ontwikkeling van een serodiagnostische test voor de
TRANSCRIPT
UNIVERSITEIT GENT
FACULTEIT DIERGENEESKUNDE
Academiejaar 2015 - 2016
Ontwikkeling van een serodiagnostische test voor de detectie van worminfecties in pluimvee
door
Matthias SNIJDERS
Promotor: Prof. dr. Peter Geldhof Literatuurstudie in het kader
Copromotor: Hilde van Meirhaeghe van de Masterproef
Elise Vandekerckhove © 2016 Matthias Snijders
Universiteit Gent, haar werknemers of studenten bieden geen enkele garantie met betrekking tot de juistheid of volledigheid van de gegevens vervat in deze masterproef, noch dat de inhoud van deze masterproef geen inbreuk uitmaakt op of aanleiding kan geven tot inbreuken op de rechten van derden. Universiteit Gent, haar werknemers of studenten aanvaarden geen aansprakelijkheid of verantwoordelijkheid voor enig gebruik dat door iemand anders wordt gemaakt van de inhoud van de masterproef, noch voor enig vertrouwen dat wordt gesteld in een advies of informatie vervat in de masterproef
UNIVERSITEIT GENT
FACULTEIT DIERGENEESKUNDE
Academiejaar 2015 - 2016
Ontwikkeling van een serodiagnostische test voor de detectie van worminfecties in pluimvee
door
Matthias SNIJDERS
Promotor: Prof. dr. Peter Geldhof Literatuurstudie in het kader
Copromotor: Hilde van Meirhaeghe van de Masterproef
Elise Vandekerckhove © 2016 Matthias Snijders
2
Voorwoord
Graag wil ik iedereen bedanken die op enige manier heeft geholpen deze masterproef tot stand
te brengen. In de eerste plaats wil ik Elise Vandekerckhove bedanken voor het vele werk dat ze
heeft uitgevoerd om me te helpen bij deze masterproef: meegaan met de bedrijfsbezoeken,
uitwerken van de serologische test, inplannen van de infectieproef en zoveel meer. Ik wil de
dienst parasitologie op de faculteit diergeneeskunde in Merelbeke bedanken voor het aanreiken
van de middelen die ik nodig had om deze masterproef te kunnen uitwerken: het materiaal nodig
voor de onderzoeken, gebruik van het labo, de proefstal en de tijd van assistenten en
doctoraatstudenten om te helpen diagnoses uit te voeren. Professor Peter Geldhof wil ik
bedanken om mij de kans te geven dit onderzoeksonderwerp uit te werken.
Naast deze personen wil ik ook de dierenartsenpraktijk Degudap te Izegem bedanken, in het
bijzonder dierenartsen Nele Vandenbussche en Kevin Baeten, om de bedrijven aan te reiken
waar er bloedstalen konden worden genomen en deze samen te bezoeken.
Ten slotte wil ik nog iedereen bedanken die op enige manier heeft geholpen met het tot stand
brengen van deze masterproef, bijvoorbeeld door te helpen deze te verbeteren.
3
1. Samenvatting p.4
2. Inleiding p.5
a. Parasieten bij industrieel pluimvee p.6
i. Nematoden p.6
1. Ascaridia galli p.7
a. Algemeen p.7
b. Morfologie p.7
c. Levenscyclus p.8
d. Pathogeniciteit p.9
2. Heterakis gallinarum p.10
a. Algemeen p.10
b. Morfologie p.10
c. Levenscyclus p.10
d. Pathogeniciteit p.11
ii. Andere intestinale parasieten p.11
b. Detectiemethoden p.12
i. Coprologie p.12
ii. Necropsie p.12
iii. Serologie p.14
3. Doelstelling p.16
4. Materiaal en methoden p.17
a. Algemeen p.17
i. Coprologie p.17
ii. Bloedname p.21
iii. Necropsie p.22
b. Serologie p.25
i. Principe ELISA p.25
ii. Voorbereiding bloed p.25
iii. Uitvoeren ELISA p.26
c. Ascaridia galli cultuur p.27
5. Resultaten p.29
a. Veldstudie p.29
b. Analyses veldstudie p.32
c. Experimentele infectie p.35
6. Discussie p.37
a. Grenswaarde p.37
b. Antistofpersistentie p.39
c. Relevantie en toekomst p.41
7. Referentielijst p.43
4
1. Samenvatting
Het doel van dit onderzoek is om inzicht te verkrijgen in de mogelijkheid tot, en relevantie van de
serologische diagnose van nematoden zoals Ascaridia galli en Heterakis gallinarum bij
legpluimvee. Er werd een nieuwe ELISA-test ontwikkeld om antistoffen tegenover wormen bij
legkippen in het bloed te ontdekken. Er werden 21 bedrijfsbezoeken uitgevoerd, waar telkens van
zo’n twintig dieren bloed en mest werd genomen. Het meststaal werd onderzocht op de
aanwezigheid van nematodeneieren en de nieuwe ELISA-test werd uitgevoerd op serumstalen
om te proberen de infectie in het bloed te detecteren. De resultaten van de serologische test en
van het mestonderzoek werden daarna vergeleken met de huisvesting en de leeftijd van de
dieren op de specifieke bedrijven. Op deze manier werden pogingen ondernomen om enerzijds
aan te tonen indien de ontwikkelde test al dan niet worminfecties kan detecteren en anderzijds
indien er een mogelijkheid is om met behulp van enkel deze serologische test de graad van
wormbesmetting op een bedrijf in te schatten. Het blijkt dat de ontwikkelde test wormbesmetting
kan aantonen bij legpluimvee, maar er is meer onderzoek nodig om specifieke grenswaarden
voor de detectie van een besmetting te kunnen vastleggen en de relevantie van een dergelijke
test in de praktijk te bepalen.
Sleutelwoorden: Ascaridia galli - Diagnose - ELISA - Pluimvee - Serologie
5
2. Inleiding
Besmetting van kippen met nematoden, en specifiek met Ascaridia galli is in de praktijk, zowel bij
hobbypluimvee als bij industrieel gehouden pluimvee een reëel probleem (1,2,3). Sinds de
verandering van de Europese wetgeving op 1 januari 2012 (4), waarbij nieuwe richtlijnen qua
huisvesting van industriële legkippen werden doorgevoerd (het feit dat de klassieke batterijkooien
niet meer toegelaten zijn), zijn wormbesmettingen opnieuw de hoogte in geschoten. In de praktijk
worden er nu veel meer ontwormingen uitgevoerd, maar het probleem bij de meeste
behandelingen is het bepalen van het tijdstip van ontwormen. Momenteel wordt infectie vooral
bevestigd aan de hand van autopsie of coprologie, maar de sensitiviteit en specificiteit van deze
testen, zeker als ze onafhankelijk van elkaar worden gebruikt, laat wat te wensen over (2). Ook
kan de ontworming laattijdig gebeuren (na het lijden van productieverliezen). Anderzijds kan
preventieve ontworming overbodig zijn, wat een extra kost voor het bedrijf betekent. De vraag
rees of er een mogelijkheid zou zijn om een serologische test te ontwikkelen, zoals recent
gedaan werd voor Ascaris suum infectie bij varkens (Serasca® test (5)).
6
Fig.1. Taxonomie van de meestvoorkomenden wormen bij legpluimvee (8)
a. Parasieten bij industrieel pluimvee
i. Nematoden
Nematoden zijn met voorsprong de parasieten die het meeste voorkomen bij pluimvee in het
algemeen en dus ook bij kippen. Bij kippen alleen zijn er meer dan 50 verschillende species
nematoden (6). De drie belangrijkste genera intestinale nematoden zijn Capillaria spp.,
Heterakidae en Ascaridiae (7). Deze drie nematoden zijn op basis van morfologie relatief vlot van
elkaar te onderscheiden, ook de eitjes zijn op mestonderzoek goed differentieerbaar (zie verder:
detectiemethoden).
Op figuur 1. is de taxonomie weergegeven van de meest voorkomende wormsoorten bij
legpluimvee (8). Het is niet zo dat elk van deze wormen even pathogeen of relevant is in de
praktijk; Algemeen kan er gesteld worden dat Raillietina en Capillaria species ernstigere
symptomen zullen veroorzaken dan besmettingen met Heterakis of Ascaridia species (1,2,3,6,9). De
twee meest voorkomende intestinale parasieten bij legpluimvee zijn Ascaridia galli en Heterakis
gallinarum. Op de derde nematodensoort, Capillaria spp., zal niet dieper worden ingegaan
aangezien deze in de praktijk beduidend minder relevant is (1,10,11). Het doel van deze
masterproef is het onderzoeken van de mogelijkheid van een serologische diagnose van
7
Fig.2. Ascaridia galli in een ei (15)
Ascaridia galli. Er zijn echter vermoedens dat er op serologisch niveau kruisreactie is met andere
wormsoorten, voornamelijk met Heterakis gallinarum, daarom zal deze evenwel verder
besproken worden.
1. Ascaridia galli
a. Algemeen
Ascaridia galli is een spoelworm die reeds in 1788 werd ontdekt (6). Het is een nematode die
kippen, eenden, kalkoenen en kwartels relatief vlot kan besmetten (12). Andere vogelsoorten zoals
duiven en ganzen kunnen er ook door besmet worden, maar dit zal minder snel gebeuren (13). In
de praktijk wordt deze nematode ook wel eens de “grote spoelworm” genoemd. Deze worm leeft
typisch in de dunne darm, en kan ook daar worden aangetroffen bij autopsie (14). Sterfte
veroorzaakt door deze worm is zeldzaam, al is het mogelijk dat er in bepaalde gevallen zoveel
wormen in het dier aanwezig zijn dat het
volledige lumen van de dunne darm
geblokkeerd wordt (14). Dan kan er wel sterfte
optreden. Naast de typische lokalisatie in de
dunne darm werd deze worm ook al
gevonden ter hoogte van andere organen
zoals de spiermaag, de oesophagus, de krop
of het oviduct (6). Een migratie naar het
oviduct is het meest voorkomend, een
incorporatie van een Ascarida galli worm in
een kippenei werd dan ook al verschillende
malen vastgesteld (14).
b. Morfologie
Deze spoelworm is de grootste die bij legkippen voorkomt. Mannelijke wormen zijn over het
algemeen tussen de 50 en 76 mm lang. De vrouwtjes zijn beduidend langer, tussen de 70 en 116
mm. Het is dus in theorie mogelijk om met het blote oog het geslacht van de wormen te
bepalen(8,13). De mannelijke worm is zo’n 1.2 mm breed, terwijl de vrouwtjes zo’n 1,8 mm breed
zijn (13). De kleur van de worm is wit tot geel en semitransparant, deze doorzichtigheid kan ook
helpen met het determineren van het geslacht van de worm, aangezien de eitjes soms
microscopisch zichtbaar zijn (6). De mond van beide geslachten heeft drie lippen, die vrij
prominent zijn. Het vrouwtje heeft een opening in het midden van het lichaam, terwijl het
mannetje twee spiculen van 1 à 2.5 mm heeft en een preanale zuignap (6,13).
