Hydropus,

Mycena, Filoboletus, Crepidotus и Cyphellopsis, а так же у аскомицета Bolinea

lutea и представляют собой производные β-метоксиакриловой кислоты

[18,19,20,70,182]. Они уже в очень низких концентрациях 10-7

-10-8

М

проявляют сильное противогрибное действие в отношении фитопатогенным

видам, что, в совокупности вместе с их низкой токсичностью по отношению

к млекопитающим и растениям, сделало их перспективными соединениями

как фунгицидов для сельского хозяйства [20].

Интенсивные исследования по изучению структуры природных

стробилуринов, которые представляют собой производные b-

метоксиакриловой кислоты позволили синтезировать фунгицидные аналоги с

более высокой стабильностью, эффективностью и более широким спектром

действия [27,52,197]. В 1999 году годовой объем продаж стробилуриновых

фунгицидов составлял около 10% мирового рынка фунгицидов, а сумма

выручки достигагла почти 600 миллионов долларов. В настоящее время на

мировом рынке имеются два стробилуриновых фунгицида: азоксистробины

из Zeneca, продаются как Amistar® для зерновых культур, Quadris® для

виноградных лоз и Heritage® для дерна. Азоксистробин, представляющий

один из ведущих мировых фунгицидов, зарегистрирован для применения на

55 культурах в 49 странах.

К сожалению, устойчивость к стробилуринам в популяциях грибов,

являющихся патогенами растений, была обнаружена уже спустя 2 года после

их появления на рынке, что, видимо, во многом обусловлено их достаточно

простой структурой [21,93]. Поэтому, для того чтобы лицензировать новый

24

препарат необходимо, чтобы он представлял собой смесь 2 и более

фунгицидов, имеющих разные механизмы действия. Это позволяет на

большее время избежать появление резистентности у патогенам к этим

фунгицидам [115].

Одной из самых перспективных групп грибов для поиска антимикотиков

являются грибы рода Trichoderma, из которых уже выделено достаточно

большое количество соединений, обладающих антигрибной активностью

(таблица 1).

Таблица 1 - Антибиотические вещества с антифунгальной

активностью, выделенные из грибов рода Trichoderma

Вид Метаболиты Путь биосинтеза или

класс химического

соединениия

T.harzianum Rifai 1969 1,2* Пентакетид

3,4 Октакетид


7,8 Неопределен

9 Аминокислотный путь

10-12 Аминокислотный путь

T.koningii Oudem. 1902 1 Пентакетид



13,14 Аминокислотный путь

15 Терпенойд

T.hamatum (Bonord.)

Bainier 1906

1 Пентакетид


13 Аминокислотный путь


T.viride Pers. 1794 1,2 Пентакетид


15,19 Терпенойд

T.longibrachiatum Rifai

1969

19 Терпенойд

T.polysporum Link) Rifai

1969


T.lignorum (=T.viride

Pers. 1794)


*- химические формулы представлены на рисунке 1

26

Рисунок 1 - Антибиотические вещества с антифунгальной активностью,

выделенные из грибов рода Trichoderma

Первыми, кто выделили соединения с антигрибной активностью из

гриба T. lignorum (Tode) Harz 1872 (в 1964 году идентифицированного как

Gliocladium, Webster и Lomas) были Вейндинг и Эммерсон [183]. Хотя

принято считать, что Денис и Вебстер (Dennis, Webster, 1932) были первыми,

кто описал, что грибы рода Trichoderma обладают антагонистическими

свойствами, в том числе и за счет синтеза антибиотиков с антифунгальной

активностью. [61,62].

Помимо перечисленных классов антибиотических веществ

непептидной природы, грибы способны к синтезу антибиотиков пептидной

природы, которые на данный момент представляют собой перспективную

группу поиска новых антимикотиков.

1.4 Нерибосомальные антимикробные пептиды грибов с

антифунгальной активностью и антибиотики на их основе

Нерибосомальные пептиды – соединения, синтез которых грибами

осуществляется энзиматическими комплексами без участия рибосом. Они

разнообразны по химическому строению (это низкомолекулярные пептиды,

27

дипсикептиды, пептидолактоны и липопептиды линейной, разветвленной

или циклической структуры) и биологическим свойствам [7,12,48].

Эти пептиды являются вторичными метаболитами, образуются в стадии

идиофазы, когда прекращается активный рост гриба, или при создании

специфических условий культивирования - добавлении предшественников.

Как правило, образование таких пептидов следует скорее рассматривать как

адаптацию к узкоспецилизированному образу жизни продуцентов, например,

морских симбионтов беспозвоночных животных [37,109], но, в основном,

факультативных или облигатных патогенов растений, микофильных или

энтомопатогенных грибов, занимающих некоторые специфические

экологические ниши.

Интерес к ним резко возрос в последнее время в связи с перспективами

использования для разработки лекарственных препаратов нового поколения

[12,33]. Они рассматриваются в качестве молекул-кандидатов, с помощью

которых можно преодолеть устойчивость к антибиотикам у патогенных

микроорганизмов, оболочечных вирусов и раковых клеток.

Классификация этих соединений основывается на пространственной

структуре пептидов. Биологически активные пептиды обладают составом со

сложной архитектурой, включающие циклические, разветвленные

циклические структуры и линейные молекулы, модифицированные

пептидными или непептидными аминокислотами [36,49,69,134]. Для их

описания даются физико-химические характеристики, источник

происхождения, размер молекулы, первичная структура, тип биологической

активности, механизм действия и синтеза.

Антимикробные пептиды грибов, за исключением неоифрапептинов,

продуцируются, в основном, тремя семействами: Hypocreaceae,

Clavicipitaceae, и Bionectriaceae порядка Hypocreales. Пептиды, выделенные

из грибов, имеют разнообразную структуру и обладают более выраженной

антифунгальной активностью, чем пептиды, выделенные из бактерий.

28

Публикации, сообщающие о выделении пептаибиотиков из базидиомицетов

следует рассматривать весьма критично, так как, в некоторых случаях

инфицирование плодового тела аско- или базидиомицета микопаразитами

может быть не видно невооружённым взглядом. По этой причине нельзя

исключать относительно недавнее инфицирование, что впоследствии может

привести к извлечению метаболитов из зараженного материала [57].

На сегодняшний день, 18 родов несовершенных грибов и грибов

аскомицетов были признаны в качестве продуцентов приблизительно 700

последовательностей (сиквенсов) пептаибиотиков. Большинство структур,

были обнаружены у представителей рода Trichoderma и его телеоморфы

Hypocrea, а также грибов родов Acremonium, Tolypocladium, Paecilomyces,

Emericellopsis и Sepedonium. Реже они встречены у видов из родов

Verticimonosporium, Stilbella, Mycogone, Mariannaea, Myrothecium,

Clonostachys, Culicinomyces, Cordyceps, Geotrichum и Dendrodochium. Вне

зависимости от числа попыток, предпринятых для перепроверки более

раннего сообщения о выявлении аминокислот в гидролизованных экстрактах

P.roquefortii Thom 1906 [44] и P. nalgiovense Laxa 1932 [41], пока не удаётся

подтвердить, что эти два вида являются продуцентами пептаибиотиков.

Грибные антимикробные пептиды имеют небольшой молекулярный

вес (500 – 1500 Да) и часто циклическую структуру, в их состав могут

входить кроме «белковых» и «небелковые» аминокислоты, а также

непептидные фрагменты, что обусловливает разнообразие синтезируемых

молекул [191].

Успехи в области геномики и протеомики грибов позволяют считать,

что разнообразие нерибосомальных пептидов грибов еще более высокое, чем

нам известно. Это объясняется тем, что в стандартных лабораторных

условиях у культур не экспрессируются многие гены, ответственные за их

синтез, штаммы не демонстрируют весь свой потенциальный спектр

29

биологической активности. Полагают, что в перспективе, возможно,

добиться активации многих из этих ''тихих'' кластеров генов.

Основные антимикробные пептиды грибов, их продуценты и мишени

представлены в таблице 2.

Таблица 2 - Основные АМП грибов, их продуценты и мишени

Пептиды Источник Структура Способ

действия

Организм-

мишень

Ссылка

Акулеацин Aspergillus

aculeatus

Iizuka 1953

Липопетид Синтез

глюкана

Candida

albicans (C.P.

Robin)

Berkhout 1923

157

Ауреобазидин Aureobasidiu

m pullulans

(de Bary and

Löwenthal) G.

Arnaud 1918

Циклический

депсипептид

Делокализа-

ция сборки

актина

Cryptococcus

neoformans

(San Felice)

Vuill. 1901

172

Эхинокандин

В

Aspergillus

nidulans

(Eidam) G.

Winter 1884

Липопептид Синтез

глюкана

Candida

albicans (C.P.

Robin)

Berkhout 1923

29

Хелиоферин Mycogone

rosea Link

1809

Липопептид Неизвестен Candida

albicans (C.P.

Robin)

Berkhout 1923

80

Лейциностатин Penicillium

lilacinum

Thom 1910

Аминолипо-

пептид

Неизвестен

Cryptococcus

neoformans

(San Felice)

Vuill. 1901

22

Мулунокандин Aspergillus

sydowii

(Bainier and

Sartory) Thom


глюкана

Aspergillus

niger Tiegh.

1867

153

Никкомицин Х Streptomyces

tendae

Пептидил

нуклеозид

Синтез

хитина

Coccidioides

immitis G.W.

Stiles 1896

84

Полиоксин D Streptomyces

cacaoi

Тринуклеозид

пептид

Синтез

хитина

Candida

albicans (C.P.

Robin)

Berkhout 1923

28

Пневмокандин Zalerion

arboricola

Buczacki 1972


глюкана

Candida

albicans (C.P.

Robin)

Berkhout 1923

71

Трихополин Trichoderma

polysporum

(Link) Rifai

1969

Аминолипо-

пептид

Неизвестен Candida

albicans (C.P.

Robin)

Berkhout 1923

171

30

Таблица 2 (продолжение)

Эхинокандины являются новым классом антимикотиков блокирующих

синтез (1,3)-β-D-глюкана – структурного и функционального компонента

клеточной стенки грибов с помощью неконкурентного ингибирования

фермента 1,3-β-D-глюкан-синтазы [60,131,132]. Этот селективный способ

действия по отношению к клеточным стенкам грибов приводит к

минимальной токсичности по отношению к клеткам человека. Известные

продуценты эхинокандинов: Glarea lozoyensis Bills and Peláez 1999 –

продуцент капсофунгина, A. aculeatus Iizuka 1953 - aкулеоцина А, Zalerionar

arboricola Buczacki – пневмокандина, A. syndosi var. mulundesis –

мулундокандина.

Природные эхинокандины обладают сильным гемолитическим

действием и высокотоксичны, поэтому они не применяются в медицине.

Эхинокандиновые метаболиты грибов, обнаруженные в 1970-х годах

послужили шаблоном для создания полусинтетических противогрибных

препаратов, используемых в клинической практике: каспофунгин

(Cancidas®) – первый утвержденный полусинтетический эхинокандин,

анидулафунгин (Eraxis®) и микафунгин (Mycamine®) [47]. Все три

лекарственных препарата одобрены для использования в лечении кандидоза

пищевода, кандидемии и других форм инвазивного кандидоза. Микафунгин

является единственным эхинокандином, лицензированным для

профилактики противогрибных заболеваний при трансплантации стволовых

WF 11899 B Coleophoma

empetri

(Rostr.) Petr.

1929


глюкана

Candida

albicans (C.P.

Robin)

Berkhout 1923

94

1907-II Penicillium

lilacinum

Thom 1910

Аминолипо-

пептид

Неизвестен Cryptococcus

neoformans

Vuill. 1901

154

1907-VIII Penicillium

lilacinum

Thom 1910

Аминолипо-

пептид

Неизвестен Cryptococcus

neoformans

(San Felice)

Vuill. 1901

154

31

клеток, а каспофунгин одобрен для эмпирической терапии фебрильной

нейтропении.

Полусинтетические препараты на их основе представляют собой

липопептиды, состоящие из больших циклических пептидов, связанных с

длинной цепью жирных кислот. Спектр активности эхинокандинов включает

виды родов Aspergillus (включая штаммы, резистентные к амфотерицину В),

Candida (в том числе изоляты резистентные к флуконазолу и итраконазолу),

они также обладают ингибирующим действием в отношении

родов Acremonium, Curvularia и Bipolaris, но не активны в

отношении представителей родов Cryptococcus, Scedosporium и Fusarium.

Склеротиды - циклические гексапептиды, образование которых

показано для галофильного штамма A. sclerotiorum G.A. Huber 1933 (Путянь,

Китай). Склеротиды ингибировали рост C. albicans при МИК 7.0 и 3.5 мкМ,

соответственно. Культивирование этого штамма на обогащенной

питательной среде и 10% содержанием соли позволило обнаружить 11

новых аспохрациновых циклотрипептидов - склеротиотидов A–K [202]. Эти

гексапептиды проявили антимикробную активность в отношении C. albicans

с МИК 7.5, 3.8, 30 и 6.7 мкМ, соответственно. Изолят A. unsulicola из образца

грунта, собранного у берегов Гавайев, продуцировал пресклеротиотид F

(302), N-деметилированное производное 62 склеротиотида F (296) [188,189].

Крисоспермины A-D из нового Вьетнамского штамма Xerocomus

langbianensis Dörfelt, Kiet and A. Berg bis 2004 (Boletaceae, Boletales) [64]. В

отличие от этого примера, в примерах [23,111,112] продуцирование

соответствующих пептаибиотиков тексеномицина, болетусина и тилопептина

было отнесено к извлеченным веществам плодовых тел. Вполне вероятно,

что произошло незамеченное инфицирование X. langbianensis Dörfelt, Kiet

and A. Berg bis 2004 с Sepedonium sp., которое и послужило причиной

обнаружения четырёх крисосперминов [99]. Впервые крисоспермины были

обнаружены у S. chrysospermum (Bull.) Fr. 1832 [65] – широкого

32

распространенного паразита грибов порядка Boletales [76]. Штамм

Coleophoma empetri (Rostr.) Petr. 1929 F-1899 продуцирует пептиды WF

11899 A, B, С, которые более эффективны в отношении C. albicans чем

флуконазол.

Ауреобазидины продуцируются Aureobasidium pullulans (de Bary and

Löwenthal) G. Arnaud 1918. Они практически не токсичны и обладают

высокой биодоступностью. Активны в отношении грибов рода Candida,

Cryptococcus neoformans (San Felice) Vuill. 1901, Blastomyces dermatitidis

Gilchrist and W.R. Stokes 1898 и Histoplasma capsulatum Darling 1906.

Ауреобазидин А обладает более широким спектром активности, чем

эхинокандины, флуконазол и амфотерицин В.

Лейциностатины А и В продуцируются P. lilacinum Thom 1910, а

лейциностатины D, H и K – Paecilomyces marquandii (Massee) S.Hughes 1951.

P. lilacinum так же продуцирует небольшие пептиды 1907-II и 1907-VIII,

структуры которых похожи на лейциностатины. Активны в отношении

C. albicans и С. neoformans, но, к сожалению, токсичны для клеток

млекопитающих.

Хелиоферины продуцируются Mycogone rosea Link 1809. Активны в

отношении C. albicans, но так же проявили тератогенное действие в

отношении эмбрионов млекопитающих.

Образование нового циклического гептапептида унгуизина E

установлено у штамма Aspergillus sp., выделенного из песка прибрежной

зоны Тайваньского пролива у города Сямынь (Китай) [59]. Соединение

является производным известного унгуизина A, с метилированным по CH2-

группе феналаланином. Унгуизин E ингибировал рост C. albicans в

концентрации 30 мкг/диск.

Пептаиболы и пептаибиотики (липопептаиболы,

липоаминопептаиболы, липоаминопептиды) представляют собой семейство

пептидных антибиотиков продуцируемых грибами. Количество

33

обнаруженных пептаиболов и пептабиотиков постоянно увеличивается. Они

обладают интересными физико-химическими и биологическими свойствами,

такими как антибактериальные, антигрибные, противовирусные [195] и

противопаразитарные [158]. Как правило, свойства антибиотиков зависят от

строения структур, например, формирующих поры в двухслойных липидных

мембранах. Так же имеются данные, подтверждающие ингибирование

митохондриальной АТФ и остановку окислительного фосфолирования,

проявление имуносупрессорных свойств [54,123,125,130,163], ингибирование

агрегации тромбоцитов [50], индукцию морфогенеза грибов и

нейролептические свойства [81,139,152,205]. Для некоторых из этих

соединений показана также противовирусная активность: они препятствуют

синтезу капсида вирусов таких как грипп А, везикулярный вирус стоматита,

ВИЧ. Перспективность исследования пептаиболов обусловлена тем, что к

ним практически не возникает резистентность у клеток-мишеней.

Пептаиболы и похожие на них пептиды (пептаибиотики)

продуцируются преимущественно грибами, в основном, почвенными

сапротрофами или патогенами растений. Микофилных продуцентов

пептаиболов можно обнаружить на плодовых телах или в их пределах аско-

или базидиомицетов. Большинство пептаиболов и пептаибиотиков были

выделены из несовершенных грибов, относящихся к родам Trichoderma,

Acremonium, Paecilomyces и Emericellopsis. Было сообщено об обнаружении

пептаиболов болетусин [111] и тилопептины А и B [112], выделенных из

нескольких плодовых тел базидиомицетов Boletus ssp. и Tylopilus neofelleus

Hongo 1967. Авторы утверждают, что сделали подобные выводы на

основании гомологи и выделенных структур с выделенными

крисосперминами A-D [65]. Однако, данные сообщения вызывают некоторые

сомнения, связанные с тем, что авторы не указывают был ли свежим (в

случае с Boletus spp.) или высушенным (в случае с Tylopilus neofelleus Hongo

1967) материал, используемый для экстракции. Информация о состоянии

34

материала для экстракции может указать на разложение или заражение

микофильными грибами.

Синтез пептаиболов осуществляется мультиэнзимными комплексами –

синтетазами, поэтому они являются продуктом нерибосомального синтеза.

Мультиэнзимный комплекс содержит различные амикослоты, карбонильные

остатки, гидроксильные остатки и другие предшественники, а каждая синтаза

продуцирует только один тип пептида. Сам процесс сборки пептаиболов

включает 3 последовательные стадии, выполняемые специфичными

доменами ферментов. На первой ступени сборки происходит активация

аминокислоты А-доменом за счет энергии АТР. Активированная

аминокислота прикрепляется тиоэфирной связью к PCP-домену и

транспортируется им. На 3 ступени синтеза С-домен формирует пептидную

связь между остатками аминокислот, каждая из которых прикреплена к PCP-

домену, и пептидной цепочкой, прикреплённой к предшествующему PCP-

домену. Сборка завершается только после того, как на C-конец прикрепиться

аминоспирт. При циклической структуре пептаибола образуется пептидная

связь между первым и последним остатками аминокислот. Таким образом,

пептаиболы представляют собой линейные, нерибосомальные пептиды,

содержащие от 5 до 20 аминокислотных остатков, а присоединение

различных ароматических остатков, как правило, происходит на C- и N-

концах цепи [113].

Механизм действия пептаиболов объясняется образованием пор в

мембране, через которые могут передвигаться вода, ионы и содержимое

самой клетки. На данный момент установлены 2 модели образования пор:

бочковая модель (barrel-stade model) и модель тороидальных пор (toroidal или

carpet model).

Бочковая модель. Пептид, связываясь с поверхностью мембраны,

формирует спираль. При этом он не погружается глубоко и вызывает

существенных изменений в самой структуре мембраны. Потом пептид

35

встраивается в мембрану и переходит в трансмембранное состояние.

Несколько таких пептидов и формируют канал (пору), который представляет

собой связанные параллельно α-спирали.

Модель торроидальных пор. Сначала пептид, связываясь с

поверхностью мембраны, формирует спираль. Существует предположение,

что пептид более глубоко встраивается в поверхность мембраны, чем в

бочковой модели. Такое связывание пептида с поверхностью мембраны

вызывает латеральное растяжение мембраны и уменьшение её толщины. При

этом пептид не переходит в трансмембранное состояние.

Пептиды, образующие поры по первому типу, как правило, более

активны, менее специфичны, а сами поры обладают более длительным

временем существования по сравнению с порами, образованными по второму

типу [51].

Один из самых известных пептаиболов - зервамицин IIB, продуцентом

которого является Emericellopsis salmosynnemata Grosklags and Swift 1957

[24].

Немного позже, были выделены из грибов рода Emericellopsis

зервамицины (Z1A, Z1C, ZII-3) с похожим спектром действия, как и у

зервамицина IIB. Известные зервамицины имеют следующие

аминокислотные последовательности: 1) Зервамицин IIB: Ace-Trp-Ile-Gln-

Iva-Ile-Thr-Aib-Leu-Aib-Hyp-Gln-Aib-Hyp-Aib-Pro-Pheol; 2) Зервамицин Z1A:

Ace-Trp-Ile-Glu-Iva-Val-Thr-Aib-Leu-Aib-Hyp-Gln-Aib-Hyp-Aib-Pro-Pheol; 3)

Зервамицин Z1C: Ace-Trp-Ile-Glu-Iva-Ile-Thr-Aib-Leu-Aib-Hyp-Gln-Aib-Hyp-

Aib-Pro-Pheol; 4) Зервамицин ZII-3: Ace-Trp-Val-Gln-Aib-Ile-Thr-Aib-Leu-Aib-

Hyp-Gln-Aib-Hyp-Aib-Pro-Pheol.

Наибольшую активность зервамицины проявляют в отношении

грамположительных бактерий, меньшую активность по отношению к

грамотрицательным бактериям, более низкую активность в отношении

36

некоторых представителей микроскопических грибов. При этом они не

проявляют токсических свойств по отношению к эукариотическим клеткам.

Похожим по спектру действия и структурой (аминокислотной

последовательностью) является пептаибол XR586, продуцируемый

Acremonium persicinum. Его аминокислотная последовательность: Ace-Trp-

Iva-Gln-Aib-Ile-Thr-Aib-Leu-Aib-Pro-Gln-Aib-Hyp-Iva-Pro-Pheol.

Установлено, что антибиотик антиамоибин продуцируется

Emericellopsis poonensis, E. synnematicola P.N. Mathur and Thirum. 1961,

Stilbella fimetaria (Pers.) Lindau 1905 и Cephalosporium pimprina [175].

Некоторыми другими авторами было показано, что подобные антиамоибину

антибиотики продуцируются Stilbella erythrocephala (Ditmar) Lindau 1900,

Stilbella fimetaria (Pers.) Lindau 1905 [40,41,42] и Gliocladium catenulatum J.C.

Gilman and E.V. Abbott 1927 [43]. Аминокислотная формула: Ace-

Phe*(Val,Leu)-Aib-Aib-Aib*(Iva)-Iva*(Aib,Val)-Glu-Leu-Aib*(Iva)-Aib-Hyp-

Gln-Iva*(Aib)-Hyp*(Pro)-Aib-Pro-Pheol. В природе синтез антиамоибина

играет решающую роль в колонизации субстрата, как это было недавно

продемонстрировано Лерхом с соавторами [114]. Учитывая, что антиамоибин

продуцируется, в основном, копрофильными видами, обитающими на

травоядном навозе, другие узкоспециализированные гипокрейные грибы,

занимающие данные экологические ниши, должны рассматриваться в

качестве дополнительных модельных систем для исследований способности

к биосинтезу пептабиотиков [114]. Первоначально антиамоибин

рассматривался как антипротозойное и противогельминтное лекарство [56].

В дальнейшем было показано, что антиамоибины, как и зервамицины,

активны в основном в отношении грамположительных бактерий и

незначительного количества микромицетов. Кроме того, они обладают

гемолитическими свойствами по отношению к эритроцитам человека [186].

Недавно, был изолирован штамм Mycogone cervina Ditmar 1817 A09–02

как паразит на Helvella (Paxina) acetabulum. Было показано, что штамм

37

продуцирует два пептаибола с 12 остатками аминокислот, оба антибиотика

имели новые для данной группы веществ соединения на N-конце - Ac-Leu

[57]. Установлено, что на С-конце цервинина I содержит леуол. Цервинин II

имеет ту же последовательность аминокислот, но его С-конец содержит

ацетилированный леуол [57]. Поскольку никаких основательных доводов не

было сделано в отношении ацетилирования С-конца цервинина II, нельзя

исключить, что С-конец цервинина I частично ацетилируется во время

работы с ним, таким образом, создавая цервинин II. Кроме того, авторы

данных сообщений заявили, что пептаиболы содержат исключительно L-

аминокислоты. Последнее их утверждение вряд ли правильное, так как в

работе были опубликованы и обсуждались ряд контрпримеров относительно

возникновения D-Iva в пептабиотиках [57]. Насколько известно, это первый

доклад об изоляции и установлении структуры вторичных метаболитов из M.

cervina Ditmar 1817. Удивляет ещё и тот факт, что до сих пор никто не описал

липоаминокислотные пептиды, выделенные из данного вида.

Липоаминопептиды - были выделены из австралийского изолята

Culicinomyces clavisporus Couch, Romney and B. Rao 1974 (Hypocreales,

Clavicipitaceae). Штамм LL-12I252 изолирован из личинок кусающейся

мошки Forcipomyia marksae (Diptera, Ceratopogonidae). Цулицинины

представляют собой липополипептидную цепь с 10 остатками аминокислот и

имеют ряд общих структурных особенностей: их N-терминальный конец,

представляющий собой остаток пролина, защищен бутановой кислотой

(ВТА), а в позиции 2 пептидной цепи обнаружена 2-амино-6-гидрокси-4-

метил-8-оксооктановая кислота (AHMOD).

На данный момент имеется подробная база пептаиболов

http://www.cryst.bbk.ae.uk/peptaibol, включающая сведения о 1043

соединений, из которых более 600 описано для разных видов рода

Trichoderma [207].

38

Основные продуценты рода Trichoderma и синтезируемые ими

пептаиболы представлены в таблице 3.

Таблица 3 - Основные продуценты грибов рода Trichoderma и

синтезируемые ими пептаиболы

Вид Пептиды Пример структуры Ссылка

Trichoderma

atroviride Bissett

1984

Атровиридины A-C Атровиридин А (1)* 45

Неоатровиридины Неоатровиридин А (2) 45

Trichoderma

asperellum Samuels,

Lieckf. and Nirenberg

1999

Трихотоксин А 501 Трихотоксин А 501 (3) 127

Trichoderma viride

Pers. 1794

Триходеценин I Триходеценин I (4) 73

Сузукациллин А Сузукациллин А (5) 104

Аламетицин F 50 Аламетицин F 50 (6) 128

Trichoderma

harzianum Rifai 1969

Трихокиндины I-X Трихокиндин IIIa (7) 90

Трихорзин HA I Трихорзин HA I (8) 87

Харзианины Харзианин HB I (9) 206

Trichoderma koningii

Oudem. 1902

Трихоконины I-III Трихоконин Ib (10) 167

Триконингины Триконингин KB I (11) 26

Trichoderma

saturnisporum

Hammill 1970

Парацельзин Е Парацельзин Е (12) 151

Сатурниспорины SA

II и IV

Сатурниспорин SA IV (13) 149

Trichoderma

longibrachiatum Rifai

1969

Лонгибрахины LGA

I-IV LGB II-III

Лонгибрахин LGB III (14) 110

Трихогин A IV Трихогин A IV (15) 25

Trichoderma

polysporum (Link)

Rifai 1969

Трихоспорины B III-

VI

Трихоспорины B V (16) 72

Циклоспорины B, D

и E

Циклоспорин D (17)

Циклоспорин E (18)

176

Trichoderma

pseudokoningii Rifai

1969

Псевдоконины KL Псевдоконин KL III (19) 150

Trichoderma reesei

E.G. Simmons 1977

Парацельзины A-C Парацельзин A (20) 39

Пептаиболы, продуцируемые штаммами рода Trichoderma, объеденены

в 4 подгруппы (1, 4, 5 и 9) в зависимости от количества аминокислотных

остатков. Подгруппа 1 (SF1) включает в себя примерно половину всех

известных структур с 18 - 20 остатками аминокислот. Структуры с 18

остатками аминокислот характерны для: трихозинов HA, MA и PA,

триховирина II, трихотоцина и трихокиндина. Синтезируются он в основном

39

штаммами вида T. harzianum Rifai 1969/Hypocrea lixii Pat. 1891; гипомуразин

B - Hypocrea atroviridis Dodd, Lieckf. and Samuels 2003; трихотоцин и

трихостроматицин – T. asperellum Samuels, Lieckf. and Nirenberg 1999.

Пептаиболы, содержащие 19 остатков – триконингин, трихостригоцин и

трихолонгин синтезируются T. stromaticum Samuels and Pardo-Schulth. 2000 и

T. strigosum Bissett 1992 [58,137]. Пептаиболы с 20 остатками аминокислот –

парацелзин продуцируется T. reesei E.G. Simmons 1977/Hypocrea jecorina

Berk. and Broome 1873, T. longibrachiatum Rifai 1969, T. citrinoviride Bissett

1984, T. pubescens Bissett 1992 и T. strictipile Bissett 1992; лонгибрахнин –

T. longibrachiatum и T. ghanense Yoshim. Doi, Y. Abe and Sugiy. 1987; и

аламетицин из T. hamatum (Bonord.) Bainier 1906, T. atroviride Bissett 1984 и

T. brevicompactum G.F. Kraus, C.P. Kubicek and W. Gams 2004.

Подгруппа 4 состоит из пептаиболов с количеством аминокислотных

остатков 11 или 14 [137]. В основном, пептаиболы из этой подгруппы

содержат 11 аминокислотных остатков: триховерин из T. viride Pers. 1794,

трихорзин и харзианин HBI из T. harzianum /Hypocrea lixii Pat. 1891,

харзианин HKVI из T. pseudokoningii, гипомурацин A из T. atroviride и

трихофумин A и B из Trichoderma spp.

Подгруппа 5 содержит 11 аминокислотных остатков и 9 подгруппа – 7

остатков. Ещё их так же называют липопептаиболы из-за липофильных

характеристик N-концевой группы. Синтезирует эти группы

T. longibrachiatum (трихогин), T. koningii Oudem. 1902 (триконингины),

T. polysporum (Link) Rifai 1969 (трихополины) и T. viride Pers. 1794

(триходеценины). Подгруппа 9 содержит всего несколько пептаиболов,

наиболее известный из них ˗ трихополин из T. polysporum.

У штамма АТСС 36042 (јCBS 391,92), который первоначально был

идентифицирован как T. atroviride [106], параллельное образование

гидролитических ферментов и противогрибных трихорзианинов А и В с 19

остатками запускается в присутствии клеточных стенок грибов – патогенов

40

растений [160]. Трихорзианины, как было показано ранее на формировании

ионных каналов в планарных липидных бислоях [129], обеспечивают

изменение проницаемости мембраны липосом, и трихорзианины активны в

отношении Rhizoctonia solani J.G. Kühn 1858 и рода Phythophthora - рака

древесины. На основании результатов была предположена модель того, как

пептаибиотики, такие как трихарзианины и гидролазы синергетически

взаимодействуют между собой: стенка клетки-хозяина расщепляется

ферментативно; после этого пептаибиотики проникают через клеточную

мембрану, формируя каналы, что снижает способность клетки хозяина

эффективно восстанавливать свою клеточную стенку. Ингибирование

синтеза хитина и β-глюкана, в дальнейшем, усиливает разрушительный

эффект хитиназы и β-1,3-глюканазы [117]. Присутствие пептаибиотиков

играет роль в индукции защитных реакций растений [181].

В последние десятилетия активно ищут продуцентов антибиотиков, как

антигрибных, так и с другим спектром активности, среди изолятов из

морских и пресноводных местообитаний, разлагающихся растительных

субстратов и эндофитов, ассоциантов беспозвоночных.

Морские виды рода Penicillium описаны как продуценты соединений с

противогрибной активностью: терпеноидов, пеницистеройдов и

поликетидов; фузариедина Е соответственно [74,77,89,161,142,177]. Штамм

Penicillium sp. TPU1271, выделенный из органических остатков,

прикрепленных к культивируемым устричным оболочкам, собранным на

глубине 10 м синтезировал два новых поликетида, содержащие блок α-пирон,

названные пеницироны А (1) и В (2. Так же из этого штамма были выделены

девять известных соединений: веррукозидин (3), фруктигенин А (4),

веррукофортин (5), цикло-L-триптофан-L-фенол (6), циклопенол (7),

циклопенин (8), пенипратинолин ( 9), асптерриновая кислота (10) и

виридикатол (11). Веррукозидин (3) показал зону ингибирования 11мм при

40 мкг на диск в отношении Mycobacterium smegmatis Trevisan 1889. Это

41

первое исследование, которое продемонстрировало, что веррукозидин (3)

активен против микобактерий [193]

Несколько классов соединений, с разнообразным антибактериальным и

противогрибным потенциалами, были изолированы из морских изолятов

вида A. niger. Такие антибиотики, как янутоны, действующие в отношении

C. albicans, могут быть перспективным источником антимикотических

препаратов. Четыре новых аналога янутонов (1-4) были выделены из

мицелиальных грибов A. niger. Структуры этих соединений были получены

на основе данных UHPLC-DAD-HRMS и одномерной и двумерной ЯМР-

спектроскопии. Маркировочные исследования с 13C8-6-метилсалициловой

кислотой определили три янутона класса I, происходящих из поликетида 6-

метилсалициновой кислоты (янутоны K, L и M (1-3)) и янутон класса II,

который был назван янутон X2 (4). Четыре новых соединения испытывали по

отношению к патогенным дрожжам C. аlbicans, и все они обладали

противогрибной активностью. Янутон X2 представляет собой первый пример

биоактивного янутона II класса, демонстрируя фармацевтический потенциал

этого класса [46].

Глубоководные грибы, выделенные из образца осадка, расположенного

на 2000 м ниже дна моря в Тайланде, были исследованы на антимикробную

активность. Такой скрининг с использованием 16 тест-организмов выявил

33% мицелиальных грибов, синтезирующих биологически активные

соединения в отношении патогенных бактерий и грибов. В зависимости от

изолята гриба, противомикробные соединения синтезируются только на

полутвердых или твердых средах и не синтезируются при использовании

жидких сред. Встречаемость изолятов, продуцирующих антимикробные

соединения, хорошо коррелирует со сложностью обитания (в перспективе

микробного богатства), так как антимикробные соединения с большим

эффектом действия были получены из штаммов, выделенных из

определенных слоев осадочных кернов. Штаммы, обладающие

42

противогрибной активностью относились к следующим родам и видам:

Penicillium bialowiezense K.M. Zaleski 1927 (CB_4, CB_5, CB_6, CB_7, CB_8,

CB_9 и CB_10), Sarocladium sр. (2H5-S0-P7 (2), 3H5-P3-P6 (1) и 5H3-M3-P2 ),

Fusarium oxysporum Schltdl. 1824 (4H1-P0-P1 (1) и 4H1-P3-P3) и Paecilomyces

sр. 1H3-M3-P1.

Было показано, что морские изоляты Paecilomyces из мангровых лесов,

продуцируют поликетиды, обладающие противогрибной активностью

[133,184]. Как известно, Sarocladium kiliense (Grütz) Summerb. 2011 и

Sarocladium оryzае (Sawada) W. Gams and D. Hawksw. 1976 синтезируют

терпеноиды и поликетиды, обладающие противогрибной активносью в

отношении фитопатогенных грибов [118] и С. аlbicans [155,178]. У морского

эндофитного штамма Sarocladium sр. была описана способность

ингибировать бактериальные сообщества и синтезирует биологически

активные соединения в отношении А. flavus [122].

Неочищенный экстракт гриба Fusarium oxysporum Schltdl. 1824

выделенный из донных образцов, собранного в Санчеоне Bay, Южная Корея,

проявлял in vitro антимикробную активность против устойчивых к

метициллину и резистентных ко многим лекарственным средствам

Staphylococcus aureus Rosenbach 1884 (MRSA и MDRSA). Толипоалбин

вместе с известной тетрамовой кислотой F-14329 (2) из гипокрейного

эндофитного гриба Tolypocladium album (W. Gams) Quandt, Kepler and

Spatafora 2014 TAMA 479 оказывал антимикробное действие в отношении

M. luteus, Escherichia coli Escherich 1885 и C. аlbicans при концентрации 40

μgml [13].

