光学活性基幹化学品を 余剰バイオマスから製造する …1...
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光学活性基幹化学品を
余剰バイオマスから製造する技術
産業技術総合研究所健康工学研究部門
河田 悦和
2
研究背景・概略
社会要請 ・余剰バイオマス(バイオエネルギーの生産に伴って、
副生するC5糖や廃グリセロール)の利活用
・石油を原料とする化成品の再生資源化
余剰になるには訳がある → 難しい利用
独自の好塩好アルカリ・ハロモナス菌を発見、余剰バイオマスを直接活用を検討、有望な基幹化学品
3-ヒドロキシ酪酸(3HB)の生産手法を開発した。
3
廃グリセロールとは
• バイオディーゼル生産の副生物, 原料油脂に対し10重量%程度生じる.
• 世界で年間100万トン以上生産される.
• 組成
グリセロール 60-65 %
アルカリ触媒 2-3% メタノール 2 %以下
pH 10 - 11
• 用途
現在は 精製グリセロール(コストに難), 廃棄(燃焼など)
将来は Epichlorohydrin, 1,2-propanediol, 1,3-propanediol, Succinic acid, Lactic acid,
Hydrogen, Dihydroxyacetone, Polyesters,
Polyhydroxyalkanoates (PHA バイオプラスチック) と リファイナリー
CH2-COOR1 + CH3OH R1COOCH3 CH2OH
CH -COOR2 + CH3OH R2COOCH3 + CH OH
CH2-COOR3 + CH3OH R3COOCH3 CH2OH
アルカリ触媒KOH
60~70℃
油脂 バイオディーゼル廃グリセロールメタノール バイオディーゼルBDF
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木材、ソフトバイオマス糖化液とは
・木材
セルロース C6糖 グルコース
ヘミセルロース C6糖 グルコース C5糖 キシロース、アラビノース
リグニン
・ソフトバイオマス
農業残渣、草本など 主に、セルロース、ヘミセルロースから構成
・糖化手法
化学法 (主に硫酸糖化)
生物分解法 (酵素処理、物理的な前処理が必要)
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PHA (poly-3-hydroxylkanoate) とは
微生物中に蓄えられる
Courtesy: Metabolix & Biomeryより
PHA R PHB - CH3
PHV -CH2CH3
PHBV (Biopol®) - CH3 & CH2CH3
として1990年代に商業化
PHBHx -CH3 & - CH2CH2CH3
PHBO -CH3 & -(CH2)4CH3
O
R
OH
O
H
x
n
PHA の構造
R =Alkyl group
(up to C13)
x = 1 to 3 PHA
Ralstonia eutropha の例
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廃グリセロール利用菌のスクリーニング
培地組成
NaHCO3 16.8 g/l
K2HPO4 0.5
NaNO3 2.5
K2SO4 1.0
NaCl 1.0
MgSO47H2O 0.2
CaCl22H2O 0.04
FeSO47H2O 0.01
EDTA・2Na 0.32 他トレース金属
Glycerol pH 9.0
土壌サンプル
プレート培養 集積培養 水などに懸濁
液体培養 1 液体培養 2
分析へ
→ Halomonas sp. KM-1など取得
トリプトン、酵母エキスを含まない
安価な培地で培養
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Halomonas sp. KM-1は
栄養塩と廃グリセロールで培養できる.