8
c. Levenscyclus
Qua levenscyclus is Ascaridia galli een vrij eenvoudige parasiet: de worm heeft een directe
ontwikkelingscyclus, de wormeieren ontwikkelen zich vrij in de buitenwereld, zonder dat er een
tussengastheer nodig is (8). De eieren van de worm verlaten de kip in een niet-infectieuze vorm,
waarna ze in de buitenwereld embryoneren. Dit proces van embryoneren bestaat uit het
ontwikkelen van een L3 larve in het ei. Het eitje is typisch na 10 à 20 dagen in de buitenwereld
infectieus (6), hoewel in extreme omstandigheden (warmte, vochtigheid en zuurstof) de
ontwikkelingsduur van de eitjes tussen de 7 en 28 dagen kan bedragen (13). De eitjes zijn vrij
resistent in de omgeving, zelfs matige vorst kunnen ze overleven, zo werden er al overlevende
eitjes gevonden op weiden waar er 66 weken geen legkippen meer hadden gezeten (13). De eitjes
worden wel afgedood bij strenge vorst of bij blootstelling aan temperaturen boven 43 °C, langer
dan 12 uur (6).
Eens de infectieuze wormeitjes worden opgenomen door de kip komen ze uit in het duodenum of
het jejunum (6). Bepaalde bronnen vermelden dat de L3 larven al in de spiermaag uit de eitjes
kunnen komen, wat ook het aantreffen van wormen in de maag kan verklaren (13). Eens het eitje
opgenomen en ter plaatse is, zal de L3 larve binnen de 24 uur uit het eitje komen. Hierna begint
de histiotrofe fase van de ontwikkeling: de larve zet zich vast in de mucosa van de darmwand van
de kip en afhankelijk van de hoeveelheid opgenomen eitjes zal deze fase 3 tot 54 dagen duren
(6). Gemiddeld zal de worm na 17 dagen weer in het lumen terecht komen, de worm matureert
dan verder in het lumen en kan na nog een tiental dagen als volwassen worm beschouwd worden
(13). De prepatente periode van de worm varieert in de praktijk tussen 5 en 8 weken (6). Bij oudere
dieren (>3 maanden) zal de prepatente periode iets langer duren, dit doet vermoeden dat er een
Fig.3. Volwassen Ascaridia galli in een kippendarm (15)
9
vorm van resistentie optreedt tegen deze wormbesmetting, wat kan verklaren dat infecties op
serologische manier detecteerbaar kunnen zijn (8,13).
d. Pathogeniciteit
De pathogene effecten veroorzaakt door Ascaridia galli zijn eerder aspecifiek; in de meeste
gevallen betreft het symptomen die moeilijk detecteerbaar zijn, mede door de grote groepen
waarin de kippen gehuisvest worden. Het meest voorkomende symptoom is gewichtsverlies (6),
vormen van productiedaling komen eveneens vrij veel voor. In grote groepen zijn dergelijke
symptomen echter moeilijk te detecteren. Deze symptomen zijn proportioneel met de hoeveelheid
wormen die in de darm van het dier aanwezig zijn (8,14), dit maakt het detecteren van matige
infecties moeilijker. Productiedaling kan voorkomen, maar dit is slechts bij zware infecties
merkbaar (14). Zoals eerder vermeld kunnen er ook wormen in de eieren van de kip terechtkomen,
dit is echter een rariteit (14). Bij zware infecties kunnen er ook andere symptomen voorkomen; de
belangrijkste hiervan is een, al dan niet haemorraghische, enteritis. Dit komt vooral voor bij een
hoge initiële ei-opname en wordt veroorzaakt door het innestellen van de L3 larve in de mucosa
van de darm. Als er teveel larven de kans krijgen de darm te bevolken, kan dit leiden tot
spijsverteringsstoornissen en dus een vorm van enteritis (6,8,13). Ten slotte kan er ook een
indirecte vorm van pathogeniciteit worden gezien bij het voorkomen van co-infecties. Zo is er
vastgesteld dat een menginfectie van Ascaridia galli en Pasteurella multocida ervoor zorgt dat
Pasteurella een hogere pathogeniciteit krijgt (16). Er werd daarnaast aangegeven dat ziektes zoals
coccidiose en infectieuze bronchitis sneller klinisch tot uiting kunnen komen indien er reeds een
infectie met Ascaridia galli aanwezig is (13). Er zijn aanwijzingen dat dit gezien wordt ten gevolge
van een immunosuppressief effect van een Ascaridia galli infectie (16).
10
Fig.4. Differentiatie tussen Ascaridia galli (rechts) en Heterakis gallinarum
(links) (15)
2. Heterakis gallinarum
a. Algemeen
Heterakis spp. is de tweede worm die heel relevant is in de pluimveeindustrie. Deze wordt in de
praktijk ook wel eens de “kleine spoelworm” genoemd. Er zijn een drietal subspecies, waarvan
Heterakis gallinarum met voorsprong de belangrijkste is (6,8,13). Net als A. galli komt deze worm
voor bij veel verschillende pluimveesoorten. De kleine spoelworm leeft in het caecum, dus is qua
lokalisatie vrij vlot te onderscheiden van andere wormen (6).
b. Morfologie
Qua morfologie is er
een duidelijk verschil
tussen Heterakis
gallinarum en
Ascaridia galli; de
mannelijke wormen
zijn 7 à 13 mm,
terwijl de vrouwtjes
10 à 15 mm lang zijn.
De wormpjes zijn niet
doorzichtig, maar wit-
geel van kleur (8,14).
c. Levenscyclus
De levenscyclus van H. gallinarum is net als die van A. galli direct, een extra aspect van de
levenscyclus is echter dat regenwormen en vliegen als mechanische transportgastheer kunnen
dienen (6). De niet geëmbryoneerde eieren worden via de mest uitgescheiden. Na een tweetal
weken zijn de eieren infectieus. Na opname van de infectieuze eieren, zullen de larven van de
worm binnen 24 uur in het caecum terug te vinden zijn. De larven zullen gedurende 10 tot 14
dagen nauw geassocieerd zijn met de mucosa van het caecum en zullen nadien, als volwassen
worm, vooral in het lumen van het caecum terug te vinden zijn (6,13).
11
Fig.4. Algemene levenscyclus van Eimeria spp.(7)
d. Pathogeniciteit
Echt duidelijke klinische tekens vertonen kippen die geïnfecteerd zijn met Heterakis gallinarum
niet. Plaatselijk kan het caecum ontstoken zijn en eventueel zijn de slijmvliezen op bepaalde
plaatsen ontstoken (8). Ook kan je op de caecale wand lokale petechiën (6) of wat nodules, al dan
niet gevuld met larven van de nematode (13), terug vinden. Andere Heterakis wormen, zoals
Heterakis isolonche, kunnen bijkomende symptomen veroorzaken zoals diarree, typhlitis en zelfs
sterfte, maar dit is niet het geval voor Heterakis gallinarum (6). Heterakis gallinarum is vooral
gekend als drager van Blackhead ziekte (Histomonas meleagridis). Histomonas is een eukaryoot
die kan voorkomen in de eitjes van H. gallinarum, maar ook in de volwassen wormen. Dit
protozoön veroorzaakt een ziekte die Blackhead heet. Deze ziekte veroorzaakt laesies in de
caeca en lever, maar kan bij ernstige besmettingen aanleiding geven tot encephalitis (1,7).
Blackhead heeft de capaciteit om veel sterfte, vooral bij kalkoenen, te veroorzaken. Bij kippen
komen klinische vormen van Blackhead echter minder voor. De vormen die voorkomen zijn
daarnaast minder pathogeen dan bij kalkoenen (13).
ii. Andere intestinale parasieten
Er zijn nog veel andere parasieten,
onder andere enkele
trematodenspecies zoals
Echinostoma revoltum (6), maar de
meeste van deze zijn niet relevant in
de praktijk, hetzij door de extreem
lage prevalentie bij industriële
kippenhouderij, hetzij door de lage
pathogeniciteit. Cestodenspecies
(Raillietinna spp.) komen niet zo vaak
voor, maar deze lintworm
veroorzaakt, als hij voorkomt,
ernstige klinische verschijnselen.
