「新規カイコバキュロウイルス発現細胞と 膜タンパ...
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「新規カイコ「新規カイコバキュロウイルス発現バキュロウイルス発現細胞と細胞と膜タンパク質応用機能解析技術」膜タンパク質応用機能解析技術」
新潟大学・大学院医歯学総合研究科新潟大学・大学院医歯学総合研究科分子細胞機能学分子細胞機能学（医学部（医学部 生化学第二）生化学第二）
准教授准教授 武内武内 恒成恒成
なぜ、バキュロウイルス発現系なのか？なぜ、バキュロウイルス発現系なのか？なぜ、昆虫細胞発現系なのか？なぜ、昆虫細胞発現系なのか？
・・ 今後の製薬・薬剤の標的の多くは今後の製薬・薬剤の標的の多くは 細胞膜タンパク質細胞膜タンパク質である。である。
・・ 細胞膜タンパク質では細胞膜タンパク質では 77回膜貫通分子回膜貫通分子 GPCRGPCRなどがなどが今後の大きな標的かつ研究課題である。今後の大きな標的かつ研究課題である。
⇒⇒ しかし、膜タンパク質の発現は難しい。しかし、膜タンパク質の発現は難しい。
・・ バキュロタンパク質発現系は発現量でバキュロタンパク質発現系は発現量で 他を凌駕する。他を凌駕する。
・・ 温度管理（３７℃）も温度管理（３７℃）も CO2CO2も必要ない昆虫細胞の扱いは簡単も必要ない昆虫細胞の扱いは簡単
・・ 細胞膜タンパク質発現では細胞膜タンパク質発現では 細胞体細胞体 or or 虫体にて発現されるため虫体にて発現されるため
細胞膜タンパク特有の翻訳後修飾もされる。細胞膜タンパク特有の翻訳後修飾もされる。
⇒⇒ 細胞膜タンパク質の解析に向いている細胞膜タンパク質の解析に向いている。。
バキュロウイルス発現系でなにができるか？バキュロウイルス発現系でなにができるか？－本日の話題ー－本日の話題ー
１）これまで困難であった膜タンパク質（構造・機能）解析に有効である
（圧倒的な発現量を利用する）（圧倒的な発現量を利用する）
２）我々が開発した新規昆虫細胞などを応用し、生きた細胞膜上を基盤とした機能解析-Cell on chip assay- を可能とした
（昆虫細胞の扱いやすさ利点を利用する）（昆虫細胞の扱いやすさ利点を利用する）
３）細胞内・細胞膜上でのイメージング技術との統合
（バキュロウイルスの利点を利用する）（バキュロウイルスの利点を利用する）
タンパク質大量発現系: ２つのバキュロウイルス生産系Two major baculovirus systems
• AcNPV-昆虫細胞系
– ヨトウムシなどの昆虫由来細胞質生産
– 高発現の樹立細胞が多数存在
• BmNPV-カイコ系
– カイコの幼虫や蛹を使用してタンパク質生産
– 虫体を用いることで、極めて高いタンパク質生産性を有する
昆虫培養細胞系の数１０倍～数１００倍
Sf9, Sf21,Hi5 cells etc.