Control 1% 3% 5% 10% 15%
副生グリセロール濃度
・pH 調整 なし
・滅菌操作 なし
濁度
60
0n
m
8
Halomonas sp.KM-1によるPHA生産状況
廃グリセロール 10%
乾燥菌体重量 23.4 g/L
PHA の割合 52.8%
グリセロール 10%
乾燥菌体重量 34.8 g/L
PHA の割合 63.6%
滅菌なし、直接添加して48 h培養
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培養条件改善によるPHA高収率化
0
5
10
15
20
25
10 20 30 40 50 60 70 80
O
D
6
0
0
培養時間
グリセロール10%
グリセロール5%+12h後5% 計10%
グリセロール5%+24h後5% 計10%
0
5
10
15
20
25
30
10 20 30 40 50 60 70 80
P
H
B
m
g
/
m
l
培養時間
グリセロール10%
グリセロール5%+12h後5% 計10%
グリセロール5%+24h後5% 計10%
培養時間
40h 84h
培養時間
炭素源
PHA
content
(wt.%)
CDW
(g l−1)
PHA
concentration
(g l−1)
Volumetric
productivity
(g l−1 h−1)
当初は
160時間
グリセロール
5%
72.4
3.5
0.03
現在は
84時間
グリセロール
計 20%
86.4
47.3
1.14
2.53
40.9
研究当初の16倍以上に
10
C5,C6糖利用の検討
→ キシロースとグルコースの代謝は競合しない.
0
5
10
15
20
25
10 15 20 25 30 35 40 45 50
O
D
6
0
0
培養時間 (h)
グルコース 5%
キシロース 5%
グルコース 2.5% + キシロース 2.5%
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
10 15 20 25 30 35 40 45 50
P
H
B
%
培養時間 (h)
グルコース 5%
キシロース 5%
グルコース2.5%+キシロース2.5%
0.0
2.0
4.0
6.0
8.0
10.0
12.0
10 15 20 25 30 35 40 45 50
P
H
B
m
g
/
m
l
培養時間 (h)
グルコース 5%
キシロース 5%
グルコース2.5%+キシロース2.5%
0%
1%
2%
3%
4%
5%
0 10 20 30 40 50
残存糖量%
培養時間 (h)
グルコース 5%
キシロース 5%
混合培養グルコース量
混合培養キシロース量
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木材糖化液の利用
木材糖化液をほぼ利用できる
0
5
10
15
20
25
30
0 20 40
OD
60
0
Culture time (h)
Glucose 5%
Glucose 8%
ダグラスファー50%
Glucose 5%+ダグラス
ファー50%
ユーカリ50%
Glucose 5%+ユーカリ
50%
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Organism Carbon source
PHA
content
(wt.%)
CDW
(g l−1)
PHA
concentration
(g l−1)
Volumetric
productivity
(g l−1 h−1)
Reference
Halomonas sp. KM-1 廃グリセロール 60.0 24.8 14.9 0.58
本成果 Halomonas sp. KM-1 グリセロール 86.4 47.3 40.9 1.14
Halomonas
boliviensis ショ糖 54.0 14.0 7.7 0.40
Quillaguamán et al.
2007
Alcaligenes latus ショ糖 83.0 14.0 11.5 0.39 Wang and Lee 1997
Azotobacter
vinelandii a グルコース 74.0 10.0 7.5 0.30 Page 1992
Escherichia coli a グルコース 80.8 8.9 7.2 0.15 Lee et al. 1994
Wautersia eutropha H2/CO2 76.0 17.0 13.0 0.18 Heinzle and Lafferty
1980
Wautersia eutropha a グルコース 54.0 9.4 5.1 0.11 Doi et al. 1988
Pseudomonas
oleovorans Octane 25.0 2.0 0.5 0.02 Lageveen et al. 1988
Haloferax
mediterranei
デンプン
67.0
9.7
6.5
-
Lillo and Rodriguez-
Valera 1990;
Rodriguez-Valera
and Lillo 1992 a Cultivation of the microorganism was performed in shake flasks
バッチ培養によるPHA 生産の比較 (shake flasks and fermentors)
生産効率が異なる?