Raillietina spp. wormen zijn vlot
onderscheidbaar van andere
wormen die bij pluimvee voorkomen
door hun gesegmenteerd aspect en lokalisatie (nl. in het caudale deel van de dunne darm,
caudaler dan Ascaridia galli) (6,13). Een intestinale parasiet die wel heel relevant in de praktijk is, is
Eimeria spp(6,7). Het is niet de bedoeling om in deze masterproef de verschillende species van
Eimeria te bespreken, maar er kan wel opgemerkt worden dat deze endoparasiet de laatste jaren
in prevalentie stijgt door dezelfde redenen die de stijging in Ascaridia galli veroorzaakt (2,7). In de
12
oude batterijkooien hadden de dieren namelijk amper contact met de mest van toomgenoten en
kon een infectie met Eimeria spp. zichzelf niet handhaven. Echter sinds dergelijke huisvesting
niet meer toegelaten is (4), kunnen de dieren zichzelf in grondstallen of volièrestallen veel sneller
herbesmetten. Ook in verrijkte kooien kan besmetting optreden, maar dit is vooral veroorzaakt
door het pikgedrag van de leghennen in de richting van de mestband.
b. Detectiemethoden
In de praktijk worden de meeste wormbesmettingen vastgesteld door het uitvoeren van
necropsie. Een andere methode die echter ook wordt gebruikt, vooral als controlemaatregel, is
het coprologisch onderzoek (2).
i. Coprologie
Een eerste belangrijk aspect met betrekking tot coprologisch onderzoek, is een correcte
staalname. Zo heb je bijvoorbeeld voor onderzoek naar cestoden een grotere hoeveelheid mest
nodig en enkel niet-cecale mest (2). De meeste coprologische onderzoeken worden echter
uitgevoerd met het oog op het ontdekken van nematoden. Hiervoor moet er voldoende mest
worden genomen (toch zo’n 30-tal hoopjes faeces, ten opzichte van zo’n 60 voor onderzoek naar
lintwormen) (2). Deze mest moet zo vers mogelijk zijn en je moet zowel cloacale als caecale mest
nemen (visueel is het verschil tussen deze twee duidelijk (6) doordat de caecale mest bleker is, er
geen uraten bijzitten en ze typisch een vloeibaarder aspect heeft (17)). De caecale mest wilt men
vooral erbij nemen om een infectie met H. gallinarum niet over het hoofd te zien. Ten slotte moet
er nog voor gezorgd worden dat er mest uit verschillende delen van de stal wordt genomen en
dat de mest zo weinig mogelijk bezoedeld is met zaken zoals strooisel (1,2,3). Na de staalname
wordt de mest best zo snel mogelijk verwerkt, of indien dit niet mogelijk is, koel bewaard (2) (Zie
materiaal en methoden voor de manier van het uitvoeren van een mestonderzoek). Een laatste
opmerking bij de bewaring van een meststaal is dat stalen die gekoeld worden na toevoeging van
formaldehyde eventueel wel langer kunnen bewaard worden (tot drie weken (8)). Uit deze stalen
kan er blijkbaar nog een succesvol mestonderzoek volgen, al moet er rekening gehouden worden
met de hoeveelheid toegevoegde formaldehyde om bij kwantitatief onderzoek een
verdunningseffect te kunnen incalculeren (8,18).
13
ii. Necropsie
Necropsie is een methode die in de praktijk heel frequent gebruikt wordt (1,2), vaak wordt deze
methode verkozen boven coprologisch onderzoek. Omdat het een snellere methode is, die vlot in
het veld kan worden uitgevoerd. Voor het uitvoeren van de necropsie is het belangrijk dat de
dierenarts een protocol volgt. Door op een dergelijke manier systematisch te werk te gaan, kun je
er zeker van zijn dat je zo weinig mogelijk aandoeningen mist. (1,19).
Het meest cruciale punt van de necropsie is de dierkeuze. In de eerste plaats kan er gekozen
worden voor reeds gestorven dieren. Behalve bij particulieren, kleine diergroepen of extreem
waardevolle dieren zal dit echter niet worden toegepast. Een belangrijke reden waarom dit in de
praktijk niet wordt uitgevoerd is dat het moment van sterfte niet gekend is. Zo kunnen
coccidioseletsels twee tot vier uur postmortem al vrijwel onmogelijk terug te vinden zijn. In de
praktijk wordt er echter vastgesteld dat de detectie van Ascaridia galli amper beïnvloedt wordt
door het sterftemoment, maar andere nematoden zoals Heterakis gallinarum worden minder
goed detecteerbaar kort na de dood (1,2,7,13,14).
Bij de meeste bedrijven worden er enkele dieren uitgekozen door de dierenarts om te
euthanaseren voor necropsie. Het probleem bij deze manier van werken is de keuze van de
dieren, vooral in functie van wat je wil bekomen: enerzijds kan je het al dan niet aanwezig zijn van
ziekte willen aantonen, anderzijds zijn er ook gelegenheden waar de pluimveehouder liever een
gemiddeld beeld van de prevalentie wil verkrijgen, met het oog op behandelen indien de
prevalentie boven een bepaalde threshold ligt (bv coccidiose lesie-score) (2,8,13,19). Vooral bij deze
diagnostische vorm is het belangrijk om “gemiddelde dieren” uit te kiezen, aangezien de zichtbaar
zieke dieren vatbaarder zijn voor wormbesmetting en er bij de topdieren over het algemeen een
lagere prevalentie van worminfecties is (2).
Een derde en laatste vorm van dierkeuze voor necropsie, specifiek voor wormbesmettingen, is
het gebruik van indicatordieren. Er is één bron (6) die het gebruik van wormvrije dieren als
indicatordieren vermeld als alternatief voor de detectie van wormen bij legpluimvee. Hierbij wordt
een wormvrij, gevoelig dier in een mogelijk besmette stal geïntroduceerd en na vier tot zes weken
geëuthanaseerd om het besmettingsgehalte bij dit dier te bepalen. In de praktijk is deze methode
niet relevant, aan de ene kant omdat het moeilijk en tijdrovend is om geschikte indicatordieren te
verkrijgen en anderzijds omdat de diagnose ten vroegste vier weken na introductie van het
indicatordier kan worden gesteld (6,8). De algemene consensus lijkt te zijn dat necropsie
momenteel de meest accurate manier is om wormbesmetting vast te stellen (2,12,13,18,19). Aan de
ene kant omdat het in de praktijk vlot uitvoerbaar is en aan de andere kant omdat het individuele
dier een relatief lage economische waarde heeft.
14
Tabel 1: Het verschil tussen necropsie en coprologisch onderzoek (2)
Uit tabel 1 kan je echter afleiden dat er een groot verschil is tussen de resultaten van een
necropsie en een coprologisch onderzoek. Dit zijn resultaten van een recente studie waaruit blijkt
dat een diagnose gesteld op basis van necropsie slechts in twintig procent van de gevallen
identiek is als de uitslag van corpologisch onderzoek bij hetzelfde dier. Opvallend is ook dat in
veertig procent van de gevallen er zelfs meer wormeieren worden aangetoond bij mestonderzoek
(2). Op basis van dergelijke resultaten kan natuurlijk de vraag rijzen of in de praktijk beide
methoden telkens moeten gecombineerd worden, of indien er een andere, consequent correctere
methode bestaat of kan uitgewerkt worden (1,2) (zie materiaal en methoden voor de manier van
het uitvoeren van een necropsie).
iii. Serologie
Momenteel wordt serologie niet gebruikt om infecties met Ascaridia galli te detecteren (6,18). Er
kan echter wel gesteld worden dat er vraag is naar dergelijke detectiemethoden. Bijvoorbeeld
omdat coprologie en necropsie niet altijd even nauwkeurige resultaten geven (2). Deze twee
methoden geven per definitie een minder genuanceerd beeld dan een serologisch profiel van een
stal. Daarnaast moeten er geen dieren geëuthanaseerd worden. In grote bedrijven of bij slechts
matig waardevolle dieren speelt dit weliswaar geen rol, maar specifiek bij moederdierbedrijven
kan dit een factor zijn die een belangrijke rol speelt (2,8). Ook wetenschappelijke studies kunnen
gebaat zijn bij het uitvoeren van een serologische test in plaats van de meer conventionele
methoden, bijvoorbeeld door met behulp van serologie verschillende opeenvolgende rondes op te
volgen en te vergelijken.
Een eerste stap in het ontwikkelen van een serodiagnostische test is het bepalen indien er al dan
niet een immuunrespons is tegenover Ascaridia galli bij kippen. Al in de jaren dertig werd er
vermoed dat gastheerfactoren mogelijks een invloed hadden op infecties met parasitaire
helminthen (21). Bij zoogdieren volgt er na een infectie met gastro-intestinale parasieten een T-cel
infiltratie in de mucosa na een stijging van de T-helper 2 cytokines (22). Een mogelijk probleem is
dat vogels over een ander immuunsysteem dan zoogdieren beschikken, zo hebben vogels een
15
Fig.5. IgG immuunrespons na artificiële
besmetting met Ascaridia galli (9)
extra orgaan, de Bursa van Fabricius, dat instaat voor de maturatie van B-cellen (23,24).
Onderzoek heeft echter uitgewezen dat er een vorm van resistentie optreedt tegenover Ascaridia
galli bij leghennen (25,26). Bovendien werd er ook vastgesteld dat deze weerstand sterk
gelijkaardig is aan de resistentie die bij zoogdieren tegen parasitaire helminthen optreedt (22,24).
Op basis van deze gegevens kan er vermoed worden dat het ontwikkelen van een diagnostisch
test om Ascaridia galli op te sporen moet mogelijk zijn.
Figuur 5 (9) geeft de resultaten van een
onderzoek uit Spanje weer. Voor dit onderzoek
werden vier legkippen besmet met
geëmbryoneerde Ascaridia galli eieren. Na
infectie werd de IgG-respons bij de dieren
wekelijks gedocumenteerd. Dit onderzoek werd
niet specifiek op hemoglobine antigenen
uitgevoerd, zoals de ELISA-test die in het kader
van deze masterproef gepland staat, maar toch
kan er verwacht worden dat de resultaten
gelijkaardig zullen zijn aan het resultaat van dit
onderzoek (9).
16
3. Doelstelling
Recent werd er door de universiteit van Gent een serologische test ontwikkeld om Ascaris suum
infecties bij varkens te detecteren (27,28). Met behulp van antigenen die zich in de volwassen worm
bevinden kan er een ELISA-test worden opgesteld om deze infectie bij varkens te detecteren
(27,28,29). Specifiek voor deze SERASCA®-test werden er antistoffen tegenover het hemoglobine
van de worm gedetecteerd (27,28). Door de grote gelijkenis tussen Ascaris suum bij varkens en
Ascaridia galli bij de kip kan er verwacht worden dat Ascaridia galli op een gelijkaardige manier
gedetecteerd zou kunnen worden. Een ander veelbelovend aspect voor het ontwikkelen van een
serologische test voor Ascaridia galli is dat onderzoek heeft uitgewezen dat het een relatief
homogene populatie op genetisch niveau betreft, in tegenstelling tot bijvoorbeeld bepaalde
bacteriële pathogenen (30). Met behulp van dergelijke test kan er een nauwkeuriger beeld
verkregen worden van de graad van wormbesmetting en het nut van het al dan niet ontwormen
van de dieren. Het doel van het uitvoeren van deze studie is dan ook het bepalen of diagnose op
serologisch niveau een realistische mogelijkheid is en indien ja, wat de grenswaarden van een
ELISA-test zouden zijn. Indien deze initiële testen een positief resultaat zouden geven, kan een
dergelijke test op de markt gebracht worden om de detectie van wormbesmetting in de praktijk te
uniformiseren en korter op de bal te kunnen spelen door bijvoorbeeld op regelmatige basis een
serologisch profiel van een bedrijf op te stellen.