BmN4, Ke1 cells&
★年間を通していつでも飼育できる。
★探餌行動と蛾の飛翔能力が無いため、飼育設備が簡単である。
★発育ステージが良くそろい、計画通りに飼育できる。
★大量飼育も少量飼育もコントロール自在であり、飼育コストが安い。
★多くの原種が存在し、自由に品種改良できる。
★遺伝的性質が均一で、個体差が小さい。
★蚕血中のアミノ酸量は、ヒトの約５００倍存在し、外来蛋白生産に適している。
★孵化幼虫から５齢幼虫まで、約１ヶ月で体重が１万倍になる（驚異的な成長速度）
蚕＝高能率な全自動細胞培養タンク
発現系素材としてのカイコ
片倉工業（株）
カイコバキュロウイルスタンパク質発現系の概略カイコバキュロウイルスタンパク質発現系の概略
さまざまなタンパク質の発現にバキュロウイルス系は非常に向いている
Presenilinや密着結合帯形成分子数回膜貫通タンパク質の発現構造解析
Alzhimer 病関連分子APP / Presenilin
・膜タンパク質、巨大分子の大量発現に有利・ 昆虫細胞膜上に発現させ、細胞生物学的解析が可能
これまでにバキュロ発現系で我々が手掛けた分子群これまでにバキュロ発現系で我々が手掛けた分子群
神経特異的免疫グロブリンスーパーファミリー接着分子群（IgSF)の発現・構造解析
カイコバキュロ大量発現系の実績（現況）と有用性
カイコバキュロ大量発現系の実績（現況）と有用性
膜タンパク質発現に適合した新規カイコ培養細胞と無血清培養系の導入
虫体・蛹体を用いた産生系
・従来のSf9やカイコBmN4細胞より、高発現細胞株・無血清高密度培養に耐えるNIAS-Bm-Ke1細胞
膜タンパク質発現の実績からの、GPCRの大量産生 および
リガンドなど 機能解析系の開発
膜タンパク質発現の実績からの、GPCRの大量産生 および
リガンドなど 機能解析系の開発
・構造解析を見据えた発現系・リガンドなども見据えたG蛋白質共役型受容体の細胞生物学的研究
新規培養細胞株の確立 Ke1・Ke17細胞 （１）新規培養細胞株の確立 Ke1・Ke17細胞 （１）
NIAS-Bm-Ke1 NIAS-Bm-Ke17
・ 細胞膜タンパク質の発現に好都合の新規培養細胞株 Ke17 細胞を確立した
・ウイルス感染効率が良い・低温発現 誘導活性がある（右図）・他の細胞株とくらべて 細胞膜タンパク質の細胞膜へのソーティング活性が高い・無血清培養に耐える
今西（農水省生物研）武内（新潟大）ら、 （特願2009-200187）
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18℃ 20℃ 22℃ 24℃ 26℃
発現培養温度条件(細胞膜画分／全画分）
新規樹立株細胞 Ke1 における 培地選択でのC.elegans 膜タンパク質 (sax7/L1)発現効率
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KBM700 AGDSA-α８ Grace(Bm)
Ke1 BmN4
新規培養細胞株の確立 Ke1・Ke17細胞 （２）新規培養細胞株の確立 Ke1・Ke17細胞 （２）
Ke1(attach)
Ke1(Suspend) BmN4(attac
h)
BmN4(Suspend)
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Ke1(attach) BmN4(attach)
発現培養条件
血清あり血清あり 培地培地無血清無血清 培地培地
1000
10000
100000
1000000
14day 30day 45day 60day 75day
nat ive
E.co l i
Vacu lo ( larva)
Vacu lo (pupa)
TAG-1 antigens に対する抗体タイターの変化
バキュロ発現タンパク質の抗体産生能への効果バキュロ発現タンパク質の抗体産生能への効果
（ｐｕｐａ） （ｌａｒｖａ）Ｎａｔｉｖｅ
Ｆα１－３
Antigen に対する糖鎖修飾
・接着分子リガンドの検索・接着分子リガンドの検索・オーファンリガンド・オーファンリガンド ＆＆ 結合化合物（薬剤）の探索結合化合物（薬剤）の探索・チャネル分子の機能解析・チャネル分子の機能解析 ・・・・・・・・・・
カイコバキュロ発現細胞を用いた Cell on Chip assay膜タンパク解析システムの構築
カイコバキュロ発現細胞を用いたカイコバキュロ発現細胞を用いた Cell on Chip assayCell on Chip assay膜タンパク解析システムの構築膜タンパク解析システムの構築
<movie>
細胞トラップを用いたon cell スクリーニング系の構築
・オーファンリガンド、結合化合物（薬剤）の探索・チャネル分子の機能解析 ・・・・・
カイコバキュロウイルスを用いた マーカー遺伝子導入と
イメージングシステム
カイコバキュロウイルスを用いたカイコバキュロウイルスを用いた マーカー遺伝子導入とマーカー遺伝子導入と
イメージングシステムイメージングシステム
感染率：感染率： AcNPVAcNPV << << BmNPVBmNPV
From: Invitrogen™
遺伝子導入効率の比較遺伝子導入効率の比較 ：： AcNPV and BmNPV AcNPV and BmNPV
PC12PC12 Primary Primary cult.cult.
