筑波大学長崎研究室

新しいがん免疫療療法のためのナノメディシンの設計

BBiiooeennggiinneeeerriinngg 220000 SSeemmiinnaarr,, 110066 SSttaannlleeyy HHaallll,, UUCC BBeerrkkeelleeyy,, SSeepptt.. 1166,, 22001155

筑波⼤大学物質⼯工学、フロンティア医科学、WPI-‐‑‒MANA  

⻑⾧長崎幸夫

平成27年年度度知財群活⽤用事業新技術説明会、2016年年1⽉月26⽇日、JST東京別館ホール  

筑波大学長崎研究室

NK cell

macrophage

Immune activity @ Premalignant state

INF-γIL-12

Perforin

Granzyme

CTL

Th1 cell

dendritic cell

IL-12

IL-2

Th1 cell

IL-2

INF-γ

INF-γ

INF-γ

Immune cells produce cytokines to activate each other, which leads to anti-tumor activity at premalignant state.

NO

(腫瘍形成初期)

NO↓

(腫瘍形成後期)

IImmmmuunnee aaccttiivviittyy @@ MMaalliiggnnaanntt ssttaattee

TGF-β cytokines produced by tumors deactivate all immune cells through malignant state.

TGF-β TGF-β

INF-γ

NNiittrriicc OOxxiiddee iiss iimmppoorrttaanntt ffoorr iimmmmuunnee ssyysstteemm!!

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タンパク医薬の問題点  

1.易易分解性  

2.抗原性  

3.免疫に由来する毒性の発現

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⽬目 　次  

1.レドックスインジェクタブルゲルによるタンパク質徐放とがん免疫療療法  

2.⼀一酸化窒素（NO)ターゲッティングによるがん免疫療療法

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既往研究：疎⽔水-‐‑‒親⽔水-‐‑‒疎⽔水性トリブロックポリマーによる温度度応答性ゲル

PLGA-‐‑‒PEG-‐‑‒PLGA

Shim, et al., JBMR, Volume 61, Issue 2, pages 188–196, August 2002

PLGA-‐‑‒PEG-‐‑‒PLGA  20wt%

Yu, et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2006, 45, 2232 –2235

粘度度上昇してゲル化

問題点  1.機械的強度度が弱い  2.疎⽔水性コアのためタンパク等が⼊入らない

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H-(CHCH2)m-(CH2CH2O)n-(CH2CH)m-H

NH

N O

NH

N O

HydrophilicPolycationic Polycationic

Increase  hydrophobicity

Cationic  nature

ROS  scavenge  ESR  Active

Minley Pua

我々の提案するポリイオンコンプレックスに基づくレドックスインジェクタブルゲル

Min  Ley  Pua,  et  al.,  J.  Controlled  Rel.,172,  914(2013)

筑波大学長崎研究室 7

Preparation  of  polygon  complex  flower  micelle

Polyamion

Redox  tribrock  copolymer

Redox  Flower  Micelle

FL-‐‑‒labelled-‐‑‒Polyamion

Ishii,  et  al.,  Macromolecules,  48,  3088(2015)

筑波大学長崎研究室 8

Viscoelastic  properties  of  redox  flower  micelle

PLGA-‐‑‒PEG-‐‑‒PLGA  20wt%

Yu, et al., Angew. Chem. Int. Ed. 2006, 45, 2232 –2235

Ishii,  et  al.,  Macromolecules,  48,  3088(2015)

既存ポリマー

PIC-‐‑‒flower  micelle  55  mg/mL

PICインジェクタブルゲル

High  mechanical  strength  Irreversible  response

ポリイオンコンプレックス型レドックスインジェクタブルゲルによる起⽤用研究の簡単な紹介  

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口腔内に大量にいる細菌から産生される大量の活性酸素種を消去し、炎症を抑制するとともに全身への拡散を防ぐ！

レドックスインジェクタブルゲルの設計

歯周�ポケットに注入�してゲル化し、長期にわたってRROOSSを消去する新しい材料！

2255ooCC 3377ooCC

歯周�病

糖尿病,, 動脈硬化,, リュウマチ,, など

歯周�病が全身疾患に大きく寄与することが知られてきた。

RROOSSRROOSSRROOSSRROOSSRROOSS

RROOSSRROOSS

RROOSSRROOSS

RROOSS

歯周�病に効果的なレドックスインジェクタブルゲルの設計

PPuuaa,, eett aall..,, PPuuaa,, JJ.. CCoonnttrroolllleedd RReell..,, 117722,,,, 991144--992200((22001133))

30 min 3 h 5 h 10 minTEMPOL

RIG

平山　暁

TEMPOL RIG

Redox Flower Micelle

Redox Injectable Gel (RIG)T ↑

I ↑

+ + + ++ + + +

- - -- - ---++

Minley Pua

nitroixide radical

1

CCoonnttrrooll PPgg PPgg++nnRRIIGG PPgg++RRIIGG

李教授　斉田博士

神奈川歯科大学

AAbbssoorrppttiioonn ooff AAvveeoollaarr

bboonnee ((mmmm))

nnRRIIGG

*  

PPgg -- ++RRIIGG

++++

*  *   *  

00..55

00..44

00..33

00

SSaaiittaa,, eett aall..,, ssuubbmmiitttteedd..