Concreet is het doel van deze masterproef in de eerste plaats om de resultaten van een
serologische test vergelijken met de resultaten bekomen op necropsie en bij mestonderzoek.
Deze test is gebaseerd op de bestaande SERASCA®-test, die in het kader van deze masterproef
werd aangepast om deze geschikt te maken voor de detectie van Ascaridia galli bij pluimvee. Als
op basis hiervan interessante resultaten kunnen worden vastgesteld, kan seroconversie bij
artificieel geïnfecteerde dieren gemonitord worden. Indien de test succesvol is, kan deze
uiteindelijk gevalideerd worden en gebruikt worden in de praktijk en bij wetenschappelijk
onderzoek.
17
4. Materiaal en methoden
a. Algemeen
i. Coprologie
Coprologisch onderzoek op dierlijke uitwerpselen kan volgens vele methoden uitgevoerd worden.
Naargelang de gebruikte methode wordt er een kwantitatief of kwalitatief resultaat verkregen.
Kwalitatieve methoden geven je informatie over het al dan niet aanwezig zijn van wormeitjes in
de faeces. Het resultaat van een kwalitatieve methode geeft echter geen enkele indicatie over de
graad van besmetting. Wat wel kan beschouwd worden als een voordeel van een kwalitatieve
methode is dat de methoden veel gevoeliger zijn en dus lagere besmettingsgraden kunnen
detecteren. Aan de andere kant bestaan er ook kwantitatieve methoden. Hoewel deze methoden
iets minder gevoelig zijn, kan er een inschatting gemaakt worden van de specifieke graad van
wormbesmetting (2,6,8,31). Om in het kader van deze masterproef een link te kunnen leggen tussen
het serologisch profiel van de dieren en de graad van besmetting, werd er gekozen om voor de
bezochte bedrijven eerst een kwantitatieve test uit te voeren. Indien deze test negatief was, werd
hetzelfde meststaal nog eens gecontroleerd op een kwalitatieve manier.
De kwalitatieve methode die werd uitgevoerd is de McMaster methode. Deze methode is relatief
eenvoudig en wordt uitgevoerd op een gestandaardiseerde manier om de resultaten van het
onderzoek zoveel mogelijk herhaalbaar en vergelijkbaar te maken (6).
Er wordt eerst vier gram mest (+/- 0.1 gram) van het
te onderzoeken meststaal afgewogen en in een
beker geplaatst (fig. 6.A en 6.B.).
Fig. 6.B. Fig. 6.A.
18
Aan deze beker wordt er 60 ml flotatievloeistof (een
verzadigde zoutoplossing) toegevoegd. De inhoud
van de beker wordt goed gemengd, zodat het te
onderzoeken meststaal zoveel mogelijk in oplossing
gaat (fig 6.C. en 6.D.).
De bekomen vloeistof wordt drie maal gezeefd (fig
6.E.).
Dan volgt de cruciale stap voor de McMaster methode; de vloeistof wordt tien maal gemengd
(door deze in een andere beker over te gieten) om de eitjes te doen floteren. Hierna wordt er snel
een hoeveelheid van de vloeistof opgezogen met een pipet en in een telkamer (fig.7. (32))
gebracht die specifiek werd ontwikkeld voor de McMaster methode (fig.6.F., 6.G. en 6.H.).
Fig. 6.C. Fig. 6.D.
Fig. 6.E.
Fig. 6.F. Fig. 6.G. Fig. 6.H.
19
Deze laatste stap wordt tweemaal uitgevoerd opdat beide telkamers van het McMaster plaatje
gevuld zouden zijn. Het plaatje wordt na enkele minuten afgelezen onder een microscoop. De
wormeieren worden geteld, maar het is belangrijk om enkel de wormeieren te tellen die zich
binnen de gemarkeerde zones bevinden, dit is nodig om een correcte EPG (eieren per gram
faeces) te kunnen verkrijgen door middel van extrapolatie.
Wanneer het aantal getelde eieren wordt vermenigvuldigd met vijftig, bekom je de EPG van het
meststaal. Het getal 50 is bepaald op basis van de oppervlakte van het McMasterplaatje dat
wordt afgelezen, de hoeveelheid onderzochte mest en de hoeveelheid flotatievloeistof die werd
toegevoegd aan het staal (6,31).
Dit is het standaardprotocol voor een McMaster onderzoek en ook de manier waarop het in het
kader van deze masterproef werd uitgevoerd (6,18, 31).
Indien de McMaster test negatief was voor wormeieren relevant voor het onderzoek, werd er
nadien een kwalitatieve methode gebruikt. De bedoeling hiervan is om besmettingen die onder de
detectielimiet van de McMastermethode (dus onder 50 EPG) ook te kunnen detecteren (6,8).
Hiervoor werd er geen uitgebreide kwalitatieve methode zoals een sedimentatie-flotatie
uitgevoerd, maar werd de methode uitgevoerd op de reeds bekomen vloeistof van de McMaster
methode. Er werd een dekglaasje bovenop de vloeistof geplaatst. Dit dekglaasje werd na enkele
minuten op een draagglaasje geplaatst om eventueel aanwezige wormeieren te vinden. De
gedachte achter deze methode is dat de wormeitjes in de gemaakte vloeistof zouden moeten
floteren en aan het dekglaasje zouden moeten blijven kleven (6,18,31).
Een aandachtspunt bij het uitvoeren van het mestonderzoek is de detectie van de correcte eitjes.
Zo zijn bijvoorbeeld eitjes van Raillietina sp. of Capillaria sp. goed onderscheidbaar zijn van de
eitjes van Ascaridia galli maar kan hetzelfde niet gezegd worden voer de eitjes van Ascaridia galli
en Heterakis gallinarum (zie figuur 8) (1,2,6,7,13,18).
Fig.7. McMaster telkamer (32)
20
Fig.8. Differentiatie van verschillende nematodeneitjes bij pluimvee. C: Heterakis gallinarum D: Ascaridia galli, F: Capillaria spp. (7)
Fig.9. Ascaridia galli eitje onder de microscoop (eigen foto)
Op figuur 9 en 10 kan er gezien worden dat de eitjes van Ascardia galli iets ellipsvormiger zijn
dan de meer ovale Heterakis gallinarum eitjes (1,3,6). In de praktijk is dit verschil echter niet altijd
zo duidelijk en natuurlijk ook
subjectief. Op de resultaten van
een necropsie kan er beter
worden afgegaan om de
wormsoort te bepalen, maar er is
natuurlijk (zie hoger) veel verschil
in detectie van wormen tussen
necropsie en mestonderzoek (2,3).
De meest objectieve methode om
beide wormeieren van elkaar te
differentiëren blijkt het meten van
de wormeitjes (6,12,13,14). Specifiek
voor dit onderzoek werd er op de
manier die hierboven staat
beschreven een extra
flotatieonderzoek uitgevoerd. Bij
dit kwalitatief onderzoek was het mogelijk om de lengte en breedte van de wormeieren te
bepalen. De afmetingen zijn namelijk niet eenduidig te bepalen bij een normaal McMaster
onderzoek (6,8). De wormeitjes van beide nematoden zijn verschillend qua lengte en breedte,
maar het verschil is vrij subtiel (zie hoger), daarom is het belangrijk dat men nauwgezet tewerk
gaat bij het bepalen van de dimensies van de eitjes.
21
Fig.10.A. en B.: Vergelijking van wormeitjes in detail A.= Ascaridia galli B.= Heterakis gallinarum (3)
ii. Bloedname
Bloed bij de kip kan op verschillende manieren en op verschillende
plaatsen genomen worden. In de praktijk wordt er meestal bloed
genomen in de vleugel, hiervoor gebruikt men de vena basilica.
Deze loopt aan de ventrale zijde van de vleugel en is duidelijk,
eventueel na het plukken van enkele veren (39). Gedurende de
veldstudie werd het bloed genomen door met een incisiemesje
een snede in deze vene te maken. Omdat deze methode niet echt
duurzaam is en er voor de experimentele studie vele malen bloed
genomen moest worden, werd er tijdens het experiment voor
gekozen om met behulp van een injectienaald bloed te nemen. Dit
is weliswaar technisch een iets moeilijkere methode, maar met wat
ervaring toch goed uitvoerbaar.
Naast deze, zijn er bij de kip nog twee venen waar vlot bloed kan bekomen worden. Enerzijds de
vena jugularis externa dextra (39). De rechtervene in de hals wordt verkozen boven de linkervene
omdat deze groter is en omdat er links structuren lopen, zoals de vagus-zenuw (39). Anderzijds
kan er ook uit de vena metatarsalis plantaris superficiales bloed genomen worden. Deze loopt
oppervlakkig aan de mediale kant van de poot van de kip (39). Bij duiven is deze laatste de
standaardplaats om bloed te nemen (39).
Fig.10.A. Fig.10.B.
Fig.11. Bloedname uit de
vena basilica (eigen foto)
22
iii. Necropsie
Aangezien het volledig bespreken van de manier waarop men een necropsie bij pluimvee kan
uitvoeren buiten het kader van deze masterproef valt, zal hieronder enkel dieper ingegaan
worden op de details met betrekking tot het diagnosticeren van worminfecties bij kippen.
Protocollen die alle aspecten van een necropsie verduidelijken kunnen gemakkelijk in
handboeken terug gevonden worden (6,13,18,19).
Hierboven (figuur 12) zie je beelden van zware infectie met respectievelijk Ascaridia galli (links)
en H. gallinarum (rechts) (3). Het dier dient meestal eerst nog geëuthanaseerd te worden. Er zijn
verschillende methoden waarop dit kan gebeuren, zoals een chemische vorm van euthanasie.
Voorbeelden hiervan zijn euthanasie door middel van CO2, toediening van een volatiel
anestheticum of intraveneuze toediening van barbituraten (19). Zeker voor deze laatste methode is
er echter wel een zekere vorm van expertise nodig (6,18). Elk van deze methoden dient gevolgd te
worden door exsanguinatie opdat de rest van de autopsie vlot zou kunnen worden uitgevoerd (19).
