ΟΟ ΚυτταρικόςΚυτταρικός ΚύκλοςΚύκλος

The Cell CycleThe Cell Cycle

HH ζωήζωή τουτου κυττάρουκυττάρου

Αντιγραφή τουDNA και

Κυτταρική αύξηση

ΚυτταρικόςΚύκλος

Θυγατρικά Κύτταρα

Κυτταρική∆ιαίρεση

Γήρανση(Senescence)

Κυτταρικός θάνατος

ΟιΟι φάσειςφάσεις τουτου κυτταρικούκυτταρικού κύκλουκύκλου

G1S

MG2

∆ιαχωρισμόςχρωμοσωμάτων

Κυτταροπλασματική∆ιαίρεση

(Κυτταροκίνηση)

G0

Z Ζ Ζ Ζ Quiescence

S

G2

M

G1

Η φάση G0

• Είναι περίοδος στην οποία το κύτταρο ευρίσκεται«έξω» από τον κυτταρικό κύκλο, σε κατάστασηληθάργου (quiescent), δηλαδή δεν διπλασιάζει το DNA και δεν διαιρείται, επιτελεί όμως άλλες λειτουργίες(μεταβολισμός, επικοινωνία, κίνηση, κ.α.)

• Σε συνθήκες κυτταροκαλιέργειας, τα κύτταραπηγαίνουν από τη G1 στη G0 όταν οι θρεπτικές ουσίεςδεν επαρκούν, έως ότου υπάρξουν πάλι προϋποθέσειςνα πολλαπλασιαστούν οπότε επιστρέφουν στην G1 καισυνεχίζουν τον κυτταρικό κύκλο

• Στον οργανισμό, τα διαφοροποιημένα κύτταρα (ποιαείναι?) είναι μόνιμα σε φάση G0

ΡύθμισηΡύθμιση τουτου κυτταρικούκυτταρικού κύκλουκύκλου

Οι φάσεις του κυτταρικού κύκλου (G1, S, G2 και M)πρέπει να διαδραματίζονται:

• Με τη σωστή σειρά

• Στον κατάλληλο χρόνο

• Μόνο μία φορά σε κάθε κύκλο

Cyclin-dependent kinase (Cdk)

cyclin

TaTa σύμπλοκσύμπλοκaa κινκινaaσώνσών Cdk/CyclinCdk/Cyclin είναιείναιυπεύθυναυπεύθυνα γιαγια τοτο συντονισμόσυντονισμό τωντωνγεγονότωνγεγονότων τουτου κυτταρικούκυτταρικού κύκλουκύκλου

S Cdk/Cyclin

ΕνεργοποίησηΕνεργοποίηση/ / απενεργοποίησηαπενεργοποίηση συμπλόκωνσυμπλόκων Cdk/CyclinCdk/Cyclinρυθμίζειρυθμίζει τηντην πρόοδοπρόοδο τουτου κυτταρικούκυτταρικού κύκλουκύκλου

G1S

MG2

G1 Cdk/Cyclin

G1/S Cdk/Cyclin

M Cdk/Cyclin

G2 Cdk/Cyclin

Anaphase onset

Growth factors Mitogens

No Cdkactivity

Ποιοι μηχανισμοί ρυθμίζουν τηνενεργότητα των Cdks?

Cdk

INACTIVE

ATP

Cyclin

active site

Cyclin

T-loop

ATP

Cdk-activating kinase (CAK)

activating phosphorylation T161

ACTIVE

ATP

P

1. 1. ΕνεργοποίησηΕνεργοποίηση τωντων CdksCdks μέσωμέσω πρόσδεσηςπρόσδεσηςκυκλινώνκυκλινών καικαι φωσφορυλίωσηςφωσφορυλίωσης

Cdc25 phosphatases

Activating phosphorylation T161

Cdk

cyclin

ACTIVE

P

Wee1 kinase

Inhibitory phosphorylationsT14 & Y15

INACTIVE

P

P

2. 2. ΑναστολήΑναστολή τηςτης ενεργότηταςενεργότητας τωντωνCdksCdks μέσωμέσω φωσφορυλίωσηςφωσφορυλίωσης