Иниатины (ENs) – группа антибиотиков, чаще всего продуцируемых

различными штаммами Fusarium, представляют собой шестичленные

циклические депсипептиды. Гриб Fusarium tricinctum (Corda) Sacc. 1886

выделеный из плодов Hordeum sativum продуцировал шесть EN

антибиотиков (А, А1, В, В1, В2 и Q). В дополнение к пяти известным ENs (А,

43

А1, В, В1 и В2) был идентифицирован новый аналог EN A и обозначен, как

EN Q. Противомикробное действие метанольных экстрактов гриба

F.tricinctum (Corda) Sacc. 1886, содержащих шесть ENs (А, А1, В, В1, В2 и

Q), испытано в отношении грамположительных и грамотрицательных

бактерий и грибов, а также была показана антималярийная активность при

значении IC50 410 μgml-1

.

Этилацетатные экстракты 96 штаммов из донных отложений

пресноводных озер были испытаны на антимикробную активность в

отношении Alternaria tagetica S.K. Shome and Mustafee 1966, Bacillus subtillus

(Ehrenberg 1835) Cohn 1872, C. albicans, Colletotrichum gloeosporioides (Penz.)

Penz. and Sacc. 1884, Fusarium oxysporum Schltdl. 1824, St. aureus.

Антимикробным эффектом обладали в отношении хотя бы одной тест-

культуры 78 грибных экстрактов, а широкий спектр активности был

обнаружен у 53% из них. Среди них количество идентифицированных видов

относилось к родам (данные представлены в порядке убывания): Fusarium

(13), Cladosporium (4), Acremonium, Beltrania и Volutella. В общей сложности

19 экстрактов из культур Acremonium pseudozeylanicum W. Gams 1975,

Gliocladium penicilliodes Corda 1840, Gliocladium sp., Penicillium citrinum

Thom 1910 показали наибольший диаметр зон ингибирования в отношении

бактерий и дрожжей (MIC = от 50 до 200 мкг/мл). Длительное

противогрибное действие было характерно для Beltrania rhombica Penz. 1882,

Fusarium sр. XH1Ga, и шести неидентифицированных штаммов (TA53, TH34,

2TA2, 2TA6, 2TS6, 2XA7). Среди них изоляты Alternaria sp. TH1, Beltrania

rhombica Penz. 1882, Stagonospora sр. TA34, неидентифицированные штаммы

TA53, 2TA7 и TS23 показали широкий спектр активности, включающий

грамположительные и грамотрицательные бактерии, дрожжи и некоторые из

фитопатогенов грибов. Gliocladium sр. TH16 и неидентифированный штамм

2TS6 остановливали рост S. aureus при концентрации 200 мг/мл. Результаты

MICs в случае грам-отрицательных патогенов установлены только для P.

44

citrinum Thom 1910 и изолята 2TS4, проявляющих ингибирующее действие

на X. campestris (200 мг/мл) [75].

Так, в исследованиях 61 изолята грибов с различной морфологией

колоний, изолированных из 440 участков ткани (236 листьев, 152 стеблей и

52 корней) растительной биомассы T. purpurea. Из 61 штамма 59 были

определены до родов, таких как Chaetomium, Zopfiella, Fusarium,

Purpureocillium, Arthrinium, Nigrospora, Eurotium, Aspergillus, Penicillium,

Neosartorya, Talaromyces, Alternaria, Curvularia, Leptosphaerulina, Bipolaris и

Periconia. Из выделенных штаммов, только 9,84% были активны в

отношении одного или более индикаторных патогенных грибов [198].

Ophioceras leptosporum (S.H. Iqbal) J. Walker 1980 MFLU 10-0281 и

Fusicoccum aesculi Corda 1829 MFLU10-0260 проявляли максимальную зону

ингибирования 15 ± 1 мм и 11 ± 1,6 мм против S. aureus TISTR 1466 и

C. albicans 1923TISTR 5779, соответственно. Эти грибы также известны как

биодеструкторы листового опада Magnolia liliifera [96].

Виды родов Akanthomyces и Gibellula порядка Hypocreales, класс

Sordariomycetes, отдел Ascomycota. описаны как паразиты моли или пауков,

за исключением А. johnsonii - сапротрофного гриба, в то время как виды рода

Gibellula являются облигатными паразитами пауков [88,156,180]. Сорок пять

образцов Akanthomyces и десять Gibellula были илледованы на наличие

противомикробных соединений. В общей сложности было протестировано

165 неочищенных экстрактов (концентрация 200 мг/мл), полученных из 55

изолятов грибов – патогенов беспозвоночных. Двадцать один (12,73%)

экстракт из 16 (29,09%) изолятов (13 изолятов Akanthomyces и 3 изолята

Gibellula) обладают антимикробной активностью в отношении по меньшей

мере одного тестируемого штамма. Экстракты показали наибольшую

активность в отношении S. aureus ATCC 25923 (8,48%), затем C. neoformans

ATCC 90112 (3,03%), C. neoformans ATCC 90113 (2,42%), P. marneffei

45

(2,42%), M. gypseum (1,21%), C. аlbicans АТСС 90028 (1,21%), P. aeruginosa

АТСС 27853 (0,61%) и E. сoli АТСС 25922 (0,61%) соответственно [185].

Итак, среди грибов – продуцентов антимикотиков, и, в частности,

нерибосомальные пептиды, позволяющие преодолевать

резистентоустойчивость патогенов к существующим антибиотикам,

перспективными таксонами для поиска новых соединений являются согласно

проведенному анализу преимущественно представители аскомицетов. Далее,

в последние годы фармацевтические компании ориентированы на

исследование веществ с молекулярным весом не выше 1500 Да. Это

обусловлено тем, что их удобно химически модифицировать и получать на

их основе лекарства, применяемые перорально. В эту группу биологически

активных соединений попадают и мембранно-активные пептиды с невысокой

молекулярной массой. Интерес к ним вызван их довольно высокой

специфичностью, структурным и функциональным разнообразием и

способностью эффективного действия на резистентные к антибиотикам

клетки. Ряд пептидных антибиотиков грибных продуцентов, открытых в 70 -

80-е гг прошлого столетия, успешно используется в клинике уже более 20

лет.

1.5 Подходы скрининга и идентификации грибных антибиотиков

Несмотря на достижения в области комбинаторной химии в период с

1981 по 2006 годы только около 30% от утвержденных антимикробных

препаратов, а также 22,2% от утвержденных противоопухолевых препаратов

имели синтетическое происхождение [138]. С 2000 по 2006 годы около 50%

от принятых для лечения новых лекарственных средств составляли

природные соединения. Учитывая прошедший промежуток времени, можно

предположить, что число натуральных соединений возрастает до 70%,

46

включая природные соединения, лекарственные препараты на их основе или

подобные природным препаратам.

Основным способом получения антибиотиков по прежнему является

культивирование микробных продуцентов в условиях, способствующих

наилучшему выходу целевого продукта, с последующим выделением и

химической очисткой препаратов. Этот подход часто сопровождается

биологической или химической трансформацией антибиотика, с целью

улучшения их биологических свойств и способен обеспечить создание новых

эффективных лекарственных препаратов. Знание химической структуры

антибиотика позволяет в ряде случаев осуществить синтез соединения

химическим способом, однако подавляющее большинство антибиотиков

производится микробиологическим путем. Однако главным способом

получения новых соединений, по-прежнему, является поиск их продуцентов

в природе, что позволяет микроорганизмам, в том числе, микроскопическим

грибам, оставаться важнейшим неисчерпаемым источником антибиотиков.

В поисковой работе используются методологические приемы,

позволяющие наиболее полно раскрыть потенциальные возможности

микробных продуцентов. Проводимый при этом комплекс включает:

1. Выделение микроорганизмов из природных мест обитания,

2. Культивирование продуцентов, приводящее к накоплению ими

биологически активных соединений

3. Выделение и химическую идентификацию микробных метаболитов

4. Выявление характера их биологического действия (типирование).

В силу непомерно большого объема исследований практически

невозможно осуществлять тотальную проверку всех выделяемых в процессе

поисковых работ микробных метаболитов. Для выявления среди них

веществ, обладающих биологическим действием, позволяющим

рассматривать их в качестве потенциальных лекарственных средств,

необходим целенаправленный отбор, в основе которого должно быть ясное

47

представление о конечной цели – создании препарата с определенной

биологической активностью. В процессе поиска и выделения вторичных

метаболитов внимание акцентируется не только на описании химически

новых групп веществ, но и на поиске соединений из известной группы, уже

зарекомендовавшей себя как эффективные соединения для лечения

заболеваний. Методология поиска стремится учесть такие факторы, как

механизм действия препарата, его принадлежность к определенному классу

химических соединений, особенности биосинтеза, потенциальную

биологическую роль в физиологии микроорганизма – продуцента.

За последние семь десятилетий, открытие и поиск новых соединений с

антибиотическими свойствами сильно эволюционировали. Если в течение

первых 30 лет стратегии отбора были относительно простыми, то затем они

становились все более разнообразными, сложными и ускоренными. В

настоящее время, недорогое секвенирование генома микроорганизмов

открыло совершенно новые стратегии для открытия новых вторичных

метаболитов, обладающих лекарственной ценностью. Следует отметить, что

усилия по открытию новых антибиотиков со стороны фармацевтической

промышленности в течение последних десяти лет снизились.

В первый тридцатилетний период после обнаружения пенициллина и

гризеофульвина, основным методом поиска являлся систематический

последовательный фенотипический скрининг почвенных микроорганизмов

против патогенных бактерий, что привело к открытию актиномицина,

стрептомицина. Это побудило фармацевтические компании начать скрининг

среди экстрактов грибов новых соединений с разными типами активностей

(противоопухолевой, имунносупресорной и антигрибной).

В течение первых 30 лет для открытия новых антибиотиков следовали

парадигме: (1) фенотипический скрининг, (2) изоляция соединения и его

структурные характеристики, (3) в некоторых случаях модифицирование

действия активности, (4) доклиническая разработка, и, в случае успеха, (5)

48

клинические испытания и коммерциализация. Усилия были направлены,

прежде всего, на обнаружение антибактериальных и противогрибных

соединений. Таким образом было выявлено более 1000 новых соединений

различной химической природы, которые обладали антибактериальной или

противогрибной активностями. Десятки из них, в конечном счете,

утверждены в качестве лекарственных средств, большинство из которых, или

их второе, третье или четвертое поколение - это полусинтетические

производные, использующиеся сегодня.

Дальнейшее совершествование получения антибиотиков велось по

принципу подбора условий и сред для культивирования продуцентов,

совершенствования панелей тест-организмов и методов экстракции

биологически активных соединений. В некоторых случаях, продуктивный

штамм подвергали мутагенезу и селекции для увеличения титра активных

соединений на ранней стадии с использованием химических или физических

мутагенных факторов. Перспективные продуценты использовали в опытно-

промышленной установке биореактора для получения большего количества

материала для выделения и структурной характеристики, и их дальнейшей

оценки.

Всего компании, институты и научно-исследовательские лаборатории

по всему миру, занимавшиеся скринингом в период с 1950 по 2000 год,

исследовали около 10-20 миллионов изолятов. Несомненно, многие из

наиболее распространенных видов были обследованы много раз многими

компаниями, кроме того для этого периода была характерна низкая

пропускная способность за счет несовершенных методов изоляции и

культивирования продуцентов.

Методы для скрининга антибиотической активности у

микроорганизмов резко изменились за последние 50 лет, а процессы,

используемые для их выделения, а также для извлечения и очистки

натуральных метаболитов претерпели лишь незначительные изменения.

49

Высокоскоростные шейкеры, способные обеспечивать достаточную аэрацию,

позволяющую актиномицетам расти в микротитровальных пластинах [126],

заменили потребность в культивировании во флаконах на шейкере.

Использование ядерно-магнитного резонанса [38] и масс-спектрометрии [83]

в химических анализах ускорили и упростили определение структуры

сложных антибиотиков. Масштабирование же культивирования продуцентов

остается, в основном, неизменным.

В течение второго периода, открытие новых антибиотиков в процессе

скрининга продолжались. Мы не можем точно указать количество

обнаруженных новых природных соединений в этот период, но число

патентных заявок, поданных во всем мире, превысило 1300 [101]. Тем не

менее, менее двух десятков новых новых веществ, их полусинтетические или

полностью синтетические производные, которые были обнаружены в течение

этого периода, были использованы в качестве лекарственных средств [170].

Единственный новый антибактериальный антибиотик, обнаруженный во

второй 30-летний период и прошедший клинические испытания, был

даптомицин, а эхинокандины ˗ единственный класс новых противогрибных

лекарственных средств, рекомендованных в клиническую практику.

В течение 1990-х годов были разработаны комбинации методов химии

(или комбинаторной химии), существенно облегчившие научную работу по

идентификации уникальных соединений из сотен химических компонентов.

Большинство фармацевтических компаний либо приобретали или

разработали свои собственные библиотеки "комби-ХИМ", диапазон которых

насчитывал от 5*105 до 4*10

6 соединений. Кроме того, прогресс в области

робототехники вместе с развитием изучения связывающих рецепторов на

основе анализов ферментов позволяет компаниям пропускать эти библиотеки

через несколько «экранов» с высокой пропускной способностью

одновременно. Для обработки большого количества материала были сделаны

и просеяны смеси, содержащие известные соединения; смеси, образующие

50

"хиты", были подвержены деконволюции в последующих стадиях скрининга.

При этом культивирование продуцентов практически не изменилось.

Перспектива достаточно быстрого скрининга бесконечного количества

известных соединений по сравнению с низкой пропускной способностью

фенотипичного скрининга небольшого количества компонентов, которые

неизвестно содержат или не содержат антибиотики, была слишком заманчива

для фармацевтических компаний. К середине 1990-х годов, большинство

фармацевтических компаний в США и Европе прекратили скрининг

натуральных метаболитов. Исключение составила Novartis, которая

продолжает скрининг метаболитов среди различных таксономических групп

организмов [159].

В период между серединой 1990-х до середины 2000-х годов миллионы

соединений подвергали скринингу с целью применения в областях,

связанных с метаболическими, иммунологическими и инфекционными

заболеваниями, раком, нейронарушениями и болезнями сердечно-сосудистой

системы. Но пока эти усилия не привели к обнаружению очень качественных

соединений, и до настоящего времени на их основе нет никаких одобренных

лекарств.

Микроорганизмы с большими геномами способны кодировать

несколько SMGCS, большинство из которых остаются неизвестными, и

многие из которых, по всей видимости, кодируют новые Sms. С помощью

недорогого секвенирования генома можно подойти к изучению неизвестных

путей синтеза вторичных метаболитов. Этими новыми кластерами генов

можно будет управлять с помощью генетических и физиологических

манипуляций у микроорганизмов-продуцентов или в гетерологичных

хозяевах.

В «золотую эру» антибиотиков продуценты, в основном, выделяли из

образцов почв, но со временем исследования почвенных грибов начали

выявлять всё меньше новых соединений. Теперь внимание исследователей

51

обращено на другие альтернативные источники, включая морские

микроорганизмы [34,143,148] и эндофитные грибы растений [16,98,190,199]

и микроорганизмы, выделенные из экстремальных местообитаний (кратеры

вулканов, засоленные почвы и т.п.).

Эндофитные грибы, которые коэволюционировали в течение

миллионов лет с их эукариотическими хозяевами, высшими растениями,

представляют собой важный ресурс новых вторичных метаболитов. До 80%

исследуемых эндофитных грибов продуцируют соединения, обладающие

антибиотическим действием в отношении патогенных микроорганизмов или

опухолевых клеток. В последнее десятилетие, примерно половина

антибиотиков из вновь обнаруженных метаболитов грибов (около 5000

соединений) были выделены из эндофитных штаммов [53,108,164,194].

Микроорганизмы, живущие в уникальной обстановке и экстремальных

условиях, например, шахтные озера и пустыни, также могут быть

перспективными исходными источниками метаболитов.

Мало изученные морские экосистемы могут представлять собой

резервуар новых биологически активных молекул для разработки новых

препаратов. Согласно многочисленным исследованиям [85,145,200,201] до

38%-59% тестируемых экстрактов морских грибов обладают

антибактериальной и/или противогрибной активностью. Доминирующие

представители с антимикробным действием были среди родов Aspergillus и

Penicillium.

Кроме морских грибов, интерес могут представлять также грибы

пресноводных озер и заболоченных территорий.

К настоящему времени все больше лабораторий занимаются поиском и

изучением антибиотиков продуцентов, выделенных из экстремальных

экониш. В течение последних 10-12 лет было выделено более 20 000

соединений, полученных из морских микроорганизмов, и более 30 000

новых, полученных из эндофитов растений. Многие из этих новых

52

соединений, структурно очень похожи на уже открытые антибиотики

микроорганизмов. Некоторые из них уже продаются или находятся в стадии

клинических испытаний. Эта направленность является перспективным

направлением при поиске источников новых природных антибиотиков.

Как сами морские животные (хозяин), так и их симбионты -

микроорганизмы и эндофитные микроорганизмы, обитающие вместе с

высшими растениями, представляют собой практически нетронутый

резервуар новых биологически активных метаболитов. Эти взаимодействия

очень сложны, и их детали менее изучены.

Разнообразие метаболитов ассоциированных с губками морских грибов

также пока слабо изучено, но в последние годы все больше информации

появляется об их антимикробном потенциале. Шестьдесят пять изолятов

собранных из губок на острове Кинг-Джордж (Антарктика), принадлежащих

к родам Geomyces, Penicillium, Epicoccum, Pseudeurotium, Thelebolus,

Cladosporium, Aspergillus, Aureobasidium, Phoma и Trichocladium были

описаны продуценты антимикробных соединений [119].

Исследование грибов, выделенных из растительных остатков или

мертвых растительных материалов, также является интересной

альтернативой гумусовых горизонтов почв для поиска новых биологически

активных соединений [66].

В последние годы с целью поиска новых БАВ стали активно

использовать методы метагеномики для учета метаболического разнообразия

некультивируемых микроорганизмов. Однако необходима разработка

подходов, позволяющих использовать некультивируемые микроорганизмы.

Внедрение новых современных междисциплинарных подходов в

исследования является абсолютным требованием. В дополнение к

исчерпывающему скринингу БАВ у новых видов и изолятов симбионтов и

паразитов морских организмов и эндофитов высших растений, манипуляции

с биосинтетическими возможностями уже имеющихся продуцентов

53

представляют практически неограниченные возможности для нового

открытия метаболитов. Биосинтетический потенциал уже открытых

продуцентов далек от полной его эксплуатации. Знания и современные

методы генетики, молекулярной биологии, биологической химии и

биотехнологии, информатики и нанотехнологий могут быть использованы

для обнаружения новых антибиотиков и раскрытия потенциала

биоразнообразия микроорганизмов [35,187].

Существует несколько стратегий по увеличению метаболического

разнообразия продуцентов, которые включают новые методы

культивирования, варьирование сред культивирования (возможно со-

культивирование или культивирование смешанных культур) и использование

мутасинтеза (биосинтеза направленного предшественника). Эти методы были

продуктивны для получения гибридных молекул макролидов,

аминогликозидов и гликопептидов. Новые уникальные методы скрининга и

ферментации продуцентов - ингибиторов биосинтеза жирных кислот привели

к новым перспективным соединениям, таким как платенсимицин.

Комбинированнные биосинтетические подходы были использованы для

прямой ферментации новых антибиотиков, таких как производные

эпирубицина и эритромицина.

Преимуществами натуральных метаболитов являются их структурное

разнообразие, несколько хиральных центров, а также их высокая активность,

селективность и несколько способов действия. Многоцентровые лиганд-

белковые взаимодействия натуральных метаболитов обеспечивают

функциональное разнообразие и селективность в отношении более чем одной

цели. Их совместимость с клетками - хозяинами, препаративные структуры

гарантируют разнообразные эффекты. Возможная «наводка» между

микроорганизмами и клетками-хозяевами с помощью метаболитов

микроорганизмов привела к открытию многих противоопухолевых и

антивирусных соединений. Есть случаи, когда один метаболит проявляет до

54

10-15 различных типов активностей из-за наличия нескольких сайтов

связывания с клетками хозяина. Недостатками природных метаболитов

является то, что их масштабирование является проблематичным, экстракты

продуцентов всегда содержат смесь веществ, делая изоляцию необходимых

соединений достаточно сложным процессом.

В последнее десятилетие получение генов биосинтетическими путями,

диверсификация библиотек натуральных метаболитов, модификация с

помощью химических или генетических методов известных природных

антибиотиков – вот наиболее эффективные способы поиска новых

химиотерапевтических препаратов. Натуральные метаболиты обладают

многими благоприятными свойствами. Иногда необходимы незначительные

изменения растворимости, стабильности и свойств поглощения для

модификации базовой структуры.

Одна из самых сложных задач - найти подходящие молекулы, которые

отвечают всем требованиям к эффективности антибиотиков: Биодоступность

- переносятся через мембрану (ы) и связываются с мишенью (мишенями).

Препараты должны связываться с простетической группой (группами)

мишени. Преимущественной целью является действительные,

негипотетические (как в HTC) сайты с несколькими связями (ферментные

системы).

Усвоение и транспорт - доступ к желаемому патогену или органу и

эффективного проникновения во внешние барьеры клеток (на различные

мембраны). Взаимодействие лекарственных мишеней и хозяина - препараты

должны обладать определенным действием без действия на другие органы,

действовать конкретно на мишень без каких-либо нежелательных побочных

эффектов или токсичности, и быть стабильными и устойчивыми по

отношению к окружающей среде в хозяине. Большинство проблем,

связанных с синтетическими и HTS-производными соединениями,

заключаются в отсутствии большинства из этих требований. Кроме этого

55

рыночный препарат должен соответствовать следующим трем требованиям:

доступная стоимость, специфичность и низкая токсичность.

Поиск и ранняя идентификация природных соединений,

ориентированные на химические характеристики препаратов, их

принадлежность к определенным классам химических соединений, т.е.

проведение так называемого химического скрининга существенно повышают

эффективность поисковых работ.

В настоящее время существует 94 миллиона соединений,

депонированные в реестре CAS и по 15 000 добавляются каждый день; 80

миллионов из них являются органическими соединениями, не связанными с

ионом металла, и молекулярной массой тела <1500 Дa. Использование

антибактериального фильтра 8 (<1200 Да) дает 29 миллионов соединений с

теоретическим потенциалом антибактериальной активности, при этом более

половины из них (15,5 миллиона) имеют потенциал благодаря академической

химии [120].

Итак, грибы остаются важнейшим источником антибиотиков,

обладающих принципиально новой структурой, и поиск их продуцентов

среди грибных изолятов не исчерпал себя и требует дальнейшего развития.

Огромное разнообразие метаболитов, выделенных и обнаруживаемых

ежегодно из культивируемых грибов, большой потенциал неизвестных

грибных организмов, позволяют считать, что многие продукты

перспективные для медицины жизнедеятельности, остаются неоткрытыми.

В ближайшие годы можно ожидать, что при целенаправленном

скрининге не только из среди известных, но и слабо изученных таксонов

грибов, а также штаммов, выделенных из необычных и необследованных

местообитаний и регионов, будут обнаружены продуценты новых

антибиотиков. Соответственно, требуются обширные коллекции изолятов

грибов, определение в каких биотопах и какие таксоны наиболее

перспективны для скрининга.

56

ГЛАВА 2. Объекты и методы исследования

2.1 Объекты

Для проведения скрининга микроскопических грибов с

антибиотическми свойствами, главным образом, высокой антимикотической

активностью, использовали штаммы из коллекции кафедры микологии и

альгологии биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова

(выделены А.В. Кураковым, В.С. Садыковой, А.В. Александровой,

Е.Н. Биланенко, М.Л. Георгиевой) и свежевыделенные изоляты из почв

разных типов, растительных субстратов, грунтов и некоторых других

объектов.

Антимикотическая активность была проверена у 914 штаммов, из них

201 были коллекционными штаммами и 713 - свежие изоляты. Перед

первичным тестированием большинство свежевыделенных культур было

идентифицировано по культурально-морфологическим признакам до рода

или вида, коллекционные штаммы были ранее – до вида.

Скрининг штаммов с антимикотической активностью базировался на

двух принципах. Отбирали микромицеты различных таксонов отдела

Ascomycota, причем акцент был сделан на порядках Eurotiales, Hypocreales,

как одних из наиболее перспективных по данным литературы, и также были

включены представители порядков Onygenales, Pleosporales, Sordariales,

Capnodiales, Coniochartiales, Chaetospaeriales, Microascales, Helotiales, Incertae

sedis.

При изоляции грибов, как и при отборе из коллекций, учитывали их

источник выделения. Использовали образцы почв и других объектов,

характеризующиеся физико-химическими параметрами, при которых

способны функционировать многие виды грибов, так и - из экстремальных

местообитаний (например, засоленных и щелочных почв и грунтов и т.д.).

Выделение проводили из верхних горизонтов почв (подстилки, гумусового

57

или пахотного горизонтов) зонального ряда из-под различных фитоценозов:

разлагающихся травянистых и древесных остатков, плодовых тел грибов,

поверхности живых растений, зеленых мхов, семян, поврежденных книг,

торфяных горизонтов олиготрофных почв и верховых торфяников,

примитивных почв на вечной мерзлоте, выветренных горных пород,

засоленных и щелочных грунтов и почв (таблица 4). Образцы были отобраны

из регионов с разным климатом - от умеренного холодного до

субтропического и тропического и с различной степенью гидроморфного

режима (от мелкозема выветренных пород до торфяных слоев болот).

Таблица 4 - Почвы и другие объекты, из образцов которых выделены

штаммы микроскопических грибов для первичного скрининга

Почва Природная зона/ Экосистема

Регион

Примитивные, торфяные почвы, мелкозем

Тайга/Лиственничные леса и торфяные болота с карликовой березой, выходы горных пород

Якутия, Оймяконский район, Кюбюме

Торфяно-болотные олиготрофные почвы и верховые торфяники

Тайга (верховые болота)

Тюменская обл., Нижневартовский р-н, Тверская обл. (ЦЛГЗ)

Дерново-подзолистая почва Зона южной тайги ( ельники, смешанные леса, косимые луга, картофельное поле), Зона хвойно-широколиственных лесов (березняк)

Тверская обл., Центрально-лесной государственный заповедник; Москва, Ботсад МГУ на Ленинских горах

Выщелоченный чернозем

Лесостепь (агроценоз, зерно-пропашной севооборот, пшеничное поле

Воронежская обл., Рамонский район, ВНИИСС им. А.Л.Мазлумова

Типичный чернозем Лесостепь (залеж) Воронежская обл., Каменная степь, ВНИИСХЧЗ

Обыкновенный чернозем Лесостепь (агроценоз) Липецкая обл., Полибино Торфяные, подзолистые, дерново-подзолистые, серые лесные и черноземные почвы)

Тундра, лесотундра, все зоны тайги, лесостепь, островные участки спепи, (тундровые, лесные ценозы, агроценозы, лесные питомники)

Красноярский край,Тыва и Хакассия

Каштановая и темно-каштановая почвы

Степь (разнотравная целина, залеж, агроэкосистемы)

Ростовская обл. и Волгоградская обл.

Южный чернозем и темно-каштановая почва

Степь (разнотравная и полынная степь), культурные слои археологических раскопок

Краснодарский край, Таманский полуостров, район Фанагории

58

Таблица 4(продолжение) Коричневая почва Выветриваемые карбонатные породы

Субтропики (лесные экосистемы - дуб, фисташка, можжевельник, сосна)

Крым, Карадахский заповедник

Андосойл на вулканических породах

Субтропики (лесные ценозы)

Португалия, о.Мадейра

Ферраллитные почвы Тропические леса Вьетнам Песчаные пустынные почвы Пустыня Турмения Засоленные и щелочные почвы и грунты

Степная зона (засоленные почвы и грунты побережья содовых озер)

Забайкалье, Западная Сибирь, Монголия

Засоленные грунты и ризосфера и корни солянки

Степная зона (побережье засоленного озера)

Крым, Феодосия, Сиваш

Соровые солончаки и засоленные песчаные грунты

Полупустыня и пустыня Казахстан, полуостров Бузачи

Содержимое личинок и взрослых короедов, буровая мука, копролиты и содержимое дождевых червей

Южная тайга и хвойно-широколиственные леса

Московская обл.

Разрушающаяся книга - Москва, библиотека МГУ Воздух лаборатории - МГУ имени

М.В.Ломоносова Поверхность стены во внутреннем помещении

- Нижегородская обл., г.Саров

Разрушающаяся поверхность штукатурки, кирпича, камня (известняк)

- Москва, Новодевичий монастырь

Плодовые тела базидиомицетов

Тайга (лесные ценозы) Красноярский край

Семена растений (культурных злаков)

Тайга (лесные ценозы, питомники, агроценозы)

Красноярский край

Сфагнум и другие зеленые мхи

Верховое болото Тверская обл., ЦЛГЗ

Разлагающиеся растительные субстраты (древесина разной степи разложения)

Тайга (лесные и луговые ценозы)

Тверская обл., ЦЛГЗ,

Московская обл.,

Красноярский край

Поверхность растений (кедровый стланик, полынь якутская и др.)

Тайга (лиственничные леса и луга)

Якутия, район Оймякона

2.2. Методы исследования

2.2.1 Методы выделения чистых культур грибов

Метод водно-почвенных разведений. Для выделеия грибов были

использованы стандартные лабораторные методы. Выделение микромицетов

59

производили из последовательного ряда десятикратных разведений с

последующим посевом на твердые среды: Чапека, сусло-агар [5].

Посев мелкоземом. Высев почвы непосредственно на агаризованные

среды заключался в высеве небольших почвенных частиц на питательную

среду. Для этого 10— 15 комочков почвы размером ≤ 1 мм стерильным

пинцетом равномерно, на расстоянии 1—2 см друг от друга, наносили на

поверхности среды.

2.2.2 Оценка антимикотической активности микромицетов и

первичный отбор штаммов

Отбор штаммов в процессе изоляции чистых культур. В процессе

изоляции чистых культур были отобраны штаммы в качестве потенциальных

продуцентов антибиотиков, вокруг которых визуально образовывались зоны

подавления.

Метод блоков. Отбор штаммов, обладающих антимикотической

активностью, производили с помощью метода диффузии антибиотических

веществ в агар по Н.С. Егорову [4]. Поверхность питательного агара засевали

тест-культурой, после чего на агаризованную среду раскладывали блоки

тестируемого штамма грибов. Затем чашки помещали в термостат при

температуре 25-28ºС и просматривали через 5 суток, на наличие блоков,

вокруг которых образовались зоны задержки роста тест-организма.

Высокоактивными считали культуры, у которых зона задержки роста

микроорганизма составляла 25 мм и более, умеренно активными культурами

считались с зоной задержки роста 10-25 мм и слабоактивными с зоной менее

10 мм. В качестве тест-культур для первичного скрининга использовали

A. niger 2K.

Метод распыления из почвенных образцов. Выделение

антибиотически активных чистых культур грибов из почвенных образцов

осуществляли также по методике, предложенной М. Кавагучи с соавторами

60

[97]. Для этого с помощью мелкого распылителя предварительно

инокулировали поверхность агаровой пластинки тест организмом (A. niger)

с титром 5 до 10 КОЕ/мл в количестве 40 мкл на чашку, затем на агаровую

поверхность наносили почвенные частицы. Инокулированные таким образом

чашки инкубировали при 27°С в течение 2-х суток. Затем отсевали все

грибные культуры, показавшие антагонистический эффект (угнетение роста)

на тест-организм.

2.2.3 Проверка продукции штаммами антигрибных соединений в жидкой

среде и вторичный отбор штаммов с высокой антибиотической

активностью

2.2.3.1 Оценка антибиотической активности методом дисков

Отобранные в результате первичного скрининга активные штаммы

микромицетов культивировали на жидкой стандартной средах Чапека,

Сабуро и Сусло.

Посев культур осуществляли в качалочные колбы Эйрленмейера

объемом 750 мл с объемом питательной среды 250 мл и предварительным

внесением посевной (маточной) культуры (2% от объема питательной

среды).

Для показавших высокую активность отобранных методом блоков и

распыления штаммов микромицетов проводили оценку фунгицидной и

антибактериальной активностей экстрактов культуральной жидкости (КЖ) и

мицелия методом дисков при выращивании на жидких средах.

Экстракцию антибиотических веществ из культуральной жидкости

проводили рекомендуемым для выделения из КЖ реагентов - этилацетатом в

соотношении 1:1. Полученные экстракты упаривали в вакууме на роторном

испарителе «Rotavapor-RBǘchi» (Швейцария). Полученные экстракты

61

упаривали в вакууме досуха, сухой остаток растворяли в водном 60% этаноле

и получали спиртовые концентраты 1:100.

Мицелий штаммов экстрагировали 70 % этиловым спиртом в

соотношении 3:1 в течении 24 часов, затем надосадочную жидкость

упаривали в вакууме на роторном испарителе «Rotavapor-RBǘchi»

(Швейцария). Полученные экстракты упаривали в вакууме досуха, сухой

остаток растворяли в водном 60% этаноле и получали спиртовые

концентраты 1:100.

Тест-объектами для оценки фунгицидной активности были штаммы

патогенных мицелиальных и дрожжевых микроскопических грибов A. niger

INA 00760, C. albicans АТСС 2091, C. tropicalis INA 00763 и условно-

патогенных микромицетов – 8 видов рода Aspergillus: A. oryzae 1К, A. niger

2К, A. fisheri 3К, A. terreus 4К, A. fumigatus 5К, A. ustus 6К, A. flavus 7К,

A. nidulans 8К, а так же на 4 видах токсигенных Penicillium: P. nalgiovense,

P. roqueforti 233Р, P. commune 27Р, P. chrysogenum 30Р и для оценки

эффективности использования мицелия в отношении возбудителей болезней

растений использовали использовали 2 вида рода Fusarium: F. oxysporum

890, F. solani 9K.

Спектр антибактериального действия изучали с использованием в

качестве тест-культур штаммы грамположительных бактерий – на 3 видах

Bacillus: B. subtillus АТСС 6633, B. coagulans 429, B. mycoides 537 и на

штаммах: Micrococcus luteus NCTC 8340, S. aureus FDA 209P, а так же на

грамотрицательных бактериях E.coli ATCC 25922.

Стерильные бумажные диски пропитывали экстрактами из КЖ и

мицелия и высушивали в стерильных условиях. Контролем служили

стандартные диски с амфотерицином В («НИИ Пастера», 40 мкг/мл) и

ампициллином («НИИ Пастера», 10 мкг/мл). Величину диаметра зоны

подавления роста тест - культур изучаемыми штаммами оценивали на 2-e

сутки (для бактерий), и на 5-7 сутки (для грибов). Полученные результаты

62

интерпретировали следующим образом: 0 мм – активности нет; до 10 мм –

слабая чувствительность; от 10 до 25 мм – средняя чувствительность; 25 мм и

более – высокая чувствительность.

Для сравнительной оценки активности штаммов использовали

коэффициент антибиотической активности, который рассчитывали по

формуле:

Ка =

где Ка – коэффициент антибиотической активности гриба, мм;

А – сумма диаметров зон подавления тест-объектов, мм;

К – количество тест-объектов.

В результате вторичного скрининга было отобрано 9 культур,

обладающих максимальной антибиотической активностью: T. asperellum (2

штамма), T. gamsii (2 штамма), T. citrinoviride (1 штамм), T. harzianum (2

штамма), T. viride (1 штамм), T. koningii (1 штамм).

2.2.4 Молекулярно-генетическая идентификация выделенных

штаммов, активных продуцентов антибиотических веществ

Для отобранных штаммов, которые ранее были определены по

культурально-морфологическим методам до рода, определяли видовую

принадлежность с помощью полимеразно-цепной реакции.

