БИОХИМИЯ - usmf · 2019-03-04 · Кинетика ферментативных ......

Государственный Университет Медицины и Фармации

им. Николая Тестемицану

Кафедра биохимии и клинической биохимии

БИОХИМИЯ

Руководство к практическим занятиям

для студентов первого курса

факультета Стоматологии

Студент ________________________

Группа ________________________

Преподаватель ____________________

Кишинев

2019

2 Cate

dra

de b

ioch

imie

și b

ioch

imie

clin

ică

© Tagadiuc Olga ș. a., 2019

ВЕСЕННИЙ СЕМЕСТР

Глава I

Ферменты

Методическое указание №1 Дата _________________

Тема: Роль биохимии в системе подготовки врача.

Химическая природа и структура ферментов.

Коферментная функция витаминов

Опыт 1. Идентификация витаминов B1, B2, B6 и P

Идентификация витамина B1

Принцип метода: В щелочной среде тиамин с диазореактивом образует комплексное

соединение оранжевого цвета.

Ход работы: К готовому диазореактиву (5 капель 1% раствора сульфаниловой кислоты и 5

капель 5% раствора нитрита натрия) добавляют 1-2 капли исследуемого раствора и по стенке,

наклонив пробирку, осторожно добавляют 5 капель 10% бикарбоната натрия. На границе

двух жидкостей появляется кольцо оранжевого цвета.

Результат:_______________________________________________________________________

Вывод:__________________________________________________________________________

_________________________________________________________________________

Идентификация витамина B2 Принцип метода: Окисленная форма витамина В2 желтого цвета при восстановлении

приобретает розовый цвет за счет образования промежуточных соединений, а затем

обесцвечивается.

Ход работы: В пробирку наливают 10 капель исследуемого раствора, добавляют 5 капель

концентрированной НСl и опускают зернышко цинка. Появляются пузырьки водорода и

изменяется окраска.

Результат:_______________________________________________________________________

Вывод:__________________________________________________________________________

_________________________________________________________________________

Идентификация витамина PP

Принцип метода: Витамин РР при нагревании с раствором ацетата меди дает синий

осадок медной соли никотиновой кислоты, плохо растворимый.

Ход работы: В пробирку наливают 10 исследуемого раствора и нагревают. Раствор

становится прозрачным. Добавляют 10 капель ацетата меди и нагревают содержимое

пробирки до кипения. После охлаждения пробирки под струей холодной воды, выпадает

синий осадок.

Результат:_______________________________________________________________________

Вывод:__________________________________________________________________________

_________________________________________________________________________

Идентификация витамина B6

Принцип метода: При взаимодействии витамина В6 с раствором хлорного железа

образуется комплекс красного цвета.

Ход работы: К 5 каплям исследуемого раствора приливают равное количество 1%

раствора хлорного железа и перемешивают. Образуется красное окрашивание.

Результат:_______________________________________________________________________

Вывод:__________________________________________________________________________

_________________________________________________________________________

3

Исходный уровень знаний

1. Белки – функции, структура и свойства. Классификация белков.

2. Структура витаминов В1, В2, В6, РР, C, биотина, пантотеновой кислоты и фолиевой

кислоты. Суточная потребность и источники. Гиповитаминозы.

Вопросы для обсуждения на семинаре

1. Предмет биохимии. Pоль биохимии в медицинской практике. Биохимические методы

исследования.

2. Понятие о ферментах. Биологическая роль ферментов. Сходства и различия с

небиологическими катализаторами.

3. Химическая природа ферментов. Доказательства белковой природы ферментов.

4. Структура ферментов. Активный и аллостерический центры ферментов. Простые и

сложные ферменты. Понятие о холоферменте, апоферменте, кофакторе, коферменте,

косубстрате и простетической группе.

5. Коферментная функция витаминов и микроэлементов. Структура коферментов витаминов

В1, В2, В6, РР, биотина, пантотеновой кислоты и фолиевой кислоты. Их метаболическая

роль.

Задачи для самостоятельной работы

1. Заполните таблицу:

Витамин Название Коферменты Метаболическая роль

Гиповитаминоз.

Основные

клинические

проявления

Пример:

B1

Тиамин Тиамин-

пирофосфат

(TPP)

1.Реакциии окислитель-

ного декарбоксилирования

α-кетокислот).

2.Транскетолазные

реакции.

Бери-бери.

Депресия,

периферическая

нейропатия,

атаксия.

B2

B6

PP

C

4 Cate

dra

de b

ioch

imie

și b

ioch

imie

clin

ică


H

B5

B9

2. Напишите по одной реакции, в которых участвуют коферменты витаминов B1, B2, B6, PP,

C, Н, фолиевой и пантотеновой кислот. Определите класс фермента и назовите фермент.

5

3. Объясните если возможно отделить активный центр от фермента, сохраняя его структуру и

функцию?

______________________________________________________________________________

______________________________________________________________________________

______________________________________________________________________________

______________________________________________________________________________

______________________________________________________________________________

______________________________________________________________________________

______________________________________________________________________________

______________________________________________________________________________

______________________________________________________________________________

Тесты для оценки знаний

1. Выберите правильные утверждения относительно сложных ферментов:

а) специфичность фермента зависит от кофермента

б) специфичность фермента зависит от апофермента

в) кофермент является термолабильным компонентом

г) апофермент является термолабильным компонентом

д) кофермент является белковым компонентом фермента

2. Относительно коферментов правильными являются утверждения:

а) кофермент связан в аллостерическом центре фермента

б) коферментами могут быть нуклеотиды

в) простетическая группа легко отделяется от апофермента

г) кофермент не участвует в катализе

д) кофермент является небелковой частью фермента

3. Выберите функции кофакторов:

а) стабилизируют активную конформацию ферментов

б) непосредственно участвуют в катализе

в) определяют специфичность действия

г) необратимо связываются с субстратом

д) ингибируют фермент

4. Выберите верные утверждения относительно активного центра фермента:

а) содержит кофермент (у сложных ферментов)

б) состоит из радикалов аминокислот

в) является местом связывания аллостерических модуляторов

г) образуется на основе вторичной структуры

д) образуется на основе третичной и четвертичной структур

5. Субстрат:

а) это вещество, на которое действует фермент

б) это вещество, которое регулирует активность фермента

в) связывается в аллостерическом центре фермента

г) является составной частью фермента

д) является ингибитором фермента

6 Cate

dra

de b

ioch

imie

și b

ioch

imie

clin

ică


6. Аллостерический центр:

а) пространственно отделен от активного центра

б) является местом связывания кофермента

в) присутствует во всех ферментах

г) является регуляторным центром

д) является местом связывания активаторов и ингибиторов

7. Относительно коферментов ФМН и ФАД верными являются утверждения:

а) катализируют окислительно-восстановительные реакции

б) катализируют реакции изомеризации

в) присоединяют только электроны

г) присоединяют 2 протона и 2 электрона

д) присоединяют 1 протон и 2 электрона

8. Кофермент НАД+:

а) участвует в переносе гидрид-иона

б) ковалентно связан с апоферментом

в) нековалентно, слабо связан с апоферментом

г) является коферментом трансфераз

д) является коферментом дегидрогеназ

9. Кофермент НАДФН:

а) участвует в реакциях гидролиза

б) участвует в реакциях переноса фосфатного остатка

в) является кофактором изомераз

г) является кофактором редуктаз

д) содержит тиамин

10. Выберите химические реакции, в которых участвуют следующие коферменты –

проведите стрелки:

а) ФАД декарбоксилирование пирувата

б) НАД+

декарбоксилирование гистидтна

в) ТГФК трансаминиование аланина

г) ТПФ дегидрирование лактата

д) пиридоксальфосфат активация жирных кислот

е) НS-СоА дегидрирование сукцината

ё) биотин синтез глицина из серина

карбоксилирование пирувата


Тема: Классификация и номенклатура ферментов.

Meханизм действия ферментов. Кинетика ферментативных реакций

Опыт 1. Термолабильность ферментов

Принцип метода: Ферменты, являясь белками, при температуре выше 45-50oC

подвергаются денатурации и теряют свою активность.

Каталаза расщепляет H2O2 согласно химической реакции: 2H2O2 → 2H2O + O2.

7

Ход работы:

Реактивы Пробирки

Опыт Контроль

1 Дистиллированная H2O 1 мл 1 мл

2 Каталаза (кровь) 2 капли 2 капли

3 Инкубация 5 мин 37oC 100

oC

4 3% H2O2 5-10 капель 5-10 капель

6 Осторожно взбалтывают

7 Выделение газа

Вывод:__________________________________________________________________________

_________________________________________________________________________


1. Номенклатура и классификация ферментов. Характеристика классов и основных

подклассов ферментов. Идентификационный номер (шифр) ферментов.

2. Специфичность ферментов (типы, примеры).

3. Механизм действия ферментов. Активный центр фермента и его роль в образовании и

превращении энзим-субстратного комплекса. Роль конформационных изменений

молекулы фермента и субстрата при катализе.

4. Кинетика ферментативных реакций. Уравнение Михаэлиса-Ментен и константа

Михаэлиса. Зависимость скорости ферментативных реакций от концентрации субстрата и

фермента, от температуры и рН среды.

5. Принципы определения активности ферментов. Единицы измерения активности ферментов

(международная единица, удельная активность).


1. Определите класс и подкласс следующих ферментов (заполните таблицу):

Фермент Класс Подкласс

Пепсин

Амилаза

Липаза

2. В случае отравления этиленгликолем (антифризом) и метанолом в качестве антидота

назначают этиловый спирт. Напишите реакции окисления этанола, метанола и

этиленгликоля под действием алкоголь дегидрогеназы.

8 Cate

dra

de b

ioch

imie

și b

ioch

imie

clin

ică


Как объясняется токсичность этиленгликоля и метанола и c какой целью назначают

этанол?

______________________________________________________________________________

______________________________________________________________________________

______________________________________________________________________________

______________________________________________________________________________

3. Первой реакцией при использовании глюкозы тканями является ее фосфорилирование под

действием ферментов глюкокиназа (в печени) и гексокиназа (в остальных тканях). Кмглюкокиназы для глюкозы ≈ 5 мМ, а гексокиназы ≈ 0,05 мМ. После приема пищи,

концентрация глюкозы в воротной вене ≈ 5 мМ/л.

Выберите вариант ответа, характеризующий активность ферментов при данной

концентрации глюкозы:

Гексокиназа Глюкокиназа

А. Неактивна Неактивна

Б. v = ½Vmax Неактивна

В. v = Vmax Неактивна

Г. v = Vmax v = ½Vmax

Д. v = Vmax v = Vmax


1. Относительно механизма действия ферментов верными являются утверждения:

а) ферменты снижают энергию активации катализируемых реакций

б) в процессе катализа образуется фермент-субстратный комплекс [ES]

в) комплекс ES является стабильной, жесткой структурой

г) комплекс ES не подвергается преобразованию

д) образование комплекса ES является последним этапом в действии фермента

2. Выберите верные утверждения относительно механизма действия ферментов:

а) образование фермент-субстратного комплекса (ES) является необходимым условием

для катализа

б) при взаимодействии с ферментом, субстрат не подвергается превращениям

в) в составе комплекса ES, субстрат подвергается превращениям

г) в активном центре ферментов может происходить ковалентный катализ

д) в активном центре ферментов может происходить кислотно-щелочной катализ

3. Выберите правильное утверждение относительно специфичности ферментов:

а) все ферменты обладают абсолютной специфичностью

б) ферменты не обладают специфичностью

в) все ферменты обладают относительной специфичностью

г) специфичность зависит от кофермента

д) специфичность зависит от белковой части фермента

4. Выберите ферменты, относящиеся к классу лигаз:

а) аргининосукцинатлиаза

б) цитратсинтаза

в) пируваткарбоксилаза

г) глутаминсинтетаза

д) глюкокиназа

9

5. Выберите ферменты, относящиеся к классу оксидоредуктаз:

а) фенилаланингидроксилаза

б) фумараза

в) ксантиноксидаза

г) глутатионредуктаза

д) сукцинатдегидрогеназа

6. Относительно термолабильности ферментов верными являются утверждения:

а) все ферменты обладают одинаковой оптимальной температурой действия

б) термолабильность зависит от апофермента

в) оптимальная температура для большинства ферментов 20-40 0С

г) при температуре выше 500C активность фермента увеличивается

д) при температуре ниже 100C активность фермента не изменяется

7. Влияние рН на активность ферментов (выберите правильное утверждение):

а) каждый фермент обладает оптимальным рН действия

б) оптимальный pH для пепсина 7.0-8.0

в) рН не влияет на каталитическую активность фермента

г) оптимальный pH для трипсина 1.0-2.0

д) оптимальный pH для аргиназы 7.0


Тема: Регуляция активности ферментов.

Биомедицинское значение ферментов

Опыт 1. Определение активности α-амилазы мочи со стойким крахмальным

субстратом (метод Каравея)

Принцип метода: α-амилаза расщепляет крахмал с образованием конечных продуктов,

которые не окрашиваются раствором йода. Активность амилазы оценивают по уменьшению

количества крахмала.

Ход работы: Опыт проводится в 10 мл-х калиброванных пробирках!

Nr. Реагент Опытная пробирка Контрольная пробирка

1. Раствор крахмала 1 мл

(содержит 0,0004 г крахмала)

1 мл

(содержит 0,0004 г крахмала)

2. Инкубация 5 минут на водяной бане при

температуре 370C

-

3. Моча 0,02 мл -

4. Пробирки взбалтывают и инкубируют на водяной бане при температуре 370C на 7,5

минут (время считают с момента добавления мочи)

5. Раствор йода 1 мл 1 мл

6. Моча - 0,02 мл

7. Дистилл. H2O до метки 10 мл до метки 10 мл

8. Определяют оптическую плотность опытной (Eо) и контрольной проб (Eк) по

отношению к дистиллированной воде на фотоколориметре (красный светофильтр,

=630-690 нм) в кюветах на 10 мм.

10 Cate

dra

de b

ioch

imie

și b

ioch

imie

clin

ică


Расчет: Активность амилазы выражают в граммах крахмала, расщепляемого ферментом за 1

час в одном литре мочи при температуре 37°C и рассчитывают по формуле:

Активность амилазы = [(Eк–Eо) / Eк] х 160 г / ч • л,

Eк – оптическая плотность контрольной пробы;

Eо – оптическая плотность опытной пробы;

0,0004 – количество крахмала в пробе (г);

8 – коэффициент перерасчета на 1 час инкубации (60 мин : 7,5 мин = 8);

50000 – коэффициент перерасчета на 1 литр мочи (1000 мл : 0,02 мл = 50000).

Нормальная активность амилазы в моче – 20-160 г / ч • л.

Клинико-диагностическое значение: Активность амилазы в моче увеличивается при

острых панкреатитах, панкреонекрозе, паротитах.

Результат: ______________________________________________________________________

Вывод: ________________________________________________________________________

________________________________________________________________________


1. Активация и ингибирование ферментов:

а) Активация ферментов частичным протеолизом. Зимогены (проферменты).

б) Ингибирование ферментов (специфическое и неспецифическое, обратимое и

необратимое, конкурентное и неконкурентное).

2. Регуляция активности ферментов (аллостерическая регуляция, ковалентная регуляция).

Значение принципа обратной связи.

3. Изоферменты – структурные и функциональные особенности, диагностическое значение

их определения.

4. Организация ферментов в клетке (полиферментные комплексы, компартментализация

ферментов).

5. Различия ферментного состава органов и тканей. Органоспецифические ферменты.

Изменение активности ферментов при разных заболеваниях (энзимодиагностика).

6. Использование ферментов в медицинской практике:

а) Энзимодиагностика.

б) Энзимотерапия.

в) Использование ферментов в лабораторной практике.

7. Методы выделения и очистки ферментов. Аффинная хроматография.

8. Ферменты слюны.


1. Объясните, почему протеолитические ферменты желудка и поджелудочной железы

синтезируются в виде неактивных зимогенов (проферментов)? Объясните механизм их

активации. Приведите примеры.

______________________________________________________________________________

______________________________________________________________________________

______________________________________________________________________________

______________________________________________________________________________

______________________________________________________________________________

11

2. Ферменты, имеющие различные структурные и физико-химические свойства, но

катализирующие одну и ту же реакцию, являющиеся олигомерными белками, состоящими

из разных мономеров являются: аллостерическими ферментами, изоферментами или

проферментами? Примеры таких ферментов и клинико-диагностическое значение

определения их активности в биологических жидкостях.

______________________________________________________________________________

______________________________________________________________________________

______________________________________________________________________________

______________________________________________________________________________

______________________________________________________________________________

______________________________________________________________________________

______________________________________________________________________________

3. Назовите механизм действия сульфаниламидов. От чего зависит эффективность лечения

сульфаниламидными препаратами?

______________________________________________________________________________

______________________________________________________________________________

______________________________________________________________________________

______________________________________________________________________________

______________________________________________________________________________

______________________________________________________________________________

______________________________________________________________________________

4. Клинико-диагностическое значение определения активности лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в

сыворотке крови. Назовите изоферменты ЛДГ. Активность каких изоформ ЛДГ

увеличивается в крови при заболеваниях печени и сердца?

______________________________________________________________________________

______________________________________________________________________________

______________________________________________________________________________

______________________________________________________________________________

______________________________________________________________________________

______________________________________________________________________________

______________________________________________________________________________

Напишите химическую реакцию, катализируемую ЛДГ:

5. Клинико-диагностическое значение определения активности амилазы в сыворотке и моче.