筑波大学長崎研究室 NNaakkaaggaawwaa,, eett aall..,, ssuubbmmiitttteedd..

物理的および化学的に臓器癒�着を防ぐレドックス癒�着防止剤の開発

http://myth.gonna.jp/vetlab/

帝王切開や手術後の臓器癒�着が問題になっている！

RRIIGGをスプレーで使い臓器保護

物理的に隔離するだけで無く、出血等で起こる炎症の抑制を行う全く新しいタイプの癒�着防止剤！

ゲル化により長期滞留0  h 3  h 12  h

24  h 72  h 120  h

Ex:  500nm   Em:  540nm  

TTAALLCC障害により臓器が完全に癒�着している

RRIIGGによりTTAALLCC障害癒�着が完全に抑制される！

Control TALC

TEMPO RIG

腹膜切片

TTAALLCCにより腹膜炎症が惹起((右上）、RRIIGGにより完全に腹膜炎症が抑制されている！

TTNNFFα ((ppgg//uugg--pprrootteeiinn)) 好中球の浸潤がほ

ぼ完全に抑制されている！

中川寛之 松本陽子先生

レドックスインジェクタブルゲルによるタンパク徐放  

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Size  of  protein  loaded  RIG

Fluorescent  resonance  energy  transfer  between  FL-‐‑‒protein  and  TEMPO

Protein  release  from    redox  injectable  gel  in  vitro

No  initial  burst  release  was  observed!  RIG  is  not  choosy  size  and  charge  of  proteins.

13

PIC-‐‑‒Flower  micelle

Charged  drugs

Stable  entrapment

Ishii,  et  al.,  submitted  for  publication

Encapsulation  of  charged  molecule  in  RIG

0h 7h 24h

ICG-BSA

ICG-BSA @RIG 0h 7h 24h 3d 6d 10d 14d 17d

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Cancer  immunotherapeutics  by  IL-‐‑‒12@RIG

Local  administration  beside  tumor

Tumor

Weight  change

Tumor  size

IL-‐‑‒12(4ug)@RIG

IL-‐‑‒12(8ug)TNF-‐‑‒a  level  in  blood

Ishii,  et  al.,  submitted  for  publication

IL-‐‑‒12@RIG  improved  therapeutic  efficacy  and  reduced  its  adverse  effect!

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⽬目 　次  

1.レドックスインジェクタブルゲルによるタンパク質徐放とがん免疫療療法  

2.⼀一酸化窒素（NO)ターゲッティングによるがん免疫療療法

筑波大学長崎研究室

NK cell

macrophage

Immune activity @ Premalignant state

INF-γIL-12

Perforin

Granzyme

CTL

Th1 cell

dendritic cell

IL-12

IL-2

Th1 cell

IL-2

INF-γ

INF-γ

INF-γ

Immune cells produce cytokines to activate each other, which leads to anti-tumor activity at premalignant state.

NO

(腫瘍形成初期)

NO↓

(腫瘍形成後期)

IImmmmuunnee aaccttiivviittyy @@ MMaalliiggnnaanntt ssttaattee

TGF-β cytokines produced by tumors deactivate all immune cells through malignant state.

TGF-β TGF-β

INF-γ

NNiittrriicc OOxxiiddee iiss iimmppoorrttaanntt ffoorr iimmmmuunnee ssyysstteemm!!

筑波大学長崎研究室

INF-γ

INF-γ

INF-γIL-12

NO

Perforin

Granzyme

Th1 cell

dendritic cell

IL-12

IL-2

Th1 cell

IL-2

INF-γINF-γ

↓

↓

↓

NK cell

TGF-βTGF-β

CTL

AAnnttii--ttuummoorr aaccttiivviittyy bbyy mmaaccrroopphhaaggeess

macrophageiNOS

L-Arginine Nitric Oxide

OOC NH3H

NH

H2N NH2

OOC NH3H

NH

H2N NH

OOC NH3H

NH

H2N OOH

NO2e

O2 H2O

1e

O2 H2O

NOArginine is required as substrate.

Hypothesis Since this NO production rate is rate-limiting step, effective arginine delivery to tumor tissues can enhance anti-tumor activity via accelerated NO generation.