Выделение ДНК. Суспензия гриба, разведенная в 700 мкл СТАВ-буфера

прогревалась при 65˚С в течение 1 часа. После прогрева к смеси добавляли

500 мкл хлороформа и центрифугировали в течение 10 минут при скорости

13000 об/мин. После центрифугирования из пробирки отбирали 500 мкл

надосадочной жидкости, добавляли 500 мкл хлороформа и повторно

центрифугировали в течение 10 минут при скорости 13000 об/мин. К

полученному супернатанту добавляли 400 мкл изопропанола и 60 мкл 5М

ацетата калия, опять центрифугировали при условиях, описанных выше.

63

Выпавший осадок ДНК дважды промывали охлажденным 70%-ным этанолом

и ресуспендировали в 100 мкл деионизированном воды.

Постановка ПЦР. Для серотипироваия ПЦР были использованы

праймеры, представленные в таблице 5.

Таблица 5 - Праймеры, использованные в работе

Название Последовательность ДНК Ссылка Температура

отжига

Регион ITS5 – ITS4 ядерных рибосомных генов

ITS5

ITS4

5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'

5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'

White et al., 1990

White et al., 1990 58

Рекомендованная методика предполагает постановку ПЦР с

электрофоретическим разделением продуктов амплификации в агарозном

геле.

ПЦР проводилось по следующей схеме: в пробирку добавляли смесь,

содержащую буфер 10x PCR buffer (поставляется в наборе с Taq-полимеразы

«Helicon») – 2,5 мкл; 25mM Mg² (входит в состав буфера) – 2 мкл; Taq-

полимеразу, 5U/ml – 0,5 мкл; dNTP mix – 2 мкл; праймер 1 – 0,4 мкл; праймер

2 – 0,4 мкл; деионизированную воду – 19,5 мкл; раствор ДНК – 1 мкл.

Амплификацию проводили на приборе «Biometra T1» по следующей схеме:

95˚С – 3 минуты (1 цикл); 94˚С – 40 секунд/72˚С – 60 секунд (25 циклов);

72˚С – 3 минуты (1 цикл).

Детекция продуктов амплификации проводилась в 1,2% агарозном

геле, содержащим этидил бромид. После электрофореза гели анализировали

в УФ свете.

Подготовка к секвенированию. Подготовка осуществлялась по

следующей схеме: к вырезанным фрагментам геля, помещенным в

микроцентрифужную пробирку, добавляли равный объем связывающего

буфера; инкубировали 10 минут на водяной бане при 60°C с периодическим

перемешиванием содержимого до расплавления геля; смесь переносили в

64

спин-колонку и инкубировали 2 минуты при комнатной температуре;

центрифугировали в течение 1 минуты при 13000 об/мин; вносили в колонку

500 мкл отмывочного раствора и центрифугировали 15 секунд при

13000об/мин; повторно добавляли 500 мкл отмывочного раствора и

центрифугировали 1 минуту при 13000 об/мин; переносили колонку в чистую

пробирку и вносили 30-50 мкл буфера для элюции, после чего

центрифугировали 30 секунд при 13000 об/мин

Секвенирование ДНК. Секвенирование ДНК проводилось в компании

«Евроген» с помощью набора реактивов BigDye®Terminator v3.1 Cycle

Sequencing, с последующим анализом продуктов реакции на автоматическом

секвенаторе ДНК AppliedBiosystems 3730 xl. При секвенировании

использовались те же праймеры, с помощью которых проводилась

амплификация исследуемого участка. Чтение каждой последовательности

проводили 2 раза – с прямого и обратного праймеров [121].

2.2.5 Определение спектра усваиваемых соединений активными

продуцентами антимикотиков

Спектр определяли с целью установления для 9 отобранных штаммов

рода Trichoderma метаболических свойств: T. аsperellum Mg-6, T. аsperellum

30, T. сitrinoviride TYVI 4/11, T. harzianum М99/51, T. koningii TCL-06,

T. gamsii 282, T. harzianum 313, T. gamsii 314, T. viride 346.

С помощью Biolog FF MicroPlate проводили оценку утилизации 95

различных субстратов. FF Database содержит информацию о 400 таксонов

грибов, относящихся к 120 родам.

Само тестирование выполнялось в 5 этапов [165]:

1) Выращивание чистой культуры гриба на 2% Мальт Экстракт Агаре

(номер в каталоге Biolog 71106) до тех пор, пока не будет

достаточное количество конидий для приготовления суспензии

65

2) Снятие конидий с поверхности агара и суспензирование в

инокулируемую жидкость со специально подобранной плотностью

(номер в каталоге Biolog 72106)

3) Пипетирование 100 мл суспензии в каждую точку планшета Biolog

FF MicroPlate (номер в каталоге Biolog 1006)

4) Инкубирование планшета при 26˚С в течении 24-96 часов

5) Считывание информации с планшета с помощью Biolog MicroStation

Reader, начиная с 24 часового культивирования.

2.2.6 Оптимизация выхода антибиотика для штамма

Trichoderma сitrinoviride TYVI 4/11 ВКПМ F-1228

В качестве основного продуцента был отобран штамм Т. сitrinoviride

ВКПМ F-1228, продуцирующий антибиотик, обладающий широким

спектром действия.

Питательная среда Сабуро оказалась оптимальной среди стандартных

сред для выхода антибиотика, поэтому дальнейшие работы по изучению

антибиотической активности штамма проводили с её использованием.

Для определения оптимальной температуры культивирования

производили посев методом укола на стандартную среду Сабуро в чашках

Петри и оставляли в термостатах при различных температурах. Рост и

морфологию штамма T.citrinoviride ВКПМ F-1228 изучали на 1 – 5 сутки в

диапазоне от 0˚С до +35˚С, образование антибиотика контролировали на 7,

10 и 14 сутки.

Для определения оптимального значении рН штамм выращивали

поверхностным способом, с использованием стандартной питательной среды

Сабуро с разным диапазоном рН от 5,0 до 9,0. После культивирования из КЖ

получали экстракт и проверяли антибиотическую активность методом

дисков. Все используемые методы являются стандартными и описаны выше.

66

Для определения оптимального способа культивирования, выращивали

штамм поверхностным, комбинированным и глубинными способами. Для

глубинного культивирования культуры выращивали на качалке при 200 об/с

в течение 10 и 14 суток. Для комбинированного способа 5 и 7 суток

выращивали на качалке, а затем стационарно 5 и 7 суток, а для

поверхностного способа стационарно в качалочных колбах в течение 10 и 14

суток.

Твердофазное культивирование проводили на вермикулите. При

культивировании на вермикулите использовали частицы твердого субстрата

диаметром 5 мм. В колбу со стерильным твердым субстратом добавляли

суспензию клеток штамма Т. сitrinoviride ВКПМ F-1228, полученную

методом смыва со скошенного агара, и культивировали в течении 14 суток.

Затем добавляли стерильной воды для экстракции с твердого субстрата

антибиотических веществ и использовали в качестве сырья для экстракции.

Антибиотические свойства экстрактов оценивали методом диффузии в агар

на дисках.

Мембранно-жидкостное культивирование штамма проводили на

мембранных фильтрах фирмы Millipore размером 25мм/0,45 um в течении 14

суток. Экстракцию антибиотических веществ проводили из культуральной

жидкости.

Оптимизацию среды Сабуро была проведена по источникам азота и

углерода на выход антибиотиков у штамма Т. сitrinoviride ВКПМ F-1228 по

методу полного факторного эксперимента [2].

Таблица 6 - Матрица значений полного факторного эксперимента

№ экспериментальной

пробы

Вариации шагов х1 Вариации шагов х2

1 12,5 3,125

2 7,5 3,125

3 12,5 1,875

4 7,5 1,875

67

В качестве источников углерода и азота выбрали глюкозу и пептон.

Исходные шаги для глюкозы были следующие: х1= 10 г на 1 литр, а для

пептона х2 = 2,5 г на 1 литр. Полученные значения представлены в таблице 6.

Таким образом, количественное содержание компонентов

варьировалось от 30 до 50 грамм глюкозы и от 6 до 14 грамм пептона на литр

среды.

Штамм выращивали поверхностным способом в течение 14 суток.

Антибиотическую активность определяли методом диффузии в агар с

бумажных стерильных дисков и подсчитывали коэффициент

антибиотикоактивности для выбора лучшего варианта состава среды.

2.2.7 Выделение и изучение свойств антибиотических веществ,

продуцируемых штаммом Trichoderma сitrinoviride ВКПМ F-1228

Экстракция КЖ. Экстракцию антибиотических веществ из

культуральной жидкости штамма проводили органическими

растворителями: этилацетатом (3:1) и бутанолом (1:1) при 55С в течение 1.5

ч. Полученные экстракты упаривали в вакууме на роторном испарителе

«Rotavapor-RBǘchi» (Швейцария). Полученные экстракты упаривали в

вакууме досуха, сухой остаток растворяли в водном 60% этаноле и получали

спиртовые концентраты. Во всех фракциях – маточниках (исходной

культуральной жидкости), спиртовых концентратах, осадке и мицелии

определяли антимикробную активность методом дисков [8].

Прямофазная хроматография. Для разделения на фракции экстрактов

использовали так же хроматографическую колонку. В качестве сорбента на

колонку наносили силикагель Kieselgel 60 (40-63 мкм), а элюирование

осуществляли хлороформом с последующим увеличением процентного

содержания метанола в хлороформе. На выходе собирали элюаты, которые

подвергались тестированию на антимикробную активность методом дисков

68

на тест-культурах. Контролем выхода антибиотического вещества являлась

тсх. Активные элюаты были упарены в вакууме досуха и растворены в 3 мл

60% этанола. Элюант номер 2 являлся активной антибиотической фракцией

данного штамма [10].

Тонкослойная хроматография. Для определения веществ, находящихся

в экстракте, использовали метод тонкослойной хроматографии. Сначала

наносили капилляром испытуемый образец на пластину DCAlufoilien

Kieselgel-60 (“Merck”, Германия) размером 15х15 см с тонким слоем

силикагеля и помещали системы в сосуд, на дне которого содержался слой

элюента. Были протестированы различные элюенты для ТСХ:

хлороформ:метанол (20:1;9:1;7:1;4:1;3:1), хлороформ:этанол (20:1),

хлороформ:изопропанол (20:1), хлороформ:этилацетат (20:1), этилацнтат,

этилацетат:гексан (1:1), этилацетат:метанол (3:1),

хлороформ:метанол:вода:уксусная кислота (65:25:4:3). Наиболее

оптимальной оказалась система хлороформ:метанол (3:1). Сосуд

герметизировали для избежания испарения летучего элюента с поверхности

пластинки при хроматографировании. После того, как линия фронта

достигала достаточной для анализа высоты, пластинку извлекали и

высушивали. Для определения расположения веществ на пластинке

использовали различные методы: поглощение в ультрафиолетовом свете и

визуализация на пластинке с флуоресцентным индикатором F254, а так же

применяли растворы различных кислот или окислителей, при нагревании с

которыми вещества образуют коричневые или чёрные пятна. В качестве

таких растворов испозовали нингидрин и фосфомолибденовую кислоту [10].

Биоавтография фракций экстракта КЖ. Биоавтографию выделенных

фракций проводили с использованием в качестве тест-организма B.subtillus

АТСС 6633 и A. niger INA 00760. Для этого полученные при тсх пластины

помещали на агаровую поверхность квадратных чашек Петри с

предварительно засеянным тест-организмом. По прошествии 15 минут

https://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%9A%D0%B8%D1%81%D0%BB%D0%BE%D1%82%D0%B0

https://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%9E%D0%BA%D0%B8%D1%81%D0%BB%D0%B8%D1%82%D0%B5%D0%BB%D1%8C

69

пластины убирали, чашки помещали в термостат при температурах 37ºС и

28ºС для бактерий и грибов соответственно. Через сутки для бактерий и 5

суток для грибов смотрели наличие зон отсутствия роста тест-организма.

Определение молекулярных масс соединений в активной фракции

экстракта КЖ. Молекулярные массы активных соединений в выделенной

фракции определяли на масс-спектрометре Ultraflex II MALDI ToF/ToF

“BrukerDaltoniсs” (Германия), оснащенном УФ лазером 355 нм (Nd) в режиме

получения положительных ионов с использованием рефлектрона. На мишени

смешивали по 1 мкл раствора образца и 0.3 мкл раствора 2.5 -

дигидроксибензойной кислоты с концентрацией 10 мг/мл в 20%-ном

ацетонитриле с 0,5%-ной трифторуксусной кислотой и полученную смесь

высушивали на воздухе. Точность измеренных молекулярных масс

соединений во фракции составляла 0,001 % [68].

Обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография

(ОФ-ВЭЖХ). ОФ-ВЭЖХ анализ и разделение активных фракций после

прямофазной хроматографии проводили на полупрепаративной колонке Luna

C18 100A размерами 250×10 мм (Phenomenex, США) в линейном градиенте

увеличения концентрации подвижной фазы, создаваемый элюентом А (0,1%

трифторуксусная кислота (ТФУ) в воде MQ) и элюентом В (80% ацетонитрил

c добавлением 0,1% водной ТФУ) при скорости потока 2,5 мл/мин. Для

ВЭЖХ использовали ацетонитрил фирмы «Panreac» (Испания).

Детектирование разделяемых веществ осуществляли при длине волны

247 нм в градиенте концентрации элюента В: 16-28% за 12 мин; 28-55% за 27

мин;; 55-75% за 20 мин и 75-85% за 10 мин с последующим изократическим

элюированием в течение 25 мин. Полученные в ходе ОФ-ВЭЖХ-анализа

фракции, соответствующие отдельным пикам, были собраны вручную [6].

Схема выделения и очистки антибиотических веществ у штамма

Т. сitrinoviride ВКПМ F-1228 представлена на рисунке 2.

70

Рисунок 2 - Схема выделения и очистки антибиотических веществ

штамма Т. сitrinoviride ВКПМ F-1228

Культивирование штамма Т. сitrinoviride Bissett 1984

ВКПМ F-1228 поверхностным способом 14 суток

Сбор культуральной жидкости(кж) Сбор мицелия

Экстрагирование КЖ этилацетатом (1:3) 1,5 часа Экстрагирование этанолом 24 часа

Получение экстрактов Получение экстрактов

Тонкослойная хроматография на пластине Kieselgel-60

Прямофазная колоночная хроматография с использованием в качестве

адсорбента силикагель Kieselgel 60, а элюента – метанола в хлороформе

Биоавтография на тест-штаммах Bacillus subtillus АТСС 6633 и Aspergillus niger INA 00760

ОФ-ВЭЖХ для получения отдельных фракций антибиотических веществ

MALDI масс-спектрический анализ активной фракций

Концентрирование в вакууме досуха на

роторном испарителе

Водно-спиртовой экстракт Водно-спиртовой экстракт

71

2.2.8 Определние токсичности активной фракции штамма Trichoderma

сitrinoviride ВКПМ F-1228

Для определения токсичности активной фракции использовали

биотестирование на клетках млекопитающих, а именно сперматозойдов

молодого быка. Сперма быка, замороженная в жидком азоте, производится в

соответствии с ГОСТ 26030-83 на станциях искусственного осеменения.

Хранится и транспортируется в сосудах Дьюара, наполненных жидким

азотом. Срок хранения неограничен.

С этой целью использовали анализатор токсичности типа АТ (далее –

анализатор). Принцип работы анализатора основан на подсчете подвижных

сперматозоидов с использованием объектива микроскопа, компьютера,

программ распознавания подвижных клеток, управления и вычисления

индекса токсичности. Устройство термостатирования обеспечивало

нахождение растворов при постоянной температуре (40 +/- 1,5) °C, а

устройство перемещения кювет обеспечивало проведение испытаний в

автоматическом режиме. Для приготовления растворов использовался блок

пробоподготовки, представляющий собой сухой термостат с набором гнезд

для пробирок. В качестве кювет для помещения образцов использовали

капилляры, Для настоящей методики экспериментально установлены

следующие нормативные интервалы величины индекса токсичности: 80% <=

I <= 120% - образец нетоксичен, I < 80%, I > 120% - образец токсичен.

Для определения индекса токсичности сравнивали опытный и

контрольный растворы. В качестве контрольного раствора выбрали глюкозо-

цитратную среду (глюкоза - 4 г, цитрат натрия - 1 г, дистиллированная вода -

100 мл). Контрольная среда одновременно являлась разбавителем для

оттаивания замороженной спермы. Опытным раствором являлся испытуемый

образец, доведенный до изотонии сухими реактивами глюкозы и цитрата

натрия (глюкоза - 4 г, цитрат натрия - 1 г, испытуемый раствор -100 мл).

72

Контрольный и опытный растворы по 0,4 мл помещали в пробирки с

притертыми пробками и ставили в устройство термостатирования.

Далее оттаивали замороженную сперму. Для этого дозировали в

пробирку разбавитель согласно паспорту на сперму быка и помещали ее в

устройство термостатирования. Охлажденным до температуры жидкого азота

анатомическим пинцетом извлекали из сосуда Дьюара гранулу спермы и

опускали ее в пробирку с нагретым разбавителем. Через каждые 1 - 2 минуты

содержимое пробирки перемешивали легким встряхиванием. Через 5 - 6

минут в пробирке образовалась маточная суспензия сперматозоидов.

Затем в пробирки с контрольным и опытным растворами помещали по 0,1

мл маточной суспензии сперматозоидов. Рабочие образцы переносили в

кюветы. Для уменьшения случайной ошибки для каждого рабочего образца

использовали выборку из 3 - 5 кювет. Кюветы устанавливали в

кюветодержатель, который помещали в анализатор токсичности. Запускали

процесс регистрации зависимости количества подвижных клеток от времени

для рабочих контрольного и опытного образцов. Процессы, происходящие в

кюветах, контролировались визуально на мониторе.

По истечении времени, когда сперматозоиды визуально уже не были

подвижными, прибор отключали и считали индекс токсичности по

полученным данным [11].

2.2.9 Определение цитотоксической активности активной фракции

Trichoderma сitrinoviride ВКПМ F-1228

Цитотоксическую активность фракции штамма Т. сitrinoviride ВКПМ

F-1228 оценивали на 2-х линиях опухолевых клеток: Сolo 357 – клетки

панкреатической карциномы и Т3М4 ‒ клетки рака печени. Для этого линии

клеток культивировали в монослойных культурах во флаконах или

планшетах на среде DMEMв термостате при температуре 37ºС с подачей СО2.

73

В среды добавляли фетальную бычью сыворотку (FBS) 8%, L-глютамин, 300

мкг/мл, ампицилин/стрептомицин (50 мкг/мл), 2-меркаптоэтанол (5х10Е-5М).

Для анализа цитотоксичности активной фракции штамма использовали

тест с метил-триазолтетразолием (МТТ) (Sigma). МТТ-тест используется для

анализа цитотоксичности потенциальных противоопухолевых соединений

в эксперименте и основан на способности дегидрогеназ живых клеток

восстанавливать неокрашенные формы 3-4,5-диметилтиазол-2-ил-2,5-

дифенилтераразола (МТТ-реагента) до голубого кристаллического

формазана, растворимого в диметилсульфоксиде. Клетки вносили в

количестве по 30 тыс. на лунку в плоскодонный 96-луночный планшет, в

котором заранее титровали культуральные фильтраты штаммов. Линии

клеток инкубировали в СО2-инкубаторе 72чи в последние 4 часа добавляли

250 мкг/мл МТТ-реагента. По окончанию инкубированиянадосадочную

жидкость убирали, а в лунки добавляли по 100 мклдиметилсульфоксида

(Реахим, Москва) для растворения формазана. Окрашивание клеток

анализировали на планшетном спектрофотометре (Titertek, UK), при длине

волны 540 нм. Цитотоксическую активность оценивали по индексу

ингибирования, рассчитывали по формуле (Iинг=ОП эксперим/ОП контроль) * 100 %

[32].

2.2.10 Обработка данных и повторности

Повторность в опытах не менее 3-х кратной. Данные обрабатывали с

помощью программ Statistica 10.0.

74

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

ГЛАВА 3. Распространенность среди микроскопических грибов

способности к образованию антимикотиков и отбор активных

продуцентов

3.1 Общая оценка антимикотической активности грибных культур

Оценка проявления среди микроскопических грибов антимикотической

активности проведена у 713 свежевыделенных и 201 коллекционной

культуры методом блоков в отношении тест-культуры A. niger 2K. Из них

120 штаммов были выделены в посевах с использованием метода распыления

по поверхности питательного агара тест-организма и 63 штамма, колонии

которых в традиционных посевах проявляли антагонистические свойства

(подавляли рост колоний других видов, расположенных в непосредственной

близости) (рисунок 3).

Рисунок 3 - Антимикотическая активность чистых культур грибов

Всего для оценки распространения способности к продукции

антигрибных соединений было протестировано 914 чистых культур

микроскоскопических грибов. Среди них 288 штаммов принадлежало к

порядку Eurotiales, 197 – Hypocreales и 41 штамм к другим таксонам отдела

75

Ascomycota. 388 изолятов не принадлежали к вышеуказанным таксонам, и

так как среди них не было высоко активных продуцентов, дальнейшую их

идентификацию не проводили.

Всего среди исследованных 914 штаммов высокой антимикотической

активностью в отношении тест-культуры обладали 2%, умеренной

антимикотической активность – 38%, слабой активностью - 59% и было

незначительное количество неактивных штаммов – 1% от общего числа

изученных штаммов.

3.2 Антимикотическая активность микроскопических грибов,

выделенных из почв различных природных зон

Проанализирована распространённость среди изученных культур

способности к синтезу антимикотических веществ в зависимости от

природной зоны. Высокоактивные культуры обнаружены в таежной,

степной и лесостепной, субтропической и тропической природно-

климатических зонах, и их доля от протестированных изолятов составляла

8%, 3% и 1%, соответственно. Доля умеренно активных и слабоактивных

культур к одному тест-организму A. niger 2K, от общего числа изолятов из

образцов различных экотопов таёжной зоны составляло 32% и 60%,

соответственно, степной/лесостепной зон – 40% и 57%, в субтропиках и

тропиках – 24% и 75% (таблица 7).

В целом, доля умеренно активных штаммов достигает около трети, а

слабоактивных - порядка 65% от общего числа проверенных изолятов из всех

природных зон. То есть способностью к образованию антигрибных

соединений обладают подавляющее большинство изолятов независимо от

природных зон. Значительных различий по количеству высокоактивных и

умеренно активных культур из разных природных зон не обнаружено. Это

можно объяснить тем, что для сравнения таких обширных природных зон

необходима большая выборка штаммов из сходных местообитаний.

76

Таблица 7 – Антимикотическая активность микроскопических грибов,

выделенных из почв различных природных зон

Природная

зона

Общее

число

штамм-

мов

Из них

Неактив-

ные

Слабоaк-

тивные

Умеренно

активные

Высокоак-

тивные

Таежная 96 0(0%)* 57(60%) 31(32%) 8(8%)

Степная /

лесостепная

262 0(0%) 150(57%) 104(40%) 8(3%)

Тропическая /

Субтропичес-

кая

274 0(0%) 207(75%) 65(24%) 2(1%)

* - доля штаммов от общего числа, выделенных из экотопов данной природной

зоны, в %

3.3 Антимикотическая активность микроскопических грибов из разных

экотопов

Проведена оценка антимикотической активности грибных изолятов из

различных экотопов. Установлено, что высокоактивные штаммы были

выделены из почв зональных типов (верхних гумусовых горизонтов почвы) и

разлагающихся растительных субстратов, торфяных горизонтов и мхов. Их

число составляло 3% и 3% от общего количества изолятов из этих

местообитаний, соответственно. Среди штаммов, выделенных из

разлагающихся растительных остатков, выше, чем среди изолятов из других

экотопов, были те, что проявляли и умеренную антигрибную активность.

В образцах из местообитаний, которые характеризуются

экстремальными условиями (высоким содержанием солей, рН, инсоляции,

низкими температурами, большими перепадами температур)

высокоактивных штаммов не было выявлено. Подавляющее число изолятов

из этих экониш (61%) характеризовались слабой антимикотической

активностью или ее не проявляли к тест-объекту A. niger 2K (таблица 8).

77

Таблица 8 - Антимикотическая активность микроскопических грибов

из разных местообитаний

Местообитания Общее

число

штаммов

Из них

Неактивные* Слабоaктивные Умеренно

активные

Высокоактив-

ные

Почвы

зональных

типов (верхние

гумусовые

горизоты, А1 и

Апах)

569 0(0%)** 346 (60%) 209 (37%) 14(3%)

Разрушающиеся

растительные

субстраты,

буровая мука,

торфяные

горизонты и

мхи

135 0(0%) 72(53%) 59(44%) 4(3%)

Экстремальные

местообитания

(солончаки,

засоленные и

щелочные

грунты и

почвы,

поверхность

горных пород и

стен каменных

сооружений)

210 4(2%) 129(61%) 77(37%) 0(0%)

* - Неактивные – зона подавления 0 мм; Слабоактивные – зона подавления 0-10 мм;

Умеренно активные – зона подавления 10-25 мм; Высокоактивные – зона подавления

более 25 мм

** - в процентном соотношении по отношению к общему числу штаммов из данной

группы местообитания

Итак, для поиска высоко активных продуцентов антимикотиков

перспективными являются экониши, богатые органическим веществом

(растительные остатки и верхние гумусовые горизонты, торфяные почвы,

буровая мука). Они характеризуются высоким видовым разнообразием

грибов и в них чаще возникают ситуации, благоприятные для их развития,

что, по-видимому, обусловливает возникновение тесных взаимодействий и

конкуренции, одним из механизмов которой является продукция

78

антибиотических веществ. Использование образцов экстремальных

местообитаний для выделения культур с сильным антимикотическим

действием не представляется столь успешным, по крайней мере, при

использовании в качестве тест-организма широко распространенного в

разных почвах и растительных остатках микромицета A. niger. И это вполне

согласуется с общим экологическим представлением, что для организмов,

обитателей экониш, экстремальных по физико-химическим условиям,

которые не обильно заселены, способность к синтезу антибиотиков не так

значима. Их усилия направлены на адаптацию к высокой солености, уровню

облучения, температуре, крайним значениям рН и другим параметрам среды.

Вместе с тем, в популяциях грибов экстремальных местообитаний можно

ожидать присутствие культур активных в отношении организмов, которые

способны к существованию в этих условиях. Подтверждение или

опровержение этого положения требует дальнейших исследований.

Перспективными для поиска штаммов, проявляющих высокую и

умеренную антигрибную активность, оказались также гидроморфные

торфяные почвы и верховые торфяники. Продукция антибиотиков, по-

видимому, эффективный прием в конкуренции среди грибов этих экониш,

так как условия здесь часто характеризуются повышенной обводненностью и

внеклеточные водорастворимые метаболиты могут успешно

распространяться вокруг развивающегося мицелия.

Еще одним экотопом из которого выдели в большом количестве

изоляты с умеренной и высокой антигрибной активностью были

местообитаниями, связанные с наземными беспозвоночными, в частности

буровая мука и ходы, образуемые в древесине личинками короедов. В этих

богатых доступными органическими веществами экотопах большая

численность не только бактерий, но и мицелиальных и дрожжевых грибов, и,

соответственно, конкуренция, в которой важную роль, видимо, играет и

синтез антимикотиков.

79

3.4 Антимикотическая активность микроскопических грибов различных

таксонов отдела Ascomycota

Антигрибная активность у микромицетов разной таксономической

принадлежности существенно различалась (таблица 9 и приложение1)

Наибольшую антигрибную активность (умеренную и высокую)

продемонстрировали штаммы из порядков Hypocreales и Eurotiales. Среди 41

штамма, принадлежаших к другим таксонам аскомицетов (порядки

Onygenales, Pleosporales, Sordariales, Capnodiales, Coniochaetales,

Chaetospaeriales, Microascales, Helotiales, Incertae sedis) не обнаружено ни

одного штамма с высокой активностью и 9 из них характеризовались

умеренной активностью.

Умеренной и высокой антигрибной активностью из 288 штаммов

порядка Eurotiales обладали 39% и 1% соответственно. Выявлены отличия в

антимикотической активности у штаммов разных родов этого порядка

(рисунок 4). 95 культур из 227 рода Penicillium характеризовалась умеренной

активностью, и один штамм рода Penicillium был высокоактивным. Изоляты

этого рода проявляли более высокую активность к тест-культуре А. niger 2К,

чем представители других таксонов эвроциевых грибов. Слабая антигрибная

активность обнаружена у 175 штаммов этих таксонов из 288

протестированных, т.е. у 60%. Например, 4 из 5 изученных изолятов родов

Paеcilomyces, 7 из 9 изученных изолятов рода Eupenicillium, 32 изолята из 46

рода Aspergillus у родов Fennellia, Penicillium 132 культуры из 228 проявляли

слабую антимикотическую активность по отношению к тест-культуре.

Из 197 протестированных штаммов, относящихся к порядку

Hypocreales, умеренной и высокой антигрибной активностью обладали,

соответственно, 52% и 9%. Умеренно активные изоляты обнаружены в родах

Trichoderma (70 из 120), Emericellopsis (9 из 16 изолятов), Acrostalagmus (4 из

5 изолята), Tolypocladium (6 из 7 изолятов), Stachybotrys (2 из 4), и

80

Purpureocillium (2 из 3 изученных изолятов) (рисунок 5). Высокая

антимикотическая активность обнаружена у штаммов родов Fusarium (1 из

13 изолятов) и Trichoderma (у 16 из 120 изолятов). Слабая антимикотическая

активность была обнаружена у 9 из 13 штаммов рода Fusarium, у 14 изолятов

из 21 изученых рода Acremonium, а так же при изучении 1-3 штаммов родов

Cylindrocarpon, Gliocladium, Clonostachys, Sarocladium.

Таблица 9 – Антимикотическая активность микроскопических грибов

различных таксонов отдела Ascomycota

Таксон Общее

число

штамм-

мов

Из них

Неактив-

ные

Слабоaктив-

ные

Умерен-

но

актив-

ные

Высокоак-

тивные

Порядок

Hypocreales

(семейства:

Bionectriaceae,

Hypocreaceae,

Nectriaceae,

Ophiocordycipitaceae,

Incertae sedis - 102

штамма 31 вида и

95 штаммов 6 родов)

197 0(0%) 77(39%) 103(52%) 17(9%)

Порядок Eurotiales

(сем-во

Trichocomaceae - 64

штамма 38 видов и

224 штамма 3

родов)

288 0(0%) 175(60%) 112(39%) 1(1%)

Другие порядки 41 0 (0%) 32 (78%) 9 (22%) 0 (0%)

* - в процентном соотношении по отношению к общему числу штаммов из данной

таксономической группы

81

Рисунок 4 – Антимикотическая активность грибов порядка Eurotiales в

процентах по отношению к общему количеству штаммов в пределах одного

рода

Рисунок 5 - Антимикотическая активность грибов порядка Hypocreales

в процентах по отношению к общему количеству штаммов в пределах одного

рода

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Неактивные культуры

Слабоактивные культуры

Умеренно активные культуры

Высокоактивные активные культуры

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

Неактивные культуры

Слабоактивные культуры


Высокоактивные культуры

82

В целом при анализе проявления антимикотических свойств у

представителей микромицетов двух порядков можно отметить более

выраженную фунгицидную активность для гипокрейных (61%, в том числе

9% высокоактивных культур) в сравнении с эвроциевыми грибами, у

которых высокоактивные изоляты составили 1%, а умеренно-активных было

менее половины всех исследуемых штаммов (39%). Данные представлены на

рисунке 6.

Рисунок 6 - Представленность умеренно активных и высокоактивных

изолятов в процентном соотношении к общему числу изолятов среди

порядков Eurotiales и Hypocreales

Итак, наиболее широко способностью к образованию

антимикотических веществ обладают представители рода Trichoderma. Доля

высокоактивных и умеренно активных культур среди проверенных грибов

этого рода составляла 13% и 59% (таблица 10). Значительное число штаммов

с высокой и/или умеренной активностью принадлежало к родам

Emericellopsis, Cladosporium, Tolypocladium, Acrostalagmus.

Ряд видов Bipolaris sorghicola, Bipolaris secalis, Verticillium

zaregamsianum, Scopulariopsis brevicaulis представляются также интересными

для скрининга продуцентов антигрибных соединений. Проверено по

небольшому числу изолятов этих таксонов, они проявили хорошую

0

10

20

30

40

50

60

Грибы порядка Eurotiales Грибы порядка Hypocreales


Высокоактивные культуры

83

активность, но для оценки распространенности этой способности внутри них

необходимо изучить большее число штаммов.

Таблица 10 - Рода и виды микроскопических грибов с высокой долей

штаммов с антимикотической активностью

Таксон Общее

число

штаммов

Из них

Неактивные Слабоaктивные Умеренно

активные

Высокоактив-

ные

Trichoderma 120 0(0%) 34(28%) 70(59%) 16(13%)

T. harzianum 7 - 2 3 2

T. polysporum 5 - 2(40%) 3(60%) -

T. asperellum 4 - - 2(50%) 2(50%)

T. koningii 4 - 1(25%) 2(50%) 1(25%)

T. viride 4 - 1(25%) 2(50%) 1(25%)

Т. gamsii 2 - - - 2(100%)

T. citrinoviride 1 - - - 1(100%)

Emericellopsis 16 0(0%) 7(44%) 9(56%) 0(0%)

E. alkaline 14 - 7(50%) 7(50%) -

E. pallida 1 - - 1(100%) -

E. minima 1 - - 1(100%) -

Cladosporium 9 0(0%) 5(55%) 4(45%) 0(0%)

C. macrocarpum 2 - 1(50%) 1(50%) -

C. longipes 1 - - 1(100%) -

C. herbarum 1 - - 1(100%) -

Tolypocladium 7 0(0%) 1(14%) 6(86%) 0(0%)

T.

cylindrosporum 3 - - 3(100%) -

T. inflatum 3 - - 3(100%) -

Acrostalagmus 5 0(0%) 1(20%) 4(80%) 0(0%)

A. luteoalbus 5 - 1(20%) 4(80%) -

84

ГЛАВА 4. Отбор активного продуцента антимикотиков

Отбор культур, обладающих антимикотическими свойствами,

базировался на основе анализа распространения активных штаммов среди

микромицетов отдела Ascomycota порядков Eurotiales и Hypocreales. Была

создана коллекция из 18 штаммов, 16 из которых - представители рода

Trichoderma, и по одному штамму к родам Fusarium и Penicillium. Все

отобранные штаммы проявили высокую антимикотическую активность в

отношении тест-культуры A. niger 2K при росте на среде агаре Чапека.

4.1 Оценка способности к синтезу антимикотиков у наиболее активных

культур микромицетов в жидкой среде

Антимикотическую активность в жидкой среде Сабуро проявили 9 из 18

штаммов (таблица 11). Для остальных штаммов, по-видимому, жидкая среда

и такие ее компоненты не обеспечивали синтез антибиотиков. Однако эти

штаммы при подборе иных условий культивирования и добавления

предшественников, витаминов, активаторов антибиотикообразования вполне

могут проявить хорошую активность.

Все штаммы, кроме известных коллекционных, которые проявили

антимикотическую активность в среде Сабуро, были идентифицированы на

основе анализа нуклеотидной последовательности участков ITS, 5,8 s РНК.

Полученные сиквенсы по данным программ Blast и TrichoBlast

соответствовали видам, указанным в таблице 11 (совпадение варьировалось

от 98 до 99%).

Нуклеотидная последовательность штамма 282 , сходство с Trichoderma

gamsii 99 %.

TCTCCGTTGGTGAACCAGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTACAACTCCC

AAACCCAATGTGAACCATACCAAACTGTTGCCTCGGCGGGGTCACGCC

CCGGGTGCGTCGCAGCCCCGGAACCAGGCGCCCGCCGGAGGGACCAAC

85

CAAACTCTTTTCTGTAGTCCCCTCGCGGACGTTATTTCTTACAGCTCTGA

GCAAAAATTCAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTC

TGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGC

AGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGT

ATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAACCCCT

CCGGGGGGTCGGCGTTGGGGATCGGGAACCCCTCAGACGGGATCCCGG

CCCCGAAATACAGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCGCAGTAGTT

TGCACAACTCGCACCGGGAGCGCGGCGCGTCCACGTCCGTAAAACACC

CAACTTCTGAAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACT

TAA

Нуклеотидная последовательность участка ITS 1 штамма 313, сходство с

Trichoderma harzianum 99 %:

GATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCAATGTGAACGTTACCAAA

CTGTTGCCTCGGCGGGATCTCTGCCCCGGGTGCGTCGCAGCCCCGGACC

AAGGCGCCCGCCGGAGGACCAACCTAAACTTTTTTTGGATACCCCCTCC

CGGGTTTTTTTATAATCCGAACCTTCCCGGGG

Нуклеотидная последовательность штамма 314, сходство с Trichoderma

gamsii 99 %.

GAGGGACATTACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCAATGTGAACCATAC

CAAACTGTTGCCTCGGCGGGGTCACGCCCCGGGTGCGTCGCAGCCCCG

GAACCAGGCGCCCGCCGGAGGGACCAACCAAACTCTTTTCTGTAGTCC

CCTCGCGGACGTTATTTCTTACAGCTCTGAGCAAAAATTCAAAATGAAT

CAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGC

AGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCG

AATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTG

TCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGGTCGGCGTTGGG

GATCGGGAACCCCTCAGACGGGATCCCGGCCCCGAAATACAGTGGCGG

TCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCGCAGTAGTTTGCACAACTCGCACCGGGA

GCGCGGCGCGTCCACGTCCGTAAAACACCCAACTTCTGAAATGTTGAC

CTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCG

GAGGAAAT

Нуклеотидная последовательность штамма 346, сходство с Trichoderma

viride 98 %:

TTACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCAATGTGAACGTTACCAAACT

GTTGCCTCGGCGGGGTCACGCCCCGGGTGCGTAAAAGCCCCGGAACCA

GGCGCCCGCCGGAGGGACCAACCAAACTCTTTTCTGTAGCCTTCGGGC

GTTATTTCTTACAGCTCTGAGCAAAAATTCAAAATGAATCAAAACTTTC

AACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATG

CGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAA

86

CGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTC

ATTTCAACCCTCGAACCCCCTAGGGGGTCCGGCGTTGGGGATCGGGAA

CCCCTGAGACGGGATCCCGGCCCCGAAATACATTGGCGGCCTCGCAAC

AGCCTCTCCAGCGCAGTAT

Таблица 11 - Способность синтеза внеклеточных антигрибных

соединений штаммами в жидкой среде Сабуро

Таксон, № штамма Зона подавления тест-

организма экстракта КЖ, мм

Источник выделения

Trichoderma аsperellum Mg-6 7 Моноспоровая культура штамма

Mg-97, изолированного из серой

лесной почв Красноярского края

Trichoderma сitrinoviride TYVI

4/11

17 Почва Као-Хемского

лесопитомника Республики Тыва,

степная зона

Trichoderma gamsii 282 10 Тёмно-каштановая почва, степь,

Краснодарский край

Trichoderma gamsii 314 17 Выщелоченный чернозем,

агроценоз, Воронежская область

Trichoderma harzianum М99/51 14 Моноспоровая культура штамма

M-99, изолированного из мульчи с

поверхности серой лесной почв

лесопитомника, Красноярский

край

Trichoderma harzianum 313 8 Тёмно-каштановая почва,

Краснодарский край

Trichoderma koningii TCL-06 7 Плодовое тело Fomitopsis officinales, Тыва, южная тайга

Trichoderma viride 346 15 Южный чернозем, целина,

Краснодарский край Trichoderma аsperellum 30 7 Серая лесная почва

лесопитомника, Средняя Сибирь

Trichoderma sp. K48 0 Торфяная почва, Якутия, р-н

Оймякона и Кюбюме

Trichoderma sp. K55 0 Торфяная почва, Якутия, р-н

Оймякона и Кюбюме

Trichoderma sp. K15 0 Верховое торфяное болото,

Тверская область

Trichoderma sp. K22 0 Верховое торфяное болото,

Тверская область

Trichoderma sp. K103 0 Коричневая почва, Карадагский

заповедник

Trichoderma sp. K127 0 Коричневая почва, Карадагский

заповедник

Trichoderma sp. K300 0 Обыкновенный чернозем,

агроценоз, Липецкая область

Fusarium sp. K16 0 Выщелочный чернозем,

Воронежская область

Penicillium sp. К09 0 Выщелочный чернозем,

Воронежская область

87

4.2 Характеристика спектра антибиотической активности и утилизации

соединений у отобранных штаммов рода Trichoderma

Оценка интенсивности усвоения 95 соединений штаммов показала, что

они разделяются на 2 группы - штаммы 30, TYVI 4/11, 313 и 346 обладают

высокой суммарной интенсивностью потребления субстратов и способны

утилизировать большинство субстратов. Для штаммов 314 и Mg-6

характерна слабая интенсивность потребления субстратов, но, при этом, они

способны утилизировать большинство субстратов (90 и 87 из 95 соединений,

соответственно). Штаммы 282, 314 и TSL-06 показали низкую суммарную

интенсивность потребления субстратов, и усваивали меньшее количество

соединений в сравнении с первой группой (70, 68 и 65) (таблица 12)

Таблица 12 - Метаболическая активность штаммов рода Trichoderma

Показатель Время

инку-

бации,

часов

TY-

VI

4/11

M

99/51

TCL-

06

Mg-

6

30 282 313 314 346

Суммарная

интенсивность

потребления 95

субстратов

24 14,6 5,8 7,1 31,8 10,5 5,8 9,9 9,1 7,7

48 75,8 44,2 56,6 51,1 41,1 19,5 59,3 18,6 23,6

72 82,1 59,9 80,3 71,7 89,3 43,7 79,4 41,1 54,3

96 76,1 51,7 71,4 74,6 108,

3

66,6 83,9 45,3 72,9

168 63,1 35,1 42,3 71,7 90,1 81,1 82,8 53,1 82,7

Средняя

интенсивность

потребления

24 0,2 0,1 0,1 0,3 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1

48 0,7 0,4 0,5 0,5 0,4 0,2 0,6 0,1 0,2

72 0,8 0,6 0,8 0,7 0,9 0,4 0,8 0,4 0,5

96 0,8 0,5 0,7 0,7 1,1 0,7 0,8 0,4 0,7

168 0,6 0,3 0,4 0,7 0,9 0,8 0,8 0,6 0,8

Количество

усваиваемых

субстратов

168 84 68 70 87 79 85 90 65 82

Все штаммы плохо усваивают спирты - этанол, инозитол, мальтитол;

нуклеозиды - уридин; галактозиды: метил-галактозид; органические кислоты

- бромо-янтарная, молочная, себациновая; нуклеотиды - аденозин-5-

88

монофосфат и метиловый эфир молочной кислоты. Ни один из штаммов не

усваивает 2-аминоэтанол и n-ацетилгалактозамин.

Выявлены различия в активности усвоения соединений разных классов

между штаммами.

Все штаммы первой группы способны утилизировать углеводы -

целлобиозу, циклодекстрин, трегалозу, при этом для них характерна слабая

утилизация маннозы, декстрина, псикозы, рамнозы, тагатозы, седогептулозы.

Из аминокислот хорошо усваивались - аспарагин, серин; плохо -

фенилаланин, треонин, орнитин. Кроме того, они обладали способностью

утилизировать многие органические кислоты, такие как, фумаровая,

яблочная, аспарагиновая, глюкуроновая, глюконовая, амино-маслянная,

хинная и спирты - эритритол, маннитол, ксилитол, глицерол, арабитол.

Обнаружено, что для штамма T. citrinoviride ВКПМ F-1228 характерна

высокая активность утилизации витамина - амигдалина и амида -

глюкуронамида.

Таким образом, штаммы T. citrinoviride ВКПМ F-1228, T. harzianum 313

и T. viride 346 усваивают с наибольшей интенсивностью в сравнении с

большинством других штаммов широкий спектр соединений, включая

многие углеводы и аминокислоты, входящие в состав питательных сред.

Проверку антибиотической активности этих 9 штаммов проводили на

наиболее часто используемых для изучения роста и синтеза вторичных

метаболитов жидких средах - синтетической (среда Чапека), и

полусинтетических (Сабуро и 3% неохмелённое сусло). Штаммы

секретировали антибиотики в культуральную жидкость (проверка по

этилацетатным и бутанольным экстрактам), а метанольные и этанольные

экстракты из их мицелия были не активны вне зависимости от среды

выращивания. Максимальная фунгицидная активность у всех штаммов

установлена при культивировании на среде Сабуро.

89

Наиболее активными культурами в отношении условно-патогенных и

патогенных культур грибов являются TYVI 4/11 и M 99/51, умеренная

активность установлена у штаммов 314 и 346. Данные представлены в

таблице 13 и на рисунках 7,8.

А

Б

В

Рисунок 7 - Коэффициент антибиотической активности при

культивировании на различных средах: А) Сабуро; Б) Сусло; В) Чапека

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

20

Коэффициент антибиотической активности при культивировании на среде Сабуро, мм

TYVI 4/11

Mg-6

M99/51

TCL-06

30

282

313

314

346

0

2

4

6

8

10

12

14

16

Коэффициент антибиотической активности при культивировании на среде Сусло, мм

TYVI 4/11

Mg-6

M99/51

TCL-06

30

282

313

314

346

02468

101214

Коэффициент антибиотической активности при культивировании на среде Чапека,

мм

TYVI 4/11

Mg-6

M99/51

TCL-06

30

282

313

314

346

90

Таблица 13 – Диаметр зоны подавления роста тест-культур при культивировании штаммов на различных

средах, мм

Тест-культура Зона подавления при культивировании на среде Сабуро, мм

TYVI 4/11 Mg-6 M99/51 TCL-06 30 282 313 314 346

A. fumigatus 5К 19±0,1 12±0,1 13±0,3 6±0,2 6±0,3 13±0,1 8±0,3 11±0,1 14±0,1

A. oryzae 1К 14±0,2 8±0,1 17±0,2 8±0,2 9±0,1 6±0,2 11±0,2 8±0,2 17±0,2

A.ustus 6К 17±0,3 6±0,3 12±0,5 9±0,1 6±0,2 8±0,3 7±0,2 10±0,1 15±0,1

A. terreus 4К 16±0,1 6±0,1 14±0,2 7±0,2 7±0,1 8±0,1 6±0,1 12±0,2 11±0,1

A. fisheri 3К 17±0,2 11±0,2 14±0,3 10±0,2 6±0,2 7±0,2 8±0,2 13±0,1 12±0,2

A. niger 2К 22±0,1 12±0,2 16±0,1 12±0,3 8±0,1 9±0,1 12±0,3 14±0,2 11±0,1

A. flavus 7К 21±0,4 16±0,3 20±0,1 8±0,1 10±0,2 10±0,4 6±0,1 9±0,2 10±0,2

A.nidulans 8К 17±0,6 9±0,4 9±0,2 6±0,1 6±0,1 7±0,3 8±0,2 15±0,1 14±0,1

C.albicans АТСС 2091 16±0,1 11±0,1 19±0,2 7±0,2 6±0,1 6±0,1 6±0,3 14±0,2 16±0,1

C. tropicales INA 00763 21±0,2 9±0,3 16±0,2 7±0,1 6±0,2 6±0,2 8±0,3 14±0,1 10±0,1

Ка 18 10 15 8 7 8 10 12 13

Зона подавления при культивировании на среде Сусло, мм

A. fumigatus 5К 11±0,4 9±0,2 14±0,2 8±0,1 7±0,2 9±0,5 10±0,1 8±0,2 10±0,2

A. oryzae 1К 10±0,2 9±0,1 8±0,1 8±0,1 8±0,2 6±0,1 9±0,1 11±0,2 10±0,1

A.ustus 6К 15±0,2 8±0,1 13±0,2 7±0,2 6±0,3 6±0,2 11±0,3 9±0,3 18±0,2

A. terreus 4К 12±0,2 7±0,1 17±0,2 7±0,3 8±0,3 6±0,2 13±0,2 14±0,1 15±0,3

A. fisheri 3К 14±0,1 9±0,4 16±0,1 6±0,2 7±0,1 7±0,1 7±0,1 9±0,2 14±0,3

A. niger 2К 16±0,4 12±0,2 16±0,3 10±0,1 7±0,1 8±0,3 14±0,2 11±0,3 16±0,2

A. flavus 7К 16±0,3 8±0,4 12±0,3 7±0,4 6±0,3 8±0,1 6±0,2 8±0,1 10±0,1

A.nidulans 8К 22±0,1 8±0,1 14±0,2 8±0,1 8±0,2 6±0,1 9±0,1 17±0,1 11±0,3

C.albicans АТСС 2091 19±0,1 9±0,5 21±0,2 9±0,1 6±0,2 8±0,3 10±0,1 8±0,1 14±0,2

C. tropicales INA 00763 15±0,1 9±0,3 9±0,1 10±0,1 7±0,2 6±0,2 11±0,2 15±0,1 12±0,1

Ка 15 9 14 8 7 7 10 11 13

91


Тест-культура Зона подавления при культивировании на среде Чапека, мм

TYVI 4/11 Mg-6 M99/51 TCL-06 30 282 313 314 346

A. fumigatus 5К 10±0,1 6±0,1 9±0,2 6±0,2 6±0,1 8±0,1 6±0,3 10±0,1 12±0,1

A. oryzae 1К 10±0,1 6±0,3 11±0,3 6±0,3 6±0,2 6±0,2 6±0,3 8±0,3 10±0,3

A.ustus 6К 12±0,2 6±0,3 8±0,3 6±0,2 6±0,1 7±0,1 6±0,1 10±0,1 14±0,2

A. terreus 4К 10±0,3 6±0,4 9±0,4 6±0,1 6±0,1 6±0,3 6±0,1 12±0,2 12±0,1

A. fisheri 3К 14±0,1 6±0,4 8±0,2 6±0,1 6±0,2 6±0,1 6±0,1 9±0,3 10±0,1

A. niger 2К 14±0,2 6±0,1 10±0,1 6±0,1 6±0,1 8±0,1 6±0,1 8±0,1 11±0,3

A. flavus 7К 10±0,2 6±0,1 13±0,1 6±0,1 6±0,2 7±0,1 6±0,1 9±0,3 11±0,2

A.nidulans 8К 17±0,1 6±0,2 14±0,3 6±0,2 6±0,2 8±0,1 6±0,2 12±0,2 10±0,1

C.albicans АТСС 2091 12±0,3 6±0,1 10±0,2 6±0,3 6±0,1 6±0,1 6±0,1 9±0,3 10±0,1

C. tropicales INA 00763 11±0,1 6±0,1 8±0,2 6±0,3 6±0,1 8±0,2 6±0,1 13±0,2 10±0,1

Ка 12 6 10 6 6 7 6 10 11

А Б В

Рисунок 8 – Антимикотическая активность штаммов М 99/51 и TYVI 4/11 при культивировании на

различных средах:

А – C. tropicales INA 00763 при культивировании штамма на среде Сабуро; Б – A. niger 2K при культивировании штамма на среде

Сусло; В - A. terreus 4К при культивировании штамма на среде Чапека

92

Факторный анализ данных по физиологическому профилю

потребляемых субстратов и антибиотической активности в отношении

условно-патогенных грибов показывает наличие 2-х групп штаммов. 1-я

группа включает штаммы с высокой антимикотической активностью,

способные к утилизации большого количества органических соединений, в

том числе аминокислот и витаминов, которые могут быть

предшественниками биосинтеза антимикробных пептидов. Во 2-я группу

вошли штаммы с низкой активностью (рисунок 9)

Projection of the cases on the factor-plane ( 1 x 2)

Cases with sum of cosine square >= 0,00

Labell ing variable: NewVar

Active Active

TV4-1

M99/5

TCL-06

MG-6

30

313

282

314346

-10 -8 -6 -4 -2 0 2 4 6 8 10 12

Factor 1: 30,76%

-16

-14

-12

-10

-8

-6

-4

-2

0

2

4

6

8

10

Fa

cto

r 2

: 1

7,8

7%

TV4-1

M99/5

TCL-06

MG-6

30

313

282

314346

Рисунок 9 - Факторный анализ отобранных штаммов методом главных

компонентов

На основе максимальной антибиотической активности и способности к

усвоению широкого спектра субстратов для дальнейшего исследования нами

был отобран штамм T. citrinoviride ВКПМ F-1228. Он обладал высокой

антибиотической активностью в отношении условно-патогенных и

патогенных мицелиальных и дрожжевых грибов. Экстракты культуральной

жидкости этого штамма проявляли максимальную фунгицидную

активностью в отношении патогенных видов C. tropicales INA 00763 и

A. niger INA 00760. Штамм продемонстрировал способность утилизировать

93

подавляющее большинство тестированных органических соединений и

хорошо растет на средах, рекомендованных для мицелиальных грибов.

4.3 Оптимизация условий культивирования штамма T. citrinoviride

ВКПМ F-1228 – продуцента антимикотических веществ

Для развития любого микроорганизма существуют определенные

температурные и рН оптимумы, при которых обеспечивается его

максимальный рост, выход целевого продукта и т.д. Температурные границы

для видов триходерм довольно широки (0 – 43ºС), большинство

представителей рода Trichoderma являются мезофилами c оптимумом роста

при 24 – 26 ºС [1].

Штамм T. citrinoviride ВКПМ F-1228 растет при температурах от 5ºС до

35оС, с оптимумом 28ºС - 30

оС, но менее активно продуцирует антибиотики

при температуре ниже 25оС (таблица 14,15). При температурах менее 15

оС

синтез внеклеточных антибиотических веществ практически полностью

прекращался, что может быть связано с замедлением роста культур.

Оптимальными для секреции метаболитов с антигрибной активностью

являлись температуры в диапазоне от 25ºС до 30С. Установлено, что при

температуре 25ºС штамм интенсивно накапливать метаболиты с

антигрибной активностью на 10 сутки, в дальнейшем активность

практически не изменялась до окончания культивирования.

Повышение температуры культивирования с 30ºС до 35º С также

приводило к уменьшению образования метаболитов с фунгицидной

активностью.

94

Таблица 14 – Динамика изменения размеров колонии T. citrinoviride

ВКПМ F-1228 при росте на среде Сабуро

Температура/сут Диаметр колонии штамма в зависимости от времени

измерения, мм

1 2 3 4 5

5ºС 0 0 0 0 0

10ºС 0 0 0 0 2±0,1

15ºС 0 0 0 5,5±0,1 8±0,2

20ºС 0 7±0,2 29,5±0,2 41±0,2 42±0,2

25ºС 5,5±0,1 12±0,1 29,5±0,2 54.5±0,1 55±0,1

28˚С 10,0±0,3 19,5±0,4 45±0,1 67±0,1 90±0,1

30ºС 9,5±0,4 21±0,1 44,5±0,2 65±0,4 90±0,3

35ºС 6±0,1 10±0,3 28±0,4 39±0,5 43±0,1

Таблица 15 - Зоны ингибирования тест-культур экстрактами

культуральной жидкости штамма T. citrinoviride ВКПМ F-1228, полученных

при его выращивании при разных температурах

Температура Зона подавления тест-культуры, мм Коэффициент

антибиотической

активности

A.niger

INA

00760

B.subtillus

АТСС

6633

B.coagulians

429

S.aureus

FDA

209P

5ºС 0 0 0 0 0

10ºС 0 0 0 0 0

15ºС 0 0 0 0 0

20ºС 0 0 8±0,2 8±0,1 4

25ºС 10±0,5 21±0,2 22±0,3 28±0,5 21

28˚С 14±0,1 27±0,2 25±0,1 33±0,2 25

30ºС 12±0,3 27±0,3 24±0,1 36±0,1 25

35ºС 9±0,6 16±0,1 18±0,7 22±0,4 18

Способность к синтезу антибиотиков наблюдали в исследованном

диапазоне рН (5-9) культивирования штамма. Наибольшее количество

антибиотических веществ штамм секретировал при рН 7,5, что составляло по

коэффициенту активности 23 ед. (таблица 16 и рисунок 9). На биосинтез

95

комплекса антибиотических веществ рН среды оказывало меньшее влияние,

чем температурный режим.

Таблица 16 – Зоны подавления экстрактов культуральной жидкости

штамма T. citrinoviride ВКПМ F-1228 при различных значениях рН

питательной среды

Вариа

нт

рН

Зона подавления тест-культуры, мм Ка

A.niger INA

00760

B. subtillus

АТСС 6633

B. coagulians

429

S.au-

reus

FDA

209P

1 5,0 10±0,4 19±0,3 17±0,3 18±0,3 16

2 5,5 9±0,7 22±0,1 21±0,1 23±0,4 19

3 6,0 8±0,3 21±0,2 22±0,1 25±0,2 19

4 6,5 8±0,1 22±0,4 22±0,5 29±0,2 20

5 7,0 10±0,1 23±0,1 24±0,2 30±0,3 22

6 7,5 12±0,2 27±0,4 25±0,3 31±0,1 24

7 8,0 9±0,3 27±0,2 22±0,2 27±0,3 21

8 8,5 7±0,1 23±0,1 20±0,4 25±0,2 19

9 9,0 9±0,2 24±0,3 19±0,4 22±0,2 19

Рисунок 9 - Антибиотическая активность штамма T. citrinoviride ВКПМ

F-1228 (тест-культура B. subtillus АТСС 6633, номер диска соответствует

варианту в таблице 16)

Таким образом, для максимальной продукции штаммом

антибиотических веществ оптимальные значения рН среды составляет 7,5, а

температура - 28-30˚С.

96

4.4 Оптимизация содержания С и N в среде для накопления

антибиотиков T. citrinoviride ВКПМ F-1228 методом полнофакторного

эксперимента

Углеводы и органический азот являются основными компонентами для

конструктивного и энергетического обмена грибов. Обычно в средах для

получения пептидных антибиотиков источником азота служат белки и

продукты их гидролиза - пептоны, гидролизаты, отдельные аминокислоты

[92]. Существенное значение для продукции пептидных антибиотиков

грибами имеет также соотношение углерода и азота в среде, и

применительно к каждому штамму-продуценту эта величина различна [134].

Стандартная питательная среда Сабуро содержит 40 г глюкозы и 10 г

пептона на литр, в соответствии с матрицей значений нами были

апробированы 4 варианта среды соотношения С/N в среде Сабуро: 1) 50 г

глюкозы и 12,5 г пептона; 2) 30 г глюкозы и 12,5 г пептона 3) 50 г глюкозы и

7,5 г пептона и 4) 30 г глюкозы и 7,5 г пептона (таблица 17). Оптимизацию

проводили по содержанию антибиотика в культуральной жидкости

(количество активного экстракта после лиофилизации), при этом учитывали

также накопление биомассы продуцента.

Таблица 17 – Количество активного экстракта и биомасса

T. citrinoviride ВКПМ F-1228

Показатели Вариант полнофакторного эксперимента

1 2 3 4

Среднее

значение,

биомасса (г/л)

31,4±0,21 20,4±0,24 24,4±0,025 28±0,10

Количество

сухого

экстракта

антибиотиков,

мг/л

33 мг/л 27 мг/л 28 мг/л 30 мг/л

97

Уравнение регрессии имеет следующий вид:

y = 6,25 + 1,25x1 + 0,3125x2, где

x1 – это значение содержания глюкозы

x2 – это значение содержания пептона

y – количества экстракта антибиотических веществ из культуральной

жидкости.

Оптимальное содержание определяемых компонентов среды было 30 г

глюкозы и 12,5 г пептона на литр. Такая среда обеспечивала максимальный

синтез и выделение штаммом антибиотического комплекса в культуральную

жидкость. То есть увеличение содержание глюкозы и пептона по сравнению

со стандартной средой оказывает положительный эффект на синтез

антибиотика штаммом.

Данные экспериментов по определению оптимального способа

выращивания штамма для синтеза антибиотических веществ представлены на

рисунках 10, 11 и таблицах 17-21.

Рисунок 10 - Динамика накопления антибиотических веществ при

разных способах культивировании штамма T.citrinoviride ВКПМ F-1228

0

5

10

15

20

25

30

35

5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 сутки

Ко

эфф

иц

иен

т

ан

ти

би

оти

чес

кой

ак

ти

вн

ост

и

Время культивирования

Поверхностное

культивирование

Мембранно-

жидкостное


Комбинированное


Твердофазное


Глубинное

98

А Б

Рисунок 11 – Динамика антибиотической активности экстрактов КЖ

T.citrinoviride ВКПМ F-1228 при мембранно-жидкостном (А) и

поверхностном культивировании (Б). Тест-объект B. coagulians 429, номер

варианта соответствует суткам в таблицах 17-21

Оптимальным для накопления антибиотиков штаммом был

поверхностный способ культивирования. Штамм образовывал плотную

мицелиальную пленку на поверхности жидкой среды, а после 5-6 суток

формировались органы спороношения и начиналась секреция антибиотиков в

культуральную жидкость.

Таблица 17 - Антибиотическая активность экстрактов КЖ

T. citrinoviride ВКПМ F-1228 при мембранно-жидкостном культивировании

Вариант Сутки Зона подавления тест-культуры, мм Ка

A.niger

INA

00760

B.subtillus

АТСС

6633

B.coagulians

429

S.aureus

FDA 209P

1 5 6±0,1 14±0,1 7±0,1 21±0,3 12

2 6 6±0,2 20±0,4 9±0,2 22±0,4 14

3 7 6±0,1 21±0,3 10±0,4 23±0,1 15

4 8 6±0,1 23±0,4 10±0,2 25±0,5 16

5 9 6±0,1 29±0,5 12±0,2 28±0,6 19

6 10 7±0,3 30±0,1 17±0,5 30±0,2 21

7 11 7±0,2 30±0,5 19±0,2 31±0,2 22

8 12 8±0,2 31±0,3 20±0,2 32±0,3 23

9 13 9±0,2 33±0,1 27±0,1 33±0,3 26

10 14 10±0,1 35±0,2 32±0,1 40±0,3 29

11 15 10±0,2 32±0,4 29±0,1 37±0,3 27

99


T. citrinoviride ВКПМ F-1228 при поверхностном культивировании


A.niger

INA

00760

B.subtillus

АТСС 6633

B.coagulians

429

S.aureus

FDA 209P

1 5 6±0,4 14±0,4 8±0,2 25±0,1 13

2 6 6±0,3 22±0,4 11±0,3 26±0,1 16

3 7 6±0,4 24±0,1 13±0,3 26±0,2 17

4 8 6±0,2 24±0,3 14±0,3 27±0,3 18

5 9 6±0,1 27±0,3 17±0,4 29±0,2 20

6 10 7±0,5 30±0,1 20±0,3 33±0,3 22

7 11 9±0,1 32±0,2 22±0,4 36±0,3 25

8 12 10±0,3 35±0,2 24±0,3 38±0,2 27

9 13 12±0,3 36±0,1 29±0,2 39±0,1 29

10 14 14±0,1 40±0,1 35±0,4 43±0,2 33

11 15 13±0,2 38±0,2 31±0,3 38±0,2 30


T. citrinoviride ВКПМ F-1228 при комбинированном культивировании


A.niger

INA

00760

B.subtillus

АТСС

6633

B.coagulians

429

S.aureus

FDA 209P

1 5 6±0,3 10±0,2 10±0,1 14±0,3 10

2 6 6±0,2 12±0,4 13±0,2 17±0,4 12

3 7 7±0,1 15±0,3 15±0,4 19±0,1 14

4 8 7±0,1 18±0,3 16±0,2 19±0,5 15

5 9 7±0,1 20±0,5 22±0,2 23±0,6 18

6 10 8±0,3 22±0,1 23±0,1 23±0,2 19

7 11 9±0,2 23±0,5 23±0,2 25±0,2 20

8 12 10±0,2 26±0,3 26±0,2 26±0,2 22

9 13 12±0,2 29±0,1 30±0,1 29±0,3 25

10 14 12±0,1 30±0,2 31±0,1 31±0,3 26

11 15 11±0,2 28±0,3 28±0,3 29±0,3 24

100


T.citrinoviride ВКПМ F-1228 твердофазном культивировании (вермикулит)


A.niger

INA

00760

B.subtillus

АТСС 6633

B.coagulians

429

S.aureus

FDA 209P

1 5 6±0,3 8±0,3 6±0,2 9±0,1 7

2 6 6±0,4 8±0,2 7±0,1 11±0,2 8

3 7 6±0,1 8±0,2 7±0,2 11±0,2 8

4 8 6±0,4 9±0,3 8±0,3 12±0,1 9

5 9 6±0,2 9±0,1 9±0,3 13±0,1 9

6 10 7±0,1 12±0,4 11±0,4 13±0,3 11

7 11 7±0,4 14±0,1 14±0,5 14±0,4 12

8 12 7±0,3 16±0,2 15±0,3 15±0,4 13

9 13 7±0,2 18±0,3 15±0,2 16±0,1 14

10 14 8±0,2 22±0,4 19±0,3 17±0,2 17

11 15 7±0,2 20±0,2 18±0,1 17±0,3 16


T.citrinoviride ВКПМ F-1228 при глубинном культивировании


A.niger

INA

00760

B.subtillus

АТСС 6633

B.coagulians

429

S.aureus

FDA 209P

1 5 0 0 0 0 0

2 6 0 0 0 0 0

3 7 6±0,2 6±0,2 6±0,1 6±0,2 6

4 8 6±0,3 6±0,3 6±0,2 7±0,2 6

5 9 6±0,2 7±0,1 7±0,3 8±0,1 7

6 10 6±0,4 7±0,4 7±0,3 8±0,1 7

7 11 6±0,1 9±0,1 9±0,1 9±0,3 8

8 12 6±0,3 10±0,2 10±0,3 10±0,1 9

9 13 7±0,2 12±0,3 10±0,2 10±0,4 10

10 14 8±0,3 15±0,3 11±0,4 12±0,1 12

11 15 6±0,2 13±0,1 9±0,7 11±0,5 10

Это согласуется с известным наблюдением, что синтезу пептаиболов у

грибов рода Trichoderma предшествует стадия интенсивного конидиогенеза.

Так, аспорогенный мутантный штамм Т. harzianum переставал синтезировать

101

комплекс пептаиболов в сравнении с исходным «диким» изолятом [105].

Близкие значения по продукции пептаиболов получены при мембранно-

жидкостном культивировании штамма. И в этом случае у штамма создаются

более благоприятные условия для конидиогенеза, чем в жидкой среде. В

технологическом аспекте данный способ более предпочтителен, поэтому

перспективно его применение для синтеза многих метаболитов грибов,

включая антибиотики. Выход целевого продукта с его использованием можно

повысить путем оптимизации режима подпитки среды.

Оптимизация состава и рН среды, температуры и способа

культивирования позволила увеличить выход комплекса антибиотических

веществ в 1,83 раза по сравнению с исходными условиями.

Активность антибиотиков в экстракте культуральной жидкости

T. citrinoviride ВКПМ F-1228 после оптимизации состава среды, условий и

способа культивирования достигала 40 ед. по стрептомицину и 80 ед. – по

амфотерицину В.

Итак, оптимальным способом культивирования штамма T. citrinoviride

ВКПМ F-1228 для синтеза антимикотиков является поверхностное

выращивание на жидкой среде Сабуро с содержанием глюкозы – 30,0 г и

пептона – 12,5 г в 1 л, при температуре 28оС, рН – 7,5 в течение 12-14 суток.

102

ГЛАВА 5. Выделение, идентификация и характеристика

антибиотического комплекса T. сitrinoviride ВКПМ F-1228

5.1. Спектр антимикробной активности экстрактов T. сitrinoviride ВКПМ

F-1228

Штамм T.citrinoviride ВКПМ F-1228 характеризуется широким спектром

антимикробного действия и высокой активностью в отношении широкой

группы грибов-микромицетов и грамположительных бактерий, при этом

антибиотические вещества накапливаются преимущественно в культуральной

жидкости (КЖ). Экстракты, полученные из мицелия, оказались неактивны

или слабо активны (зона подавления менее 2–3 мм) в отношении всех

исследуемых тест-организмов. Практически полное извлечение из раствора

маточного концентрата культуральной жидкости активных компонентов

достигали экстракцией такими гидрофобными органическими

растворителями как этилацетат и н-бутанол, что указывает на их

преимущественно гидрофобную природу.

Экстракты культуральной жидкости штамма оказались активны в

отношении условно-патогенных штаммов C. tropicalis INA 00763 и A. niger

INA 00760. Величины зоны подавления роста тест-культур достигали 25±2

мм и 22±2 мм соответственно. Кроме того, штамм ингибировал рост условно-

патогенных микромицетов A. oryzae 1K, A. niger 2K, A. fumigatus 5K,

A. terreus 4K и токсигенных штаммов рода Penicillium (таблица 22).

Антибактериальную активность экстрактов КЖ наблюдали только в

отношении грамположительных бактерий, а к грамотрицательным бактериям

они были неактивны. Высокую активность штамм проявил в отношении

S. aureus FDA 209P и M. luteus NCTC 8340.

103

Таблица 22 - Фунгицидная активность (средняя зона (в мм) подавления

тест-организмов) экстрактов культуральной жидкости штамма T. citrinoviride

ВКПМ F-1228 при поверхностном культивировании на различных средах

Тест-

организмы

Среда

Чапека Сусло Сабуро

Амфоте-

рицин В бутанол этил-

ацетат

бутанол этил-

ацетат

бутанол этил-

ацетат

A.fumigatus 5К 7*/6* 9/10 7/7 11/18 6/9 6/17 8

A.oryzae 1К 6/6 6/6 6/6 6/6 6/7 6/6 9

A.ustus 6К 8/6 8/6 9/10 9/7 7/9 7/15 9

A.terreus 4К 10/9 8/8 9/10 6/7 8/12 6/11 9

A.fischeri 3К 8/8 7/8 10/7 8/17 7/9 7/6 11

A.niger 2К 6/6 9/6 6/6 14/6 11/8 16/18 21

A.flavus 7К 6/6 6/7 6/6 11/6 6/7 9/14 7

F. solani 9К 6/6 7/6 6/6 13/6 6/6 6/16 0

C.albicans

АТСС 2091

10/16 8/13 7/16 18/33 10/32 15/24 11

A. niger INA

00760 15/8 10/0 13/10 10/12 10/20 20/25 14

С. tropicalis

INA 00763 0/10 10/13 10/10 10/15 10/11 14/20 10

P.nalgiovense

18Р 0/0 9/13 0/7 10/15 0/11 12/22 11

P. roqueforti

233Р 0/0 10/14 0/10 10/15 0/11 14/25 14

P. commune

27Р 0/10 7/11 10/10 10/15 10/11 16/27 12

P.

chrysogenum

30Р

0/8 10/13 7/11 10/15 10/14 14/20 17

* – на 10/14 сутки культивирования штамма

Итак, оптимальным экстрагентом для извлечения антибиотических

веществ являлся этилацетат.

Этилацетатом извлекалось большее количество антибиотиков, в

сравнении с экстракцией бутанолом (таблица 23). Этилацетатные экстракты

оказались активны в отношении условно-патогенных штаммов C. tropicalis

INA 00763 и A. niger INA 00760. Величины зоны подавления роста тест-

культур достигали 25±2 мм и 22±2 мм, соответственно. Кроме того, штамм

104

ингибировал рост условно-патогенных микромицетов A. oryzae 1K, A. niger

2K, A. fumigatus 5K, A. terreus 4K и токсигенных штаммов рода Penicillium

(табл. 2).

Антибактериальную активность экстрактов КЖ наблюдали только в

отношении грамположительных бактерий, а к грамотрицательным бактериям

они были неактивны. Высокую активность штамм проявил в отношении

St. aureus FDA 209P и M. luteus NCTC 8340.