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C2 C3 C4 C5 C6
ヒドロキシ化合物
CH3CH2OH
(エタノール) CH3CH2CH2CH2OH
(n-ブタノール)
HOCH2CH2CH2OH
(1,3-プロパンジオール) CH3CH(OH)CH(OH)CH3
(2,3-ブタンジオール)
HOCH2CH(OH)CH2OH
(グリセリン)
CH2OHCH(OH)CH
(OH)CH2OH
(エリスリトール)
カルボキシ化合物 CH3COOH
(酢酸) CH3CH2COOH
(プロピオン酸) CH3CH2CH2COOH
(酪酸) CH3CH2CH2CH2COOH
(カプロン酸)
HOOCCH2CH2COOH
(コハク酸)
HOOCCH=CHCOOH
(フマル酸) CH2=C(COOH)CH2COOH
(イタコン酸)
CH3CH(OH)COOH
(乳酸) HOOCCH2CH(OH)COOH
(リンゴ酸)
HOOCCH(OH)CH(OH)COOH
(酒石酸) HOOCCH2CH(COOH)CH(OH)COOH
(クエン酸)
CH3CH(OH)CH2CH2COOH
(4-ヒドロキシ吉草酸) (CH3CH(OH)CH2CH2CH2COOH) (5-
ヒドロキシヘキサン酸)
CH2(OH)CH2COOH
(3-ヒドロキシプロピオン酸) (CH2(OH)CH2CH2COOH)
(4-ヒドロキシ酪酸) CH2(OH)CH2CH2CH2COOH
(5-ヒドロキシ吉草酸)
(CH3CH(OH)CH2COOH) (3-ヒドロキシ酪酸)
CH3CH2CH(OH)CH2COOH
(3-ヒドロキシ吉草酸) (CH3CH2CH2CH(OH)CH2COOH)
(3-ヒドロキシヘキサン酸)
CH3COCOOH
(ピルビン酸) HOOCCH2CH2COCOOH
(ケトグルタル酸)
カルボニル化合物 CH3COCH3
(アセトン) CH3CH(OH)COCH3
(アセトイン)
アミノ酸 CH2(OH)CHNH2COOH
(セリン)
CH2CH(OH)CH(NH2)COOH
(スレオニン) HOOCCH2CH2CH(NH2)COOH
(グルタミン酸) H2NCH2CH2CH2CH2CH(NH2)COOH
(リジン)
HOOCCH2CH2(NH2)COOH
(アスパラギン酸)
バイオリファイナリーの出発中間体として期待しうる32化合物 (RITE 湯川氏発表より)
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Halomonas sp. KM-1の
菌体内代謝解析
依頼分析
CE-MSにより、はカチオンモード、アニオンモードの測定を行った。
カチオンモード Agilent CE-TOFMS system
Capillary : Fused silica capillary i.d. 50 μm × 80 cm
測定条件
Run buffer : Cation Buffer Solution (p/n : H3301-1001)
Rinse buffer : Cation Buffer Solution (p/n : H3301-1001)
Sample injection : Pressure injection 50 mbar, 10 sec
CE voltage : Positive, 27 kV
MS ionization : ESI Positive
MS capillary voltage : 4,000 V
MS scan range : m/z 50-1,000
Sheath liquid : HMT Sheath Liquid (p/n : H3301-1020)
アニオンモード
測定条件
Run buffer : Anion Buffer Solution (p/n : H3302-1021)
Rinse buffer : Anion Buffer Solution (p/n : H3302-1022)
Sample injection : Pressure injection 50 mbar, 25 sec
CE voltage : Positive, 30 kV
MS ionization : ESI Negative
MS capillary voltage : 3,500 V
MS scan range : m/z 50-1,000
Sheath liquid : HMT Sheath Liquid (p/n : H3301-1020)
190種類の代謝中間体を分析
赤 廃グリセリン
青 グリセリン
廃グリセリンとグリセリンで
代謝が異なる候補は?
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赤 廃グリセロール
青 グリセロール
菌体の内と外で違うものを作る
・内でバイオプラスチックPHA
・外で代謝中間体 も可能か?
