Opta fiziologija sa biofizikom Veba br. 7Metode za odreivanje uoblienih elemenata krvi - leukocitaLeukociti (bela krvna zrnca)

Prema obliku i izgledu jedara, kao i prema prisustvu ili odsustvu specifinih granula u citoplazmi, leukociti se dele u nekoliko grupa:

1. Granulociti (polimorfonuklearni leukociti) nastaju u kostnoj sri, imaju renjevito jedro i poseduju granule u citoplazmi koje se razliito boje, te se, prema tome, ovi leukociti dalje dele na vie podgrupa:a) Neutrofilni granule se boje neutralnim bojama

- ine 70 % od ukupnog broja leukocita - igraju vanu ulogu u odbrani organizma - prva linija odbrane

b) Bazofilni granule se boje baznim bojama

- ine 0, 5 % od ukupnog broja leukocita

- igraju vanu ulogu u procesu reparacije tkiva, u obnavljanju tkiva u organizmu

c) Eozinofilni granule se boje kiselim bojama

- ine 1, 5 % od ukupnog broja leukocita - uestvuju u procesu detoksikacije organizma od bakterija, parazita, kao i u alergijskim reakcijama2. Agranulociti - imaju ovalno jedro, nemaju granule u citoplazmi, nastaju u limfnim vorovima i slezini. Dele se na dve grupe:

a) Limfociti ima ih oko 24 %

- imaju vanu ulogu u sintezi specifinih globulina plazme

- imaju ulogu i u alergijskim reakcijama

b) Monociti ima ih oko 4 %

- nastavljaju delovanje neutrofilnih leukocita u odbrani organizma predstavljaju tzv. drugu odbrambenu liniju organizma

U normalnim fiziolokim uslovima broj leukocita u krvi je stalan u okviru jedne ivotinjske vrste, a takoe je karakteristian za vrstu. Referentna vrednost za oveka je 6 8 109 /l.U odreenim uslovima ovaj broj moe da se poremeti, to ukazuje na mnogobrojne patoloke promene. Povean broj leukocita leukocitoza javlja se prilikom gnojnih procesa u organizmu, kod bolesti leukemije i sl. Smanjen broj ovih krvnih elemenata leukopenija moe da nastane u sluajevima trovanja industrijskim otrovima, prilikom ozraivanja radioaktivnim materijalom itd. Pored toga, itav niz aktivnih materija u organizmu, npr. glukokortikoidni hormoni mogu da menjaju broj i odnos pojedinih grupa leukocita, to takoe potvruje znaaj odreivanja broja ovih elemenata u krvi. Postupak brojanja leukocita

Potreban materijal:

Aparati: svetlosni mikroskopPribor: hemocitometar, lanceta, vataHemikalije: Trck ov rastvor ( 100 ml destilovane vode, 1 ml glacijalne siretne kiseline, 1ml 1% rastvora gencijana violet), 70 % etil alkoholHemocitometar je poseban pribor koji se sastoji od melanera za uzimanje krvi, komorice za brojanje i mikroskopa.

Melaneri predstavljaju specijalne mikropipete sa proirenim delom na vrhu i meusobno se razlikuju po zapremini pomenutog proirenja. Melaneri za uzimanje krvi u svrhu brojanja leukocita (i trombocita) imaju manje proirenje (manje se krv razblauje) i belu kuglicu (perlicu) za meanje u sebi.

Na stakleni deo melanera navlai se gumeni nastavak pomou koga se ustima uvlai krv.Komorice za brojanje predstavljaju specijalne mikroskopske ploice sa udubljenjem u koje se uliva krv. Povrina komorice je izdeljena uzdunim i poprenim linijama na kvadratne povrine razliite veliine. Pod malim uvelianjem mikroskopa u sredini komorice uoava se kvadrat veliine 1mm2 (A). Kvadrat (A) je dalje izdeljen uzdunim i poprenim linijama na 25 manjih kvadrata (B), ija povrina iznosi 1/25 mm2. Svaki (B) kvadrat je dalje izdeljen na 16 jo manjih kvadrata (C) ija povrina iznosi 1/400 mm2. Dubina komorice iznosi 0, 1 mm, tako da svaki od pomenutih kvadrata obuhvata razliitu zapreminu: kvadrat (A) obuhvata zapreminu od 0, 1 mm3 (1mm2 0,1 mm), kvadrat (B) obuhvata zapreminu od 0, 004 mm3 (1/25 mm2 0, 1 mm = 0, 04 mm 2 0, 1 mm = 0, 004 mm3), kvadrat (C) pokriva zapreminu od 0, 00025 mm3.