Таблица 23 - Антибактериальная активность экстрактов культуральной

жидкости штамма T. citrinoviride ВКПМ F-1228 при поверхностном

культивировании на различных средах при экстракции этилацетатом

Тест-организмы Среда Чапека Сусло Сабуро Ампицилл

ин

B. subtillus АТСС

6633

32±0,1*/42±0,

3*

24±0,2/31±0,1 45±0,1/45±0,2 25±0,1

B. coagulans 429 24±0,3/30±0,2 15±0,1/24±0,2 25±0,1/28±0,2 35±0,1

B. mycoides 537 14±0,1/20±0,3 24±0,3/25±0,2 25±0,3/28±0,2 20±0,2

St. aureus FDA 209P 12±0,2/25±0,2 11±0,1/16±0,2 22±0,1/26±0,1 15±0,1

M. luteus NCTC 8340 12±0,1/17±0,2 7±0,2/12±0,3 13±0,1/15±0,1 12±0,1

B. coagulans 429 24±0,2/28±0,1 15±0,1/24±0,2 25±0,1/30±0,2 35±0,3 * – на 10/14 сутки культивирования штамма

5.2 Очистка и разделение антибиотического комплекса и оценка

токсичности T. сitrinoviride ВКПМ F-1228

Была разработана схема выделения антибиотических веществ (рисунок

12). После упаривания на роторном испарителе этилацетатного экстракта

полное растворение антибиотических веществ достигали при применении

водно-спиртовой смеси в соотношении 30/70. Такое соотношение из

проверенных 5-ти других водно-спиртовых растворов было оптимальным.

Для первичной очистки антибиотического комплекса использовали

прямофазную колоночную хроматографию. Элюирование осуществляли

хлороформом с последующим введением метанола от 1 до 10% в

хлороформе, что позволяло провести первичное разделение экстракта для

105

выделения активного комплекса. Элюаты по 10-15 мл тестировали на

антимикробную активность методом диффузии в агар. В результате получено

5 фракций экстракта, активной из которых была фракция №2.

Рисунок 12 - Схема выделения антибиотического комплекса, разделение и

очистки отдельных антибиотиков штамма T. citrinoviride ВКПМ F-1228

Экстрагирование культуральной

жидкости этилацетатом (1:3) 1,5 часа

Концентрирование досуха в вакууме на

роторном испарителе

Прямофазная колоночная хроматография

с использованием в качестве адсорбента

силикагель Kiesgel 60, а элюента

метанол: хлороформ (1:10)

Тонкослойная хроматография на пластине

с силикагелем Kiesgel 60 в системе

метанол:хлороформ (1:3)

Биоавтография на тест-штаммах B. subtillus

ATCC 6633 и A. niger INA 00760

ОФ-ВЭЖХ антибиотического комплекса

фракции

Получение экстракта

Получение водно-спиртового

экстракта

Разделение экстракта на

отдельных фракций

Контроль схода

антибиотического вещества

Разделение индивидуальных

соединений пептаиболов с

антибиотической активностью

106

Оценка токсичности и активности фракции №2 в отношении

опухолевых клеток. Развитие микозов часто сопутствует раковым

заболеваниям, в связи с этим перспективно наличие у новых антимикотиков

способности ингибировать рост опухолевых клеток. Активную фракцию №2

штамма T. citrinoviride ВКПМ F-1228 протестировали на линиях опухолевых

клеток.

Установлено, что она обладает выраженной цитотоксической

активностью в 10% концентрации на линии опухолевых клеток Colo 357 и

Т3М4. Гибель клеток составила 88,6% и 92,5% соответственно (рисунок 13).

При концентрациях от 10% до 100% фракция №2 не оказывает токсического

действия на клетки млекопитающих (сперматозоиды быка), выживаемость

клеток была от 80 до 100%. Известный антигрибной антибиотик - нистатин

оказывал достаточно выраженное токсическое действие на клетки-

сперматозоиды быка. При его 10% концентрации степень выживаемости

клеток составила всего 40%.

Рисунок 13 – Цитотоксическая активность антигрибной фракции №2

штамма Trichoderma citrinoviride ВКПМ F-1228 в отношении опухолевых

клеток Colo 357 и Т3М4

107

Итак, активная фракция №2 оказывает выраженное цитотоксическое

действие на опухолевые клетки, не оказывая токсического действия на

клетки млекопитающих.

С применением тонкослойной хроматографии (ТСХ) и последующей

биоавтографией были получены 2 активных компонента этой фракции.

Предварительно были протестированы различные системы для ТСХ такие,

как: хлороформ:метанол (20:1;9:1;7:1;4:1;3:1), хлороформ:этанол (20:1),

хлороформ:изопропанол (20:1), хлороформ:этилацетат (20:1), этилацнтат,

этилацетат:гексан (1:1), этилацетат:метанол (3:1),

хлороформ:метанол:вода:уксусная кислота (65:25:4:3). Наилучшее

разделение фракции №2 достигали в системе хлороформ:метанол (3:1).

С помощью ТСХ на пластинках с силикагелем в системе

хлороформ:метанол 3:1 установлено, что входящие в состав исходной

фракции №2, одна подавляет тест-культуру B. subtillus INA 6633, т.е.

обладает обладает антибактериальным действием, а другая антигрибной

активностью (тест-культура A. niger INA 00760) и слабым

антибактериальным действием (рисунок 14).

Рисунок 14 – Антигрибной (Rf 0,43) и антибактериальный компоненты

(Rf 0,86) по данным тонкослойной хроматография фракции №2

108

Таким образом, из исходной смеси антибиотических веществ при

первичной очистке мы выделили фракцию №2, содержащую 2 компонента с

антигрибной и с антибактериальной активностями.

Разделение и физико-химические свойства антибиотического комплекса

штамма T. citrinoviride ВКПМ F-1228. При проведении последующей

аналитической обращенно-фазной высокоэффективной жидкостной

хроматографии (ОФ-ВЭЖХ) антигрибного компонента фракции № 2 был

получен профиль, состоящий из 32 индивидуальных соединений, которые

были собраны вручную. Отметим, что преимущественное разделение

компонентов достигали при длительном изократическом элюировании

буфером с высоким объемным содержанием органического растворителя, что

указывает на выраженные гидрофобные свойства поверхностей разделяемых

соединений (время удерживания составило 40-60 мин) (рисунок 15).

Рисунок 15 - ОФ-ВЭЖХ фракции 2 после прямофазной хроматографии

на колонке с силикагелем Kieselgel 60 в системе хлороформ: метанол 4:1.

Черными стрелками отмечены пики, показавшие антимикробную активность;

н/а - не активно

109

Частичный профиль разделения активного комплекса в изократическом

градиенте 85 и 90% ацетонитрил (ACN) с добавлением 0,1% (3-фтор

уксусной кислоты) ТФУ представлен на рисунке 15.

Активная фракция содержит нескольких биологически активных

соединений. Для соединений (№№ 28-32) была установлена выраженная

фунгицидная и/или антибактериальная активность (таблица 24).

Таблица 24 - Физико-химические и биологические свойства

индивидуальных антибиотиков, продуцируемых штаммом Trichoderma

сitrinoviride ВКПМ F-1228

Физико-

химические

свойства

Компонент 28 Компонент 29 Компонент 30 Компонент 31 Компонент 32

Антимик-

робный

спектр

действия

Грибы:

A.niger

A.repens

C.tropicalis

P.chrysogenum

Бактерии:

B.subtilis

B.coagulans

M.luteus

S.aureus

Бактерии:

B.subtilis

B.coagulans

Грибы:

A.niger

A.repens

C.tropicalis

P.chrysogenum

Бактерии:

B. subtilis

B. coagulans

S. aureus

M. luteus

Бактерии:

B.subtilis

Грибы:

A.niger

A.repens

C.tropicalis

A.fumigatus

Раствори-

мость

растворим в

хлороформе,

этилацетате;

этаноле,

ацетонитриле,

нерастворим в

воде




этаноле,


не растворим в

воде




этаноле,


нерастворим в

воде




этаноле,



воде




этаноле,



воде

Прибли-

зительная

молеку-

лярная

масса по

МАЛДИ,

Да

1109 1569 1675 1720 1760

Близкий

аналог,

согласно

базе

пептаибо-

лов

отсутствует отсутствует отсутствует трихорзин отсутствует

Причем для соединений №№ 29 и 31 отмечали только

антибактериальную активность в отношении грамположительных бактерий,

110

для № 28 – только антимикотическое действие, а №№ 30 и 32 ингибировали

рост как грибов, так и бактерий. При сравнении их молекулярных масс (1100-

2000 Да) с данными базы пептаиболов [207] и базы природных соединений

Берди [30,31] выявили гомологию этих веществ с пептаиболами. Вещество

№ 31 близко к пептаиболу – трихорзину, четыре других соединения не

удалось отнести к известным пептаиболам, но они также могут быть из

данной группы биологически активных соединений.

5.3 Антимикробная активность пептаиболов T. citrinoviride ВКПМ F-1228

Пять индивидуальных соединений – пептаиболов T. citrinoviride ВКПМ

F-1228, соответствующие времени удержания на аналитической ОФ - ВЭЖХ,

установленном ранее для активных компонентов (соединение № 28 – 44 мин;

№ 29 – 48 мин; № 30 – 53 мин № 31 – 55 мин и № 32 – 62 мин), были

накоплены с помощью полупрепаративной высокоэффективной жидкостной

хроматографии. У них был изучен спектр действия в отношении условно-

патогенных бактерий и грибов, и патогенных клинических аспергиллов

(рисунок 16 и таблица 24).

Рисунок 16 - Полупрепаративная ОФ-ВЭЖХ антибиотического

комплекса, продуцируемого штаммом T. citrinoviride ВКПМ F-1228

28 29 30

14

31 32

111

Таблица 24 - Антибиотическая активность пептаиболов,

продуцируемых штаммом Trichoderma citrinoviride ВКПМ F-1228

Тест-культура Зона подавления роста тест-культуры (мм)

Номер индивидуального соединения Ниста-

тин

Ампи-

цил-

лин 28 29 30 31 32

A.terreus 4К 10±0,1 0 0 0 0 25±0,2 -*

A.fumigatus 5К 10±0,1 16±0,1 10±0,3 9±0,1 8±0,1 30±0,3 -

A.niger 2К 8±0,1 0 0 11±0,2 10±0,2 17±0,1 -

B.subtilis АТСС

6633

14±0,2 0 13±0,4 29±0,3 20±0,3 - 28±0,2

B.coagulans

429

19±0,2 17±0,1 17±0,2 17±0,2 19±0,4 - 25±0,1

S.aureus FDA

209P

20±0,3 22±0,1 25±0,3 25±0,3 25±0,4 - 25±0,1

Клинические изоляты

A.niger 646М 9±0,1 10±0,1 11±0,

2

7±0,2 6±0,1 Не

активен

-

A.fumigatus

397М

6±0,1 6±0,1 6±0,1 6±0,1 6±0,2 Не

активен

-

A.ochraceus

497М

11±0,2 11±0,1 11±0,

1

6±0,1 10±0,3 Не

активен

-

-* -исследование не проводили

Антибактериальную активность проявили все исследуемые 5

пептаиболов. Для них характерна высокая активность к золотистому

стафилококку (рисунок 17).

А Б В

Рисунок 17 – Антибактериальная активность индивидуальных

соединений T. citrinoviride ВКПМ F-1228 в отношении B. subtillus ATCC

6633(А) B. coagulans 429 (Б), S.aureus FDA 209P (В)

112

Рисунок 18 – Антигрибная активность индивидуальных соединений

T. citrinoviride ВКПМ F-1228 в отношении A. fumigatus 5K

Индивидульные соединения 28, 30 и 31 проявляли антимикотическую

активность и к изолятам клинических аспергиллов. Они способны

ингибировать рост патогенных штаммов A. ochraceus 497М и A. niger 646М –

возбудителей бронхолегочного аспергиллеза, которые были резистентны к

амфотерицину В (рисунок 19).

Рисунок 19 - Антибиотическая активность индивидуальных

соединений T. citrinoviride ВКПМ F-1228 в отношении клинических

патогенных штаммов A. niger 646М и A. ochraceus 497М

Как показали исследования, наиболее активными были

индивидуальные пептаиболы № 28, 30 и 31, что, возможно, связано с

большей их концентрацией в антибиотическом комплексе, продуцируемом

штаммом. Штамм T. citrinoviride TYVI 4/11 был задепонирован нами

продуцент антибиотиков-пептаиболов с антигрибной и антибактериальной

113

активностью во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов

с присвоением номера ВКПМ F-1228.

Возможным практическим применением штамма, образующего

комплекс пептаиболов с фунгицидной и антибактериальной активностью,

может быть создание на его основе антибиотиков широкого спектра действия

для лечения микозов, осложненных бактериальными инфекциями.

На основании проведенных исследований был разработан

лабораторный регламент на получение антибиотиков-пептаиболов с

антигрибной и антибактериальной активностью, продуцируемых штаммом

Т. citrinoviride ВКПМ F-1228.

114

Глава 6. Лабораторный регламент получения комплекса

антимикотиков - пептаиболов из T.citrinoviride ВКПМ F-1228

6.1 Область применения

Настоящий технический регламент распространяется на препарат ТСП

- 1 (Trichoderma citrinoviride пептаиболы), получаемый на основе штамма

Trichoderma citrinoviride Bissett (1984) ВКПМ F-1228 (патент РФ №

2564577), обладающий антифунгицидной, а так же антибактериальной

активностями. Данный препарат предназначен для фармацевтической

промышленности.

6.2 Характеристики препарата

Препарат ТСП - 1 предназначен для фармацевтической

промышленности для производства лекарственного средства для лечения

инвазивных микозов, включая аспергиллёзы, отягощённые бактериальными

инфекциями и онкологическими заболеваниями. Действующим компонентом

препарата является комплекс пептаиболов, продуцируемый штаммом в

культуральную жидкость.

Основные характеристики

Характеристика продуцента: штамм Trichoderma citrinoviride Bissett

1984 ВКПМ F-1228 является телеаморфой гриба рода Hypocrea семейства

Hypocreaceae порядка Hypocreales отдела Ascomycota.

Действующее вещество – комплекс пептаиболов штамма Trichoderma

citrinoviride Bissett (1984) ВКПМ F-1228.

Препаративная форма представляет собой кристаллический порошок

от светло-белого до бежевого цвета, полученный путем культивирования

штамма на модифицированной среде Сабуро, отделения культуральной

жидкости, выделения, очистки и сушки продукта.

115

Токсичность: данный препарат не является токсичным для людей

Меры предосторожности: работа с препаратом должна

осуществляться в перчатках и маске. После работы вымыть руки и лицо с

мылом. При попадании в глаза промыть большим количеством воды.

6.3 Субстраты и материалы

Таблица 25 – Характеристика сырья и материалов

Наименование Обозначение Сорт или

артикул

Показатели,

обязательные для

проверки

Примечание

Основое сырье

Агар

микробиологический

ГОСТ 17206-96 - Прозрачность, цвет,

температура

плавления студня

Использовать для

хранения

посевного

материала

Сахароза ГОСТ 5833-75 Ч Цвет, растворимость Использовать для

хранения

посевного

материала

Натрий

азотнокислый

ГОСТ 4197-74 Ч Влажность не более

5%, содержание

основного вещества

не менее 99%


хранения

посевного

материала

Калий

фосфорнокислый

двузамещенный




не менее 98%


хранения

посевного

материала

Магний

сернокислый 7-

водный




не менее 99 %


хранения

посевного

материала

Калий хлор ГОСТ 4568-95 Ч Цвет. Рассыпчатость,

массовая доля

вещества не менее

60%


хранения

посевного

материала

116


Вода очищенная ФС 42-2619-97 - рН 5,0…7,0;

cух. ост. ≤ 0,001

%; нитраты,

нитриты,

хлориды,

сульфаты,

кальций, тяж.

металлы –

отсутствие

Для

производственных

стадий

Глюкоза ГОСТ 975-88 Ч Цвет, вкус, запах,

растворимость


приготовления

питательного

субстрата

Пептон ГОСТ 13805-76 Ч Внешний вид,

цвет. запах


приготовления

питательного

субстрата

Вспомогательное сырье и материалы

Этилацетат ГОСТ 8981-78 Ч Внешний вид,

цветность,

плотность,

содержание

основного

вещества не

менее 98%

Для


стадий

Силикагель ГОСТ 3956-76 Ч Внешний вид,

плотность

Для


стадий

Метанол ГОСТ 2222-95 Ч Внешний вид,

смешиваемость с

водой, цветность,

плотность

Для


стадий

Хлороформ ГОСТ 20015-88 Ч Внешний вид,

запах, плотность

Для


стадий

Спирт этиловый

ректификованный

ГОСТ 5962-13 Ч Внешний вид,

цвет, запах,

растворимость

Для


стадий

Средство

дезинфецирующее

«Сандез»,

концентрат

- - Массовая доля

суммарного

действующего

вещества 35 %,

pH 6,0 ... 8,0

Для мойки и

дезинфекации

оборудования

117

6.4 Технология и экономические затраты на производство препарата в

лабораторных условиях

Технология получения комплекса пептаиболов, обладающих

антимикотической активностью, представлена блок-схемой на рисунке 20 и

состоит из 4 стадий: подготовки, ферментация, выделения и очистки

целевого продукта (комплекса пептаиболов), приготовление товарных форм.

Подготовительная стадия включает в себя хранение и поддержание

производственного штамма продуцента комплекса пептаиболов,

приготовление посевного материала, подготовка и стерилизация

ферментационной среды.

Ферментационная стадия является стадией, на которой происходит

биосинтез целевого продукта (комплекса пептаиболов) и побочных

продуктов.

Стадия выделения и очистки целевого продукта включает в себя ряд

промежуточных стадий (фильтрация с помощью водоструйного насоса,

экстракция, вакуумная упарка на роторном испарителе, колоночная

хроматография, тсх, ВЭЖХ, масс-спектрометрия). На каждом этапе

проводится оценка антимикотической активности продукта методом

диффузии в агар с применением дисков.

Стадия приготовления товарных форм заключается в придании

товарного вида продуктам биотехнологии.

118

Рисунок 20 – Схема получения пептаиболов из штамма T.citrinoviride

ВКПМ F-1228

Хранение культуры

ВКПМ F-1228

Получение рабочей культуры

ВКПМ F-1228

Стерильная вода

Получение инокулята ВКПМ F-1228

Культивирование в колбах поверхностным способом на

жидкой модифицированной среде Сабуро (глюкозы 23

г/л, пептона 6 г/л) в течение 14 дней

Отделение мицелия с помощью

вакуумного насоса Отделение культуральной жидкости с

помощью вакуумного насоса

Спиртовой концентрат из КЖ

Проверка методом диффузии антибиотических

веществ из концентратов со стерильного

бумажного диска в агар, засеянный тест-культурой

Лиофильная сушка

Фасовка

Препарат для защиты растений и

повышения супрессивности почв

Колоночная хроматография, в

качестве адсорбента

используется силикагель

Kiesеgel 60, а в качестве

элюента смесь

метанол:хлороформ в

соотношении 1:10

Тонкослойная

хроматография на

пластинах с тонким слоем

силикагеля Kiesеgel 60 и

элюентом

метанол:хлороформ 1:9

Получение отдельных фракций по 10-15 мл

(при исходном объёме кж 2 литра)

ОФ-ВЭЖХ

Получение отдельных фракций из комплекса

веществ

Лиофильная сушка

Фасовка

119

6.4.1 Стадия подготовки

Подготовка питательных сред: питательные среды Чапека и Сабуро

указанного выше состава предварительно стерилизуются в автоклаве в

течение 15 минут при 1 атмосфере.

Подготовка стерильной воды осуществляется методом

автоклавирования дистиллированной воды в течение 15 минут при 1

атмосфере.

Подготовка чашек Петри с тест-культурами: тест-объектами для

оценки фунгицидной активности были штаммы патогенных мицелиальных и

дрожжевых микроскопических грибов A. niger INA 00760, C. albicans АТСС

2091, C. tropicalis INA 00763 и условно-патогенных микромицетов – 8 видов

рода Aspergillus: A. oryzae 1К, A. niger 2К, A. fisheri 3К, A. terreus 4К,

A. fumigatus 5К, A. ustus 6К, A. flavus 7К, A. nidulans 8К, а так же на 4 видах

токсигенных Penicillium: P. nalgiovense 18Р, P. roqueforti 233Р, P. commune

27Р, P. chrysogenum 30Р; для оценки эффективности использования мицелия

в отношении возбудителей болезней растений использовали 2 вида рода

Fusarium: F. oxysporum 890, F. solani 9K. Используются пятисуточные

культуры, выращенные на среде Чапека. С помощью камеры Горяева

осуществляется пересчет количества спор грибов до концентрации 1•105 в 1

мл стерильной воды. Далее засевают тест-культуры сплошным газоном на

чашки Петри со средой Чапека. Чашки с тест-организмами хранятся при

температуре от 0 до +4ºС.

Подготовка стерильных бумажных дисков для метода дисков:

бумажные диски d=6 мм предварительно стерилизируются в автоклаве в

стеклянной чашке Петри в дистиллированной воде в течение 20 минут при 1

атмосфере.

Хранение культуры осуществляется на косяках со средой Чапека при

темературе от 0 до +4ºС.

120

Подготовка посевного материала: культуру штамма Trichoderma

citrinoviride Bissett 1984 ВКПМ F-1228 пересевают на свежие косяки со

средой Чапека. Инкубируют при температуре 25-28ºС в термостате в течении

5-7 суток. Далее в пробирки добавляют стерильную воду, взбалтывают

пробирку для получения смыва спор и фрагментов мицелия штамма, получая

таким образом посевной инокулят.

6.4.2 Ферментационная стадия

Условия культивирования штамма: инокулят вносят в качалочные

колбы с модифицированной средой Сабуро, оптимальный исходный рН =

7,5. Штамм выращивают стационарно при температуре 25-28ºС в течении 14

дней. В течение этого времени происходит продуцирование комплекса

пептаиболов, обладающего антифунгальной, антибактериальной и

цитотоксической (к линиям раковых клеток Colo 357 и T3M4) активностями.

Контроль выделения комплекса пептаиболов в культуральную

жидкость штаммом T. citrinoviride ВКПМ F-1228 осуществляется методом

дисков. Для этого в стерильных условиях отбирается небольшое количество

культуральной жидкости, в ней смачиваются стерильные бумажные диски и

раскладываются на предварительно засеянные тест-культурой A. niger 2К

чашки Петри. Наличие зоны диаметром свыше 25 мм свидетельствует о

высокой активности штамма.

6.4.3 Стадия выделения и очистки

Стадия выделения включается в себя фильтрацию с помощью

водоструйного насоса, экстракцию, вакуумную упарку на роторном

испарителе.

121

Фильтрация для отделения культуральной жидкости от мицелия

штамма T. citrinoviride ВКПМ F-1228 осуществляют с помощью мембранных

фильтров на воронке Зейца под вакуумом.

Экстракция: культуральная жидкость штамма T. citrinoviride ВКПМ

F-1228 экстрагируется в течение 1,5 часов этилацетатом в делительной

воронке. По окончании времени остатки культуральной жидкости удаляются,

а для дальнейшего получения антибиотического вещества используется

этилацетат с находящимся в нем комплексом пептаиболов.

Вакуумная упарка осуществляется на роторном испарителе «Rotavapor-

RBǘchi» (Швейцария). Упаривание происходит за счет внешнего нагрева

роторной колбы с этилацетатом, содержащим комплекс пептаиболов.

Вращательное движение поршня обеспечивает хорошее перемешивание и

равномерное распределение температуры. Роторная колба нагревается на

водяной бане, энергия к которой подается при помощи электричества. Пары

выходят из колбы в месте ее соединения с вращающим мотором, протекают

через вал, через вращающий элемент и достигают конденсатора, где

конденсируются и охлаждаются на холодильнике. Затем конденсат

собирается в приемнике. Специальная система приемников позволяет

собрать конденсат как при нормальном давлении, так и в вакууме. В

результате на стенках колбы остается сухой остаток, который растворяют в

60% этиловом спирте и получают спиртовый экстракт.

Для стадии очистки используют прямофазную колоночную

хроматографию, тсх, ОФ-ВЭЖХ, масс-спектрометрию.

Прямофазная колоночная хроматография: хроматографическую

колонку на 2/3 заполняют силикагелем Kiesеgel 60. Через колонку

пропускают экстракт, постепенно элюируя смесью метанол:хлороформ

(1:10). Отбираются первые пять фракций объёмом 10-15 мл. Для контроля

выхода пептаиболов используется метод тонкослойной хроматографии.

Тонкослойная хроматография осуществляется на пластинах

DCAlufoilien Kieselgel-60 (“Merck”, Германия) размером 15х15 см с тонким

122

слоем силикагеля. Капилляром наносятся на пластины фракции, полученные

при прямофазной колоночной хроматографии. В качестве элюента так же

используется смесь метанол:хлороформ (1:9). Первые 5 фракций, у которых

при просвечивании в УФ при длине волны = 254 нм наблюдаются

светящиеся пятна, содержат пептаиболы.

Обращенно-фазовая высокоэффективная хроматография проводится

на полупрепаративной колонке Luna C18 100A размерами 250×10 мм

(Phenomenex, США) в линейном градиенте увеличения концентрации

подвижной фазы, создаваемый элюентом А (0.1% трифторуксусная кислота

(ТФУ) в воде MQ) и элюентом В (80% ацетонитрилc добавлением 0.1%

водной ТФУ) при скорости потока 2,5 мл/мин. Для ВЭЖХ используется

ацетонитрил фирмы «Panreac» (Испания). Детектирование разделяемых

веществ осуществляется при длине волны 247 нм в градиенте концентрации

элюента В: 16-28% за 12 мин; 28-55% за 27 мин;; 55-75% за 20 мин и 75-85%

за 10 мин с последующим изократическим элюированием в течение 25 мин.

Полученные в ходе ОФ-ВЭЖХ-анализа фракции №28-№32,

соответствующие отдельным пикам, обладают антифунгальной и

антибактериальной активностями соответственно.

Масс-спектры измеряют на масс-спектрометре Ultraflex II MALDI

ToF/ToF “BrukerDaltoniсs” (Германия), оснащенном УФ лазером 355 нм (Nd)

в режиме получения положительных ионов с использованием рефлектрона.

На мишени смешивают по 1 мкл раствора активной фракции штамма

Trichoderma citrinoviride Bissett 1984 ВКПМ F-1228 и 0.3 мкл раствора 2.5 -

дигидроксибензойной кислоты с концентрацией 10 мг/мл в 20%-ном

ацетонитриле с 0,5%-ной трифторуксусной кислотой и полученную смесь

высушивают на воздухе. Точность измеренных молекулярных масс

соединений во фракции составляла 0,001 %.

На каждом этапе проводится оценка антифунгальной и

антибактериальной активности с помощью метода дисков.

123

Стадия придания товарных форм включает в себя лиофильную сушку и

фасовку.

Лиофильная сушка: сначала производят заморозку исходной активной

фракции штамма Trichoderma citrinoviride Bissett 1984 ВКПМ F-1228, затем

помещают ее в вакуумную камеру. Процесс возгонки продолжается до тех

пор, пока концентрация водяных паров в камере не достигнет нормального

для данной температуры уровня, в связи с чем избыточные водяные пары

постоянно откачиваются.

Фасовка осуществляется в стерильные флаконы с резиновыми

пробками с алюминиевым колпочком.

6.4.4 Побочные продукты

В качестве побочного продукта данного регламента является мицелий

штамма T. citrinoviride ВКПМ F-1228, полученный при отфильтровывании

культуральной жидкости на вроронке Зейца. Мицелий можно использовать в

качестве биопрепарата для защиты растений.

Высушивание осуществляют лиофильно - сначала производят

заморозку исходной активной фракции штамма T. citrinoviride ВКПМ F-1228,

затем помещают ее в вакуумную камеру. Процесс возгонки продолжается до

тех пор, пока концентрация водяных паров в камере не достигнет

нормального для данной температуры уровня, в связи с чем избыточные

водяные пары постоянно откачиваются. Небольшое количество мицелия

можно высушить в стерильных условиях в сушильном шкафу BINDER ED

115 (115 л, 300°C, Германия) при температуре 30˚С-40оС в течение

нескольких часов. Высушенный продукт смешивается с носителем

(измельченным торфом или каолином) для получения однородного порошка

и определения количества колониеобразующих единиц грибов (КОЕ) в 1 г

продукта.

https://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%92%D0%B0%D0%BA%D1%83%D1%83%D0%BC

https://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%92%D0%BE%D0%B4%D1%8F%D0%BD%D0%BE%D0%B9_%D0%BF%D0%B0%D1%80

https://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%92%D0%B0%D0%BA%D1%83%D1%83%D0%BC

https://ru.wikipedia.org/wiki/%D0%92%D0%BE%D0%B4%D1%8F%D0%BD%D0%BE%D0%B9_%D0%BF%D0%B0%D1%80

http://www.nv-lab.ru/catalog_info.php?ID=878&Full=1

http://www.nv-lab.ru/catalog_info.php?ID=878&Full=1

124

Фасовка осуществляется в полиэтиленовые пакеты объёмом до 10

литров или иные тары, предусмотренные Роспотребнадзором. Препарат

хранится до 3 месяцев при температуре не более +10оС без потери

антибиотической активности.

6.5 Экономические затраты

В таблице 26 приведены затраты по ценам 2015 г. на сырье для

получения препарата ТСП-1 на основе комплекса пептаиболов штамма

T. citrinoviride ВКПМ F-1228.

Таблица 26 - Затраты на сырьё для получения препарата ТСП-1 на

основе штамма T. citrinoviride ВКПМ F-1228 (в рублях)

Наименование Количество на флакон

препарата

Суммарная стоимость,

рубли

Среда Сабуро, кг 0, 0425 150,8

Вода,л 2 27

Этилацетат, л 2 140

Спирт, л 0,1 14

Силикагель, кг 0,18 10,7

Хлороформ, л 0,227 340,5

Метанол, л 0,017 15,6

Итого 698,6

На 100 флаконов =69860 рублей, на 1000 флаконов = 690860 рублей

Стоимость сырья на производство 100 флаконов составляет 69860

рублей, с учётом 30% надбавки на период освоения 90818 рублей. Согласно

структуре распределения затрат в производстве антибиотиков на долю сырья

приходится 40-50%, таким образом с учётом 20% рентабельности

ориентировочная оптовая цена 100 флаконов составит 217963,2 рублей.

Продуктивность по биомассе составляла 31,4 г, а по выходу комплекса

антибиотических веществ – 33 мг антибиотика на литр среды.

125

6.6 Технические требования

Препарат должен изготавливаться в соответствии с данными

условиями с соблюдением всех действующих санитарных норм и правил.

Препарат должен соответствовать характеристикам, указанным в

таблице 27

Таблица 27 - Характеристика препарата

Наименование показателя Характеристика препарата

Внешний вид Воздушно-сухой порошок

Запах Без запаха

Цвет От белого до бежевого оттенка

По микробиологическим показателям препарат должен быть

стерильным. Препарат готовят в асептических условиях, пользуются

стерильной посудой, соблюдают стерильность при их упаковке, после

приготовления стерилизуют.

Проверку стерильности производят в боксах со строгим соблюдением

правил асептики. Делают посев на тиогликолевую среду (для выявления

различных бактерий, в том числе анаэробов) и посев на среду Сабуро (для

выявления грибов, в том числе рода Candida). Если нет роста микробов на

средах, то препарат является стерильным. Если лекарственное

средство обладает антимикробным действием, то стерильность определяют

путем мембранной фильтрации. После фильтрации исследуемого препарата

фильтр делят на части и вносят для роста задержанных микроорганизмов в

жидкие питательные среды. При отсутствии роста препарат считается

стерильным.

126

6.7 Упаковка и маркировка

Упаковка препарата в асептических условиях в стеклянные флаконы

объёмом 10 мл с резиновыми пробками с алюминиевой фольгой.

Маркировку препарата осуществляют таким образом, что на каждую

единицу препарата наносят маркировку трафаретом или наклеиванием

этикетов, содержащих следующую информацию: наименование

предприятия-изготовителя, адрес, наименование препарата, номер партии,

масса нетто, дата изготовлении, состав, способ применения, срок годности,

условия хранения.

6.8 Требования безопасности

Все операции производятся в специальных «чистых» помещениях,

отвечающих требованиям «Правил организации производства и контроля

качества лекарственных средств [GMP] (от 01 февраля 2013 года)» в

соответствии с рекомендациями сборника методических указаний

«Организация и контроль производства лекарственных средств. Стерильные

лекарственные средства» (МУ 42-51-1-93 + МУ 42-51-26-93 с изменениями,

внесенными МУ 64-09-001-2002).

Технологический процесс осуществляется в помещениях 2–го класса

чистоты (число частиц размером 0,5 мкм в литре воздуха не более 25) с

использованием установок ламинарного потока стерильного воздуха – 1-й

класс чистоты (число частиц размером 0,5 мкм в литре воздуха не более 2–х).

6.9 Приемка

Приемку каждой серии каждого вида поставляемых исходных,

упаковочных и печатных материалов проводят в соответствии с письменной

инструкцией. По результатам приемки должен быть оформлен протокол.

127

Протоколы приемки должны включать в себя следующие данные:

a) наименование материала по накладной и обозначение на упаковке;

b) внутризаводское наименование или код материала (если они

отличаются от указанных в перечислении а);

c) дату приемки;

d) наименования поставщика и производителя (по возможности);

e) номер серии производителя;

f) общее количество полученных материалов и число единиц упаковки;

g) номер, присвоенный после приемки;

h) замечания (например, о состоянии упаковки).

Следует разработать и утвердить инструкции по внутризаводской

маркировке, карантину и хранению исходных, упаковочных и других

материалов.