Какую реакцию катализирует амилаза? Где синтезируется и где действует амилаза?

______________________________________________________________________________

______________________________________________________________________________

______________________________________________________________________________

______________________________________________________________________________

______________________________________________________________________________

______________________________________________________________________________

12 Cate

dra

de b

ioch

imie

și b

ioch

imie

clin

ică


6. Клинико-диагностическое значение определения активности креатинфосфокиназы (СРК) в

сыворотке. Назовите изоформы СРК. Активность каких изоформ фермента увеличивается

при патологии сердца, мышц и мозга?

______________________________________________________________________________

______________________________________________________________________________

______________________________________________________________________________

______________________________________________________________________________

______________________________________________________________________________

______________________________________________________________________________


1. Относительно конкурентного ингибирования верными являются утверждение:

а) является обратимым ингибированием

б) является неспецифическим ингибированием

в) устраняется снижением концентрации субстрата

г) возможно одновременное присоединение субстрата и ингибитора

д) ингибитор связывается в аллостерическом центре

2. Относительно неконкурентного ингибирования верным является утверждение:

а) ингибитор связывается к субстрату

б) ингибитор является структурным аналогом субстрата

в) ингибирование устраняется избытком субстрата

г) образуется тройной комплекс: ESI

д) образуется двойной комплекс: EI

3. Аллостерическая регуляция:

а) характерна для некоторых олигомерных ферментов

б) заключается в связывании модулятора в активном центре

в) характерна для всех ферментов

г) характерна для всех ферментов с третичной структурой

д) заключается в необратимом связывании модулятора с ферментом

4. Выберите механизмы активации ферментов:

а) ненонкурентная активация

б) ковалентная модификация (фосфорилирование-дефосфорилирование)

в) самосборка вторичной структуры

г) аллостерическая активация

д) конкурентная активация

5. Относительно сукцинатдегидрогеназы (СДГ) и регуляции её активности верными

являются утверждения:

а) СДГ относится к классу трансфераз

б) малоновая кислота вызывает конкурентное ингибирование СДГ

в) при ингибировании меняется первичная структура фермента

г) ингибирование СДГ не зависит от концентрации малоновой кислоты

д) ингибирование СДГ можно снять увеличением концентрации сукцината

13

6. Выберите верное утверждение относительно пепсина и регуляции его активности:

а) пепсин относится к классу лигаз

б) пепсин относится к классу лиаз

в) пепсин образуется частичным протеолизом из пепсиногена

г) частичный протеолиз является обратимым процессом

д) активация фермента происходит под действием трипсина


Итоговая работа по разделу «Ферменты»

Вопросы для подготовки1. Понятие о ферментах. Биологическая роль ферментов. Сходства и различия с

небиологическими катализаторами.

2. Химическая природа ферментов. Доказательства белковой природы ферментов. Структура

ферментов. Активный и аллостерический центры ферментов.

3. Простые и сложные ферменты. Понятие о холоферментах, апоферменте, кофакторе,

коферменте, косубстрате и простетической группе. Витамины и микроэлементы в качестве

кофакторов.

4. Структура витаминов В1, В2, В6, РР, С, биотина, пантотеновой кислоты и фолиевой кислоты.

Коферменты этих витаминов и их метаболическая роль.

5. Номенклатура и классификация ферментов. Характеристика классов и основных подклассов

ферментов. Идентификационный номер (шифр) ферментов.

6. Специфичность ферментов (типы, примеры).

7. Механизм действия ферментов. Активный центр фермента и его роль в образовании и

превращении энзим-субстратного комплекса. Роль конформационных изменений молекулы

фермента и субстрата при катализе.

8. Кинетика ферментативных реакций. Уравнение Михаэлиса-Ментен и константа Михаэлиса.

Зависимость скорости ферментативных реакций от концентрации субстрата и фермента, от

температуры и рН среды.

9. Принципы определения активности ферментов. Единицы измерения активности ферментов

(международная единица, удельная активность).

10. Активация и ингибирование ферментов:

а) Активация ферментов частичным протеолизом. Зимогены (проферменты).

б) Ингибирование ферментов (специфическое и неспецифическое, обратимое и

необратимое, конкурентное и неконкурентное).

11. Регуляция активности ферментов (аллостерическая регуляция, ковалентная регуляция).

Значение принципа обратной связи.

12. Изоферменты – структурные и функциональные особенности, диагностическое значение их

определения.

13. Организация ферментов в клетке (полиферментные комплексы, компартментализация

ферментов).

14. Различия ферментного состава органов и тканей. Органоспецифические ферменты.

Изменение активности ферментов при разных заболеваниях (энзимодиагностика).

15. Использование ферментов в медицинской практике:

а) Энзимодиагностика.

б) Энзимотерапия.

в) Использование ферментов в лабораторной практике.

16. Методы выделения и очистки ферментов. Аффинная хроматография.

17. Ферменты слюны.

14 Cate

dra

de b

ioch

imie

și b

ioch

imie

clin

ică


Глава II

Биоэнергетика

Методическое указание № 5

Тема: Введение в метаболизм. Биоэнергетика.

Макроэргические соединения

Опыт 2. Количественное определение каталазы

Принцип метода: В основе качественного определения каталазы лежит определение

количества перекиси водорода, разложенной ферментом за определенный промежуток

времени, по следующему уравнению:

2KMnO4 + 5H2O2 + 3H2SO4 → 2MnSO4 + K2SO4 + 8H2O + 5O2

О количестве расщепленной перекиси водорода судят по разности количества

перманганата калия, израсходованного на титрование перекиси водорода до и после действия

каталазы.

Активность каталазы выражают с помощью каталазного числа и показателя каталазы.

Каталазное число это количество перекиси водорода (в мг), разложенной 1мкл крови.