Een andere methode, die in de praktijk vaker gebruikt wordt, is een fysische vorm van
euthanasie, namelijk de cervicale dislocatie. Deze is in Europa ook toegelaten als
euthanasiemethode voor kippen en wordt in België heel frequent gehanteerd (33,34). Een voordeel
van deze methode is dat er geen exsanguinatie meer nodig is na het uitvoeren van de dislocatie.
Er doet zich cervicaal namelijk een bloeduitstorting voor; de autopsie kan onmiddellijk begonnen
worden.
Om uiteindelijk tot een diagnose van een worminfectie te kunnen komen, wordt de buikholte
geopend net onder de carina met een schaar of een scalpel. De carina van de borst wordt
omhoog geklapt en het darmpakket kan er in zijn volledigheid worden uitgehaald (6,19). Indien je
Heterakis gallinarum wilt diagnosticeren zul je je moeten focusen op het onderzoek van de
caecuminhoud (1). Deze worm is het vlotst detecteerbaar als de cecumtop wordt afgesneden met
een schaar of scalpel. Hierna kun je de caecale inhoud, samen met de eventuele aanwezige
Fig.12.B.
Fig.12.A. en B.: Wormen op autopsie A.= Ascaridia galli B.= Heterakis gallinarum (3)
Fig.12.A.
23
nematoden doorheen de nieuwgemaakte opening naar buiten duwen (19). Ascaridia galli kan niet
op een dergelijke manier gediagnosticeerd worden tengevolge van zijn andere lokalisatie. Deze
worm vind je in het craniale deel van het duodenum (6,13). Voor de diagnose van deze worm zal
de dunne darm over de ganse lengte moeten worden ingesneden (19). Dit is het vlotst uitvoerbaar
door de darm over je hand op te spannen en stuk voor stuk in te snijden.
Op figuur 13 zie je een praktisch voorbeeld van het uitvoeren van een necropsie, op de manier
waarop ze werd uitgevoerd om de resultaten van deze masterproef te verkrijgen. Dit zijn foto’s
genomen eind augustus 2015 tijdens een bedrijfsbezoek in het kader van de veldstudie van deze
masterproef. Ze werd uitgevoerd door een pluimveedierenarts van de dierenartsenpraktijk
“Degudap”. De autopsie werd uitgevoerd op recent geëuthanaseerde dieren om te bepalen indien
er al dan niet behandeld diende te worden. Er werden tientallen wormen per dier aangetroffen,
dus werd er een behandeling in het drinkwater met Flubenol® opgestart (35).
24
Fig.13.A. Fig.13.B.
Fig.13.E. Fig.13.F.
Fig.13.C. Fig.13.D.
Fig.13. A. tot en met F.: visuele beschrijving van een autopsie (eigen foto’s)
Fig.13.A.: De kip wordt onder het borstbeen geopend, waarna het borstbeen naar boven wordt geklapt Fig.13.B.: Het darmpakket wordt uit het dier verwijderd Fig.13.C. en D.: De darm wordt op de hand gelegd om deze vlot te kunnen opnemen Fig.13.E. en F.: Bij een dier besmet met Ascaridia galli kunnen de wormen vlot visueel teruggevonden worden
25
b. Serologie
Er bestaat nog geen ELISA (Enzyme-linked immuno sorbent assay)-test voor de detectie van
Ascaridia galli, daarom werd de recent ontwikkelde test voor de detectie van Ascaris suum (27)
door de dienst parasitologie van de faculteit diergeneeskunde van de Ugent te Merelbeke
aangepast om mogelijks te kunnen dienen voor de detectie van Ascaridia galli (27,36).
i. Principe ELISA
De ELISA die gebruikt werd voor de onderzoeken in het kader van deze masterproef werkt
volgens het principe van een indirecte ELISA. Op figuur 12 (37) staat het algemene principe van
een indirecte ELISA weergegeven. De ELISA-plaat wordt in de eerste plaats gecoat met
hemoglobine antigenen van de worm. Deze antigenen zijn in het geval van deze test
hemoglobine antigenen uit de pseudocoeloomholte van de L4 larve van een Ascaris suum worm
(27). Na het spoelen van de plaat worden de rest van de plaatsen beschikbaar voor de antistoffen
geblockt. Daarna wordt het serum van de kippen toegevoegd aan de plaat. Uiteindelijk wordt er
nog een conjugaat (dit conjugaat bestaat uit anti-antistoffen van konijnen) toegevoegd, dat later
kan worden aangekleurd opdat de ELISA zou kunnen worden afgelezen.
ii. Voorbereiding bloed
Het succesvol uitvoeren van een ELISA begint met het correct behandelen van het bloed gebruikt
in de test. Zo snel mogelijk na de bloedname moet het bloed gekoeld worden. Voor de ELISA
wordt er serum gebruikt, het bloed moet met andere woorden eerst gecentrifugeerd worden. Dit
Fig.12. basisschema van een indirecte ELISA (37)
26
gebeurt in een centrifuge aan 4000 RCF (relatieve centrifugale kracht (38)) gedurende 10 minuten.
Hierna wordt het serum gescheiden van de rest van het bloed met behulp van een pipet. Eens
het serum is afgezonderd, kan het ingevroren worden en eventueel later onderzocht worden.
iii. Uitvoeren ELISA
De ELISA-plaat werd eerst voorbereid: ze werd gecoat met hemoglobine antigen. De
hemoglobine antigenen van de worm werden aan een concentratie van 1µg/ml toegevoegd aan
de plaat, hiervoor werd carbonate coatbuffer gebruikt. Hierna wordt er 12u geïncubeerd bij 4°C,
waarna de rest van de plaat geblockt werd met een 5% oplossing melkpoeder gedurende twee
uur, aan 4 graden Celcius. Hierna werd de plaat gespoeld, daarna is de plaat klaar om het serum
van de dieren aan te brengen.
Het serum werd aan een concentratie van 1/50 toegevoegd aan ieder welletje op de ELISA-plaat.
Om dit getal te bereiken, werd het serum eerst aan een dosis van 20 µl toegevoegd aan een
(niet-gecoate!) plaat. Hierbij werd er 80 µl PBST-buffer toegevoegd. Op de gecoate platen werd
er dan 10 µl van deze verdunning en 90 µl PBST-buffer aangebracht. Het eindresultaat is dus dat
er 2 µl serum en 98 µl PBST per welletje in een gecoate plaat zit. Op dit punt van de test moet er
rekening gehouden dat er per plaat ook een positieve en negatieve controle aanwezig moet zijn
(36). Na deze stap wordt de ELISA-plaat gedurende twee uur in de koelkast gestoken.
De gekoelde platen worden hierna gewassen, daarna wordt conjugaat toegevoegd aan de
gewassen platen. Het conjugaat wordt voorbereid aan een concentratie van 1/30 000. Hiervoor
wordt er eerst 5% melkpoeder opgelost in PBS. Aan deze oplossing wordt er 1/30 000 van anti-
kippen antistof toegevoegd. Aan een oplossing van 40 ml, wordt er dus 1,33µl anti antistof
toegevoegd. Nadat van dit conjugaat 100 µl per welletje wordt toegevoegd, wordt de plaat
gedurende 1 uur in een incubator aan 37 graden Celcius geplaatst. Na deze stap wordt de plaat
opnieuw gewassen.
De laatste stap in het proces is het kleuren van de plaat. Hiervoor worden OPD tabletten opgelost
in citroenzuur-buffer en peroxide. Per welletje wordt er 100µl van deze oplossing ingebracht. De
platen worden gedurende 10 minuten in het donker geplaatst, opdat de kleurreactie succesvol
zou kunnen verlopen. Na deze tien minuten worden de platen uit het donker gehaald en wordt er
50 µl stopvloeistof aan ieder welletje toegevoegd. Deze vloeistof wordt toegevoegd opdat de
kleurreactie zou stoppen. Na deze stap zijn de platen klaar om afgelezen te worden door een
chromatograaf bij een golflengte van 492 nm.
27
c. Ascaridia galli cultuur
De infectievloeistof gebruikt voor de experimentele infectie werd in het coprologisch laboratorium
van de faculteit diergeneeskunde in Merelbeke ontwikkeld. Eerst werden adulte Ascaridia galli
wormen geoogst uit recent overleden of geëuthanaseerde legkippen. Deze wormen werden
versneden in zo klein mogelijke stukken. Deze stukken werden in kaliumbichromaat ingebracht.
De vloeistof werd nadien geïncubeerd bij 25 graden opdat de eitjes zouden kunnen embryoneren.
Druppels van deze vloeistof kunnen microscopisch gecontroleerd worden om te bepalen indien er
wormeieren aanwezig zijn en als deze aanwezig zijn, hoeveel er in de vloeistof zitten. Dit laatste
kan dan worden gebruikt om een verdunning te maken met een specifiek getal wormeieren per
ml vloeistof. Dit kan dan op zijn beurt worden gebruikt om nauwgezet de kippen in een
experimentele proef te infecteren.
Fig.14.C.
Figuur 14. A tem C.: visuele voorstelling van het maken van de gebruikte infectievloeistof (eigen foto’s)
Fig.14.a.: De volwassen wormen uit de darm van de kip worden op een petrisschaaltje geplaatst en worden versneden met een scalpel. Fig.14.B.: Eens de wormen klein genoeg gemaakt zijn, wordt er kaliumbichromaat aan het petrischaaltje toegevoegd. Fig.14.C.: De restanten van de wormen worden in een fles gebracht en er wordt aangelengd met kaliumbichromaat. Deze fles wordt daarna bij een geschikte temperatuur bewaard.
Fig.14.A. Fig.14.B
.
28
Op onderstaande figuur (figuur 15.) worden de verschillende ontwikkelingsstadia van een
Ascaridia galli ei weergegeven. De infectieuze eitjes staan rechts onderaan, het zijn deze eitjes
die gezocht werden om de infectiedosis van de artificieel gemaakte vloeistof te bepalen.