6.10 Методы контроля

Определение внешнего вида и цвета проводят визуально

Аппаратура и материалы:

- весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104;

- скальпели и ножницы по ГОСТ 21240;

- пинцеты по ГОСТ 21241;

- pH-метр или другой прибор для определения рН среды в интервале 1-14 с

погрешностью не более 0.1 ед. рН;

- автоклав вертикальный или горизонтальный по ГОСТ Р МЭК 61 О 1 0-2-

041;

- микроскопы марок МБИ и МБР по ГОСТ 28489;

- холодильник бытовой электрический по ГОСТ 16317;

- термостат любого типа, обеспечивающий температуру нагрева от 20 до

100ºС;

- спиртовка лабораторная стеклянная по ГОСТ 25336;

128

- пипетки градуированные по ГОСТ 29227;

- колбы

- стекла предметные для микропрепаратов по ГОСТ 9284;

- пробирки П 1-16-160 ХС по ГОСТ 25336;

- чашки ЧБН-3-100 по ГОСТ 25336;

- воронки В-I00-150(200) по ГОСТ 9147;

- штативы для пробирок ПО ТУ 64-1-2669;

- бумага фильтровальная лабораторная по ГОСТ 12026;

- вата медицинская гигроскопическая по ГОСТ 9412;

- марля медицинская по ГОСТ 9412;

- масло иммерсионное для микроскопии по ГОСТ 13739;

- ферментер горизонтального или вертикального типа ГОСТ Р 51738-2001

-бактерицидные лампы Санитарно-эпидемологическое нормирование РФ

3.5.1904-04;

- спектрoфотометр типа Hitachi-2000 или СФ-56 (ЛОМО)

- вакуумный насос ГОСТ Р 52615-2006

- делительные воронки по ГОСТ 25336-82

- градуированные мерные цилиндры ГОСТ 1770-74

- колонка для хроматографии по ГОСТ 7197-93

- кюветы для биоавтографии ГОСТ 20903-75

- масс-спектрометре Ultraflex II MALDI ToF/ToF “BrukerDaltoniсs”

(Германия)

- ИК-Фурье спектрометр Nicolet-iS10 (ThermoFisherScientific, США)

- полупрепаративная колонка Luna C18 100A размерами 250×10 мм

(Phenomenex, США)

- флаконы из дрота или стекломассы для лекарственных средств с резиновой

пробкой с алюминиевым колпочком ГОСТ 17768-90

Для контроля и подтверждения видовой принадлежности штамма

T. citrinoviride TYVI 4/11 рекомендуется сделать ПЦР. Штамм имеет

129

следующую последовательность, зарегистрированную в NCBI под шифром

KF928670:

GTTCTGTTGCCTCGGCGGGGGTCTCTGCCCCGGGCGCGTCGCGGCCCCG

GGGCCCATGGCGCCCGCCGGAGGACCAACTCAAACTCTTTTTTCTCTCC

GTCGCGGCCTACGTCGCGGCTCTGTTTTATTTTTGCTCTGAGCCTTTCTC

GGCGACCCTAGCGGGCGTCTCGAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACG

GATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAG

TAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGGGTCTTTGGGCGCGCAT

TGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAA

CCCTCGAACCCCTCCGGGGGGTCGGCGTTGGGGATCGGCCCCTCACCG

GGCCGCCCCCGAAATACAGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCGC

AATAGTTTGCACACTCGCACCGGGAGCGCGGCGCGGCC

Определение антибиотической активности рекомендуется проводить

методом диффузии в агар. Величину диаметра зоны подавления роста тест -

культур штаммом T. citrinoviride ВКПМ F-1228 оценивали на 2-e сутки (для

грамположительных бактерий – для 3 видов Bacillus: B. subtillus АТСС 6633,

B. coagulans 429, B. mycoides 537 и для штаммов: M. luteus NCTC 8340,

S. aureus FDA 209P, а так же для грамотрицательных бактерий E.coli ATCC

25922), и на 5-7 сутки (для патогенных мицелиальных и дрожжевых

микроскопических грибов A. niger INA 00760, C. albicans АТСС 2091,

C.tropicalis INA 00763 и условно-патогенных микромицетов – 8 видов рода

Aspergillus: A. oryzae 1К, A. niger 2К, A. fisheri 3К, A. terreus 4К, A. fumigatus

5К, A. ustus 6К, A. flavus 7К, A. nidulans 8К, а так же на 4 видах токсигенных

Penicillium: P. nalgiovense 18Р, P. roqueforti 233Р, P. commune 27Р,

P. chrysogenum 30Р). Полученные результаты интерпретировали следующим

образом: 0 мм – активности нет; до 10 мм – слабая чувствительность; от 10

до 25 мм – средняя чувствительность; 25 мм и более – высокая

чувствительность.

130

Для сравнительной оценки активности штамма T.citrinoviride TYVI

4/11 использовали коэффициент антибиотической активности, который

рассчитывали по формуле:

Ка =

где Ка – коэффициент антибиотической активности гриба, мм;

А – сумма диаметров зон подавления тест-объектов, мм;

К – количество тест-объектов

6.11 Хранение

Срок годности 2 года. Список Б. В сухом, защищенном от света месте

при температуре не выше 25 °С.

131

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Грибы были первыми источниками антибиотиков, с которых началась

успешная эра лечения многих бактериальных инфекций, а позднее и микозов.

Но если арсенал антибактериальных препаратов за 70 лет с момента

внедрения антибиотиков в медицину значительно расширился, эффективных

антигрибных лекарств найдено мало, а к уже применяемым антимикотикам

наблюдается появление резистентных штаммов [31,9].

Одними из перспективных антибиотиков являются нерибосомальные

пептиды, позволяющие эффективно бороться с антибиотикорезистентными

микроорганизмами [95].

Последние достижения в медицинской микологии, геномики и

протеомике грибов дают основание считать, что грибы способны

продуцировать огромное разнообразие еще не известных антигрибных

соединений, в том числе нерибосомальных пептидов, пептаиболов

[31,47,166].

Проведенный нами анализ литературы позволил предположить, что

одними из перспективных таксономических групп грибов для разработки

этой проблемы являются аскомицеты, причем в первую очередь порядков

Hypocreales и Eurotiales. Это предположение оказалось верным для порядка

Hypocreales среди представителей которого способность к синтезу

антигрибных соединений оказалась выше, чем среди евроциевых грибов и

других таксонов аскомицетов. В целом же способность к продукции

антимикотических соединений с высокой и умеренной активностью

обнаружена у более трети проверенных штаммов аскомицетов. И если в

данном исследовании для дальнейшей работы были отобраны только высоко

активные штаммы по продукции антигрибных веществ в жидкой среде, то в

будущем, конечно, более детально должны рассматриваться и многие другие

штаммы с умеренной активностью, таксономическое разнообразие которых

много выше. Практически все штаммы с высокой антигрибной активностью

132

оказались представителями нескольких видов триходерм. Это согласуется с

тем, что уже многие годы при скрининге изолятов для защиты растений от

грибных патогенов одними из лучших были штаммы триходерм [141]. В

последние годы установлено, что грибы рода Trichoderma синтезируют около

600 различных пептаиболов, проявляющих активность в отношении

опухолевых клеток, грамположительных бактерий, патогенных грибов и

дрожжей [169]. У представителей T. сitrinoviride наблюдали активность в

отношении стафилококков с множественной резистентностью [105], а у

штамма T. citrinoviride 2963 был обнаружен антибиотик из группы

пептаиболов, подавляющий рост метициллинрезистентного золотистого

стафилококка [1].

Данная работа на представительной выборке изолятов показывает, что

действительно этот таксон грибов не исчерпал себя и требует дальнейшего

изучения. Способность к проявлянию умеренной и высокой активности

обладали 59% и 13% штаммов триходерм. В то время как, например, среди

пенициллов 42% и 0,4%, аспергиллов 30 % (умеренная активность). У нового

штамма T. citrinoviride ВКПМ F-1228 обнаружен ряд неизвестных ранее

пептаиболов с новым спектром биологической активности.

Следует отметить, что если среди представителей евроциевых

(пенициллов, аспергиллов и др.) чаще обнаруживали эффективных

продуцентов антибактериальных антибиотиков, нашедших широкое

применение в медицине, то среди гипокрейных, по-видимому, есть шанс

выявить такие же перспективные для фармацевтики антигрибные препараты.

Огромное разнообразие вторичных метаболитов обнаруживаемых

ежегодно у грибов, большой потенциал неизвестных грибных организмов и

необследованных регионов Земли позволяют считать, что многие соединения

необходимые для лечения инфекционных болезней остаются неоткрытыми.

Сравнительный анализ экотопов, в которых наиболее часто выявляются

изоляты с высокой и умеренной антигрибной активностью, показал, что это

верхние гумусовые горизонты почв, в первую очередь лесостепной/степной

133

зоны, богатые органическим веществом, торфяные горизонты и

разлагающиеся растительные остатки и местообитания связанные

беспозвоночными (буровая мука и др.). Это вполне согласуется с тем, что в

таких экотопах высока плотность микроорганизмов и конкуренция между

ними. В экстремальных местообитаниях высоко активных антигрибных

штаммов не было обнаружено, что связано в большим экологическим

«вакуумом». Вместе с тем, выявлены таксоны с умеренной активностью

которые следует использовать в дальнейшей работе по поиску новых

антимикотиков.

Важным достижением работы можно считать отработку процедуры

оптимизации условий синтеза, выделения и очистки антибиотического

комплекса пептаиболов у T. citrinoviride ВКПМ F-1228. Этот этап

исследований заложил основу для проверки, имеющихся в настоящее время в

коллекции 9 активных штаммов разных видов рода Trichoderma, в более

короткие сроки первичное изучение продукции пептаиболов.

Предложенный лабораторный регламент дает возможность

нарабатывать партии препарата с антибиотическим комплексом пептаиболов

для дальнейших испытаний и исследований, так как полученные в данной

работе результаты по отсутствию токсичности, спектру антимикробной

активности, включая ингибирование резистентных к антигрибным

препаратам клинических изолятов аспергиллов имели положительный

результат.

134

ВЫВОДЫ

1. Дана оценка распространенности среди микроскопических грибов

отдела Ascomycota с акцентом на порядки Eurotiales и Hypocreales

способности к продукции антигрибных соединений. Число

высокоактивных штаммов составляло около 2% от общего количества

изолятов (914), с умеренной активностью - 38%, а подавляющее число

культур характеризовалось слабой антимикотической активностью или

ее не проявляли к тест-культуре А.niger 2К. Среди грибов порядка

Eurotiales умеренную и высокую антигрибную активность проявили

39% и 1% штаммов, а среди порядка Hypocreales - 52% и 9%,

соответственно. Наиболее широко способностью к образованию

антимикотических веществ распространена среди представителей рода

Trichoderma (доля умеренно и высокоактивных культур среди штаммов

триходерм 59% и 13%). Значительное число штаммов с умеренной

активностью выявлено среди видов родов Emericellopsis,

Acrostalagmus, Fusarium, Acremonium, Tolypocladium, Cladosporium,

Penicillium.

2. Для поиска высоко активных продуцентов антимикотиков

перспективными являются экониши, богатые органическим веществом

(растительные остатки и верхние гумусовые горизонты, торфяные

почвы, буровая мука). Штаммы с максимальной активностью и

широким спектром утилизации субстратов были выделены из

растительных субстратов и гумусовых горизонтов почв степной и

лесостепной зон.

3. На основании максимальной антигрибной активности и широкого

спектра утилизации различных соединений из 9 наиболее

перспективных культур отобран штамм T.citrinoviride ВКПМ F-1228.

Экстракты культуральной жидкости штамма активны в отношении

условно-патогенных штаммов грибов и бактерий, обладают

135

цитотоксичностью к опухолевым клеткам Colo 357 и T3M4. Комплекс

антибиотиков штамма не проявлял токсичного действия к клеткам

млекопитающих (сперматозоидам быка).

4. Проведена оптимизация условий выращивания штамма, которая

позволила повысить антигрибную активность экстрактов

культуральной жидкости в 1,8 раза. Для продукции внеклеточных

антибиотических соединений штаммом T.citrinoviride ВКПМ F-1228

оптимальным было поверхностное культивирование на

модифицированной среде Сабуро (содержание глюкозы – 30,0 г и

пептона – 12,5 г в 1 л, рН – 7,5) при температуре 28оС в течение 12-14

суток.

5. Разработана схема выделения и очистки внеклеточных антибиотиков,

образуемых штаммом T. сitrinoviride ВКПМ F-1228. Охарактеризован

спектр их антимикробной активности, показано действие на

антибиотикорезистентные культуры аспергилов. Сравнение

биологической активности и молекулярных масс этих антибиотиков с

данными базы пептаиболов указывает на гомологию этих веществ с

пептаиболами, один из которых известен как трихозин. Разработан

лабораторный регламент безотходного производства препарата

антимикотических веществ - пептаиболов из T. citrinoviride ВКПМ F-

1228.

136

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Алимова, Ф.К. Trichoderma Hypocrea (Fungi, Ascomycetes, Hypocreales):

таксономия и распространение / Ф.К. Алимова - Казань: Казанский

гос. универ., 2005. – 264 с.

2. Гайдадин, А.Н. Применение полного факторного эксперимента при

проведении исследований / А.Н. Гайдадин, Ефремова С.А. – Волгоград:

ВолгГТУ, 2008. – 16 с.

3. Горленко, М.В. Все о грибах / М.В. Горленко, Л.В. Гарибова, И.М.

Сидорова и др. – Москва: Лесная промышленность, 1985. - 280 с.

4. Егоров, Н.С. основы учения об антибиотиках / Н.С. Егоров – Москва:

Наука, 2004. – 528 с.

5. Литвинов, М.А. Методы изучения почвенных микроскопических

грибов / М.А. Литвинов – Ленинград: Наука, 1969. – 121с.

6. Матвеева, М.В. Газовая и высокоэффективная жидкостная

хроматография: Методические указания / М.В. Матвеева, Карпов С.И.,

Стоянова О.Ф. – Воронеж: ВГУ, 2003. – 31 с.

7. Орлова, Т.И. Биологически активные нерибосомальные пептиды. II.

Нерибосомальные пептиды различного биологического действия / Т.И.

Орлова, Булгакова В.Г., Полин А. // Антибиотики и химиотерапия. –

2011. - Т. 36, № 11-12. – С. 30 – 33.

8. Роганов, Г.Н. Методы очистки и определение физических констант

органических соединений / Г.Н. Роганов, Баранов О.М. – Могилев:

МГУП, 2012. – 26 с.

9. Тренин, А.С. Методология поиска новых антибиотиков: состояние и

перспективы / А.С. Тренин // Антибиотики и химиотерапия. – 2015. –

Т. 7, № 8. – С. 43 - 46.

10. Цыренова, С.Б. Методические указания к самостоятельной работе и

лабораторному практикуму по физической химии

«Хроматографические методы анализа» / С.Б. Цыренова, Балдынова

Ф.П., Карпенко Л.В. – Улан-Удэ: ВСГТУ, 2001. – 34 с.

137

11. Экспресс-метод оценки токсичности проб воздуха по

водорастворимым компонентам с использованием в качестве тест-

объекта спермы крупного рогатого скота. Методические рекомендации.

№ 29ФЦ/2688.Утверждено заместителем Главного государственно

санитарного врача РФ Е.Б. Беляевым 30.05.2003.

12. Abid, A. Fungi as chemical industries and genetic engineering for the

production of biologically active secondary metabolites / A. Abid, Ahmad

B., Bacha N. et. al // Asian Pac J Trop Biomed. – 2014. – V. 4, № 11. – P.

859-870.

13. Ahmed, M.Z. A new enniatin antibiotic from the endophyte Fusarium

tricinctum Corda / M.Z. Ahmed, Ahmad M.M., Angela I.C. // The Journal of

Antibiotics. - 2014. – V. 68, № 3. - P. 1–4.

14. Akyuz, M. Antimicrobial Activity of some Edible Mushrooms in the

Eastern and Southeast Anatolia Region of Turkey / M. Akyuz, Erecevit P.,

Kirbag S. et. al // 2010. Gazi University J Sc. – 2010. – V. 23 (№ 2). – P.

125-130.

15. Alanis, A.J. Resistance to antibiotics: are we in the post-antibiotic era? /

A.J. Alanis // Arch Med Res. – 2005. – T. 36, № 6. – P. 697-705.

16. Aly, A.H. Fungal endophytes from higher plants: a prolific source of

phytochemicals and other bioactive natural products / A.H. Aly, Debbab A.,

Kjer J. et. al // Fungal Divers. – 2010. – V. 41. – P. 1–16.

17. Aminov, R.I. Evolution and ecology of antibiotic resistance genes / R.I.

Aminov, Mackie R.I. // FEMS Microbiol Lett. – 2007. - V. 271. – P. 147–

161.

18. Anke, T. The strobilurins - new antifungal antibiotics complex from the

basidiomycete Strobiurus tenacellus (Pers. ex Fr.) Sing. / T. Anke,

Oberwinkler F., Steglich W. et. al // J. Antibiot. – 1977. – V. 30. – P. 806-

810.

19. Anke, T. Antibiotics from basidiomycetes. XVIII. Strobilurin C and

oudemansin B, two new antifungal metabolites from Xerula species

138

(Agaricales) / T. Anke, Besl H., Mocek U. et. al // J. Antibiot. – 1983. - V.

36. – P. 661-666.

20. Anke, T. The antifungal strobilurins and their possible ecological role / T.

Anke // Can J Bot. – 1995. – V. 73. – P. 940–945.

21. Appel, J. Entwicklung der Strobilurinresistenz des Weizenmehltaus in

Europa in den Jahren 1998 bis 2000 / J. Appel, Felsenstein F.G. // Mitt Biol

Bundesanst. – 2000. – V. 376. – 97 p.

22. Arai, T. A new antibiotic, leucinostatin, derived from Penicillium lilacium /

T. Arai, Fukushima T., Mikami Y. et. al // J. Antibiot. – 1973. – V. 26. – P.

1606-1612.

23. Aretz, W. Abstracts of the 9th Dechema Meeting on Natural Products? / W.

Aretz, Knauf M., Kogler H. et. al // Irsee Monastry: Germany. – 1997. -

poster 18.

24. Argoudelis, A.D. Zervamicins I and II, polypeptide antibiotics produced by

Emericellopsis salmosynnemata / A.D. Argoudelis, Dietz A., Johnson L.E. //

J. Antibiot. – 1974. – V. 27. – P. 321-328.

25. Auvin-Guette, C. Trichogin A IV, an 11-residue lipopeptaibol from

Trichoderma longibrachiatum / C. Auvin-Guette, Bodo B., Prigent Y. et. al

// J. Am. Chem. Soc. – 1992. – T. 114. – P. 2170 - 2174.

26. Auvin-Guette, C. Structural elucidation of trikoningins KA and KB,

peptaibols from Trichoderma koningii / C. Auvin-Guette, Bodo B., Massias

M. et. al // J. Chem. Soc. - 1993. – V. 1. – P. 249 - 255.

27. Beautement, K. Stereocontrolled syntheses of strobilurin A and its (9E)-

isomer / K. Beautement, Clough J.M. // Tetrahedron Lett. – 1987. – V. 28. –

P. 475–478.

28. Becker, J. Polyoxin D inhibits the growth of zoopathogenic fungi / J.

Becker, Covert N., Naider F. et. al // Antimicrob. Agents Chemother. –

1983. – V. 23. – P. 926-929.

139

29. Benz, F. Echinocandin B, ein neuartigues polypeptid antibioticum aus

Aspergillus nidulans var echinlatus: Isolierung and Baudsteine / F. Benz,

Knuesel F., Nuesch J. // Helv. Chim. Acta. – 1985. – V. 57. – P. 2459-2477.

30. Berdy, J. Handbook of Antibiotic Compounds / J. Berdy - United States:

CRC Press Inc, 1987. – 416 p.

31. Berdy, J. Thoughts and facts about antibiotics: where we are now and where

we are heading / J. Berdy // Journal of Antibiotics. – 2012. - V. 65. – P. 385-

395.

32. Berridge, M.V. Tetrazolium dyes as tools in cell biology: new insights into

their cellular reduction / M.V. Berridge, Herst P.M., Tan A.S. //

Biotechnology Annual Review. – 2005. – V. 11. – P. 127-152.

33. Bills, G.F. Enhancement of antibiotic and secondary metabolite detection

from filamentous fungi by growth on nutritional arrays / G.F. Bills, Collado

J, Fillola A et. al // J Appl Microbiol. – 2008. – V. 104, № 6. – P. 1644 -

1658.

34. Blunt, J.W. Marine natural products / J.W. Blunt, Copp B.R., Munro

M.H.G. et. al // Nat Prod Rep. - 2011. – V. 26 (2). – P. 170-244.

35. Bode, H.B. The impact of bacterial genomics on natural product research /

H.B. Bode, Muller R. // Angew. Chem. – 2005. – V. 44. – P. 6828–6846.

36. Bok, J.W. GliZ, a transcriptional regulator of gliotoxin biosynthesis,

contributes to Aspergillus fumigatus virulence / J.W. Bok, Andes D., Balajee

S.A. et. al // Infect Immun. – 2006. – V. 74. – P. 6761–6768.

37. Boot, C.M. Highly N-methylated linear peptides produced by an atypical

sponge-derived Acremonium sp. / C.M. Boot, Crews P., Tenney K. et. al // J.

Nat. Prod. – 2006. – V. 69. – P. 83-92.

38. Breton, R.C. Using NMR to identify and characterize natural products /

R.C. Breton, Reynolds W.F. // Nat Prod Rep. – 2013. – V. 30. – P. 501–534.

39. Brückner, H. Paracelsin, a peptide antibiotic containing alpha-

aminoisobutyric acid, isolated from Trichoderma reesei Simmons. Part A /

H. Brückner, Gräf H. // Experientia. – 1983. – V. 39, №5. – P. 528 - 530.

http://scholar.google.ru.sci-hub.io/scholar_url?url=http%3A%2F%2Fpubs.acs.org.sci-hub.io%2Fdoi%2Fabs%2F10.1021%2Fnp0503653&hl=ru&sa=T&ct=res&cd=0&ei=_5IgV-7hAYnLjAHxoraADQ&scisig=AAGBfm1_ZF7M23lQc5J45V5SkBvUuXwGhA&nossl=1&ws=1536x730

http://scholar.google.ru.sci-hub.io/scholar_url?url=http%3A%2F%2Fpubs.acs.org.sci-hub.io%2Fdoi%2Fabs%2F10.1021%2Fnp0503653&hl=ru&sa=T&ct=res&cd=0&ei=_5IgV-7hAYnLjAHxoraADQ&scisig=AAGBfm1_ZF7M23lQc5J45V5SkBvUuXwGhA&nossl=1&ws=1536x730

140

40. Brückner, H. GC‐MS detection of aib‐containing polypeptide mycotoxins

(antibiotics) in Penicillium roqueforti and other filamentous fungi / H.

Brückner, Reinecke C. //J. High Resolut. Chromatogr. Commun. – 1988. –

V. 11. – P. 735-738.

41. Brückner, H. Chromatographic assays for the rapid and sensitive detection

of peptaibol mycotoxins (antibiotics) in filamentous fungi / H. Brückner,

Reinecke C. // J. High Resolut. Chromatogr. – 1989. – V. 12. – P. 113-116.

42. Brückner, H. Chromatographic detection of bioactive Aib-peptides in

moulds of the genus Stilbella / H. Brückner, Nuber K, Reinecke C. //

Fresenius Z. Anal. Chem. – 1989. –V. 333. – P. 777–778.

43. Brückner, H. Production of polypeptide antibiotics by molds of the genus

Gliocladium. In Second Forum on Peptides / H. Brückner, Kussin C.,

Wunsch P. // John Libbey Eurotex. – 1989. – V. 174. – P. 103–106.

44. Brückner, H. Fully automated high-performance liquid chromatographic

separation of DL-amino acids derivatized witho-phthaldialdehyde together

withN-isobutyryl-cysteine. Application to food samples / H. Brückner,

Godel H., Wittner R. // Chromatographia. – 1991. – V. 32, № 7. – P. 383-

388.

45. Brückner, H. / H. Brückner, Jaworski A., Kirschbaum J. - In Proceedings of

the 27th

European Peptide Symposium: Sorrento, Italy, September 2002.

46. Bugni, T.S. Yanuthones: novel metabolites from a marine isolate of

Aspergillus niger / T.S. Bugni // J. Org. Chem. – 2000. – V. 65. – P. 7195–

7200.

47. Butler, M.S. The role of natural product chemistry in drug discovery / M.S.

Butler // J Nat Prod. – 2004. – V. 67. – P. 2141–2153.

48. Caruso, M.L. Novel basic-region helix–loop–helix transcription factor

(AnBH1) of Aspergillus nidulans counteracts the CCAAT-binding complex

AnCF in the promoter of a penicillin biosynthesis gene / M.L. Caruso,

Brakhage A.A., Litzka O. et. al // J. Mol. Biol. – 2002. – V. 323. – P. 425–

439.

http://scholar.google.ru.sci-hub.io/scholar_url?url=http%3A%2F%2Fonlinelibrary.wiley.com.sci-hub.io%2Fdoi%2F10.1002%2Fjhrc.1240111013%2Fabstract&hl=ru&sa=T&ct=res&cd=0&ei=jZ0gV4zeMMqZjAHA95iwDA&scisig=AAGBfm3hxIsL293gbusbwoQdwJPLZeuxrQ&nossl=1&ws=1536x730

http://scholar.google.ru.sci-hub.io/scholar_url?url=http%3A%2F%2Fonlinelibrary.wiley.com.sci-hub.io%2Fdoi%2F10.1002%2Fjhrc.1240111013%2Fabstract&hl=ru&sa=T&ct=res&cd=0&ei=jZ0gV4zeMMqZjAHA95iwDA&scisig=AAGBfm3hxIsL293gbusbwoQdwJPLZeuxrQ&nossl=1&ws=1536x730

http://scholar.google.ru.sci-hub.io/scholar_url?url=http%3A%2F%2Fonlinelibrary.wiley.com.sci-hub.io%2Fdoi%2F10.1002%2Fjhrc.1240120213%2Fabstract&hl=ru&sa=T&ct=res&cd=0&ei=Np4gV-yHJYjYjAHqpKXABA&scisig=AAGBfm1bsfkwhBBteOtcK_8npnuc1ppwoA&nossl=1&ws=1536x730

http://scholar.google.ru.sci-hub.io/scholar_url?url=http%3A%2F%2Fonlinelibrary.wiley.com.sci-hub.io%2Fdoi%2F10.1002%2Fjhrc.1240120213%2Fabstract&hl=ru&sa=T&ct=res&cd=0&ei=Np4gV-yHJYjYjAHqpKXABA&scisig=AAGBfm1bsfkwhBBteOtcK_8npnuc1ppwoA&nossl=1&ws=1536x730

141

49. Chiang, Y.M. Molecular genetic mining of the Aspergillus secondary

metabolome: discovery of the emericellamide biosynthetic pathway / Y.M.

Chiang // Chem. Biol. – 2008. – V. 15. – P. 527–532.

50. Chikanishi, T. Clonostachin, a novel peptaibol that inhibits platelet

aggregation / T. Chikanishi, Endo A., Harada T. et. al // J. Antibiotics. -

1996. – V. 50. – P. 105–110.

51. Chugh, J.K. Peptaibols: models for ion channels / J.K. Chugh, Wallace B.A.

// Biochemical Society Transactions. - 2001. – V. 29. – P. 565–570.

52. Clough, J.M. The strobilurin fungicides—from mushroom to molecule to

market / J.M. Clough – Cambridge: The Royal Society of Chemistry, 2000. -

P. 277–282.

53. Crawford, J. Bacterial symbionts and natural products / J. Crawford, Clardy,

J. // Chem. Comm. – 2011. – V. 47. – P. 7559–7566.

54. Csermely, P. The nonapeptide leucinostatin A acts as a weak ionophore and

as an immunsuppressant on T lymphocytes / P. Csermely, Mihaly K.,

Radics L. et. al // Biochim. Biophys. Acta. - 1994/ - V. 1221. – P. 125–132.

55. Daniel, F. de S. J. Peptaibols from Trichoderma / F. de S. J. Daniel, Filho

E.R. // Nat. Prod. Rep. – 2007. – V. 24. – P. 1128-1141.

56. Das, M.K. Membrane modifying activity of four peptide components of

antiamoebin, a microheterogenous fungal antibiotic / M.K. Das, Balaram P.,

Krishna K. // Indian J. Biochem. Biophys. – 1988. – V. 25. – P. 560-565.

57. Degenkolb, T. The occurrence of peptaibols and structurally related

peptaibiotics in fungi and their mass spectrometric identification via

diagnostic fragment ions / T. Degenkolb, Berg A., Gams W. et. al //J. Pept.

Sci. - 2003. – V. 9. – P. 666-678.

58. Degenkolb, T. Recent advances and future prospects in peptaibiotics,

hydrophobin, and mycotoxin research, and their importance for

chemotaxonomy of Trichoderma and Hypocrea / T. Degenkolb, Brückner

H., Nielsen K.F. et. al // Chem Biodivers. - 2008. –Vol. 5. – Р. 671– 680.

142

59. De Lucca, J. Antifungal peptides: potential candidates for the treatment of

fungal infections / J. De Lucca // Ехр. Opin. Invest. Drugs. – 2000. - V. 9,

№ 2. – P. :273-299.

60. Denning, D.W. Echinocandins and pneumocandins - a new antifungal class

with a novel mode of action / D.W. Denning // J Antimicrob Chemother. –

1997. – V. 40. – P. 611–614.

61. Dennis, C. Antagonistic properties of species-groups of Trichoderma. I.

Production of non-volatile antibiotics / C. Dennis, Webster J. //

Trunsuctions of the British Mycological Societ. – 1971. – V. 57. – P. 25-39.

62. Dennis, C. Antagonistic properties of species-groups of Trichoderma. II.

Production of volatile antibiotics / C. Dennis, Webster J. // Transactions of

the British Mycologia Society. – 1971. – V. 57. – P. 41-48.

63. Ding, T. Evaluation of antimicrobial activity of endophytic fungi from

Camptotheca acuminata (Nyssaceae) / T. Ding, Gao Z.M., Jiang T. et. al //

Genet Mole Res. – 2010. – V. 9 (№ 4). – P. 2104-2112.

64. Dorfelt, H. Neue Makromyceten‐Kollektionen von Vietnam und deren

systematische und ökogeographische Bedeutung / H. Dorfelt, Berg A., Kiet

T.T. // Feddes Repert. – 2004. – V. 115. – P. 164-177.

65. Dornberger, K. Chrysospermins, new peptaibol antibiotics from Apiocrea

chrysosperma Ap 101 / K. Dornberger, Fleck W.F., Grafe U. et. al // J.

Antibiotics. – 1995. – V. 48. – P. 977–989.

66. Duong, M.L. Fungi on leaf litter / M.L. Duong, Hyde K.D., Lumyong S. -

Bangkok: BIOTEC, 2004. - P. 163–171.

67. Elander, R.P. Industrial production of β-lactam antibiotics / R.P. Elander //

Appl Microbiol Biotechnol. – 2003. – V. 61. – P. 385–392.

68. Electrospray and MALDI Mass Spectrometry / edited by Richard B.C. -

Wiley, 2010. - 897 p.

69. Fox, E.M. Secondary metabolism: regulation and role in fungal biology /

E.M. Fox, Howlett, B.J. // Curr. Opin. Microbil. – 2010. – V. 11. – P. 481–

487.

http://scholar.google.ru.sci-hub.io/scholar_url?url=http%3A%2F%2Fonlinelibrary.wiley.com.sci-hub.io%2Fdoi%2F10.1002%2Ffedr.200311034%2Fabstract&hl=ru&sa=T&ct=res&cd=0&ei=L5cgV9XTN9DgjAH1yoLYBA&scisig=AAGBfm1GhR76cNo4MssJkfoLmuMwqehfXw&nossl=1&ws=1536x730

http://scholar.google.ru.sci-hub.io/scholar_url?url=http%3A%2F%2Fonlinelibrary.wiley.com.sci-hub.io%2Fdoi%2F10.1002%2Ffedr.200311034%2Fabstract&hl=ru&sa=T&ct=res&cd=0&ei=L5cgV9XTN9DgjAH1yoLYBA&scisig=AAGBfm1GhR76cNo4MssJkfoLmuMwqehfXw&nossl=1&ws=1536x730

143

70. Fredenhagen, A. Strobilurins F, G and H, three new antifungal metabolites

from Bolinea lutea. I. Fermentation, isolation and biological activity / A.

Fredenhagen, Cuomo V., Giuliano U. et. al // J Antibiot. – 1990. – V. 43. –

P. 655–660.

71. Fromtling, R. L-671,329, a new antifungal agent. III. In vitro activity,

toxicology, and efficacy in comparison to aculeacin / R. Fromtling, Abruzzo

G. // J. Antibiot. – 1989. – V. 42. – P .174-178.

72. Fujita, T. Structural elucidation of trichosporin-B-Ia, IIIa, IIId and V from

Trichoderma polysporum / T. Fujita, Iida A., Morita M. et. al // J. Antibiot. –

1988. – V. 41. – P. 814 - 818.

73. Fujita, T. Fungal metabolites. XIII. Isolation and structural elucidation of

new peptaibols, trichodecenins-I and — II, from Trichoderma viride / T.

Fujita, Iida A., Kanai M. et. al // Chem. Pharm. Bull. – 1994. – V. 42. – P.

489–494.

74. Gai, Y. Fusarielin E, a new antifungal antibiotic from Fusarium sp. / Y.

Gai, Hu C.Q., Zhang H.P. et. al // Chin. Chem. Lett. – 2007. – V. 18. – P.

954–956.

75. Gamboa-Angulo, M. Antimicrobial screening of tropical microfungi

isolated from sinkholes located in the Yucatán peninsula, México / M.

Gamboa-Angulo, De la Rosa-García S., Heredia-Abarca G. // African

Journal of Microbiology Research. – 2012. – V. 6 (10). – P. 2305-2312.

76. Gams, W. Biodiversity of Fungi: Standard Methods for Inventory and

Monitoring? / W. Gams, Diederich P., Poldmaa K. - New York: Academic

Press, 2004. – 343 p.

77. Gao, S.S. Penicisteroids A and B, antifungal and cytotoxic polyoxygenated

steroids from the marine alga-derived endophytic fungus Penicillium

chrysogenum QEN-24S / S.S. Gao, Li C.S., Li X.-M. et. al // Bioorg. Med.

Chem. Lett. – 2011. – V. 21. – P. 2894–2897.

144

78. Gbolagade, J.S. Antimicrobial activities of some selected Nigerian

mushrooms / J.S. Gbolagade, Fasidi I.O. // Af J Biomed Res. – 2005. – V.

8. – P. 83-87.

79. Goerke, C. Ciprofloxacin and trimethoprim cause phage induction and

virulence modulation in Staphylococcus aureus / C. Goerke, Koller J, Wolz

C. // Antimicrob. Agents Chemother. – 2006. – V. 50. – P. 171–177.

80. Gräfe, U. Helloferines: novel antifungal lipopetides Mycogone rosea:

screening, isolation, structure, and biological properties / U. Gräfe, Inh I.,

Ritzau M. // J. Antibiot. – 1995. – V. 48. – P. 128-133.

81. Grigoriev, P.A. Differences in ion–channel formation by ampullosporins B,

C, D and semisynthetic descacetyltryptophanyl ampullosporin A / P.A.

Grigoriev, Gräfe U., Hartl A. et. al // Bioelectrochem. – 2002. – V. 57. – P.

119–121.

82. Harry, M. Griseofulvin, clinical and experimental studies / M. Harry, Bell

F.K., Bereston E.S. et al // AMA Arch Derm. – 1960. – V. 81, № 1. – P. 66-

80

83. Havlicek, V. Current trends in microbial diagnostics based on mass

spectrometry / V. Havlicek, Lemr K., Schug K.A. // Anal Chem. – 2013. –

V. 85. – P. 790–797.

84. Hector, R. Evaluation of nikkomycins X and Z in murine models of

coccidiomycosis, histoplasmosis, and blastomycosis / R. Hector,

Pappagianis D., Zimmer B. // Antimicrol. Agents Chemother. – 1990. – V.

34. – P. 587-593.

85. Henriquez, M. Diversity of cultivable fungi associated with Antarctic

marine sponges and screening for their antimicrobial, antitumoral and

antioxidant potential / M. Henriquez, Araya I., Beiza A. et. al // World J.

Microbiol. Biotechnol. – 2014. – V. 30. – P. 65–76.

86. Hensens, O.D. Isolation and structure of nodulisporic acid A1 and A2,

novel insecticides from a Nodulisporium sp. / O.D. Hensens, Dombrowski

145

A.W., Ondeyka J.G. et. al // Tetrahedron Lett. – 1999. – V. 40. – P. 5455–

5458.

87. Hlimi, S. Trichorzins HA and MA, antibiotic peptides from Trichoderma

harzianum. II. Sequence determination / S. Hlimi, Bodo B., Duchamp S. et.

al // J. Antibiot. – 1995. – V. 48. –P. 1254 - 1261.

88. Hsieh, I.S. The genus Akanthomyces on spiders from Taiwan / I.S. Hsieh,

Tzean S.S., Wu W.J. // Mycologia. – 1997. – V. 89. – P. 319 -324.

89. Hussain, H. Antimicrobial constituents from endophytic fungus Fusarium

sp. / H. Hussain, Al-Harrasi A., Draeger S. et. al // Asian Pac. J. Trop. Dis.

– 2015. – V. 5. – P. 186–189.

90. Iida, A. Fungal metabolites. XVI. Structures of new peptaibols,

trichokindins I-VII, from the fungus Trichoderma harzianum / A. Iida,

Enoki A., Fujita T. et. al // Chem. Pharm. Bull. - 1994. – V. 42. – P. 1070 -

1075.

91. Imtiaj, A. Screening of Antibacterial and Antifungal Activities from Korean

Wild Mushrooms / A. Imtiaj, Lee T. //World J Agricul Sc. – 2007. – V. 3

(№3). – P. 316-321.