Показатель каталазы это отношение каталазного числа к числу эритроцитов (в миллионах)

в одном мкл крови.


Реагенты, мл Контрольная

проба

Опытная

проба

Кровь (1:1000) 1 1

Дистиллированная вода 7 7

H2O2 1% - 2

H2SO4 10% 5 -

Оставляют на 30 мин при комнатной температуре

H2O2 1% 2 -

H2SO4 10% - 5

Титруют KMnO4 до появления розовой окраски A= ____ (мл) B=____ (мл)

Расчет: Каталазное число определяют по формуле: X = (A – B) · 1,7,

где: А – количество KMnO4 израсходованное на титрование контрольной пробы (мл),

В – количество KMnO4 израсходованное на титрование опытной пробы (мл),

1,7 – количество мг H2O2, которое содержится в 1 мл 0,1N раствора H2O2Нормальные значения каталазного числа – 10-15. Клинико-диагностическое значение. Определение активности каталазы имеет значение для

диагностики рака, анемии, туберкулеза, при которых происходит снижение активности

каталазы в крови. Акаталазия это наследственная недостаточность каталазы в крови и в

других тканях, которая клинически проявляется изъязвлением десен. Высокая активность

каталазы определяется при пернициозной и макроцитарной анемиях, при употреблении

алкоголя и кофе.

Результат: __________________________________________________________________

___________________________________________________________________

Вывод: _____________________________________________________________________

_____________________________________________________________________

15


1. Химическая структура и функции нуклеотидов.


1. Ведение в метаболизм. Катаболизм и анаболизм. Метаболические пути (общие и

специфические, линейные и циклические). Амфиболический этап метаболизма, его

значение.

2. Законы термодинамики. Понятие об энтальпии, энтропии и свободной энергии.

Стандартная свободная энергия. Эндергонические и экзергонические реакции.

3. Окислительно-восстановительный потенциал. Связь между свободной энергией и

окислительно-восстановительным потенциалом.

4. Макроэргические вещества, их роль, основные представители, особенности их структуры.

5. Структура и роль АТФ. Цикл АТФ. Варианты гидролиза АТФ. Механизмы биосинтеза

АТФ.

6. Регуляция метаболизма в зависимости от энергетического статуса клетки. Показатели

энергетического состояния клетки.


1. Напишите структуру АТФ и укажите макроэргические связи.

Почему гидролиз АТФ сопровождается выделением большого количества свободной

энергии?

_____________________________________________________________________________

_____________________________________________________________________________

_____________________________________________________________________________

_____________________________________________________________________________

_____________________________________________________________________________

2. Сколько энергии выделяется при расщеплении одного моля АТФ в стандартных

условиях? Какова «продолжительность жизни» молекулы АТФ в клетках высших

организмов?

_____________________________________________________________________________

_____________________________________________________________________________

_____________________________________________________________________________

_____________________________________________________________________________

_____________________________________________________________________________

_____________________________________________________________________________

_____________________________________________________________________________

16 Cate

dra

de b

ioch

imie

și b

ioch

imie

clin

ică


3. За сутки в нашем организме образуется большое количество АТФ, но при этом

структура, состав и вес существенно не меняются. Как объяснить этот факт?

_____________________________________________________________________________

_____________________________________________________________________________

_____________________________________________________________________________

_____________________________________________________________________________

_____________________________________________________________________________

4. Напишите уравнения реакций гидролиза АТФ до а) АДФ и б) АМФ.

Возможен ли синтез АТФ из АМФ? Если возможен, напишите уравнение реакции и

назовите фермент.

Чем важна эта реакция?

_____________________________________________________________________________

_____________________________________________________________________________

_____________________________________________________________________________

_____________________________________________________________________________

_____________________________________________________________________________

5. Назовите процессы, которые протекают с потреблением свободной энергии.

_____________________________________________________________________________

_____________________________________________________________________________

_____________________________________________________________________________

_____________________________________________________________________________

_____________________________________________________________________________


1. Выберите общие метаболические пути:

а) гликолиз

б) β-окисление жирных кислот

в) синтез серотонина

г) дыхательная цепь

д) синтез кальцитриола

2. Выберите специфические метаболические пути:

а) глюконеогенез

б) синтез тироксина

в) синтез мелатонина

г) синтез жирных кислот

д) цикл Кребса

17

3. Относительно регуляции метаболизма верными являются утверждения:

а) катаболические и анаболические пути имеют общие реакции

б) скорость метаболических процессов регулируется ферментами, которые катализируют

общие реакции анаболизма и катаболизма

в) метаболические процессы регулируются на уровне обратимых реакций

г) как правило, ингибиторы катаболических процессов являются активаторами

анаболических процессов

д) гормоны не участвуют в регуляции метаболических процессов

4. Выберите правильное утверждение относительно биоэнергетики:

а) живые организмы являются закрытыми термодинамическими системами

б) свободная энергия (∆G) – это энергия, которая не может использоваться для выполнения

работы

в) энтропия (∆S) – это степень неупорядоченности термодинамической системы

г) связанная энергия (T∆S) – это энергия, которая может использоваться для выполнения

работы

д) если ∆G > 0, химическая реакция является экзергонической

5. Какие факторы способствуют гидролизу АТФ?

а) электростатическое отталкивание

б) низкая степень стабильности АТФ

в) присутствие ионов Mg2+

г) присутствие воды

д) расщепление гликозидных связей АТФ

6. Какие утверждения верны относительно регуляции метаболических процессов?