Fig. 15. Verschillende stappen in het embryoneren van Ascaridia galli eitjes (van linksboven naar
rechtsonder in oplopende leeftijd) (42)
29
5. Resultaten
a. Veldstudie
Voor de veldstudies werd er samengewerkt met de dierenartsenpraktijk Degudap. Er werden
negatieve bedrijven uitgekozen op basis van de huisvesting en leeftijd. Indien de praktijk een
positief bedrijf ontdekte (typisch werd dit vastgesteld op necropsie na vraag van de
pluimveehouder), werd er contact opgenomen om een bloedname op dit bedrijf in te plannen. Bij
enkele van deze bedrijven werden de stalen voor het ontwormen genomen, bij andere werden ze
na het ontwormen genomen.
Bij het selecteren van negatieve bedrijven werd er vooral gezocht naar opfokbedrijven of
bedrijven waar de leghennen in verrijkte kooien zaten. In de praktijk ziet men namelijk in
dergelijke bedrijven amper of nooit wormproblemen. Aangezien de dieren vrijwel geen contact
hebben met de mest van andere dieren in een dergelijk systeem kan een worminfectie zich maar
heel moeilijk klinisch manifesteren of verspreiden in de stal.
Bij zowel de positieve als negatieve bedrijven werden er willekeurig dieren uitgekozen in de stal.
Indien er dieren in de stal zaten die er visueel ziek uitzagen, werden een deel van de staalnames
op deze dieren uitgevoerd. De bedrijven werden door de dierenarts uitgekozen en waren vrij
divers, zowel qua leeftijd (er waren zowel opfokbedrijven, als bedrijven waarvan de dieren in de
rui zaten) als qua soort dieren (volwassen leghennen, moederdieren en opfokdieren). Wat betreft
huisvesting was er eveneens wat variatie tussen de bedrijven. Zo zijn er stalen genomen van
leghennen in batterijkooien, volièrestallen, grondstallen en zelfs uit enkele bio-stallen.
Voor het nemen van de meststalen werd bij de verrijkte kooien de mestband enkele meters
afgedraaid en zo vers mogelijke mest gekozen. In de andere types van huisvesting werd de mest
van de grond verzameld, er werd aandacht aan besteed om mest te nemen die zo vers mogelijk
is.
In tabel 2 zijn de resultaten van de bedrijfsbezoeken weergegeven. Er waren 6 bedrijven waar de
dieren nog steeds in de opfok zaten, de helft hiervan was gehuisvest in een opfok-batterij stal, de
andere helft in een opfok-volière stal. Qua leeftijd waren de andere bedrijven vrij divers. Twee
bedrijven zaten in de rui, terwijl één bedrijf een twintigtal weken geleden al geruid was. Dit laatste
bedrijf was het enige bedrijf waar er dieren van een vleesras (zware moederdieren) werden
bemonsterd.
Zeven van de bezochte bedrijven waren bedrijven met dieren in (verrijkte) batterijen. Vier
bedrijven hadden dieren in grondstallen en tien bedrijven hadden volièrestallen. In totaal waren er
30
ook drie bio-bedrijven en drie bedrijven waar de dieren buitenbeloop hadden. Dit waren niet
alledrie dezelfde bedrijven aangezien één van de bio-bedrijven een opfokbedrijf was waarvan de
dieren nog enkele weken te jong waren om al toegang tot buitenbeloop te krijgen.
Verschillende bedrijven waren al gediagnosticeerd met Ascaridia galli voordat het bedrijfsbezoek
werd uitgevoerd. Meestal werd de diagnose gesteld op basis van necropsie, in enkele gevallen in
combinatie met mestonderzoek. Op zeven van deze bedrijven werd er al een behandeling
ingesteld, de meeste van deze behandelingen waren minder dan één week geleden begonnen.
Eén van de behandelingen werd echter al drie weken geleden uitgevoerd (bedrijf 5).
Na de bedrijfsbezoeken werd er in het labo parasitologie mestonderzoek uitgevoerd voor alle
bedrijven. Zes van de bedrijven werden daar positief bevonden op Ascaridia galli of Heterakis
gallinarum. Meestal betrof het maar een matige infectie, maar één bedrijf had een EPG van 9300.
31
Tabel 2. Resultaten van de bedrijfsbezoeken.
32
Fig. 16. Individuele ELISA-resultaten, uitgezet per bedrijf. Het kruis per bedrijf is de
gemiddelde ELISA-waarde op het bedrijf. De pijlen (zie kleurcode) geven extra informatie over
het bedrijf weer.
b. Analyses veldstudie
In dit onderdeel zullen de data van de bedrijfsbezoeken geanalyseerd worden. Een opmerking
die dient gemaakt te worden is dat de gebruikte ELISA-test nog niet gevalideerd is. De eerste
resultaten zijn zeker veelbelovend, maar er zijn nog veel zaken met betrekking tot deze test die
verder moeten onderzocht worden, vooraleer er werkelijk significante correlaties en verschillen op
basis van deze test kunnen worden beschouwd.
33
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000 10000
Op figuur 16 zijn alle ELISA-waarden van de bedrijfsbezoeken weergegeven. De volgorde van de
bedrijven is dezelfde volgorde die in tabel 2 wordt aangegeven. Aan de rechterkant van de figuur
zijn 6 opfokbedrijven weergegeven. De eerste drie opfokbedrijven zijn opfok batterij bedrijven, de
andere drie zijn grondstal opfok bedrijven. Het is duidelijk dat deze waarden over het algemeen
lager liggen dan op de bedrijven met volwassen leghennen. Er kan wel gezien worden dat de
opfokbedrijven waar de dieren in grondstallen worden gehuisvest, over het algemeen al een iets
hogere waarde hebben. Bij het uitvoeren van een T-test (tussen opfokdieren in batterijen en
opfokdieren gehuisvest in andere stallen) in het programma “Prism”, werd dit verschil als
significant (p<0.0001) beschouwd. Hierbij moet de opmerking uit het begin van dit hoofdstuk
echter herhaald worden: het gaat hier om een niet gevalideerde ELISA-test, dus deze resultaten
moeten op een voorzichtige manier geïnterpreteerd worden.
Een opmerking is dat bedrijf 4,6,10,13,14 en 15 kort voor het bezoek behandeld werden. Het is
dus logisch dat specifiek deze bedrijven een negatief resultaat tonen op het mestonderzoek (twee
van die bedrijven: 10 en 13, waren wel nog positief op mestonderzoek). De bedrijven zijn
gerangschikt op stijgende gemiddelde ELISA-waarde. Wat opvalt is dat er verschillende bedrijven
zijn met een verhoogde ELISA-waarde, die negatief zijn op het mestonderzoek.
Fig. 17. gemiddelde ELISA-waarden, uitgezet ten opzichte van de gemiddelde EPG-waarde (x-as)
van het bedrijf. Het nummer bij de individuele waarden, komt overeen met het bedrijfsnummer
weergegeven in tabel 2
EPG
ELISA
8
15
11, 10
14
7,8,9
13, 12
6,,21,20,5,
19,4,3,2,1
18,17
16
34
Fig.18.A.:Gemiddelde Optische Densiteit op ELISA bij vier huisvestingssystemen
Fig.18.B.: Link gemiddelde optische densiteit op ELISA met de leeftijd
Op figuur 17 kunnen de ELISA-waarden gezien worden ten opzichte van de gemiddelde EPG-
waarden op de bedrijven. De trend is dat de gemiddelde ELISA-waarden hoger zijn indien het
uitgevoerde mestonderzoek positief was. Wat echter heel belangrijk is om op te merken, is dat er
enorm veel bedrijven zijn die hoge ELISA-waarden hebben, maar op bedrijfsniveau als negatief
kunnen worden beschouwd op basis van het mestonderzoek. De waarden in het bloed zijn (op
basis van deze gegevens en de individuele data) zijn bij vrijwel alle dieren verhoogd indien er een
wormbesmetting in de stal is of heeft plaatsgevonden.
Er werden ook enkele tests uitgevoerd om te bepalen of de verschillen die op basis van de
voorgaande tabellen en figuren kunnen worden vastgesteld significant zijn of niet. Er werd
vastgesteld dat er veel significante correlaties kunnen worden gevonden: Zo zijn huisvestingstype
en mestonderzoek gecorreleerd aan elkaar (dieren in batterijen hebben een significant hoger
gehalte aan negatieve mestonderzoeken P<0.05). De link tussen ELISA-waarden en huisvesting
of ELISA-waarden en leeftijd was in beide gevallen nog veel sterker aan elkaar gecorreleerd
(P<0.01): de dieren in batterijen hadden lagere ELISA-waarden en oudere dieren hadden hogere
waarden. Op dit punt kan er echter niet dieper ingegaan worden op deze correlaties, aangezien
de ELISA-test nog niet gevalideerd is, kan er officieel namelijk nog geen waarde aan deze
resultaten gehecht worden. Het is natuurlijk wel duidelijk dat deze resultaten een positief teken
zijn voor het verder ontwikkelen van de test.
Deze twee figuren tonen nogmaals aan dat de gebruikte test heel veelbelovend is: er kan een
link worden vastgesteld tussen de waarden bekomen bij de serologische test en de huisvesting of
de leeftijd van de dieren. Om de redenen hierboven aangehaald met betrekking tot de
betrouwbaarheid van de resultaten van een niet gevalideerde test zal er echter niet verder op
deze verbanden worden ingegaan.
Fig.18.A. Fig.18.B.
leeftijd
EL
ISA
35
Tabel 3. Resultaten van de experimentele infecties, euthanasie tijdstip is gemeten in dagen na
infectie
b. Experimentele infectie
Vooraleer een infectieproef kan worden uitgevoerd, moeten er eerst enkele tests uitgevoerd
worden om de gewenste infectiedosis te bepalen.
De eerste maal werden er twee dieren geselecteerd die ongeveer 20 weken oud waren. Deze
legkippen werden éénmalig met 250 wormeieren geïnfecteerd. Na 53 dagen werden deze dieren
geëuthanaseerd. Beide dieren hadden een negatief mestonderzoek (McMaster), maar beiden
hadden één volwassen worm aanwezig in de darm.
Om nog meer informatie te verkrijgen, werd er beslist om een maand nadien nog 3 dieren te
infecteren. Dit waren drie leghennen van zo’n 18 weken oud, wel dient opgemerkt te worden dat
één van de dieren Heterakis positief was voor de kip geïnfecteerd werd (De EPG van dit dier was
onder 50 eitjes per gram mest, maar er werd een eitje gedetecteerd bij kwalitatief onderzoek).