92. Iqbal, H.M.N. Media optimization for hyper-production of carboxymethyl

cellulase using proximally analyzed agroindustrial residue with Trichoderma

harzianum under SSF / H.M.N. Iqbal, Asgher M., Ahmed I. et. al //

International Journal for Agro Veterinary and Medical Sciences. – 2010. - V.

4. – P. 47–55.

93. Ishii, H. Occurrence and molecular characterization of strobilurin resistance

in cucumber powdery mildew and downy mildew / H. Ishii, Amano T.,

Fraaije B.A. // Phytopathology. – 2001. – V. 91. – P. 1166–1171.

94. Iwamoto, T. WF11899 A, B, and C, novel antifungal lipopeptides. II.

Biological properties / T. Iwamoto, Fuji A., Hasimoto S. et. al // J. Antibiot.

– 1994. – V. 47. –P. 1092-1097.

146

95. Johnston, W.D. Assembly and clustering of natural antibiotics guides target

identification / W.D. Johnston, Berdy J., Brown E.D. et. al // J. Nature

Chemical Biology. – 2016. - P. 1 – 10.

96. Jutamart, M. Antimicrobial activity of some saprobic fungi isolated from

Magnolia liliifera and Cinnamomum iners leaves / M. Jutamart,

Chamyuang S., Chukeatirote E. et. al // Mycology. – 2013. - P. 1-3.

97. Kawaguchi, M. New method for isolating antibiotic-producing fungi / M.

Kawaguchi, Masuma R., Nonaka K. et. al // The Journal of Antibiotics. –

2013. – V. 66. – P. 17-21.

98. Kharwar, R.N. Anticancer compounds derived from fungal endophytes:

their importance and future challenges / R.N. Kharwar, Gond S.K., Mishra

A. et. al // Nat Prod Rep. – 2011. – V. 28. – P. 1208 – 1228.

99. Kiet, T.T. New homoserine lipids from Xerocomus langbianensis / T.T.

Kiet, Gräfe U., Schlegel B. // J. Basic Microbiol. – 2002. – V. 42. – P. 133-

136.

100. Kirk, P.M. Dictionary of the Fungi / P.M. Kirk, Cannon P.F., Minter

D.W. et. al – Wallingford: CABI International, 2008. – 784 p.

101. Koehn, F.E. The evolving role of natural products in drug discovery /

F.E. Koehn, Carter G.T. // Nat Rev Drug Discov. – 2005. – V. 4. – P. 206–

220.

102. Kolesnick, R. The sphingomyelin pathway in tumor necrosis factor

and interleukin-1 signaling / R. Kolesnick, Golde D.W. // Cell. – 1994. – V.

77. – P. 325–328.

103. Kotzerke, A. Alterations in soil microbial activity and N-

transformation processes due to sulfadiazine loads in pig-manure / A.

Kotzerke, Heuer H., Sharma S. // Environ Pollut. – 2008. – V. 153. – P.

315–322.

104. Krause, C. Sequence diversity of the peptaibol antibiotic suzukacillin-

A from the mold Trichoderma viride / C. Krause, Brückner H., Jung G. et.

al // J. Pept. Sci. – 2006. – V. 12. – P. 321 - 327.

147

105. Kubicek, C.P. Facts and challenges in the understanding of the

biosynthesis of peptaibols by Trichoderma / C.P. Kubicek, Druzhinina I.S.,

Komon-Zelazowska M. et. al // Chem Biodivers. – 2007. – V. 4. – P. 1068–

1082.

106. Kuhls, K. Molecular evidence that the asexual industrial fungus

Trichoderma reesei is a clonal derivative of the ascomycete Hypocrea

jecorina / K. Kuhls, Borner T., Gams W. et. al // Proceedings of the National

Academy of Sciences of the United States of America. – 1996. – V. 93. – P.

7755-7760.

107. Kümmerer, K. Antibiotics in the aquatic environment—a review—

part I / K. Kümmerer // Chemosphere. – 2009. - V. 75. - P. 417–434.

108. Kunsari, S. Are we ready for industrial production of bioactive plant

secondary metabolites utilizing endophytes? / S. Kunsari, Spiteller M. //

Nat. Prod. Rep. – 2011. – V. 28. – P. 1203–1207.

109. Landreau, A. Combined use of LC/MS and a biological test for rapid

identification of marine mycotoxins produced by Trichoderma koningii / A.

Landreau, Biard J.F., Bodo B. et. al // J. Microbiol. Methods. – 2002. – V.

48. – P. 181-194.

110. Leclerc, G. Sequences and antimycoplasmic properties of

longibrachins LGB II and LGB III, two novel 20-residue peptaibols from

Trichoderma longibrachiatum / G. Leclerc, Bodo B., Goulard C. et. al // J.

Nat. Prod. – 2001. – V. 64. – P. 164–170.

111. Lee, S.J. Isolation and sequence analysis of new peptaibol, boletusin,

from Boletus spp. / S.J. Lee, Yeo W.H., Yoo I.D. et. al // J. Pept. Sci. –

1999. – V. 5. – P. 374-378.

112. Lee, S.J. Tylopeptins A and B, new antibiotic peptides from Tylopilus

neofelleus / S.J. Lee, Cho D.H., Yoo I.D. et. al // J. Antibiotics. – 1999. – V.

52, №11. – P. 998–1006.

http://scholar.google.ru.sci-hub.io/scholar_url?url=http%3A%2F%2Fwww.sciencedirect.com.sci-hub.io%2Fscience%2Farticle%2Fpii%2FS0167701201003220&hl=ru&sa=T&ct=res&cd=0&ei=yJ4gV4nXJNGN2AaUu53gDg&scisig=AAGBfm079PZnMJKqsaZ8ox7ufx6lLsUedA&nossl=1&ws=1536x730

http://scholar.google.ru.sci-hub.io/scholar_url?url=http%3A%2F%2Fwww.sciencedirect.com.sci-hub.io%2Fscience%2Farticle%2Fpii%2FS0167701201003220&hl=ru&sa=T&ct=res&cd=0&ei=yJ4gV4nXJNGN2AaUu53gDg&scisig=AAGBfm079PZnMJKqsaZ8ox7ufx6lLsUedA&nossl=1&ws=1536x730

http://scholar.google.ru.sci-hub.io/scholar_url?url=http%3A%2F%2Fonlinelibrary.wiley.com.sci-hub.io%2Fdoi%2F10.1002%2F%28SICI%291099-1387%28199908%295%3A8%253C374%3A%3AAID-PSC211%253E3.0.CO%3B2-X%2Ffull&hl=ru&sa=T&ct=res&cd=0&ei=kZkgV_LCIdDgjAH1yoLYBA&scisig=AAGBfm1pBbk1Tji-2fthNJwnri7KTHWgZQ&nossl=1&ws=1536x730

http://scholar.google.ru.sci-hub.io/scholar_url?url=http%3A%2F%2Fonlinelibrary.wiley.com.sci-hub.io%2Fdoi%2F10.1002%2F%28SICI%291099-1387%28199908%295%3A8%253C374%3A%3AAID-PSC211%253E3.0.CO%3B2-X%2Ffull&hl=ru&sa=T&ct=res&cd=0&ei=kZkgV_LCIdDgjAH1yoLYBA&scisig=AAGBfm1pBbk1Tji-2fthNJwnri7KTHWgZQ&nossl=1&ws=1536x730

148

113. Lee, W. The Peptaibol Database: a database for sequences and

structures of naturally occurring peptaibols / W. Lee, Walace B.A. // Nucl.

Acids Res. – 2004. – V. 32, T. 1. - P. 593-594.

114. Lehr, N.A. Antiamoebins, myrocin B and the basis of antifungal

antibiosis in the coprophilus fungus Stilbella erythrocephala (syn. S.

fimetaria) / N.A. Lehr, Anke H., Antelo L. et. al // FEMS Microbial

Ecology. – 2006. – V. 55. – P. 106-112.

115. Lesemann, S.S. Mitochondrial heteroplasmy for the cytochrome b

gene controls the level of strobilurin resistance in the apple powdery mildew

fungus Podosphaera leucotricha (Ell. & Ev.) E.S. Salmon / S.S. Lesemann,

Deising H.B., Dunemann F. // J Plant Dis Protect. – 2006. - V. 113. – P.

259–266.

116. Li, D. Induction of fibronectin adhesins in quinolone-resistant

Staphylococcus aureus by subinhibitory levels of ciprofloxacin or by sigma

B transcription factor activity is mediated by two separate pathways / D. Li,

Bisognano C., Estoppey T. et. al // Antimicrob. Agents Chemother. – 2005.

– V. 49. – P. 916–924.

117. Lorito, M. Cell wall synthesis is a major target of mycoparasitic

antagonism by Trichoderma harzianum / M. Lorito, Bodo B., Kubicek C.P.

et. al // Journal of Bacteriology. – 1996. – V. 178. – P. 6382-6385.

118. Lou, J. Endophytic fungi from medicinal herb Salvia miltiorrhiza

Bunge and their antimicrobial activity / J. Lou, Fu L., Luo H. et. al // Afr. J.

Microbiol. Res. - 2013. – V. 7. – P. 5343–5349.

119. Marlene, H. Diversity of cultivable fungi associated with Antarctic

marine sponges and screening for their antimicrobial, antitumoral and

antioxidant potential / H. Marlene, Aurelio S.M., Inmaculada V. et. al //

World J Microbiol Biotechnol. - 2013. – V. 30 (№ 1) – P. 65-76.

120. Mark, A. Helping Chemists Discover New Antibiotics / A.T. Mark,

Alysha G. E., T. Blaskovich T. et. al // Infection diseases. – 2015. – V. 1 – P.

285-287.

149

121. Martinez, D. Genome sequencing and analysis of the biomass-

degrading fungus Trichoderma reesei (syn. Hypocrea jecorina) / D.

Martinez, Arvas M., Baker S.E. et. al // Nat. Biotechnol. – 2008. – V. 26, T.

5. – P. 553–560.

122. Martín-Rodríguez, A.J. Inhibition of bacterial quorum sensing by

extracts from aquatic fungi: First report from marine endophytes / A.J.

Martín-Rodríguez, Couttolenc A., Espinoza C. et. al // Mar. Drugs. – 2014. –

V. 12. – P. 5503–5526.

123. Matsuzaki, K. A comparative study on interactions of α–

aminoisobutyric acid containing antibiotic peptides, trichopolyn I and

hypelcin, with phosphatidylcholine bilayers / K. Matsuzaki, Fujita T.,

Miyajima K. et. al // Biochim. Biophys. Acta. – 1991. - V. 1070. – P. 419–

428.

124. Mendoza-Figueroa, J. S. Peptides and Peptidomics: A Tool with

Potential in Control of Plant Viral Diseases / J.S. Mendoza-Figueroa,

Mendez-Lozano J., Soriano-Garcia M. et. al // Advances in Microbiology. –

2014. – V. 4, № 9. – P. 539-548.

125. Mikami, Y. Leucinostatins, peptide mycotoxins produced by

Paecilomyces lilacinus and their possible roles in fungal infection / Y.

Mikami, Abe F., Arai T. et. al // Zbl. Bakt. Hyg. A. – 1984. – V. 257. – P.

275–283.

126. Minas, W. Streptomycetes in microcultures: growth production of

secondary metabolites, and storage and retrieval in the 96 well format / W.

Minas, Bailey J.E., Duetz W. // Antonie Van Leeuwenhoek. -2000. – V. 78.

– P. 297–305.

127. Mohamed-Benkada, M. / M. Mohamed-Benkada, Biard J., Bissett J.

et. al // Rapid Commun. Mass Spectrom. – 2006. – V. 20. – P. 1176.

128. Mohr, H. Alamethicin biosynthesis / H. Mohr, Kleinkauf H. //

Biochim. Biophys. Acta. – 1978. –T. 526. – P. 375 - 386.

http://www.scirp.org/journal/PaperInformation.aspx?PaperID=48062

http://www.scirp.org/journal/PaperInformation.aspx?PaperID=48062

http://www.scirp.org/journal/AllArticle.aspx?JournalID=1000

150

129. Molle, G. Voltage-dependent and multi-state ionic channels induced

by trichorzianines, antifungal peptides related to alamethicin / G. Molle,

Duclohier H., Spach G. // FEBS Letters. – 1987. – V. 224. – P. 208-212.

130. Mori, Y. Structure of leucinostatin B, an uncoupler on mitochondria /

Y. Mori, Arai T., Fukushima K. // J. Antibiotics. – 1983. – V. 36. – P. 1084–

1086.

131. Morris, M.I. Echinocandins in the management of invasive fungal

infections, part 1 / M.I. Morris, Villmann M. // Am J Health Syst Pharm. –

2006. – V. 63. – P. 1693–1703.

132. Morris, M.I. Echinocandins in the management of invasive fungal

infections, part 2 / M.I. Morris, Villmann M. // Am J Health Syst Pharm. –

2006. – V. 63. – P. 1813–1820.

133. Mosadeghzad, Z. Chemical components and bioactivity of the marine-

derived fungus Paecilomyces sp. Collected from Tinggi Island, Malaysia / Z.

Mosadeghzad, Asmat A., Farahani G.H.N. et. al //Chem. Nat. Compd. –

2013. – V. 49. – P. 621–625.

134. Nagaray, G. Antimalarial Activities of Peptide Antibiotics Isolated

from Fungi / G. Nagaray, Balaram H., Shivayoigi M.S. et. al // Antimicrob.

agents chemotherapy. – 2009. – V. 45, № 1. – P. 145 – 149.

135. Nara, F. Scyphostatin, a neutral sphingomyelinase inhibitor from a

discomycete, Trichopeziza mollissima: taxonomy of the producing

organism, fermentation, isolation, and physico-chemical properties / F. Nara,

Hosoya T., Ogita T. et. al // J Antibiot. – 1999. – V. 52. – P. 525–530.

136. Nara, F. Biological activities of scyphostatin, a neutral

sphingomyelinase inhibitor from a discomycete, Trichopeziza mollissima /

F. Nara, Doi-Yoshioka H., Masuda-Inoue S. et. al // J Antibiot. – 1999. – V.

52. – P. 531–535.

137. Neuhof, T. Intact-cell MALDI-TOF mass spectrometry analysis of

peptaibol formation by the genus Trichoderma. Hypocrea: can molecular

151

phylogeny of species predict peptaibol structures? / T. Neuhof, Dieckmann

R., Druzhinina I. et. al // Microbiology. – 2007. –Vol. 153. - Р. 3417–3437.

138. Newman, D.J. Natural products as sources of new drugs over the last

25 years / D.J. Newman, Cragg G.M. // J Nat Prod. – 2007. - V. 70. – P.

461–477.

139. Nguyen, H.H. Synthesis and biological evaluation of analogues of the

peptaibol ampullosporin A / H.H. Nguyen, Gera L., Gräfe U. et. al // J. Med.

Chem. – 2002. – V. 45. – P. 2781–2787.

140. Ondeyka, J.G. Nodulisporic acid A, a novel and potent insecticide

from a Nodulisporium sp. isolation, structure determination, and chemical

transformations / J.G. Ondeyka, Ball R.G., Dombrowski A.W. et. al // J Am

Chem Soc. – 1997. – V. 119. – P. 8809–8816.

141. Papavizas, G.S. Trichoderma and Gliocladium: biology, ecology, and

potential for biocontrol / G.S. Papavizas // Ann. Review of Phytopathol. –

1985. – V. 23. – P. 23-54.

142. Park, M.S. Marine-derived Penicillium in Korea: Diversity, enzyme

activity, and antifungal properties / M.S. Park, Fong J.J., Kwon K.K. et. al //

Antonie van Leeuwenhoek. – 2014. – V. 106. – P. 331–345.

143. Paz, Z. Diversity and potential antifungal properties of fungi

associated with a Mediterranean sponge / Z. Paz, Aluma Y., Aveskamp

M.M. et. al // Fungal Divers. – 2010. – V. 42. – P. 17–26.

144. Praveena, Y.S.N. Antibacterial activities of mycotoxins from newly

isolated filamentous fungi / Y.S.N. Praveena, Padmini Palem P.C. // Int J Pl

Animal Environ Sc. – 2011. – V. 1 (№ 1). – P. 8-13.

145. Qin, X.Y. Phylogenetic diversity and antibacterial activity of

culturable fungi derived from the Zoanthid Palythoa haddoni in the South

China Sea / X.Y. Qin, Li J., Shao C.L. et. al // Mar. Biotechnol.: N.Y. –

2015. – V. 17. – P. 99–109.

146. Raistrick, H. A region of biosynthesis / H. Raistrick // Proc. R. Soc.

Lond.B Biol. Sci. – 1950. – V. 136. – P. 481-508.

152

147. Ranadive, K.R. Glimpses of antimicrobial activity of fungi from

World / K.R. Ranadive, Harshada K.J., Jitendra G.V. et. al // Journal on New

Biological Reports. – 2013. – V. 2 (№2). – P. 142-162.

148. Rateb, M.E. Secondary metabolites of fungi from marine habitats /

M.E. Rated, Ebel R. // Nat Prod Rep. – 2011. – V. 28. – P. 290–344.

149. Rebuffat, S. Antibiotic peptides from Trichoderma harzianum:

harzianins HC, proline-rich 14-residue peptaibols / S. Rebuffat, Bodo B.,

Goulard C. // J. Chem. Soc. – 1995. - V. 1. – P. 1849 - 1855.

150. Rebuffat, S. Two unprecedented natural Aib-peptides with the (Xaa-

Yaa-Aib-Pro) motif and an unusual C-terminus: structures, membrane-

modifying and antibacterial properties of pseudokonins KL III and KL VI

from the fungus Trichoderma pseudokoningii / S. Rebuffat, Bodo B.,

Goulard c. et. al // J. Pept. Sci. – 2000. – V. 6, № 10. – P. 519 - 533.

151. Ritieni, A. Paracelsin E, a New Peptaibol from Trichoderma

saturnisporum / Ritieni A., Altomare C., Bottalico A. et. al // J. Nat. Prod. –

1995. – V. 58, № 11. –P. 1745 - 1748.

152. Ritzau, M. Ampullosporin, a new peptaibol-type antibiotic from

Sepedonium ampullosporum HKI-0053 with neuroleptic activity in mice /

M. Ritzau, Berg A., Dornberger K. et. al // J. Antibiotics. – 1997. – V. 50. –

P. 722–728.

153. Roy, K. Mulundocandin, a new lipopeptide antibiotic. 1. Taxonomy,

fermentation, isolation, and characterization / K. Roy, Desikan K., Ganguli

B. et. al // J. Antibiot. – 1987. – V. 40. P. 275-280.

154. Saito, M. Properties and structure of a peptide antibiotic no. 1907 / M.

Saito, Arima K., Beppu T. // Agric. Biol. Chem. – 1980. – V. 44. –P. 3037-

3040.

155. Sakthivel, N. Isolation of and assay for cerulenin produced by sheath

rot pathogen, Sarocladium oryzae (Saw.) Gams / N. Sakthivel,

Gnanamanickam S. // Curr. Sci. – 1986. – V. 55. – P. 988–989.

153

156. Samson, R.A. New species of Gibellula on spiders (Araneida) from

South America / R.A. Samson, Evans H.C. // Mycological Society of

America. – 1992. – V. 84. – P. 300-314.

157. Satoi, S. Studies of aculeacin, II. Isolation and characterization of

aculeacins B, C, D, E, F and G / S. Satoi, Asano K., Mizuno K. et. al // J.

Antibiot. – 1997. – V. 30. – P. 303-307.

158. Schiell, M. Cephaibols, new peptaibol antibiotics with antihelmintic

properties from Acremonium tubakii DSM 12774 / M. Schiell, Kurz M.,

Hofmann J. // J. Antibiotics. – 2001. - V. 54. – P. 220–233.

159. Schmitt, E.K. Natural products as probes in pharmaceutical research /

E.K. Schmitt, Hoepfner D., Krastel P. // J Ind Microbiol Biotechnol. – 2015.

– V. 59. – P. 880-889.

160. Schirmbock, M. Parallel formation and synergism of hydrolytic

enzymes and peptaibols antibiotics, molecular mechanisms involved in the

antagonistic action of Trichoderma harzianum against phytopathogenic

fungi / M. Schirmbock, Arisan-Atac I., Harman G.E. et. al // Applied and

Environmental Microbiology. – 1994. – V. 60. – P. 4364-4370.

161. Shao, C. Structure elucidation of two new xanthone derivatives from

the marine fungus Penicillium sp. (ZZF 32#) from the South China Sea / C.

Shao, Gu Y., Lin Y. et. al // Magn. Reson. Chem. – 2008. – V. 46. – P.

1066–1069.

162. Shida, D. Targeting SphK1 as a new strategy against cancer / D.

Shida, Kapitonov D., Milstien S. et. al // Curr Drug Targets. – 2008. – V. 9.

– P. 662–673.

163. Shima, A. Dual inhibitory effects of the peptide antibiotics

leucinostatins on oxidative phosphorylation in mitochondria / A. Shima,

Arai T., Fukushima K. et. al // Cell. Struct. Funct. – 1990. – V. 15. – P. 53–

58.

154

164. Simmons, T.L. Biosynthetic origin of natural products isolated from

marine microorganism-invertebrate assemblaages / T.L. Simmons // Proc.

Natl Acad. Sci.: USA. – 2008. – V. 105. – P. 4587–4594.

165. Singh, M.P. Application of Biolog FF MicroPlate for substrate

utilization and metabolite profiling of closely related fungi / M.P. Singh // J

Microbiol Methods. – 2009. – V. 77, № 1. – P. 102-108.

166. Smith, D. Fungal sources for new drug discovery / D. Smith, Ryan

M.J. // Fungal Diversity. – 2009. – V. 63 (1). – P. 1-40.

167. Song, X.Y. Broad-spectrum antimicrobial activity and high stability of

Trichokonins from Trichoderma koningii SMF2 against plant pathogens /

X.Y. Song, Chen X.L., Shen Q.T. et. al // FEMS Microbiol. Lett. – 2006. –

T. 260. – P. 119 - 125.

168. Srimathi, S. Studies on Antimicrobial Activities of Chaetomium

atrobrunneum Ames against Selected Microorganisms / S. Srimathi, Devi

Narayani K.S., Muthumary J. // J Exp Sc. – 2011. – V. 2 (№ 5). – P. 13-18.

169. Stoppacher, N. The Comprehensive Peptaibiotics Database / N.

Stoppacher, Brückner H., Burgstaller L. et. al // Chemistry & Biodiversity. –

2013. – V. 10, T. 5. – P. 734-743.

170. Swinney, D.C. How were new medicines discovered? / D.C. Swinney,

Anthony J. // Nat Rev Drug Discov. – 2011. – V. 10. – P. 507–519.

171. Szekeres, A. Peptaibols and Related Peptaibiotics of Trichoderma / A.

Szekeres, Hatvani L., Kredics L. et. al // Acta Microbiologica et

Immunologica Hungarica. – 2005. - V. 52, T. 2. - P. 137-168.

172. Takesako, K. Biological properties of aureobasidin A, a cyclic

depsipeptide antifungal antibiotics / K. Takesako, Haruna F., Inque T. et. al

// J. Antibiot. - 1993. – V. 46. – P. 1414-1420.

173. Tanaka, M. Structural elucidation of scyphostatin, an inhibitor of

membranebound neutral sphingomyelinase / M. Tanaka, Hosoya T., Nara F.

et. al // J Am Chem Soc. – 1997. – V. 119. – P. 7871-7872.

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19318055

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19318055

http://www.akademiai.com/loi/030

http://www.akademiai.com/loi/030

155

174. Tayung, K. Identification and characterization of antimicrobial

metabolite from an endophytic fungus, Fusarium solani isolated from bark

of Himalayan yew / K. Tayung, Barik B.P., Deka D.C. et. al // Mycosphere.

– 2011. – V. 2 (№ 3). – P. 203–213.

175. Thirumalachar, M.J. Antiamoebin, a new antiprotozoalanthelmintic

antibiotic. Part I. Production and biological studies / M.J. Thirumalachar //

Hindustan Antibiot. Bull. – 1968. – V. 10. P. 287–289.

176. Traber, R. Neue Cyclopeptide aus Trichoderma polysporum (LINK

EX PERS.) RIFAI: die Cyclosporine B, D und E / R. Traber, Kuhn M.,

Loosli H.R. et. al // Helv. Chim. Acta. – 1977. – V. 60, № 5. – P. 1568 -

1578.

177. Trisuwan, K. Lactone derivatives from the marine-derived fungus

Penicillium sp. PSU-F44 / K. Trisuwan, Phongpaichit S., Preedanon S. et. al

// Chem. Pharm. Bull. – 2009. – V. 57. – P. 1100–1102.

178. Tschen, J.S.-M. Isolation and phytotoxic effects of helvolic acid from

plant pathogenic fungus Sarocladium oryzae / J.S.-M. Tschen, Chen L.L.,

Hsieh S.T. et. al // Bot. Bull. Acad. Sin. – 1997. – V. 38. – P. 251–256.

179. Turkoglu, A. Antioxidant and antimicrobial activities of Morchella

Conica Pers / A. Turkoglu , Duru M.E.,Gezer K. et. al // Af J Biotech. –

2006. – V. 5 (№ 11). – P. 1146-1150.

180. Vincent, M.A. Akanthomyces johnsonii, a saprophytic synnematous

Hyphomycete / M.A. Vincent, Samson R.A., Seifert K.A. // Mycologia. –

1988. – V. 80. – P. 685-688.

181. Viterbo, A. The 18mer peptaibols from Trichoderma virens elicit

plant defence responses / A. Viterbo, Brotman Y., Chet I. et. al // Molecular

Plant Pathology. – 2007. – V. 8. – P. 737-746.

182. Weber, W. Antibiotics from basidiomycetes. XXXII. Strobilurin E: a

new cytostatic and antifungal (E)-beta-methoxyacrylate antibiotic from

Crepidotus fulvotomentosus Peck / W. Weber, Anke T., Steglich W. // J

Antibiot. – V. 43. – P. 207–212.

156

183. Weindling, R. 1936 The isolation of a toxic substance from the culture

of a Trichoderma / R. Weindling, Emerson 0.H. // Phyroparhology. – 1936.

– V. 26. – P. 1068-1070.

184. Wen, L. Paeciloxanthone, a new cytotoxic xanthone from the marine

mangrove fungus Paecilomyces sp. (Tree1-7) / L. Wen, Chan W.L., Du D.S.

et. al // J. Asian Nat. Prod. Res. – 2008. – V. 10. – P. 133–137.

185. Wilawan, K. Antimicrobial activity of invertebrate-pathogenic fungi

in the genera Akanthomyces and Gibellula / K. Wilawan, Luangsa-ard J.J.,

Phongpaichit S. et. al // Mycoscience. – 2014. – V. 55, № 2. – P. 127-133.

186. Wilhelm, C. New peptaibols from Mycogone cervina / C. Wilhelm,

Anke H., Flores Y. et. al // J. Nat. Prod. - 2004. – V. 67. – P. 466-468.

187. Wilkinson, B. Mining and engineering natural-product biosynthetic

pathways / B. Wilkinson, Micklefield J. // Nature Chem. Biol. – 2007. – V.

3. – P. 379–386.

188. Wu, Q.X. Azonazine, a novel dipeptide from a Hawaiian marine

sediment-derived fungus, Aspergillus insulicola / 2010. - V. 12, № 20. - P.

4458-4461.

189. Wu, Q.X. Unraveling the Numerous Biosynthetic Products of the

Marine Sediment-Derived Fungus, Aspergillus insulicola / Q.X. Wu, Crews

M.S., Crews P. et. al // Phytochem. Lett. - 2012. - V. 5, № 1. - P. 114-117.

190. Xu, J. Pestalotiopsis a highly creative genus: chemistry and bioactivity

of secondary metabolites / J. Xu, Ebada S.S., Proksch P. // Fungal Divers. –

2010. – V. 44. – P. 15–31.

191. Xue, G. Cyclization of fungal nonribosomal peptides by a terminal

condensation-like domain / G. Xue, Ames B.D., Haynes S.W. et. al //

Natural chemical biology. – 2012. - Vol.8 – P. 823-830.

192. Yang, Q.X. Influence of oxytetracycline on the structure and activity

of microbial community in wheat rhizosphere soil / Q.X. Yang, Zhang H.,

Zhang J. et. al // J Environ Sci: China. – 2009. – V. 21. – P. 954–959.

http://scholar.google.ru.sci-hub.io/scholar_url?url=http%3A%2F%2Fpubs.acs.org.sci-hub.io%2Fdoi%2Fabs%2F10.1021%2Fnp0302899&hl=ru&sa=T&ct=res&cd=0&ei=IJIgV82ZBIjYjAHqpKXABA&scisig=AAGBfm2aDN9lgU8wOASrS-ZCULXAkAuG7Q&nossl=1&ws=1536x730

157

193. Ying-Yue, B. Penicyrones A and B, an epimeric pair of α-pyrone-

type polyketides produced by the marine-derived Penicillium sp. / B. Ying-

Yue, Namikoshi M., Kirikoshi R. et. al // The Journal of Antibiotics. –

2015. – P. 1–5.

194. Yu, H.S. Recent development and future prospects of antimicrobial

metabolites produced by endophytes / H.S. Yu // Microbiol. Res. – 2010. –

V.165. –P. 437–449.

195. Yun, B.S. Peptaivirins A and B, two new antiviral peptaibols against

TMV infection / B.S. Yun, Kim Y.H. Yoo I.D. et. al // Tetrahedron Lett. –

2000. - V. 41. – P. 1429–1431.

196. Yvonne, M.A. Solid-Phase Synthesis of Cyclosporin Peptides / M.A.

Yvonne, Flentke G.R., Rich D.H. et. al // J. Am. Chem. Soc. – 1995. – V.

117, № 27. – P. 7279–7280.

197. Zakharychev, V.V. Natural compounds of the strobilurin series and

their synthetic analogues as cell respiration inhibitors / V.V. Zakharychev,

Kovalenko L.V. // Russ Chem Rev. – V. 67. – P. 535–544.

198. Ze-Ping, L. Phylogenetic Diversity and Antifungal Activity of

Endophytic Fungi Associated with Tephrosia purpurea / L. Ze-Ping, Hai-

Yan L., Hua-Liang H. et. al // Mycobiology. – 2015. - V. 43 (№ 4). – P.

435-443.

199. Zhang, H.W. Biology and chemistry of endophytes / H.W. Zhang,

Song Y.C., Tan R.X. // Nat Prod Rep. – 2006. – V. 23. – P. 753–771.

200. Zhang, X.Y. Diversity and antimicrobial activity of culturable fungi

isolated from six species of the South China Sea gorgonians / X.Y. Zhang,

Bao J., He F. et. al // Microb. Ecol. - 2012. – V. 64. – P. 617–627.

201. Zhang, X.Y. Diverse deep-sea fungi from the South China Sea and

their antimicrobial activity / X.Y. Zhang, Qi S.H., Xu X.Y. et. al // Curr.

Microbiol. – 2013. – V. 67. – P. 525–530.

158

202. Zheng, J. Novel Cyclic Hexapeptides from Marine-Derived Fungus,

Aspergillus sclerotiorum PT06-1 / J. Zheng, Hong K., Liu P. et. al // Org.

Lett. – 2009. – V. 11, № 22. – P. 5262–5265.

203. Zhu, F. Clustered patterns of species origins of nature-derived drugs

and clues for future bioprospecting / F.Zhu, Chen Y., Cui C. et. al //

Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2011. – V.108, № 31. –

P. 12943-12948.

204. Zielezny, Y. Impact of sulfadiazine and chlorotetracycline on soil

bacterial community structure and respiratory activity / Y. Zielezny,

Groeneweg J., Tappe W. et. al // Soil Biol Biochem. – 2006. – V. 38. – P.

2372–2380.

205. Zronen, M. Ampullosporins B, C, D, E1, E2, E3 and E4 from

Sepedonium ampullosporum HKI 0053: structures and biological activities /

M. Zronen, Gräfe U., Hartl A. et. al // J. Antibiotics. – 2001. – V. 54. – P.

175–178.

206. Zugeven-Bour, I. Harzianin HB I, an 11-residue peptaibol from

Trichoderma harzianum: isolation, sequence, solution synthesis and

membrane activity. / I. Zugeven-Bour, Auvin C., Bodo B. et. al // J. Chem.

Soc. – 1997. – V. 1. – P. 1587 - 1594.

207. http://www.cryst.bbk.ae.uk/peptaibol

http://www.cryst.bbk.ae.uk/peptaibol

159

ПРИЛОЖЕНИЕ 1

Таксономическая принадлежность штаммов

О

т

де

л

П

о

р

я

д

о

к

Семейство Род/вид Число

штаммов

НА СА УА ВА

A

sc

o

m

yc

ot

a

E

u

r

o

ti

a

l

e

s

Trichocomaceae Paеcilomyces (P. varioti Bainier

1907- 1, P. marquandii (Massee)

S.Hughes 1951 – 3, P. carneus

(Duche and R.Heim) A.H.S. Br. and

G.Sm. 1957– 1)

5 0 4 1 0

Eupenicillium (E. shearii Stolk and

D.B. Scott 1967 – 3, E. sp. - 6)

9 0 7 2 0

Fennellia nivea (B.J. Wiley and E.G.

Simmons) Samson 1979 - 1

1 0 1 0 0

Aspergillus (A. ochraceus G. Wilh.

1877 - 1, A. fumigatus Fresen. 1863 - 1, A. sparsus Raper and Thom 1944 - 1, A. flavipes (Bainier and R.

Sartory) Thom and Church 1926 - 2,

A. parasiticus Speare 1912 - 1,

A. oryzae (Ahlb.) Cohn 1884 – 1,

A. sp. - 39)

46 0 32 14 0

Penicillium (P. spinulosum Thom

1910 - 2, P. brevicompactum

Dierckx 1901 - 6, P. citrinum Thom

1910 - 2, P. echinatum Rivolta 1873

- 1, P. corylophilum Dierckx 1901 -

1, P. discolor Frisvad and Samson

1997 - 1, P. sclerotiorum J.F.H.

Beyma 1937 - 6, P. funiculosum

Thom 1910 - 1, P. dierckxii Biourge

1923 - 2, P. aurantiogriseum

Dierckx 1901 - 1, P. lividum

Westling 1911 - 1, P. implicatum

Biourge 1923 - 1, P. charlesii G. Sm.

1933 - 2, P. viridicatum Westling

1911 - 1, P. solitum Westling 1911 -

1, P. vinaceum J.C. Gilman and E.V.

Abbott 1927 - 1, P. herquei Bainier

and Sartory 1912 - 3, P. steckii K.M.

Zaleski 1927 - 2, P. menonorum

S.W. Peterson 2011 - 1,

P. islandicum Sopp 1912 - 2,

P. aculeatum Raper and Fennell

1948 - 1, P. ochrochloron Biourge

227 0 131 95 1

160

1923 - 2, P. paxilli Bainier 1907 - 1,

P. divaricatium Thom 1910 - 2,

P. purpureogenum Flerov 1906 - 2,

P. puberullum Bainier 1907 – 1, P.

thomii Maire 1917 – 1, P. sp. - 179)

H

y

p

o

c

r

e

a

l

e

s

Nectriaceae Fusarium (F. heterosporum Nees

and T. Nees 1818 - 1,

F. proliferatum (Matsush.) Nirenberg

1976 - 1, F. oxysporum E.F. Sm. and

Swingle - 3, F. solani (Mart.) Sacc.

1881 - 1, F. sp. - 7)

13 0 9 3 1

Cylindrocarpon sp. 1 0 1 0 0

Hypocreaceae Trichoderma ( T. longibrachiatum

Rifai 1969 - 7, T. harzianum Rifai

1969 – 7, T. polysporum (Link) Rifai

1969 – 5, T. asperellum Samuels,

Lieckf. and Nirenberg 1999 - 12,

T. viride Pers. 1794 - 4, T. hamatum

(Bonord.) Bainier 1906 - 3,

T. koningii Oudem. 1902 - 4,

T. atroviride P. Karst. 1892 - 4,

T. citrinoviride Bissett 1984 - 1,

Т. gamsii Samuels and Druzhin.