а) высокое соотношение НАДФН/НАДФ+

ускоряет анаболические процессы

б) аллостерические модуляторы не влияют на направление и скорость метаболизма

в) высокое соотношение АТФ/АДФ ускоряет анаболические процессы

г) гормоны не принимают участие в регуляции метаболических путей

д) низкое соотношение НАДН/НАД+

ускоряет катаболические процессы

7. Выберите вещества, при гидролизе которых выделяется больше энергии по

сравнению с гидролизом АТФ

а) ГТФ

б) 1,3-бифосфоглицерат

в) карбамоил-фосфат

г) фосфоенолпируват

д) креатин

8. Выберите вещества, которые используются для субстратного фосфорилирования:

а) сукцинил-СоА

б) глюкозо-6-фосфат

в) 1,3-бифосфоглицерат

г) фосфоенолпируват

д) креатин-фосфат

18 Cate

dra

de b

ioch

imie

și b

ioch

imie

clin

ică



Тема: Окислительное декарбоксилирование пировиноградной кислоты.

Цикл Кребса

Опыт 1. Определение пирувата в моче

Принцип метода: Пируват, взаимодействуя с 2,4-динитрофенилгидразином (2,4-DNPH) в

щелочной среде, образует 2,4-динитрофенилгидразоны пировиноградной кислоты желто-

оранжевого цвета. Интенсивность окраски прямо пропорциональна концентрации пирувата в

моче и определяется на ФЕК-е.


Реагенты Пробирка:

Опыт (1) Контроль (2)

Моча 1 mL -

H2O дист. - 1mL

KOH 2,5% (спиртовой р-р) 1 mL 1 mL

Интенсивно взбалтывают в течение 1 мин.

0,1% р-р. 2,4-DNPH 0,5 mL 0,5 mL

Взбалтывают и оставляют при комнатной температуре 15 минут.

Определяют экстинкцию опытной пробы против контрольной пробы

(кюветы – 5 mm, синий светофильтр – 450-465 nm).

Концентрацию пирувата в моче (С) определяют по калибровочной кривой.

Количество пирувата, выделяемое с мочой за сутки, определяют по

формуле:

X (µM за сутки)= С · 1500,

где: С – концентрация пирувата в моче (определяется по калибровочной

кривой, µM/mL), 1500 – суточный диурез (mL).

Нормальные значения: 10-25mg или 114-284 μM за сутки.

Диагностическое значение: Содержание пирувата в крови и в моче увеличивается при

недостатке тиамина, сахарном диабете, при гиперфункции гипофизарно-адреналовой

системы. при приеме некоторых лекарств (адреналин, стрихнин, камфора).

Результат: E:______________ C: ______________ μM/ mL

Х (количество пирувата, выделяемое с мочой за сутки) = _____________ μM за сутки

Вывод: _____________________________________________________________________

______________________________________________________________________


1. Химическая структура витаминов В1, В2, РР, пантотеновой кислоты и их коферментов.

2. Механизмы регуляции активности ферментов: аллостерическая и ковалентная регуляция.

Вопросы для обсуждения на семинаре1. Окислительное декарбоксилирование пировиноградной кислоты: полиферментный

комплекс, коферменты, суммарная реакция, этапы, регуляция, связь с циклом Кребса и

дыхательной цепью. Биомедицинское значение.

19

2. Цикл трикарбоновых кислот (Кребса): функции, реакции, ферменты, коферменты,

суммарная реакция, связь с дыхательной цепью. Энергетический баланс, регуляция

процесса.

3. Анаплеротические реакции, их значение.


1. Назовите ферменты и коферменты пируватдегидрогеназного комплекса. Напишите

структуру витаминов, входящих в состав этого комплекса.

_____________________________________________________________________________

_____________________________________________________________________________

_____________________________________________________________________________

_____________________________________________________________________________

___________________________________________________________________________

2. Назовите все ферменты цикла Кребса и определите, к какому классу они относятся

(заполните таблицу):

Ферменты цикла Кребса К какому классу относится данный

фермент?

20 Cate

dra

de b

ioch

imie

și b

ioch

imie

clin

ică


3. Объясните, почему цикл Кребса является аэробным процессом?

_____________________________________________________________________________

_____________________________________________________________________________

_____________________________________________________________________________

_____________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________

4. Оксалоацетат образуется в последней реакции цикла Кребса. Возможно ли образование

оксалоацетата из ацетил-СоА под действием ферментов и коферментов цикла Кребса без

затраты промежуточных продуктов цикла Кребса? Дайте подробный ответ.

_____________________________________________________________________________

_____________________________________________________________________________

_____________________________________________________________________________

_____________________________________________________________________________

____________________________________________________________________________

5. Назовите регуляторные ферменты цикла Кребса, их активаторы и ингибиторы (заполните

таблицу):

Регуляторные

ферменты

цикла Кребса

Активаторы Ингибиторы

6. Напишите реакцию субстратного фосфорилирования цикла Кребса.


1. Выберите функции пируватдегидрогеназного комплекса:

а) окислительное декарбоксилирование CH3-COOH

б) кислительное декарбоксилирование CH3-CO-CH2-COOH

в) дегидрирование и декарбоксилирование CH3-CO-COOH

г) образование НАДФН для реакций восстановительного синтеза

д) образование НАДН для дыхательной цепи

2. Относительно регуляции активности пируватдегидрогеназного (ПДГ) комплекса

являются верными утверждения:

а) ГТФ, АТФ являются ингибиторами ПДГ комплекса

б) низкий энергетический заряд активирует ферменты ПДГ комплекса

в) се ферменты ПДГ комплекса подвергаются только аллостерической регуляции

г) все ферменты ПДГ комплекса подвергаются регуляции только энергетическим зарядом

д) все ферменты ПДГ комплекса регулируются фосфорилированием-дефосфорилированием

21

3. Выберите правильные утверждения относительно цикла Кребса:

а) поставляет промежуточные вещества для анаболизма

б) в цикле Кребса оксалоацетат окисляется до 2 молекул CO2в) в цикле Кребса непосредственно используется O2г) поставляет восстановительные эквиваленты для дыхательной цепи

д) является анаэробным процессом

4. Относительно альфа-кетоглутаратдегидрогеназного комплекса верными являются

утверждения:

а) активируется Ca2+

б) активируется АТФ

в) ингибируется НАДН и сукцинил-КоА

г) в качестве коферментов используются производные витаминов: B1, B2, PP, пантотеновой