3. 3. ΑναστολήΑναστολή τηςτης ενεργότηταςενεργότητας τωντωνCdksCdks απόαπό CdkCdk inhibitor proteins inhibitor proteins

(CKI)(CKI)

INACTIVE

CKI

ACTIVE

Cdk

cyclin

P P

All Cdksp21cip/waf1

p27kip1

p57Cip/ Kip

G1 Cdksp15INK4B

p16INK4A

P19 INK4D

INK4

TargetsMembersCKI family

Cyclin

CdkT-Y- -T p

ACTIVE

CDC25

Cyclin

CdkT-Y- -T p

Wee1

p

CdkT-Y- -T p

Cyclin

CKI

CdkT-Y- -T p

CKI

Cyclin

CdkT-Y- -T

PP

CAK (Cdk7/CycH)

ΜηχανισμοίΜηχανισμοί ρύθμισηςρύθμισης τηςτηςενεργότηταςενεργότητας τωντων CdksCdks

4. 4. ΡύθμισηΡύθμιση τηςτης ενεργότηταςενεργότηταςτωντων CdksCdks μέσωμέσω πρωτεόλυσηςπρωτεόλυσης

εξαρτώμενηςεξαρτώμενης απόαπό τοτοΠρωτεάσωμαΠρωτεάσωμα

ToTo ΠρωτεάσωμαΠρωτεάσωμα ((ProteasomeProteasome))• Είναι μια ενδοκυτταρική πρωτεάση και η δράση της απαιτείυδρόλυση ATP

• Ρόλος του πρωτεασώματος είναι η αποικοδόμηση πρωτεϊνώνλόγω βλαβών, λαθών κατά τη σύνθεσή τους ή αναγκών τουκυτταρικού κύκλου

• Αποτελείται από ένα κεντρικό «κούφιο» κυλινδρικό τμήμα

• και από δύο υπομονάδες (caps) στα άκρα του κυλίνδρου

caps

Adapted from MBC, Alberts et al, 4th Edition

ΓιαΓια νανα δράσειδράσει τοτο πρωτεάσωμαπρωτεάσωμα πρέπειπρέπει ηηπρωτεΐνηπρωτεΐνη--στόχοςστόχος νανα ««σημανθείσημανθεί»» μεμε αλυσίδααλυσίδα

μορίωνμορίων ubiquitinubiquitin

• Ubiquitin: μικρή πρωτεΐνη 76 αα. Προσδένεται σε πλευρικές αλυσίδες Lysineτων πρωτεϊνών-στόχων από ubiquitinationένζυμα και σχηματίζει αλυσίδες poly-ubiquitin

Ubiquitin

HOOC

NH2

Πρόσδεσησε Lysine

Υδρόφοβοσφαιρικό τμήμα

Adapted from MBC, Alberts et al, 4th Ed

ΛειτουργίαΛειτουργία τουτου ΠρωτεασώματοςΠρωτεασώματος

normal proteinmisfolded protein

poly-ubiquitin chain

proteasome

ATP

poly-ubiquitin chain

misfolded protein

UbiquitinationUbiquitination ΈνζυμαΈνζυμα

• Για το σχηματισμό αλυσίδων poly-ubiquitinχρειάζονται ubiquitination ένζυμα

• Κατηγορίες Ubiquitination ενζύμων :

E1: ubiquitin activating enzyme

E2: ubiquitin conjugating enzyme

E3: ubiquitin ligase

• Υπάρχουν περισσότερα από 300 σύμπλοκα Ε2-Ε3 τα οποία αναγνωρίζουν διαφορετικά σήματααποικοδόμησης πρωτεϊνών-στόχων (ειδικέςαμινοξικές αλληλουχίες, φωσφορυλιώσεις, κ.ά.)