PC12PC12 Primary Primary cult.cult.
PC12PC12 Primary Primary cult.cult.
AcNPVAcNPV BmNPVBmNPV BmNPVBmNPV<modified><modified>+ factor (s)+ factor (s)
(The ratio of transfectedcell number)
Integration Integration of of ““ the proteinthe protein--expression expression ““& & ““ the imaging analysis the imaging analysis ””
(Luc) GFP
MHV-S
VSV-G
gp64
CAG promoter NPV promoter
The modification of BmNPV to rise the transforming efficiencyThe modification of BmNPV to rise the transforming efficiency((バキュロウイルスの哺乳類細胞・組織用バキュロウイルスの哺乳類細胞・組織用 高感染ウイルスへの改変高感染ウイルスへの改変))
：バキュロウイルスエンベロープ
：水疱性口内炎ウイルスエンベロープ
：マウス肝炎ウイルスエンベロープ
Sorting-sitesOrganelle Lights™
Tag description and size
CytoplasmCytoplasm Nuclear export sequence (1.8 kD) directs cytoplasmic localization
Endoplasmic Endoplasmic ReticulumReticulum
ER-specific staining is obtained through retention signalsfrom calreticulin & KDEL (1.8 kD N-term & 0.5 kD C-terml)
EndosomeEndosome Fusion of Emerald GFP to Rab5a (23.8 kD), an early endosomal marker, allowing tracking of endosomal movement within the living cell
GolgiGolgi Human Golgi-resident enzyme N-acetylgalactosaminyl-transferase-2(12.6 kD) for Golgi-specific live cell labeling
MitochondriaMitochondria Leader sequence of E1 alpha-pyruvate dehydrogenase (3.1 kD) localizes constructs to the mitochondrial matrix
Nuclear Nuclear EnvelopeEnvelope
Nesprin 1 alpha C-terminal transmembrane domain (6.7 kD)targets E-GFP to the nuclear envelope
NucleusNucleus SV40 nuclear localization sequence (1.0 kD) restricts fluorescent protein expression to the nucleus
PeroxisomePeroxisome Peroxisomal C-terminal targeting sequence (0.3 kD) enables staining and tracking of peroxisomes in live cells
Plasma Plasma MembraneMembrane
・Myristoylation/palmitoylation sequence from Lck tyrosine kinase (0.9 kD)・CAAX box (Farnesyl/geranylgeranyl signal) of K-Ras mediates staining of the plasma membrane
SynaptophysinSynaptophysin Synaptic vesicle protein involved in vesicle endo- and exocytosis(33.8 kD, N terminus of GFP)
Integration Integration of of ““ the proteinthe protein--expression expression ““& & ““ the imaging analysis the imaging analysis ””
産学連携の経歴• 2000年-2005年 ㈱片倉工業と共同研究実施
• 2000年-2005年 文部科学省タンパク3000プロジェクト
（細胞内情報伝達）に参画（名大・生命科学）
• 2004年-2006年 ㈱エーザイ KAN研究所グループリーダー
• 2005年-2007年 ㈱オリンパス と共同研究
• 2006年 ㈱バキュロテクノロジーズ社設立 取締役
就任（2008年京都府立医大着任とともに退任）
• 2006年-2007年 ㈱ピリオドック および ㈱メディビック
と共同研究 およびアドバイザリー
• 2007年-2011年 農水省生研センター事業に採択
• 2010年-2015年 農水省アグリヘルスサイエンス事業に採択
2000~2004名古屋大学大学院生命理学
2004~2006㈱エーザイKAN研究所
2006~2008京都府立医科大学大学院・解剖学
2008~新潟大学大学院医学・生化学
お問い合わせ先
新潟大学 地域共同研究センター
TEL 025-262-7554
FAX 025-262-7550
E-mail [email protected]
新潟大学 医歯学総合研究科分子細胞機能学分野（医学部 生化学第二）
武内 恒成[email protected]