2006 – 2, T. sp. - 71)

120 0 34 70 16

Acrostalagmus luteoalbus (Link)

Zare, W. Gams and Schroers 2004 -

5

5 0 1 4 0

Gliocladium catenulatum J.C.

Gilman and E.V. Abbott 1927 - 1

1 0 1 0 0

Bionectriaceae Clonostachys (C. byssicola Schroers

2001 – 1, C. candelabrum (Bonord.)

Schroers 2001 – 2)

3 0 3 0 0

Ophiocordycipitace

ae

Purpureocillium lilacinum (Thom)

Luangsa-ard, Houbraken, Hywel-

Jones and Samson 2011 - 3

3 0 1 2 0

Tolypocladium (T. cylindrosporum

W. Gams 1971 – 3, T. inflatum W.

Gams 1971 – 3, T. sp. -1)

7 0 1 6 0

Incertae sedis Stachybotrys (S.chartarum (Ehrenb.)

S. Hughes 1958 - 1, S.sp. - 3)

4 0 2 2 0

Emericellopsis ( E. pallida Beliakova

1974 - 1, E. alkaline Bilanenko 2013

- 14, E. minima Stolk 1955 - 1)

16 0 7 9 0

Sarocladium kiliense (Grütz)

Summerb. 2011 - 3

3 0 3 0 0

Acremonium (A. furcatum Moreau

and F. Moreau ex Gams 1969 - 4,

A. sclerotigenum (Moreau and R.

Moreau ex Valenta) W. Gams 1971 -

2, A. roseolum (G. Sm.) W. Gams

1971 – 1, A. cereale (P. Karst.) W.

21 0 14 7 0

161

Gams 1971 – 1, A. strictum W. Gams

1971 – 1, A.sp. - 12)

O

n

y

g

e

n

a

l

e

s

Onygenaceae Chrysosporium pannorum (Link) S.

Hughes 1958 - 1

1 0 1 0 0

P

l

e

o

s

p

o

r

a

l

e

s

Coniothyriaceae Coniothyrium sp. - 1 1 0 1 0 0

Pleosporaceae Bipolaris

(B. sorghicola (Lefebvre and

Sherwin) Alcorn 1983 - 1, B. secalis

Sisterna 1989 - 1, B. hawaiiensis

M.Y. Chiang, K.J. Leonard and Van

Dyke 1989 – 1,

B. sp. – 1)

4 0 2 2 0

Ulocladium (U. atrum Preuss 1852 -

1, U. sp. - 4)

5 0 5 0 0

Curvularia (C. lunata (Wakker)

Boedijn 1933 – 1, C. sp. - 1)

2 0 1 1 0

Incertae sedis Periconia sp. - 1 1 0 1 0 0

S

o

r

d

a

r

i

a

l

e

s

Chaetomiaceae Chaetomium (C. globosum Kunze

1817 - 2, C. funicola Cooke 1873 -

1)

3 0 3 0 0

Humicola grisea Traaen 1914 - 1 1 0 1 0 0

Lasiosphaeriaceae Mammaria echinobotryoides Ces.

1854 - 1

2 0 2 0 0

C

a

p

n

o

d

i

a

l

e

s

Cladosporiaceae Cladosporium (C. cladosporioides

(Fresen.) G.A. de Vries 1952 - 3,

C. macrocarpum Preuss 1848 - 2,

C. oxysporum Berk. and M.A. Curtis

1868 – 1, C. longipes Sorokīn 1892 –

1,

C. herbarum (Pers.) Link 1816 – 1,

C. sp. - 1)

9 0 5 4 0

C

o

n

i

Pseudobotrytis sp. - 1 1 0 1 0 0

162

o

c

h

a

e

t

a

l

e

s

C

h

a

e

t

o

s

p

a

e

r

i

a

l

e

s

Chaetospaeriaceae Chloridium virescens (Pers.) W.

Gams and Hol.-Jech. 1976 - 1

1 0 1 0 0

M

i

c

r

o

a

s

c

a

l

e

s

Microascaceae Scopulariopsis brevicaulis (Sacc.)

Bainier 1907 - 1

1 0 0 1 0

H

e

l

o

ti

a

l

e

s

Sclerotiniaceae Botrytis cinerea Pers. 1794 - 1 1 0 1 0 0

I

n

c

e

r

Incertae sedis

Chaetomella (C. raphigera Swift

1930 - 1, C. oblonga Fuckel 1870 -

1)

2 0 2 0 0

Endocalyx melanoxanthus (Berk. and

Broome) Petch 1908 - 1

1 0 1 0 0

163

t

a

e

s

e

d

i

s

Monodictys castaneae (Wallr.) S.

Hughes 1958 - 1

1 0 1 0 0

Verticillium zaregamsianum Inderb.,

Usami, Kanto, R.M. Bostock, R.M.

Davis and Subbarao 2011 - 1

3 0 2 1 0

Geomyces pannorum (Link) Sigler

and J.W. Carmich. 1976 - 1

1 0 1 0 0

164

ПРИЛОЖЕНИЕ 2

Утилизация субстратов штаммами рода Trichoderma

Утилизация субстратов штаммом Trichoderma citrinoviride Bissett 1984 TYVI 4/11

Эм

ул

ьгатор

ы

Сахар

а

Сп

ир

ты

Ор

ган

ич

еск

ие

ки

слоты

Сол

и

Нук

лео

зид

ы

Гл

ик

ози

ды

Гл

юк

ози

ды

Гал

ак

този

ды

Ам

ин

ы

Ам

ид

ы

Ам

ин

ок

исл

оты

Ком

пл

ексн

ые

соед

ин

ени

я

Эф

ир

ы

Ви

там

ин

ы

Высок

ая

утилиз

ация

субстр

ата

- D-Cellobiose,

α-

Cyclodextrin,

α-D-Glucose,

Maltotriose,

D-Trehalose

D-Arabitol, D-

Mannitol,

Xylitol

Fumaric Acid, L-

Malic Acid, L-

Aspartic Acid

- - - β-

Meth

yl-

Dglu

cosid

e,

Salic

in

- - Gluc

uron

amid

e

L-

Serin

e

- Suc

cini

c

Aci

d

Mo

no-

Me

thyl

Est

er

Amy

gdali

n

Умере

нная

утилиз

ация

субстр

Tw

een

80

N-Acetyl-

Dgalactosamin

e, N-Acetyl-

Dglucosamine,

D-Fructose, L-

Fucose, D-

i-Erythritol,

Glycerol, D-

Sorbitol

D-Galacturonic Acid,

γ-Amino-butyric

Acid, β-Hydroxy-

butyric Acid, γ-

Hydroxy-butyric

Acid, α-Keto-glutaric

Glucose

-1-

Phospha

te

L-

Arab

inose

Arbu

tin

α-

Meth

yl-

Dglu

cosid

- D-

Gluc

osam

ine,

Putre

Alani

nami

dе

L-

Alani

ne,

L-

Aspa

ragin

L-

Alanyl

-

Glycin

e

- -

165

ата Galactose,

Gentiobiose,

Glycogen, α-

D-Lactose,

Lactulose,

Maltose, D-

Mannose, D-

Melibiose,

Palatinose, D-

Raffinose, D-

Ribose, L-

Sorbose,

Stachyose,

Sucrose,

Turanose

Acid, D-Malic Acid,

Quinic Acid,

Succinic Acid, L-

Glutamic Acid,

Glycyl-L-Glutamic

Acid, L-Proline

Acid, L-

Pyroglutamic Acid

e scine e, L-

Ornit

hine,

L-

Thre

onine

Слаба

я

утилиз

ация

субстр

ата

N-Acetyl-

Dmannosamin

e, β-

Cyclodextrin,

Dextrin, D-

Melezitose, D-

Psicose, L-

Rhamnose,

Sedoheptulosa

n, D-Tagatose,

D-Xylose

Adonitol, m-

Inositol,

Maltitol, 2-

Amino

Ethanol

D-Gluconic Acid, D-

Glucuronic Acid, 2-

Keto-D-Gluconic

Acid, Bromosuccinic

Acid, Bromosuccinic

Acid, L-Lactic Acid,

D-Saccharic Acid,

Sebacic Acid,

Succinamic Acid, N-

Acetly-L

Adenosi

ne-5'-

Monoph

osphate

D-

Arab

inose

,

Aden

osine

,

Uridi

ne

- - α-

Meth

yl-

Dgal

actos

ide,

β-

Meth

yl-

Dgal

actos

ide

- - L-

Phen

ylala

nine

- D-

Lac

tic

Aci

d

Me

thyl

Est

er

-

166

Утилизация субстратов штаммом Trichoderma harzianum Rifai 1969 М99/51 Э

мул

ьгатор

ы

Сахар

а

Сп

ир

ты

Ор

ган

ич

еск

ие

ки

слоты

Сол

и

Нук

лео

зид

ы

Гл

ик

ози

ды

Гл

юк

ози

ды

Гал

ак

този

ды

Ам

ин

ы

Ам

ид

ы

Ам

ин

ок

исл

оты

Ком

пл

ексн

ые

соед

ин

ени

я

Эф

ир

ы

Ви

там

ин

ы

Высок

ая

утилиз

ация

субстр

ата

- D-Cellobiose,

D-Trehalose

D-Arabitol, D-

Sorbitol

γ-Amino-butyric

Acid, Fumaric Acid,

γ-Hydroxy-butyric

Acid, L-Malic Acid,

L-Aspartic Acid, L-

Glutamic Acid

- - - - - - - L-

Alani

ne,

L-

Aspa

ragin

e, L-

Serin

e

- Succi

nic

Acid

Mon

o-

Meth

yl

Ester

-

Умере

нная

утилиз

ация

субстр

ата

- N-Acetyl-

Dgalactosamin

e, N-Acetyl-

Dglucosamine,

D-Galactose,

Gentiobiose,

α-D-Glucose,

α-D-Lactose,

Lactulose,

Maltose, D-

Mannose, D-

i-Erythritol,

Glycerol, D-

Mannitol,

Xylitol


D-Glucuronic Acid,

2-Keto-D-Gluconic

Acid, β-Hydroxy-

butyric Acid, α-

Keto-glutaric Acid,

L-Lactic Acid, D-

Malic Acid, D-

Saccharic Acid,

Succinic Acid,

Glycyl-L-Glutamic

- L-

Arab

inose

,

Aden

osine

Arbu

tin

β-

Meth

yl-

Dglu

cosid

e,

Salic

in

- - - L-

Ornit

hine

L-

Alanyl

-

Glycin

e

- Am

ygd

alin

167

Melibiose,

Palatinose, D-

Raffinose

Acid, L-

Pyroglutamic Acid

Слаба

я

утилиз

ация

субстр

ата

Tw

een

80

N-Acetyl-

Dmannosamin

e, α-

Cyclodextrin,

β-

Cyclodextrin,

Dextrin, D-

Fructose, L-

Fucose,

Glycogen,

Maltotriose,

D-Melezitose,

D-Psicose, L-

Rhamnose, D-

Ribose,

Sedoheptulosa

n, L-Sorbose,

Stachyose,

Sucrose, D-

Tagatose,

Turanose, D-

Xylose

Adonitol, m-

Inositol,

Maltitol, 2-

Amino

Ethanol

D-Gluconic Acid,

Bromosuccinic Acid,

p-Hydroxyphenyl

acetic acid, Quinic

Acid, Sebacic Acid,

Succinamic Acid, N-

Acetly-L, L-Proline

Acid

Glucose

-1-

Phospha

te,

Adenosi

ne-5'-

Monoph

osphatе

D-

Arab

inose

,

Uridi

ne

- α-

Meth

yl-

Dglu

cosid

e

α-

Meth

yl-

Dgal

actos

ide,

β-

Meth

yl-

Dgal

actos

ide

Putre

scine

Gluc

uron

amid

e,

Alani

nami

de

L-

Phen

ylala

nine,

L-

Thre

onine

- D-

Lacti

c

Acid

Meth

yl

Ester

-

168

Утилизация субстратов штаммом Trichoderma koningii Oudem. 1902 TCL-06 Э

мул

ьгатор

ы

Сахар

а

Сп

ир

ты

Ор

ган

ич

еск

ие

ки

слоты

Сол

и

Нук

лео

зид

ы

Гл

ик

ози

ды

Гл

юк

ози

ды

Гал

ак

този

ды

Ам

ин

ы

Ам

ид

ы

Ам

ин

ок

исл

оты

Ком

пл

ексн

ые

соед

ин

ени

я

Эф

ир

ы

Ви

там

ин

ы

Высок

ая

утилиз

ация

субстр

ата

Tw

een

80

- D-Arabitol, D-

Sorbitol

γ-Amino-butyric

Acid, Fumaric Acid,

γ-Hydroxy-butyric

Acid, L-Malic Acid,

L-Aspartic Acid

- Aden

osine

- - - - - L-

Alani

ne,

L-

Serin

e

- Succi

nic

Acid

Mon

o-

Meth

yl

Ester

Умере

нная

утилиз

ация

субстр

ата

- N-Acetyl-

Dglucosamine,

D-Fructose, L-

Fucose, D-

Galactose,

Gentiobiose,

α-D-Glucose,

Glycogen, α-

D-Lactose,

Lactulose, D-

Mannose, D-

Melibiose, D-

Raffinose, D-

i-Erythritol,

Glycerol,

Xylitol, 2-

Amino

Ethanol


D-Glucuronic Acid,

2-Keto-D-Gluconic

Acid, β-Hydroxy-

butyric Acid, α-

Keto-glutaric Acid,

L-Lactic Acid, D-

Malic Acid, Quinic

Acid, D-Saccharic

Acid, Succinic Acid,

L-Glutamic Acid , L-

Pyroglutamic Acid

Glucose

-1-

Phospha

te

L-

Arab

inose

Arbu

tin

β-

Meth

yl-

Dglu

cosid

e,

Salic

in

- Putre

scine

Gluc

uron

amid

e

L-

Aspa

ragin

e, L-

Ornit

hine,

L-

Thre

onine

L-

Alanyl

-

Glycin

e

-

169

Ribose,

Sedoheptulosa

n, Stachyose,

Sucrose, D-

Trehalose, D-

Xylose

Слабая

утилиз

ация

субстр

ата

- N-Acetyl-

Dgalactosamin

e, N-Acetyl-

Dmannosamin

e, D-

Cellobiose , α-

Cyclodextrin,

β-

Cyclodextrin,

Dextrin,

Maltose,

Maltotriose,

D-Melezitose,

Palatinose, D-

Psicose, L-

Rhamnose, L-

Sorbose, D-

Tagatose,

Turanose, D-

Xylose

Adonitol, m-

Inositol,

Maltitol, D-

Mannitol

D-Gluconic Acid,

Bromosuccinic Acid,

p-Hydroxyphenyl

acetic acid, Sebacic

Acid, Succinamic

Acid, N-Acetly-L, L-

Proline Acid

Adenosi

ne-5'-

Monoph

osphatе

D-

Arab

inose

,

Uridi

ne

- α-

Meth

yl-

Dglu

cosid

e

α-

Meth

yl-

Dgal

actos

ide,

β-

Meth

yl-

Dgal

actos

ide

D-

Gluc

osam

ine

Alani

nami

de

L-

Ornit

hine,

L-

Phen

ylala

nine

- D-

Lacti

c

Acid

Meth

yl

Ester

Am

ygd

alin

170

Утилизация субстратов штаммом Trichoderma asperellum Samuels, Lieckf. and Nirenberg 1999 Mg-6 Э

мул

ьгатор

ы

Сахар

а

Сп

ир

ты

Ор

ган

ич

еск

ие

ки

слоты

Сол

и

Нук

лео

зид

ы

Гл

ик

ози

ды

Гл

юк

ози

ды

Гал

ак

този

ды

Ам

ин

ы

Ам

ид

ы

Ам

ин

ок

исл

оты

Ком

пл

ексн

ые

соед

ин

ени

я

Эф

ир

ы

Ви

там

ин

ы

Высок

ая

утилиз

ация

субстр

ата

- D-Cellobiose,

D-Galactose,

Gentiobiose,

α-D-Lactose

i-Erythritol,

Glycerol,

Maltitol, D-

Mannitol,

Xylitol

Fumaric Acid, β-

Hydroxy-butyric

Acid, γ-Hydroxy-

butyric Acid, D-

Malic Acid, L-Malic

Acid, L-Aspartic

Acid, L-Glutamic

Acid

- L-

Arab

inose

,

Aden

osine

,

Uridi

ne

- α-

Meth

yl-

Dglu

cosid

e, β-

Meth

yl-

Dglu

cosid

e

- - - L-

Alani

ne,

L-

Serin

e

- - -

Умере

нная

утилиз

ация

субстр

ата

- N-Acetyl-

Dglucosamine,

Dextrin, D-

Fructose, L-

Fucose, α-D-

Glucose,

Glycogen,

Lactulose,

Maltotriose,

D-Mannose,

D-Sorbitol D-Galacturonic Acid,

D-Glucuronic Acid,

2-Keto-D-Gluconic

Acid, γ-Amino-

butyric Acid, α-Keto-

glutaric Acid, L-

Lactic Acid, Quinic


L-Proline Acid, L-

- - Arbu

tin

Salic

in

- D-

Gluc

osam

ine,

Putre

scine

Alani

nami

de

L-

Aspa

ragin

e, L-

Ornit

hine

L-

Alanyl

-

Glycin

e

Succi

nic

Acid

Mon

o-

Meth

yl

Ester

Am

ygd

alin

171

D-Melibiose,

Palatinose, D-

Psicose, D-

Raffinose, D-

Ribose,

Sedoheptulosa

n, L-Sorbose,

Stachyose,

Sucrose, D-

Trehalose,

Turanose

Pyroglutamic Acid

Слаба

я

утилиз

ация

субстр

ата

- N-Acetyl-

Dgalactosamin

e, N-Acetyl-

Dmannosamin

e, α-

Cyclodextrin,

β-

Cyclodextrin,

Maltose, D-

Melezitose, L-

Rhamnose,

Sedoheptulosa

n, D-Tagatose,

D-Xylose

Adonitol, D-

Arabitol, m-

Inositol, 2-

Amino

Ethanol

Bromosuccinic Acid,

p-Hydroxyphenyl

acetic acid, D-

Saccharic Acid,

Sebacic Acid,

Succinamic Acid, N-

Acetly-L, Glycyl-L-

Glutamic Acid

Glucose

-1-

Phospha

te,

Adenosi

ne-5'-

Monoph

osphate

D-

Arab

inose

- - α-

Meth

yl-

Dgal

actos

ide,

β-

Meth

yl-

Dgal

actos

ide

- Gluc

uron

amid

e

L-

Phen

ylala

nine,

L-

Thre

onine

- D-

Lacti

c

Acid

Meth

yl

Ester

-

172

Утилизация субстратов штаммом Trichoderma asperellum Samuels, Lieckf. and Nirenberg 1999 30 Э

мул

ьгатор

ы

Сахар

а

Сп

ир

ты

Ор

га

ни

чес

ки

е

ки

слоты

Сол

и

Нук

лео

зид

ы

Гл

ик

ози

ды

Гл

юк

ози

ды

Гал

ак

този

ды

Ам

ин

ы

Ам

ид

ы

Ам

ин

ок

исл

оты

Ком

пл

ексн

ые

соед

ин

ени

я

Эф

ир

ы

Ви

там

ин

ы

Высок

ая

утилиз

ация

субстр

ата

Tw

een

80

N-Acetyl-

Dgalactosamin

e, N-Acetyl-

Dglucosamine,

Dextrin, D-

Fructose, L-

Fucose,

Gentiobiose,

α-D-Glucose,

Glycogen, α-

D-Lactose,

Lactulose, D-

Mannose, D-

Melibiose,

Stachyose,

Sucrose, D-

Trehalose,

Turanose, D-

Xylose

D-Arabitol, i-

Erythritol,

Glycerol, D-

Mannitol, D-

Sorbitol

D-Glucuronic Acid,

2-Keto-D-Gluconic

Acid, β-Hydroxy-

butyric Acid , α-

Keto-glutaric Acid γ-

Hydroxy-butyric


Acid, Glycyl-L-

Glutamic Acid

- L-

Arab

inosе

- - - - - L-

Alani

ne

- D-

Lacti

c

Acid

Meth

yl

Ester

,

Succi

nic

Acid

Mon

o-

Meth

yl

Ester

-

Умере

нная

- D-Cellobiose,

α-

2-Amino γ-Amino-butyric

Acid, Bromosuccinic

- Aden Arbu β-

Meth

α-

Meth

D-

Gluc

- L-

Aspa

L-

Alanyl

- Am

ygd

173

утилиз

ация

субстр

ата

Cyclodextrin,

D-Galactose,

Maltotriose,

D-Raffinose,

D-Ribose

Ethanol

Acid, Fumaric Acid,

L-Lactic Acid,

Quinic Acid, D-

Saccharic Acid,

Sebacic Acid,

Succinic Acid, L-

Aspartic Acid, L-

Glutamic Acid

osine tin yl-

Dglu

cosid

e,

Salic

in

yl-

Dgal

actos

ide

osam

ine,

Putre

scine

ragin

e, L-

Ornit

hine,

L-

Serin

e

-

Glycin

e

alin

Слаба

я

утилиз

ация

субстр

ата

- N-Acetyl-

Dmannosamin

e, β-

Cyclodextrin,

Maltose, D-

Melezitose,

Palatinose, D-

Psicose, L-

Rhamnose,

Sedoheptulosa

n, L-Sorbose,

D-Tagatose,

Turanose, D-

Xylose

Adonitol, m-

Inositol,

Maltitol,

Xylitol


D-Gluconic Acid, p-

Hydroxyphenyl

acetic acid, D-Malic

Acid, Quinic Acid,

Succinamic Acid, N-

Acetly-L, L-Proline

Acid, L-

Pyroglutamic Acid

Glucose

-1-

Phospha

te,

Adenosi

ne-5'-

Monoph

osphatе

D-

Arab

inose

,

Uridi

ne

- α-

Meth

yl-

Dglu

cosid

e

β-

Meth

yl-

Dgal

actos

ide

- Gluc

uron

amid

e,

Alani

nami

de

L-

Phen

ylala

nine,

L-

Thre

onine

- - -

174

Утилизация субстратов штаммом Trichoderma gamsii Samuels and Druzhin. 282 Э

мул

ьгатор

ы

Сахар

а

Сп

ир

ты

Ор

ган

ич

еск

ие

ки

слоты

Сол

и

Нук

лео

зид

ы

Гл

ик

ози

ды

Гл

юк

ози

ды

Гал

ак

този

ды

Ам

ин

ы

Ам

ид

ы

Ам

ин

ок

исл

оты

Ком

пл

ексн

ые

соед

ин

ени

я

Эф

ир

ы

Ви

там

ин

ы

Высок

ая

утилиз

ация

субстр

ата

- α-

Cyclodextrin,

Glycogen

D-Arabitol, i-

Erythritol

- - - - - - - - - L-

Alanyl

-

Glycin

e

- -

Умере

нная

утилиз

ация

субстр

ата

Tw

een

80

N-Acetyl-

Dgalactosamin

e, D-

Cellobiose,

Dextrin, D-

Fructose, D-

Galactose,

Gentiobiose,

α-D-Glucose,

α-D-Lactose,

Lactulose,

Maltotriose,

D-Mannose,

Sucrose, D-

Trehalose,

Glycerol, D-

Mannitol

2-Keto-D-Gluconic

Acid, Bromosuccinic

Acid, D-Malic Acid,

L-Pyroglutamic Acid

Glucose

-1-

Phospha

te

Aden

osine

- β-

Meth

yl-

Dglu

cosid

e,

Salic

in

- - - - - Succi

nic

Acid

Mon

o-

Meth

yl

Ester

-

175

Turanose, D-

Xylose

Слаба

я

утилиз

ация

субстр

ата

- N-Acetyl-

Dglucosamine,

N-Acetyl-

Dmannosamin

e, β-

Cyclodextrin,

L-Fucose,

Maltose, D-

Melezitose, D-

Melibiose,

Palatinose, D-

Psicose, D-

Raffinose, L-

Rhamnose, D-

Ribose,

Sedoheptulosa

n, L-Sorbose,

Stachyose, D-

Tagatose

Adonitol, m-

Inositol,

Maltitol, D-

Sorbitol,

Xylitol, 2-

Amino

Ethanol


D-Gluconic Acid, D-

Glucuronic Acid, γ-

Amino-butyric Acid,

Fumaric Acid, β-

Hydroxy-butyric

Acid, γ-Hydroxy-

butyric Acid, p-

Hydroxyphenyl

acetic acid, α-Keto-

glutaric Acid, L-

Lactic Acid, L-Malic

Acid, Quinic Acid,

D-Saccharic Acid,

Sebacic Acid,

Succinamic Acid,

Succinic Acid, N-

Acetly-L, L-Aspartic

Acid, L-Glutamic

Acid, Glycyl-L-

Glutamic Acid, L-

Proline Acid

Adenosi

ne-5'-

Monoph

osphatе

D-

Arab

inose

, L-

Arab

inose

,

Uridi

ne

Arbu

tin

α-

Meth

yl-

Dglu

cosid

e

α-

Meth

yl-

Dgal

actos

ide,

β-

Meth

yl-

Dgal

actos

ide

D-

Gluc

osam

ine,

Putre

scine

Gluc

uron

amid

e,

Alani

nami

de

L-

Alani

ne,

L-

Aspa

ragin

e, L-

Ornit

hine,

L-

Phen

ylala

nine,

L-

Serin

e, L-

Thre

onine

- D-

Lacti

c

Acid

Meth

yl

Ester

Am

ygd

alin

176

Утилизация субстратов штаммом Trichoderma harzianum Rifai 1969 313 Э

мул

ьгатор

ы

Сахар

а

Сп

ир

ты

Ор

ган

ич

еск

ие

ки

слоты

Сол

и

Нук

лео

зид

ы

Гл

ик

ози

ды

Гл

юк

ози

ды

Гал

ак

този

ды

Ам

ин

ы

Ам

ид

ы

Ам

ин

ок

исл

оты

Ком

пл

ексн

ые

соед

ин

ени

я

Эф

ир

ы

Ви

там

ин

ы

Высок

ая

утилиз

ация

субстр

ата

- N-Acetyl-

Dglucosamine,

3-N-Acetyl-

Dmannosamin

e, D-Fructose,

D-Galactose,

Gentiobiose,

D-Glucose, D-

Mannose, D-

Melibiose,

Sedoheptulosa

n, D-Trehalose

D-Arabitol, i-

Erythritol,

Glycerol, D-

Mannitol, D-

Sorbitol,

Xylitol

D-Glucuronic Acid,

2-Keto-D-Gluconic

Acid, γ-Amino-

butyric Acid, Quinic

Acid, D-Saccharic

Acid, Succinamic

Acid, N-Acetly-L

- - - α-

Meth

yl-

Dglu

cosid

e, β-

Meth

yl-

Dglu

cosid

e

- - - L-

Alani

ne,

L-

Ornit

hine,

L-

Phen

ylala

nine,

L-

Serin

e

- Succi

nic

Acid

Mon

o-

Meth

yl

Ester

-

Умере

нная

утилиз

ация

субстр

ата

Tw

een

80

D-Cellobiose,

Dextrin, L-

Fucose,

Glycogen, D-

Lactose,

Lactulose,

Maltotriose, L-

Adonitol D-Gluconic Acid, D-

Glucuronic Acid,

Fumaric Acid, γ-

Hydroxy-butyric

Acid, p-

Hydroxyphenyl


- L-

Arab

inose

,

Aden

osine

Arbu

tin

Salic

in

- Putre

scinе

Alani

nami

de

L-

Aspa

ragin

e, L-

Thre

onine

L-

Alanyl

-

Glycin

e

D-

Lacti

c

Acid

Meth

yl

Am

ygd

alin

177

Sorbose,

Stachyose,

Sucrose, D-

Tagatose, D-

Xylose

glutaric Acid, L-

Lactic Acid, L-Malic


L-Aspartic Acid, L-

Glutamic Acid,т

Glycyl-L-Glutamic

Acid, L-Proline

Acid, L-

Pyroglutamic Acid

Ester

Слаба

я

утилиз

ация

субстр

ата

- N-Acetyl-

Dgalactosamin

e, α-

Cyclodextrin,

β-Cyclodext-

rin, L-Fucose,

Glycogen, α-

D-Lactose,

Lactulose,

Maltose,Mal-

totriose, D-

Melezitose,

Palatinose, D-

Psicose, D-

Raffinose, L-

Rhamnose, D-

Ribose,Turano

se

m-Inositol,

Maltitol, 2-

Amino

Ethanol


Bromosuccinic Acid,

β-Hydroxy-butyric

Acid, D-Malic Acid,

Sebacic Acid

Glucose

-1-

Phospha

te ,

Adenosi

ne-5'-

Monoph

osphatе

D-

Arab

inose

,

Uridi

ne

- - α-

Meth

yl-

Dgal

actos

ide,

β-

Meth

yl-

Dgal

actos

ide

D-

Gluc

osam

ine

Gluc

uron

amid

e

- - - -

178

Утилизация субстратов штаммом Trichoderma gamsii Samuels and Druzhin. 314 Э

мул

ьгатор

ы

Сахар

а

Сп

ир

ты

Ор

ган

ич

еск

ие

ки

слоты

Сол

и

Нук

лео

зид

ы

Гл

ик

ози

ды

Гл

юк

ози

ды

Гал

ак

този

ды

Ам

ин

ы

Ам

ид

ы

Ам

ин

ок

исл

оты

Ком

пл

ексн

ые

соед

ин

ени

я

Эф

ир

ы

Ви

там

ин

ы

Высок

ая

утилиз

ация

субстр

ата

- α-

Cyclodextrin,

D-Xylose

D-Arabitol, i-

Erythritol, 2-

Amino

Ethanol

- - - - - - - - - - - -

Умере

нная

утилиз

ация

субстр

ата

Tw

een

80

D-Cellobiose,

Dextrin, D-

Fructose, D-

Galactose,

Gentiobiose,

α-D-Glucose,

Glycogen, α-

D-Lactose,

Maltotriose,

D-Mannose,

Sedoheptulosa

n, Stachyose,

D-Trehalose,

Turanose

Glycerol, D-

Mannitol

2-Keto-D-Gluconic

Acid, Bromosuccinic

Acid, Fumaric Acid

Glucose

-1-

Phospha

te

Aden

osine

- Salic

in

- - - - - - -

179

Слаба

я

утилиз

ация

субстр

ата

- N-Acetyl-

Dgalactosamin

e, N-Acetyl-

Dglucosamine,

N-Acetyl-

Dmannosamin

e, β-

Cyclodextrin,

L-Fucose,

Lactulose,

Maltose, D-

Melezitose, D-

Melibiose,

Palatinose, D-

Psicose, D-

Raffinose, L-

Rhamnose, D-

Ribose, L-

Sorbose,

Sucrose, D-

Tagatose

Adonitol, m-

Inositol,

Maltitol, D-

Sorbitol,

Xylitol


D-Gluconic Acid, D-

Glucuronic Acid, γ-

Amino-butyric Acid,

β-Hydroxy-butyric

Acid, γ-Hydroxy-

butyric Acid, p-

Hydroxyphenyl


glutaric Acid, L-

Lactic Acid, D-Malic

Acid, L-Malic Acid,

Quinic Acid, D-

Saccharic Acid,

Sebacic Acid,

Succinamic Acid,

Succinic Acid, N-


Acid, L-Glutamic

Acid, Glycyl-L-

Glutamic Acid, L-

Proline Acid, L-

Pyroglutamic Acid

Adenosi

ne-5'-

Monoph

osphate

D-

Arab

inose

, L-

Arab

inose

,

Uridi

ne

Arbu

tin

α-

Meth

yl-

Dglu

cosid

e, β-

Meth

yl-

Dglu

cosid

e

α-

Meth

yl-

Dgal

actos

ide,

β-

Meth

yl-

Dgal

actos

ide

D-

Gluc

osam

ine,

Putre

scine

Gluc

uron

amid

e,

Alani

nami

de

L-

Alani

ne,

L-

Aspa

ragin

e, L-

Ornit

hine,

L-

Phen

ylala

ninе,

L-

Serin

e, L-

Thre

onine

L-

Alanyl

-

Glycin

e

D-

Lacti

c

Acid

Meth

yl

Ester

,

Succi

nic

Acid

Mon

o-

Meth

yl

Ester

Am

ygd

alin

180

Утилизация субстратов штаммом Trichoderma viride Pers. 1794 346 Э

мул

ьгатор

ы

Сахар

а

Сп

ир

ты

Ор

ган

ич

еск

ие

ки

слоты

Сол

и

Нук

лео

зид

ы

Гл

ик

ози

ды

Гл

юк

ози

ды

Гал

ак

този

ды

Ам

ин

ы

Ам

ид

ы

Ам

ин

ок

исл

оты

Ком

пл

ексн

ые

соед

ин

ени

я

Эф

ир

ы

Ви

там

ин

ы

Высок

ая

утилиз

ация

субстр

ата

- Glycogen - Bromosuccinic Acid,

Succinic Acid, L-

Pyroglutamic Acid

- - - - - - - - - - -

Умере

нная

утилиз

ация

субстр

ата

Tw

een

80

α-

Cyclodextrin,

Dextrin, D-

Fructose, D-

Galactose,

Gentiobiose,

α-D-Glucose,

Lactulose,

Maltotriose,

D-Mannose,

D-Ribose,

Sucrose, D-

Trehalose, D-

Xylose, D-

D-Arabitol, i-

Erythritol

D-Gluconic Acid, D-

Glucuronic Acid,

Fumaric Acid, γ-

Hydroxy-butyric


Acid, L-Malic Acid,

Quinic Acid

Glucose

-1-

Phospha

te

Aden

osine

- Salic

in

- - - - L-

Alanyl

-

Glycin

e

- -

181

Mannitol

Слаба

я

утилиз

ация

субстр

ата

- N-Acetyl-

Dgalactosamin

e, N-Acetyl-

Dglucosamine,

N-Acetyl-

Dmannosamin

e, D-

Cellobiose, β-

Cyclodextrin,

L-Fucose, α-

D-Lactose,

Maltose, D-

Melezitose, D-

Melibiose,

Palatinose, D-

Psicose, D-

Raffinose, L-

Rhamnose,

Sedoheptulosa

n, L-Sorbose,

Stachyose, D-

Tagatose,

Turanose

Adonitol,

Glycerol, m-

Inositol,

Maltitol, D-

Sorbitol,

Xylitol, 2-

Amino

Ethanol


2-Keto-D-Gluconic

Acid, γ-Amino-

butyric Acid, β-

Hydroxy-butyric

Acid, p-

Hydroxyphenyl

acetic Acid, L-Lactic

Acid, D-Malic Acid,

D-Saccharic Acid,

Sebacic Acid,

Succinamic Acid, N-


Acid, L-Glutamic

Acid, Glycyl-L-

Glutamic Acid, L-

Proline Acid

Adenosi

ne-5'-

Monoph

osphate

D-

Arab

inose

, L-

Arab

inose

,

Uridi

ne

Arbu

tin

α-

Meth

yl-

Dglu

cosid

e, β-

Meth

yl-

Dglu

cosid

e

α-

Meth

yl-

Dgal

actos

ide,

β-

Meth

yl-

Dgal

actos

ide

D-

Gluc

osam

ine,

Putre

scine

Gluc

uron

amid

e,

Alani

nami

de

L-

Alani

ne,

L-

Aspa

ragin

e, L-

Ornit

hine,

L-

Phen

ylala

ninе,

L-

Serin

e, L-

Thre

onine

L-

Alanyl

-

Glycin

e

D-

Lacti

c

Acid

Meth

yl

Ester

,

Succi

nic

Acid

Mon

o-

Meth

yl

Ester

Am

ygd

alin

Микромицеты (отдел ascomycota порядки …...1.1 Антибиотики –...

Documents