кислоты, липоевой кислоты

д) в качестве коферментов используются производные витаминов: биотина, B6, B12,

фолиевой кислоты

5. Относительно реакции: Сукцинил-КoA + ГДФ + H3PO4 ↔ сукцинат + ГТФ + HS-КoA

правильными являются утверждения:

а) это регуляторная реакция цикла Кребса

б) то реакция субстратного фосфорилирования

в) то реакция окислительного фосфорилирования

г) катализируется ферментом сукцинил-КоА синтетазой

д) фермент, катализирующий эту реакцию, относится к классу лиаз

6. Выберите витамины, входящие в состав коферментов, участвующих в цикле Кребса:

а) рибофлавин

б) никотинамид

в) фолиевая кислота

г) аскорбиновая кислота

д) пантотеновая кислота

е) витамин К

7. Выберите правильные утверждения относительно регуляции цикла Кребса:

а) высокая концентрация АТФ уменьшает скорость цикла Кребса

б) сукцинил-КоА является активатором альфа-кетоглутаратдегидрогеназного комплекса

в) низкий энергетический заряд ингибирует цикл Кребса

г) АДФ ингибирует изоцитратдегидрогеназу

д) НАДН ингибирует изоцитратдегидрогеназу и альфа-кетоглутаратдегидрогеназный

комплекс

8. Выберите анаплеротические реакции:

а) оксалоацетат + ацетил-СоА + Н2О → цитрат + НS-СоА

б) пируват + СО2 + Н2О → оксалоацетат + АДФ + Н3РО4в) 1,3-бифосфоглицерат + АДФ ↔ 3-фосфоглицерат + АТФ

г) фосфоенолпируват + СО2 + ГДФ ↔ оксалоацетат + ГТФ

д) креатин-фосфат + АДФ ↔ креатин + АТФ

е) глутамат + Н2О + NAD+ → α-кетоглутарат + NН3 + NADН+Н

+

22 Cate

dra

de b

ioch

imie

și b

ioch

imie

clin

ică



Тема: Биологическое окисление.

Дыхательная цепь и окислительное фосфорилирование

Опыт 1. Качественная реакция на каталазу

Принцип метода: Каталаза крови является оксидоредуктазой с высокой активностью,

которая расщепляет перекись водорода на воду и молекулярный кислород:

2Н2О2 → 2H2O + O2. Ход работы: В 2 пробирки берут по 1 мл H2O, добавляют по 2 капли крови и одну

пробирку кипятят 2-3 минуты для инактивации фермента. После охлаждения в обе пробирки

добавляют по 5-10 капель Н2О2 3%, встряхивают и наблюдают за выделением пузырьков

кислорода.

Результат: __________________________________________________________________

_________________________________________________________________

Вывод: _____________________________________________________________________

_____________________________________________________________________


1. Химическая структура и функции витаминов Е и С.


1. Биологическое окисление. Дегидрирование субстратов – основной источник энергии для

синтеза АТФ. Реакции, ферменты и коферменты дегидрирования.

2. Дыхательная цепь – локализация, биологическое значение:

а) Структура и окислительно-восстановительные свойства основных переносчиков

электронов и протонов (НАД+, ФАД, ФМН, CoQ). Общая характеристика цитохромов и

железо-серных белков.

б) Окислительно-восстановительный потенциал компонентов дыхательной цепи.

в) Схема дыхательной цепи. Ферментные комплексы дыхательной цепи.

г) Ингибиторы дыхательной цепи.

3. Окислительное фосфорилирование. Точки фосфорилирования. Регуляция интенсивности

дыхательной цепи. Коэффициент P/O.

4. Механизм окислительного фосфорилирования (хемиосмотическая теория Митчелла).

АТФ-синтаза. Ингибиторы АТФ-синтазы. Роль внутренней митохондриальной мембраны

в синтезе АТФ. Транспорт АТФ, АДФ и неорганического фосфата через внутреннею

митохондриальную мембрану.

5. Разобщение процессов окисления и фосфорилирования. Разобщающие агенты, их

механизм действия. Примеры физиологического и патологического разобщения.

6. Микросомальное окисление. Роль цитохрома Р450 в окислительно-восстановительных

реакциях.

7. Общие представления об окислительном стрессе. Активные формы кислорода: их синтез,

физиологические и патологические эффекты. Антиоксидантные системы.

23


1. Какие витамины и витаминоподобные вещества входят в состав дыхательной цепи?

Написать их формулы.

2. Сколько молекул АТФ образуется при полном окислении одной молекулы пирувата

(до СО2 и Н2О)?

__________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________

3. Добавление ротенона к митохондриям, которые используют для тканевого дыхания

глутамат, приводит к прекращению синтеза АТФ и переноса электронов. Как можно

восстановить эти процессы? (напоминаем, что ротенон ингибирует ферментный

комплекс НАДН-СоQ-редуктазу) .

__________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________

4. Добавление олигомицина к митохондриям, которые используют для тканевого

дыхания сукцинат, приводит к прекращению транспорта электронов и синтеза АТФ.

Последующее добавление динитрофенола или ионов Са++

приводит к немедленному

возобновлению транспорта электронов в дыхательной цепи без сопутствующего

возобновления синтеза АТФ. Какой процесс тормозит олигомицин?

__________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________

24 Cate

dra

de b

ioch

imie

și b

ioch

imie

clin

ică


5. Добавление малоната (конкурентный ингибитор сукцинатдегидрогеназы) к

митохондриям, которые используют для тканевого дыхания сукцинат, прерывает

транспорт электронов и синтез АТФ. Как восстановить : а) только транспорт

электронов ? б) перенос электронов и синтез АТФ?

__________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________

6. В каком состоянии (восстановленном или окисленном) будут переносчики

дыхательной цепи при добавлении к митохондриям антимицина А и окиси углерода

(СО)?