Komorica za brojanje uoblienih elemenata krviPojedine komorice, ukoliko su od razliitih proizvoaa, mogu se unekoliko razlikovati po broju linija i nainu njihovog povlaenja, meutim povrine su uvek iste, odnosno ukupna povrina komorice za brojanje iznosi 1mm2, a dubina 0, 1 mm. Postoje Thoma Zeiss ove, Brker ove, Trck ove, Neubauer ove komore. U zavisnosti od karakteristika komorice (od razliitih proizvoaa), vri se preraunavanje broja elija u suspenziji na odreeni nain. Brojanje elija pomou ovih komorica je sporo, ali se smanjuje greka brojanja izbegavanjem agregiranih elija, a mogue je odrediti i broj ivih (vijabilnih) elija. Uzimanje krvi za brojanje leukocita iz jagodice domalog prsta1. Najpre se izvri dezinfekcija jagodice prsta iz kojeg e krv biti uzeta, tako to se vatom natopljenom 70 % etil alkoholom pree preko distalne falange. Dok se alkohol na prstu sui, sterilna lanceta se vadi iz pakovanja, a zatim se vri ubod na vrhu jagodice.2. Potom se krv brzo uvue u odgovarajui melaner do oznake 0, 5 ili 1 eksperimentator odredi do kog podeoka e da uvue krv i potrebno je da taj podatak zapie zbog kasnijeg prorauna razblaenja a zatim se do oznake 11 iznad proirenja melanera uvlai Trck ov rastvor. On sadri siretnu kiselinu koja razara eritrocite da ne bi ometali brojanje i boju gencijana violet, koja boji jedra leukocita. Prstom se zatvaraju oba kraja melanera da bi se krv dobro meala sa Trck ovim rastvorom i ostavi da stoji 30 min.3. Za to vreme na mikroskopu se izotri mrea u komori za brojanje i pokrije pokrovnom ljuspicom. Odstranjuje se nekoliko kapi iz melanera i sledea kap kane u neposrednu blizinu ljuspice. Ona e se razliti ravnomerno ispod ljuspice i uliti u komoru.4. Za odreivanje ukupnog broja leukocita preporuuje se brojanje u 4 periferna kvadrata Neubauer ova leukociti se broje u 16 manjih kvadrata velikog perifernog kvadrata; broje se svi leukociti koji se nalaze u kvadratu i oni koji se nalaze na graninoj liniji (npr., gornja i leva); brojanje se vri u smeru osmice, u tri ponavljanja pa se potom odredi srednja vrednost.

U Thoma Zeiss ovoj komori brojanje se vri u centralnom kvadratu - (A) u ovom sluaju (na osnovu napred navedene eme).5. Potom se broj ovih krvnih elemenata izraunava na sledei nain: Broj leukocita/litru krvi = A R10106 A ukupan broj leukocita na povrini od 1mm2

R odgovarajue razblaenje:

R = 20 ukoliko je krv uvuena do oznake 0, 5 a rastvor do oznake 11 (krv je u tom sluaju razblaena 20 puta)

R = 10 ukoliko je krv uvuena do oznake 1, a rastvor do oznake 11 (krv je u tom sluaju razblaena 10 puta)

10 visina komorice je 0, 1 mm te se ovim mnoenjem dobija broj eritrocita u zapremini od 1 mm3

106 - novi meunarodni sistem jedinica usvojio je izraavanje broja krvnih elemenata na 1 litar krvi te se stoga vrednost dobijena u 1 mm3 mnoi sa 106.