工藤心平

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OOvveerrvviieeww --AArrggiinniinnee ddeelliivveerryy ssyysstteemm--

PEG

Poly(Arginine)

EPR effect

PEGylated core-shell PIC system can be expected to delivery L-arginine into tumor tissues via Enhanced Permeation and Retention(EPR) effect.

Negatively charged landmark Core-Shell PIC micelle

TUMOR

NO

NONO

L-arginine delivery system: PEGylated core-shell polyion complex architecture

Self-assembly

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iiNNOOSS aaccttiivviittiieess ffrroomm ccooppoollyymmeerrss

NOTrypsin

iNOS

L-Arg

L-Cit

PEG-b-PArg

HN

O

AcNH m

OCH3

nH

NH

NH2

NH2Cl

PEG-b-P(L-Arg)

α

β γδ

HN

O

HNH m

OCH3

nH

HN NH2

NH2 ClMimic copolymer

α

β γ

δ ε

iNOS generated NO by reacting digested L-PArg segments as substrates.

L-Arg +

PEG

PEG-b-P

(L-Arg)

PEG-b-P

(D-Arg

)Mim

icBuf

fer0

5

10

15

Nitr

ite le

vel (

nmol

)

Trypsin (+) Trypsin (-)

工藤心平

Kudo, et al., J.Controlled Rel., in press (doi: 10.1016/j.jconrel.2015.09.019)

筑波大学長崎研究室

GGrriieessss aassssaayy --NNOO pprroodduuccttiioonn lleevveell--

NO

NO

NO

NOActivationSupplymacrophage

LPSIn vitro scheme

★All the polycations in the PIC forms didn’t activate macrophages and

1mM Arginine supply, 72h incubation, n=3, mean±S.D.

+( 25

( 25

5 05 ) /

-111

+ / + /

* p < 0.05

*

Kudo, et al., J.Controlled Rel., in press (doi: 10.1016/j.jconrel.2015.09.019)

筑波大学長崎研究室

iinn vviivvoo eexxppeerriimmeenntt oonn NNOO ggeenneerraattiioonn

ttuummoorr

筑波大学長崎研究室

Anti-tumor activity -Arg conc. depend.-

Kudo, et al., J.Controlled Rel., Vol. 217, 256–262(2015)

in vivo experiment on NO generation

ttuummoorr

Tumor-growth curve

筑波大学長崎研究室

SScchheemmee ooff NNOO--ttrriiggggeerreedd iimmmmuunnootthheerraappeeuuttiiccss

Degradation by protease

Production of NO via iNOS

Poly(Arg)-containing PIC micelle

PEG-b-PArg

Systemic administration

Tumor

Accumulate in tumor via EPR effect

cytoplasm

nucleus

Lysosome

Phagocytosis by macrophage in tumor microenvironment

Tumor cell

NONO-triggered apoptosis of tumor cells

Conclusion  1.We  successfully  synthesized  Redox  Injectable  Gels(RIG),  which  effectively  eliminates  reactive  oxygen  species  (ROS).    

2.RIG  can  be  also  applicable  for  controlled  release  of  charged  compounds  including  proteins,  suppressing  ROS  at  the  same  time.  

3.PEG-‐‑‒b-‐‑‒Poly(l-‐‑‒Arg)  wa  successfylly  synthesized,  which  form  polygon  complex  micelle.  

4.Arg-‐‑‒micelle  generated  NO  in  macrophage  in  cancer  microenvironment

1

• 歯周病治療用DDS製剤

• 手術時の臓器癒着防止スプレー製剤

• NOを介したがん免疫療法薬

想定される用途

企業への期待

• 実用化開発を目指した共同研究

2

本技術に関する知的財産権

特許の名称ポリイオンコンプレックス相互作用に基づくフラワー型高分子ミセルへの薬物ローディングと局所薬物送達システム

国際出願番号 特願2013-123001

出願人 国立大学法人 筑波大学

発明者 長崎 幸夫、吉富 徹、金子 純也

特許の名称癒着防止剤への応用を目指したポリイオンコンプレックス相互作用に基づくフラワー型高分子ミセルの設計

国際出願番号 特願2014-166730

出願人 国立大学法人 筑波大学

発明者 長崎 幸夫、中川 寛之

特許の名称ガン免疫療法へ向けた腫瘍組織内マクロファージを活性化するL-アルギニンデリバリーのためのナノ粒子の製造

国際出願番号 特願2015-083987

出願人 国立大学法人 筑波大学

発明者 長崎 幸夫、工 藤心平

3

筑波大学

国際産学連携本部教授（産学連携）

産学連携部産学連携企画課技術移転マネージャー

山本信行

ＴＥＬ 029－859－ 1493

ＦＡＸ 029－859－ 1693

e-mail yamamoto.nobuyuki.ge＠tsukuba.ac.jp

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