Ubiquitin

HOOC

NH2

Πρόσδεσησε Lysine

Υδρόφοβοσφαιρικό τμήμα

Adapted from MBC, Alberts et al, 4th Ed

ΟυμπικιτινίωσηΟυμπικιτινίωση πρωτεϊνώνπρωτεϊνών ((protein protein ubiquitinationubiquitination))

E2

E3

Phosphorylationtargets protein

for ubiquitination

prot

einkinase

p

prot

ein

Misfoldedprotein to be

degraded

E2

E3

prot

ein

p

E1 SH COO-

Ub

ATPE1 SC=O

E2

E3

E1

prot

ein

Poly-Ub protein is targeted for degradation by the proteasome

E2

E3

prot

ein

p

∆ύο∆ύο κατηγορίεςκατηγορίες συμπλόκωνσυμπλόκων μεμεενεργότηταενεργότητα E3 E3 ubiquitinubiquitin ligaseligase

ρυθμίζουνρυθμίζουν τηντην ενεργότηταενεργότητα τωντων CdksCdks

SCF

(Τέλος G1, S, G2)

APC/C

(M και αρχή G1)

•• ΕίναιΕίναι σύμπλοκοσύμπλοκο πρωτεϊνώνπρωτεϊνών (Skp1/CUL1/F(Skp1/CUL1/F--Box protein) Box protein) μεμεενεργότηταενεργότητα ΕΕ3 3 ubiquitinubiquitin ligaseligase

•• ΑναγνωρίζειΑναγνωρίζει φωσφορυλιωμένεςφωσφορυλιωμένες πρωτεΐνεςπρωτεΐνες--στόχουςστόχους, , τιςτιςουμπικιτινιώνειουμπικιτινιώνει καικαι τιςτις σημαίνεισημαίνει γιαγια πρωτεόλυσηπρωτεόλυση απόαπό τοτοπρωτεάσωμαπρωτεάσωμα

•• ΣυμμετέχειΣυμμετέχει στηστη ρύθμισηρύθμιση τηςτης ενεργότηταςενεργότητας τωντων CdksCdks κατάκατά τιςτιςG1, S G1, S καικαι G2 G2 μέσωμέσω αναγνώρισηςαναγνώρισης καικαι ουμπικιτινίωσηςουμπικιτινίωσης CKICKI καικαιΚυκλινώνΚυκλινών

ΤοΤο σύμπλοκοσύμπλοκο SCFSCF

ΡύθμισηΡύθμιση τηςτης ενεργότηταςενεργότητας τωντων CdksCdksαπόαπό τοτο σύμπλοκοσύμπλοκο SCFSCF

Cdk inhibitor protein (CKI)

INACTIVE

Pkinase

P

Pactive SCF

ubiquitin, E1 + E2

enzymes

poly-ubiquitinchain

P

P

ACTIVE

Cdk

cyclin

P

kinaseP

P

active SCF

ubiquitin, E1 + E2

enzymes

P

P

active Cdk

Pproteasome

P

inactive Cdk

proteasome

ΜηχανισμοίΜηχανισμοί ρύθμισηςρύθμισης τηςτης ενεργότηταςενεργότηταςτωντων CdksCdks

• Πρόσδεση Κυκλινών και φωσφορυλίωση ενεργοποίησης στηνThr161

• Φωσφορυλιώσεις απενεργοποίησης στις Thr14 & Tyr15

• Πρόσδεση πρωτεϊνών CDK-inhibitors (CKI)

• Αποικοδόμηση Κυκλινών από το πρωτεάσωμα

• Αποικοδόμηση CKI από το πρωτεάσωμα

ΤαΤα κυριότερακυριότερα σύμπλοκασύμπλοκα Cdk/CyclinCdk/Cyclinσεσε κύτταρακύτταρα σπονδυλοζώωνσπονδυλοζώων

Cyclin BCdk1 (Cdc2)M

Cyclin ACdk1 (Cdc2)G2

Cyclin ACdk2S

Cyclin ECdk2G1/S

Cyclin DCdk4, Cdk6G1

CyclinCdkCdk/Cyclin

Cdk4,6/Cyclin DG1S

MG2

Cdk2/Cyclin E

Cdk2/Cyclin Α

Cdk1/Cyclin Α

Cdk1/Cyclin Β

ΜεταβολέςΜεταβολές στηνστην ενεργότηταενεργότητα συμπλόκωνσυμπλόκωνCdk/CyclinCdk/Cyclin ρυθμίζουνρυθμίζουν τοντον κυτταρικόκυτταρικό κύκλοκύκλο