Twee dieren werden eenmalig geïnfecteerd met 2000 wormeitjes en één dier werd geïnfecteerd
met 1000 wormeitjes. De drie dieren werden geëuthanaseerd na 45 dagen. Bij de kip die
geïnfecteerd werd met 1000 eitjes, werden 3 volwassen wormen in de darm aangetroffen. Van de
dieren die geïnfecteerd werden met 2000 eitjes werden bij de ene 7 volwassen wormen
aangetroffen in de darm. De andere kip had een dunne darm die bevolkt werd door 17 volwassen
wormen.
Met behulp van deze informatie is er een basis gelegd om op een later tijdstip over te gaan tot
een uitgebreide infectieproef. Want hoewel de eerste resultaten van zowel de bedrijfsbezoeken,
als de resultaten van deze kleinschalige infectieproef, positief lijken. Dient de test eerst
gevalideerd te worden, mede door het uitvoeren van uitgebreide, gecontroleerde infectieproeven,
voor er verder kan gewerkt worden met de serologische diagnose van Ascaridia galli in de
praktijk.
Met het oog op de verdere ontwikkelling van een serologisch diagnostische test voor de praktijk is
de volgende stap het bepalen van de grenswaarden van de test; d.i. vanaf wanneer kunnen we
36
dieren als geïnfecteerd beschouwen en/of moeten we het ontwormingsschema aanpassen. De
realiteit is dat er geen duidelijke grenswaarde kan worden bepaald op basis van slechts 21
bedrijfsbezoeken. Wat wel al kan gedaan worden is een algemene richting geven aan de te
verwachten grenswaarden op basis van de verkregen serologische resultaten.
37
6. Discussie
a. Grenswaarde
Hoewel in theorie deze test op het individuele dier kan gebruikt worden, zal er in het volgende
deel worden gefocust op een groepsdiagnose van wormproblemen, wat de gedachtegang is
waarmee dit onderzoek werd opgestart.
In het hoge spectrum zijn er vier bedrijven die serologische waarden boven 1 hebben. Dit zijn
hoogpositieve bedrijven: twee ervan waren positief bij coprologisch onderzoek, de andere twee
waren bij het moment van staalname al in behandeling voor Ascaridia galli. Er zijn echter ook
heel wat bedrijven die we als positief beschouwen, die een ELISA-waarde onder 1 tonen. Als we
de bedrijven opzoeken die positief zijn bij mestonderzoek of coprologisch onderzoek vinden we
dat deze allemaal, op één na (zie ii. Antistofpersistentie) een ELISA-waarde boven 0.75 hebben.
Wat betreft waarden onder 0.5, zijn er slechts drie bedrijven die in deze categorie vallen. Deze
drie bedrijven zijn opfok-batterij stallen. Vier batterijen met volwassen leghennen toonden
waarden tussen 0.51 en 0.62. De laagste waarde kwam van de jongste dieren, terwijl de hogere
waarden van dieren ouder dan 67 weken
afkomstig waren. In een batterij wordt niet
(routinematig) ontwormd, omdat klinische
wormproblemen er vrijwel onbestaande zijn.
De resultaten van onze bedrijfsbezoeken
wijzen er dus op dat er toch een zeker vorm
van immuunontwikkeling tegenover Ascaridia
galli optreedt in batterijen. Dit zou enerzijds
kunnen wijzen op een leeftijdsgebonden
vorm van resistentie. Op figuur 19 (40) staat
beschreven dat bij inoculatie van éénzelfde
dosis wormen op vier verschillende leeftijden
er bij de oudere groep (24 weken leeftijd)
minder volwassen wormen konden worden teruggevonden dan bij inoculatie op 12 of 18 weken
leeftijd (40). Dit onderzoek beschreef echter niet of een verdere daling bij latere leeftijd kan worden
gezien, noch of deze vorm van resistentie gepaard gaat met een stijging van de antistoftiters in
het bloed. Naast een dergelijke vorm van resistentie moet er eveneens rekening mee gehouden
worden dat het mogelijk is dat er toch een zekere prevalentie van wormen is in de batterijen. Het
is mogelijk dat deze worminfectie zich door zaken als pikgedrag naar de mestband weliswaar in
stand kan houden, maar de besmettingsgraad nooit tot klinisch relevante niveaus kan stijgen.
Fig.19. Effect van de immuniteit bij
leghennen van verschillende leeftijden op
een Ascaridia galli infectie (40)
38
Ten slotte werden ook drie “jumpstart” (opfok volière) stallen bezocht. Deze drie stallen
vertoonden waarden tussen 0.61 en 0.65. Dit zijn waarden die iets hoger liggen dan de waarden
die konden teruggevonden worden bij de dieren in batterijen. Het is niet uitgesloten dat er al op
jonge leeftijd een worminfectie kan beginnen zich te manifesteren. Klinische problemen in
opfokstallen zijn in de praktijk niet frequent voorkomend, maar dit kan te wijten zijn aan een
relatief lagere besmettingsgraad ten opzichte van de besmetting mogelijk bij oudere dieren.
39
b. antistofpersistentie
De SERASCA® test wordt vooral gebruikt om op het einde van de afmestfase bij varkens de
uitgevoerde ontworming te beoordelen (41). De vraag bij de test voor kippen is echter of dit
eveneens het belangrijkste aspect zal zijn, of indien de antistoffen op verschillende punten in de
legcyclus kunnen worden gebruikt om de stal tijdens de ronde bij te sturen en vooral in welke
mate de opgebouwde antistoffen tegenover Ascaridia galli persisteren.
De resultaten van bedrijf 4 spelen op dit punt in: op dit bedrijf werd iets meer dan 3 weken voor
de staalname wormen ontdekt bij necropsie en onmiddellijk gestart met ontwormen. De
ontworming gebeurde met wateroplosbare flubendazole gedurende 1 week. De waarde die werd
bekomen met de ELISA test is gemiddeld 0.6, met slechts vier dieren met een individuele waarde
boven 0.7.
Men zou hieruit kunnen afleiden dat de dieren relatief minder reageren op de test indien er geen
(volwassen) wormen aanwezig zijn. Op dit punt is een dergelijke conclusie echter nog te ver
gegrepen. In de wetenschappelijke literatuur zijn er amper artikels terug te vinden waar de
immuniteit van kippen wordt besproken, laat staan de immuniteit tegen parasitaire infecties zoals
Ascaridia galli. Eén van de weinige bronnen die iets vertelt over het verloop van detecteerbare
antistoffentiters gin uit van de volgende proefopzet (24) : Elf commercieel ingeteelde lijnen werden
eenmalig gevaccineerd tegen vier virussen. Tot en met vijf weken na infectie werden iedere week
dieren gechallenged met virus en werd de optische densiteit van de antistoffen in het bloed met
een ELISA bepaald (24). Het algemeen beeld is dat de antistoffen snel stijgen in het begin, maar
na vijf weken niet meer stijgen of zelfs wat afzwakken. Nog iets dat deze studie toont is dat de
respons echter sterk verschilt per pathogeen, het is met andere woorden nog niet duidelijk op
welke manier dit zou kunnen geëxtrapoleerd worden naar andere infecties, zoals Ascaridia galli.
Wat eveneens in de literatuur kan worden teruggevonden is dat de halfwaardetijd van het kippen-
IgG 3.3 ±0.7 dagen bedraagt (24). Het is echter niet geweten hoe deze halfwaardetijd verandert in
de loop van het leven bij de dieren (dit getal werd vastgesteld bij dieren jonger dan 2 maanden).
Daarnaast is er over antistofgedrag specifiek bij parasitaire infecties bij pluimvee nog niet veel
geweten.
Hoewel de resultaten van dit ene bedrijf zeker vragen oproepen, is het moeilijk om op deze
manier totaal verschillende bedrijven te vergelijken, een uitzondering op de regel kan in een
dergelijk geval puur toeval zijn. Om definitief te weten indien en op welke termijn de antistoffen
significant dalen na behandeling moeten er gerichte infectieproeven uitgevoerd worden. Deze en
andere proeven zullen de dierenartsen en onderzoekers inzicht kunnen verschaffen over het feit
of een test zoals deze enkel kan worden gebruikt om op het einde van de stalronde de
40
ontworming te beoordelen, of indien ze ook meerdere malen tijdens de ronde zou kunnen
gebruikt worden.
Er moet echter ook op een realistische manier omgesprongen worden met de gegevens uit de
praktijk. In de praktijk wordt er namelijk enkel ontwormd bij problemen: er wordt niets gedaan aan
de besmetting van de omgeving. De realiteit is dat op de meeste praktijkbedrijven er niets kan
worden gedaan aan de omgevingsbesmetting tijdens een ronde. Daardoor is de meest
realistische gedachtengang dat, aangezien de omgevingsbesmetting niet naar beneden kan
gehaald worden, de serologische waarden niet (of slechts in beperkte mate, bij herhaaldelijke
behandeling) duidelijk zullen dalen.
41
c. Relevantie en toekomst
Het zijn natuurlijk niet meer dan initiële tests, maar toch kan het onderzoek in het kader van deze
masterproef een goede aanzet zijn tot de verdere ontwikkeling van een serodiagnostische test
voor Ascaridia galli bij pluimvee. De resultaten die we hebben verzameld wijzen erop dat het in
ieder geval mogelijk is om besmettingen op te sporen met een methode gebaseerd op de
SERASCA® test bij varkens. Het verschil dat wordt opgemerkt tussen de verschillende types
huisvesting en leeftijden van dieren stemt overeen met de zaken die in de praktijk vaak worden
ondervonden, doch zullen deze resultaten en onderzoeken later moeten herhaald worden, met
een test die beter op punt gesteld is.
De volgende stap is het uitvoeren van gecontroleerde infectieproeven, waarbij de belangrijkste
aandachtspunten het gebruik van naïeve dieren en een correcte infectieuze dosis is. Op basis
van deze testen zal duidelijk worden wanneer seroconversie plaatsvindt en kunnen de
antistoffentiters bij benadering gelinkt worden aan specifieke graden van besmetting. Met behulp
van deze tests en extra bedrijfsbezoeken kan er dan ook een specifieke grenswaarde voor de
serologische test bepaald worden.