__________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________

__________________________________________________________________________

7. В митохондриях бурого жира новорожденных и животных в состоянии спячки на

один атом кислорода образуется меньше одной молекулы АТФ:

a) какой физиологической функцией бурого жира можно объяснить такое низкое значение Р/О?

b) назовите вещества и механизмы, посредством которых происходит торможение синтеза АТФ в

буром жире.

_____________________________________________________________________________________

_____________________________________________________________________________________

_____________________________________________________________________________________

_____________________________________________________________________________________

Тесты для оценки знаний 1. Выберите правильные утверждения относительно дыхательной цепи (ДЦ):

а) локализована в наружной митохондриальной мембранеб) это обратимый процессв) состоит из ферментов и окислительно-восстановительных системг) переносит H+ и ē с восстановленных коферментов на O2д) конечным продуктом ДЦ является H2O2

2. Относительно окислительно-восстановительного потенциала (Eo) редокс-систем

дыхательной цепи верны утверждения:

а) это электродвижущая сила, определяющая способность редокс пары принимать и отдавать ē

б) чем отрицательнее значение Eo, тем выше способность системы принимать ē в) чем элекроположительнее значение Eo, тем выше способность системы отдавать ē г) перенос ē в дыхательной цепи сопровождается увеличением свободной энергии д) редокс-системы дыхательной цепи расположены в порядке увеличения Eo

3. Относительно первого комплекса дыхательной цепи (НАДН-КoQ редуктаза)

верными являются утверждения:

а) выполняет роль акцептора H+ и ē с НАД+-зависимых дегидрогеназ б) выполняет роль акцептора H+ и ē с ФАД-зависимых дегидрогеназ в) содержит ФМН г) содержит железо-серные белки (FeS) д) содержит ФАД

25

4. Относительно второго комплекса дыхательной цепи (сукцинат-КoQ редуктаза)


а) переносит H+ и ē в дыхательную цепь только с сукцинатаб) содержит флавопротеины, специализированные на переносе H+ и ē в дыхательную

цепь и с других субстратов (ацил-КоА, глицерол-3-фосфат)

в) содержит НАД+

г) содержит цитохромы а и а3 д) содержит железо-серные белки (FeS)

5. Относительно четвертого комплекса дыхательной цепи (цитохромоксидаза)


а) переносит 4ē с цитохрома с на молекулярный кислород с образованием 2O2-

б) O2- взаимодействует с протонами, образуя перекись водородав) содержит цитохромы b и c1 г) содержит цитохромы a и a3 д) содержит ионы меди

6. Выберите правильные утверждения относительно цитохромов:а) являются гемопротеинами

б) в цитохромах происходит реакция: Fe2+

↔ Fe3+

в) участвуют в переносе только H+

г) переносят H+ и ē на убихинон

д) один цитохром переносит 2 ē

7. Относительно механизма окислительного фосфорилирования правильными

являются утверждения:

а) в ходе переноса ē по дыхательной цепи (ДЦ) образуется промежуточное макроэргическое соединение

б) ē являются положительными аллостерическими модуляторами для АТФ-синтазы в) перенос ē по ДЦ генерирует протонный градиент по обе стороны внутренней

мембраны митохондрии

г) внутренняя поверхность внутренней митохондриальной мембраны заряжается отрицательно, а наружная поверхность – положительно

д) H+ свободно проходят через внутреннюю митохондриальную мембрану

8. Выберите правильные утверждения относительно АТФ-синтазы:

а) это фермент, катализирующий реакции субстратного фосфорилированияб) это фермент, катализирующий окислительное фосфорилированиев) ингибируется олигомициномг) ингибирование АТФ-синтазы тормозит и перенос ē по дыхательной цепид) ингибирование АТФ-синтазы не влияет на перенос ē по дыхательной цепи

9. Относительно бурой жировой ткани верными являются утверждения:

а) это ткань, специализированная на синтезе АТФб) это ткань, специализированная для термогенезав) характерна для новорожденных и для животных, впадающих в зимнюю спячкуг) содержит мало митохондрийд) митохондрии бурой жировой ткани содержат термогенин (разобщающий белок)

26 Cate

dra

de b

ioch

imie

și b

ioch

imie

clin

ică


Глава III

Обмен углеводов


Тема: Биологическая роль, переваривание и всасывание углеводов.

Обмен гликогена

Опыт 1. Реакция Фелинга

Принцип метода. Химизм реакций тот же, что и в пробе Троммера.

CuSO4 + 2KOH → Cu(OH)2 + K2SO4

C6H12O6 + 2Cu(OH)2 → C6H12O7 (глюконовая кислота) + Cu2O (красный осадок) + 2H2O.

Жидкость Фелинга содержит сернокислую медь, едкий натрий и сегнетовую соль

(двойная натриево-калиевая соль винокаменной кислоты) в строго определенных

соотношениях. Избыток гидрата окиси меди Cu(OH)2 находится в растворенном состоянии в

виде алкоголята меди. Этим объясняется тот факт, что при проведении пробы Фелинга

никогда не появляется окись меди черного цвета.

Ход работы. В 5 пробирок вносят пипеткой по 1 мл исследуемого раствора (глюкозы,

фруктозы, сахарозы, крахмала и патологической мочи). Затем в каждую пробирку

добавляют по 1 мл жидкости Фелинга. Содержимое пробирок нагревают до кипения.

Отмечают и объясняют результаты, полученные с жидкостью Фелинга.

Результат: __________________________________________________________________

_________________________________________________________________

Вывод: _____________________________________________________________________

_____________________________________________________________________

Опыт 2. Реакция Селиванова

Принцип метода. Реакцию Селиванова используют для дифференциации кетоз

(фруктоза) от альдоз (глюкоза). Фруктоза и другие кетогексозы дают вишнёво-красное

окрашивание при нагревании их с соляной кислотой и резорц�

БИОХИМИЯ - usmf · 2019-03-04 · Кинетика ферментативных ......

Documents