Anaphase onset

Growth factors Mitogens

No Cdkactivity

Cdk4,Cdk6/Cyclin DG1S

MG2

Cdk2/Cyclin E

Growth factors Mitogens

ΗΗ ολοκλήρωσηολοκλήρωση τηςτης G1G1 καικαι ηη έναρξηέναρξη τηςτηςSS ρυθμίζεταιρυθμίζεται απόαπό τιςτις CdksCdks

Το μονοπάτι CDK-Rb-E2F

No Cdkactivity

ΗΗ πρωτεΐνηπρωτεΐνη τουτου ΡετινοβλαστώματοςΡετινοβλαστώματος((Retinoblastoma proteinRetinoblastoma protein,, RbRb))

• Είναι ογκοκατασταλτική πρωτεΐνη. Απενεργοποίηση και τωνδύο αλληλομόρφων του γονιδίου προκαλεί καρκίνο τουρετινοβλαστώματος στον άνθρωπο

• Εκφράζεται σταθερά αλλά μεταβάλλονται τα επίπεδαφωσφορυλίωσης της πρωτεΐνης κατά τον κυτταρικό κύκλο

• Φωσφορυλιώνεται στη G1 από τις CDK4, CDK6 και CDK2. Ημη φωσφορυλιωμένη μορφή της Rb προσδένει και απενεργοποιείτο μεταγραφικό παράγοντα E2F

• O ενεργός E2F προσδένεται σε αλληλουχίες υποκινητών καιεπάγει την έκφραση γονιδίων-στόχων του E2F

Growth factor-activated signaling pathways (mitogens)

Cdk4,Cdk6/ Cyclin D

Rb partially inactive Rb

PP

Rb

E2FInactive E2F No expression of E2F target

genes

E2FLow E2F activity Low expression of E2F target

genes

E2FHigh E2F activity High expression of E2F target

genes

active Rb

Cdk2/ Cyclin E

Rb inactive RbP P

P P

Cdk4,Cdk6/ Cyclin D

Το μονοπάτι CDK-Rb-E2F

No Cdk activity

ΟΟ μεταγραφικόςμεταγραφικός παράγονταςπαράγοντας E2FE2F• Προσδένει τη μη φωσφορυλιωμένη πρωτεΐνη Rb

• Απουσία προσδεδεμένης Rb εντοπίζεται σε ειδικές αλληλουχίες στονυποκινητή και επάγει την έκφραση γονιδίων-στόχων

• Προσελκύει ένζυμα που προκαλούν «άνοιγμα» της δομής της χρωματίνηςώστε αυτή να είναι μεταγραφικά ενεργή

Closed chromatin

Transcriptional inactive

Ε2FHAT

Open chromatin

Gene expression

RbE2

FRb

P P

P P

CDKs

ΟΟ μεταγραφικόςμεταγραφικός παράγονταςπαράγοντας E2FE2F

• Οι μεταγραφικοί του στόχοι περιλαμβάνουν γονίδια:

Κυτταρικού κύκλου (Cdk2, Cyclin Ε, Cyclin A, E2F)

Αντιγραφής DNA (PCNA, MCM2-7, RPA, H2A, DNA polα, δ)

Επιδιόρθωσης DNA (BRCA1,2, FANC, RAD51)

Απόπτωσης (APAF1, CASPases 3,7,8)

Cdk4,Cdk6/Cyclin DG1S

MG2

Cdk2/Cyclin E

Growth factors Mitogens

ΗΗ ολοκλήρωσηολοκλήρωση τηςτης G1G1 καικαι ηη έναρξηέναρξη τηςτηςSS ρυθμίζεταιρυθμίζεται απόαπό τιςτις CdksCdks