Een extra punt waar kan worden op gewerkt is de kruisimmuniteit met Heterakis gallinarum. Er
wordt verwacht dat Heterakis gallinarum, net als Ascaridia galli, detecteerbaar is met deze test. In
de bedrijfsbezoeken die werden uitgevoerd werd niet dieper ingegaan op het verschil tussen
deze twee nematoden, er zijn met andere woorden specifieke, gerichte tests nodig om het
verband tussen Heterakis gallinarum en de gebruikte serologische test aan te tonen. Enkele
bedrijven die waren geïnfecteerd met Heterakis hadden een hogere serologische waarde, dus
een verband kan hier verwacht worden.
Uit de praktijk kwam de vraag of een dergelijke test meerdere malen per ronde bruikbaar zou zijn,
met andere woorden of de antistoffentiters bij correcte ontworming weer naar beneden zouden
gaan. Eén bedrijf dat hierboven werd beschreven zou kunnen laten denken dat dit inderdaad het
geval is, maar de realiteit is dat door de blijvende besmetting in de stallen het onwaarschijnlijk is
dat deze titers duidelijk zouden dalen. Verder onderzoek kan hiernaar uitgevoerd worden, maar is
eerder van secundair belang. Een proefopzet die hiervoor kan worden gebruikt is geïnfecteerde
dieren die gedurende een langere periode worden ontwormd en waarvan de serologische
waarden van het bloed wekelijks worden opgevolgd. Een concreet voorbeeld van een
infectieproef zou kunnen zijn dat er een vijftigtal dieren worden onderverdeeld in verschillende
groepen, waarbij aan iedere groep een bepaalde infectiedosis wordt toegewezen. Deze dieren
kunnen dan gedurende bijvoorbeeld acht weken serologisch opgevolgd worden, waarna de helft
kan geslacht worden met het oog om levende wormen in het dier te koppelen aan de bekomen
serologische waarden. De andere helft kan dan gedurende nog eens acht weken gevolgd
42
worden, waarbij er een ontwormingsschema wordt gevolgd die het ontwikkelen van Ascaridi galli
volledig verhinderd. De serologische opvolging van deze dieren kan dan op zijn beurt informatie
verstrekken over het al dan niet dalen van de antistoffentiters tegenover nematoden in de loop
van de tijd. Bij deze proefopzet kunnen de dieren na behandeling in een negatieve omgeving
geplaatst worden. Op deze manier is een daling van de antistoffentiters wel mogelijk, maar de
relevantie voor de praktijk neemt bij een dergelijke proefopzet sterk af.
Wat voorlopig op basis van de uitgevoerde analyses kan worden gezien is dat de optische
densiteit van de serologische test bij oudere dieren, zelfs gehuisvest in batterijen, typisch hoger is
dan bij jongere dieren. Gezien de levensspan van leghennen of moederdieren, bijvoorbeeld als
ze geruid worden, twee jaar kan bereiken is er misschien een mogelijkheid om verschillende
grenswaarden voor verschillende leeftijden vast te leggen, zodat de stal op verschillende punten
in de tijd kan worden geëvalueerd. Om dergelijke waarden vast te kunnen leggen zal er echter
gedurende langere duur onderzoek nodig zijn, waarbij veel stallen met verschillende
huisvestingssystemen regelmatig in de tijd worden opgevolgd, met een correcte beschrijving van
zaken zoals het ontwormingsschema in de stal.
Om te besluiten durf ik stellen dat er potentieel zit in de test; de diagnose van Ascaridia galli en
Heterakis gallinarum is mogelijk. De vraag op dit moment is in welke mate de test kan worden
toegepast in de praktijk. Hiervoor zijn op dit punt vooral extra bedrijfsbezoeken en infectieproeven
nodig.
43
7. Referentielijst
1. Snijders M. (2015). Worminfecties bij pluimvee. Masterproef faculteit diergeneeskunde, Gent.
2. Helsen L. (2011). Wormbesmettingen bij leghennen in niet-kooihuisvesting. Brochure Dierengezondheidszorg Vlaanderen, 4-23.
3. Van Meirhaeghe H. (2013). Worminfecties bij pluimvee, Antwerpen, 2013. 4. Anoniem (1999). Europese richtlijn 1999/74/EG. 5. Vandekerckhove E. (2015).De SERASCA®-test, een verbeterde diagnose van rondworm
infecties in mestvarkens. Internetreferentie: http://www.serasca.com/nl/SERASCA%AE/1/Wat (geconsulteerd op 25 maart 2016).
6. Permin A., Hansen J.W. (1998). Epidemiology, diagnosis and control of poultry parasites. 4th edition. Food & Agriculture Organization of the UN, Rome, p. 23-40, p. 73-155.
7. Pattison M., et al. (2008). Liverpool, in: Poultry diseases, Elsevier. 8. Reuvekamp B., et al. (2008). Literatuurstudie naar wormen bij legpluimvee. Literatuurstudie
universiteit Wageningen. 9. MartÍn-Pacho J. R., et al. (2005). A coprological and serological survey for the prevalence of
Ascaridia spp. In laying hens. Journal of Veterinary Medicine Series B 52, 238-242. 10. Sherwin C.M., et al. (2013). Prevalence of nematode infection and faecal egg counts in free-
range laying hens: relations to housing and husbandry. British Poultry Science 54, 12-23. 11. Permin A., et al. (1999). Prevalence of gastrointestinal helminths in different poultry
production systems. British Poultry Science 40, 439-443. 12. Macklin K.S., (2013). Overview of helminthiasis in poultry. Internetreferentie :
http://www.merckmanuals.com/vet/poultry/helminthiasis/overview_of_helminthiasis_in_poultry.html (geconsulteerd op 12 november 2014).
13. Saif Y.M., et al (2008). Diseases of poultry, 12th edition, Blackwell Pub. Professional, Ames, Iowa, p. 1025-1067.
14. Hofstad M.S., et al. (1984). Diseases of poultry. 8th edition. Iowa State University Press, Ames, Iowa, p. 614-668.
15. De Gussem M. (2013). Voordracht: Poultry worms: an overview of the life cycle and related pathology, Brugge, 12 november 2013.
16. Dahl C., et al. (2002). The effect of concurrent infections with Pasteurella multocida and Ascaridia galli on free range chickens. Veterinary Microbiology 86, 313-324.
17. Skadhauge E. (1981). Osmoregulation in birds. Springer, Berlin. 18. Barger E.H., Card L.E. (1949). Diseases and parasites of poultry. 4th edition. Lea & Febiger,
Philadelphia, p.9-80, p. 312-382 19. Kahn, C.M. (2010). The Merck veterinary manual, tenth edition, Merck & Co, Whitehouse
Station, N.J., U.S.A. 20. Bowman, D.D. (2009). Georgis’ parasitology for veterinarians, Saunders Elsevier, St.Louis
Missouri. 21. Thorson, R.E. (1963). Seminar on immunity to parasitic helminths. Experimental parasitology
13, 3-12. 22. Schwarz, A. (2011). Immunopathogenesis of Ascaridia galli infection in layer chicken.
Developmental and comparative immunology, 35, 774-784. 23. Schat, K.A. (2013). Avian immunology (second edition), Academic Press, Elsevier, U.S.A.. 24. Davison, F. (2008). Avian immunology (first edition), Academic Press, Elsevier, Great Britain.
25. Permin A., Ranvig H. (2001). Genetic resistance to Ascaridia galli infections in chickens.
Veterinary Parasitology 102, 101-111.
44
26. Idi A., et al. (2004). Host age only partially affects resistance to primary and secondary
infections with Ascaridia galli (Schrank , 1788) in chickens. Veterinary parasitology 122, 221-
231.
27. Vlaminck J., (2013). Evaluation of Ascaris suum haemoglobin as a vaccine and diagnostic
antigen. Doctoraatsthesis faculteit diergeneeskunde, Gent.
28. Vlaminck J., (2014). Advances in the diagnosis of Ascaris suum infections in pigs and their
possible applications in humans. Parasitology, special issue article, 1-8.
29. Frontera E., (2002). Serological responses to Ascaris suum adult worm antigens in Iberian
finisher pigs. Research article.
30. Höglund J., et al. (2010). Population genetic structure of Ascaridia galli re-emerging in non-
caged laying hens. Parasites & Vectors 5, 97.
31. Snijders M., (2014). Nota’s bij de practica parasitologie, Faculteit diergeneeskunde, Gent.
32. Anoniem (onbekend). McMaster egg counting technique: Principle. Internetreferentie:
http://www.rvc.ac.uk/review/parasitology/eggcount/Principle.htm (geconsulteerd op 25
maart 2016)
33. Hermans K., (2015). Labaratory animal science II. Curcus faculteit diergeneeskunde, Gent.
34. Burgelman L., De Vliegher S., (2015). Thema wetboek veterinair recht selectie regelgeving.
Curcus faculteit diergeneeskunde, Gent.
35. Anoniem (2013). Gecommentarieerd geneesmiddelenrepertorium voor diergeneeskundig
gebruik 2013. Goekint graphics, Oostende, p. 40-48.
36. Vandekerckhove E., (2015). Laboboek ELISA dienst parasitologie, faculteit diergeneeskunde,
Gent.
37. Cawang, (2011).Basic indirect ELISA steps. Internetreferentie:
https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Indirect_ELISA.png (geconsulteerd op 14 april
2016).
38. Anoniem, (2015). RPM vs RCF. Internetreferentie: http://www.sorbio.com/index.php/rpm-
vs-rcf (geconsulteerd op 25 maart 2016).
39. Simoens P. (2012). Topografische en klinische anatomie van de huisdieren: anatomie van de
vogels. Curcus faculteit diergeneeskunde, Gent.
40. Gauly M., et al. (2005). Age-related differences of Ascaridia galli egg output and worm
burden in chickens following a single dose infection. Veterinary parasitology 128, 141-148.
41. Vandekerckhove E. (2016). Presentatie Ascaris suum voor derde master diergeneeskunde,
optie varken pluimvee en konijn.
42. Rahiman S., et al. (2016). Embryonation ability of Ascaridia galli eggs isolated from worm
uteri or host faeces. Veterinary Parasitology, january 2016 edition.