Halomonas sp. KM-1の
菌体外分泌物の代謝解析
PHA生合成に関与する代謝解析
190種類の代謝中間体を分析
培地の中に
a-ケトグルタル酸 18.5 g/L
3-Hydroxybutyric acid 0.24 g/L ・ケトン体としてアルツハイマー病等に有効
・光学活性のある化成品中間体
・ポリマーの原料
を分泌していることを発見
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Citrate
Isocitrate
Oxalosuccinate
a-Ketoglutarate
Succinyl-CoA
Succinate
Acetyl-CoA
Oxyaloacetate
Malate
Fumarate
cis-Aconiate
Pyruvate
Phosphoenolpyruvate
好気的条件 嫌気的条件
CO2
CO2
PHB
(R)-3-hydroxybutyryl-CoA
Acetoacetate
Acetoacetyl-CoA
(S)-3-hydroxybutyryl-CoA
(R)-3-hydroxybutyrate
ハロモナス菌の主要な代謝物の蓄積経路
糖など
Glutamate
GABA
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微好気培養による3-ヒドロキシ酪酸(3HB)生産
12時間後
バイオプラスチック
PHB顆粒(3HB原料) 3HB生産した跡
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余剰バイオマス資源からのリファイナリー生産
ゲノム、メタボローム解析終了
→ 安全性確認済み遺伝子改変・突然変異等可能
新しいホワイトバイオテクノロジーのためのインフラとして
バイオリファイナリー生産可能
Halomonas sp. KM-1株好塩、好アルカリ細菌
バイオエタノール関連
木材など
糖化糖化液
高塩、高アルカリ環境ゆえ雑菌の混入がない
滅菌処理不用簡易な設備で培養
(低エネルギー・低コストインフラでの生産可能)
ハロモナスKM-1株は・C5糖キシロース、アラビノースを,
C6 糖グルコースと同時代謝できる.・木材糖化液で培養阻害されにくい
バイオディーゼル工場油脂
バイオディーゼル関連
パームなど
バイオプラスチックPHB
菌体内に蓄積
菌体外に分泌
バイオリファイナリーαケト酸、乳酸など
PHB
PHBP
HB
αケト酸、乳酸など
培養液に対し数%は生産可能
PHB
PHBP
HB
菌体外に分泌
バイオリファイナリー3-ヒドロキシ酪酸
(3-HB)
微好気条件
好気条件
3-HB分解・生成エタノール発酵残液
廃グリセリン直接利用可能
海水利用可能
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従来技術とその問題点
余剰バイオマスの利用は世界的な課題
多くの研究機関で検討実施中
・純粋なグリセロール
・純粋なグルコース、キシロース、アラビノースは利用できるが、夾雑物に対しての抵抗性に難があり、広く利用されるまでには至っていない。
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新技術の特徴・従来技術との比較
• 余剰バイオマス資源(木材等糖化物、廃グリセロール)を直接利用可能(夾雑物抵抗性有り)
• 滅菌処理が不要な省エネルギープロセス
• 薬理活性があり、化成品等原料となる
3-ヒドロキシ酪酸の分泌レベルは世界最高
• 本技術の適用により、原料コスト、ランニングコストが低減できるため、全体のコストの著しい削減が期待される。
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実用化に向けた課題
• 生産規模の拡大について課題有り
• 培養残渣の処理を含めたシステムの精査
• 今後、生産規模の拡大に向け、対象とする余剰バイオマスの策定とともに、実験データを取得し、条件設定を行っていく。
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企業への期待
• 未解決の生産規模、密度については、化学工学的な手法を精査することで克服できると考えている。
• 培養技術、有機酸の精製技術を持つ、企業との共同研究を希望。
• また、バイオマスエネルギーを開発中の企業、余剰バイオマスの有効利用の分野への展開を考えている企業には、本技術の導入が有効と思われる。
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本技術に関する知的財産権
• 発明の名称 : 3-ヒドロキシ酪酸又はその
塩の産生方法
• 出願番号 :特願2011-222685
• 出願人 :産業技術総合研究所
• 発明者 :河田悦和
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お問い合わせ先
産業技術総合研究所
イノベーションコーディネータ 小高 正人
TEL 029-861-6683
FAX 029-862-6048
e-mail m.kodaka@aist.go.jp