Το μονοπάτι CDK-Rb-E2F

No Cdkactivity

G1 S

+

+

active Rb

inactive E2F

Cdk2/ CycEactive

Cdk4, 6/ CycD p27

G1/S restriction

point

ΕνεργότηταΕνεργότητα τωντων CDKsCDKs κατάκατά τηντην G1G1καικαι αρχήαρχή τηςτης SS

P

Ubiquitination by SCF & degradation

by proteasomeGrowth factors

Mitogens

Active Cdk4,6/ Cyclin D

Cdk2/ Cyclin E

G1/S restriction point

Gene expression Cdk2, CycE

Cdk2/ CycEactive

active E2F

inactive RbP PPP

No Cdk activity

ΡύθμισηΡύθμιση τωντων CDKsCDKs κατάκατά τηντην G1G1-- αρχήαρχή τηςτης SS

• Στην αρχή της G1 η συνολική ενεργότητα Cdk είναι χαμηλή

• Η Rb προσδένει και απενεργοποιεί το μεταγραφικό παράγονταE2F

• Μιτογόνες ουσίες ενεργοποιούν τις Cdk4,6/ Cyclin D καιCdk2/ Cyclin Ε

• Φωσφορυλίωση του Rb οδηγεί σε ενεργοποίηση του E2F καιμεταγραφή γονιδίων που εμπλέκονται σε περεταίρω ενεργοποίησηCDK συμπλόκων και έναρξη της αντιγραφής του DNA

G1S

MG2

Cdk1/Cyclin Β

Anaphase onset

ΈναρξηΈναρξη τηςτης μιτωτικήςμιτωτικής διαίρεσηςδιαίρεσης

Ενεργοποίηση τουσυμπλόκου Cdk1/ Cyclin B

ΕνεργότηταΕνεργότητα τηςτης Cdk1/ Cdk1/ CyclinCyclin B B είναιείναιαναγκαίααναγκαία γιαγια τηντην έναρξηέναρξη τηςτης μιτωτικήςμιτωτικής

διαίρεσηςδιαίρεσης

Cdk1/ Cyclin B

∆ιάλυσηπυρηνικούφακέλου

Σχηματισμόςμιτωτικήςατρακτου

∆ιάταξηχρωμοσωμάτων

ΕνεργοποίησηΕνεργοποίηση τηςτης Cdk1/ Cdk1/ CyclinCyclin B B καικαιέναρξηέναρξη τηςτης μιτωτικήςμιτωτικής διαίρεσηςδιαίρεσης

G2 M

Cdk1

Cyclin B

+

Cdk-inhibitory kinase

Wee1

PP

activating phosphorylation

inhibitory phosphorylation

P

Cdc25 Cdk-activating phosphatase

Cdk1/ Cyclin B

Mitotic entry

active Cdk1

• Για να μπούμε στη φάση της μιτωτικής διαίρεσης απαιτείταιενεργοποίηση του συμπλόκου Cdk1/CyclinΒ

• Η φωσφατάση Cdc25 αποφωσφορυλιώνει τις Υ14 και Τ15 της Cdk1 και την ενεργοποιεί

• Η ενεργή Cdk1/ CyclinB ενισχύει την ενεργότητα της Cdc25

• Η ενεργή Cdk1/ CyclinB φωσφορυλιώνει και απενεργοποιείτην κινάση Wee1

΄Εναρξη΄Εναρξη τηςτης μιτωτικήςμιτωτικήςδιαίρεσηςδιαίρεσης

ΠώςΠώς μπορούμεμπορούμε νανα διακρίνουμεδιακρίνουμε σεσεποιαποια φάσηφάση τουτου κυτταρικούκυτταρικού κύκλουκύκλου

βρίσκεταιβρίσκεται τοτο κύτταροκύτταρο;;

• Ανοσοφθορισμός (immunofluorescence)

• Κυτταρομετρία ροής (flow cytometry)

∆ιάκριση∆ιάκριση τωντων φάσεωνφάσεων τουτουκυτταρικούκυτταρικού κύκλουκύκλου

• Μονιμοποίηση των κυττάρων και χρώση με ουσίες οι οποίες φθορίζουν μετάτην πρόσδεσή τους στο DNA (DAPI, Propidium Iodide)

• Ανίχνευση επιτόπων ειδικών για τη συγκεκριμένη φάση του κυτταρικούκύκλου (markers), με χρήση αντισωμάτων συνδεδεμένων σε φθορίζων μόριο

• Μικροσκοπία φθορισμού

S-phase G1-phase

ΜελέτηΜελέτη τωντων φάσεωνφάσεων τουτου κυτταρικούκυτταρικούκύκλουκύκλου μεμε ανοσοφθορισμόανοσοφθορισμό

Φθορίζων μόριο

Ab

S-ειδικήπρωτεΐνηξέπλυμα

Φθορισμός

ΑνίχνευσηΑνίχνευση κυττάρωνκυττάρων στηστη φάσηφάσηδιπλασιασμούδιπλασιασμού τουτου DNADNA

Παράδειγμα S- phase marker: PCNA

phase contrastPCNA

ΑνίχνευσηΑνίχνευση κυττάρωνκυττάρων στηστη φάσηφάση τηςτηςμιτωτικήςμιτωτικής διαίρεσηςδιαίρεσης

Παράδειγμα Μ- phase marker: φωσφορυλιωμένη Ιστόνη Η3 στηΣερίνη 10 (pH3)

pH3 PI pH3 PI

ΜελέτηΜελέτη τωντων φάσεωνφάσεων τουτου κυτταρικούκυτταρικού κύκλουκύκλου μεμεκυτταρομετρίακυτταρομετρία ροήςροής (flow (flow cytometrycytometry))

• Μέθοδος ανάλυσης πληθυσμού κυττάρων η οποία δείχνει το ποσοστόκυττάρων που έχουν συγκεκριμένη ποσότητα DNA

• Μονιμοποίηση κυττάρων

• Χρώση με Propidium Iodide (PI). Η χρωστική PI φθορίζει (στο κόκκινο) όταν προσδεθεί στο DNA και η ένταση του φθορισμού είναι ανάλογη τηςποσότητας του DNA κάθε κυττάρου

• Η ποσότητα του DNA (2N, 4N ή ενδιάμεση) είναι χαρακτηριστική τηςφάσης του κυτταρικού κύκλου (G1, G2 ή S)

• Ανάλυση φθορισμού των κυττάρων με κυτταρομετρία ροής μας δείχνει τοποσοστό αυτών στις διάφορες φάσεις του κυτταρικού κύκλου

flow

FACS: fluorescence-activated cell sorter

Analysehistogram

ΚυτταρομετρίαΚυτταρομετρία ροήςροής-- PI profilesPI profiles

Even

ts (n

umbe

r of c

ells

)

Flow cytometer

DNA (PI fluorescence)

G1 G2+M

SSub-G1 (dead) polyploid

2N 4N

4.4polyploid21.3G2+M32.4S40.1G11.8Sub-G1

Percentage (%)Fraction

PI

Μικροσκόπιο φθορισμού

Κυτταρική σειρά 1 Κυτταρική σειρά 2

∆είχνονται καλλιέργειες δύο κυτταρικών σειρών σε τυπικόθρεπτικό μέσο

Ποιες διαφορές εντοπίζετε στα PI profiles των δύο σειρών? ∆ώστε πιθανή εξήγηση

PI profiles: Quiz 1 PI profiles: Quiz 1

PI profiles: Quiz 2 PI profiles: Quiz 2

A B C D

1. Τυπική καλλιέργεια κυττάρων σε θρεπτικό μέσο

2. παρουσία αναστολέα της μιτωτικής διαίρεσης (nocodazole)για 12 hrs

3. Καλλιέργεια κυττάρων παρουσία αναστολέα της αντιγραφήςτου DNA (hydroxyurea) για 12 hrs

4. Καλλιέργεια κυττάρων σε θρεπτικό μέσο χωρίς ορό (FBS)για 24 hrs

Κάντε τις αντιστοιχίες

Molecular Biology of The Cell,

Alberts et al, 4th Ed,

Chapter 17