La santé des sols: Opportunités et applications des

nouvelles technologies de biologie moléculaire et de

séquençage

Laboratoire d’écologiemicrobienne (IRDA)

Présentation LEM du 30 avril et du 1er mai 2014

)

Plan de la présentation• Le Laboratoire d’écologie microbienne (LEM)

• Les composantes de la santé des sols

• Méthodes d’analyse de la santé des sols

• Les nouvelles technologies de séquençage

• Applications et opportunitées

)

Le LEM

• Détection• Séquençage• Bioinformatique

• Biopile• Biofiltration

• Moyens de luttes• Inoculantsmicrobiens

• Rotation, • Régie• SCV

Diversité et fonctions

biologiques des sols

Phytoprotection

ServiceBioprocédés

)

Le LEMDiversification des collaborations de R&D en écologie microbienne:Développer des pratiques et des régies des cultures préservant la qualité des sols.

� Impact des rotations et des régies de production des pommes de terre, des carottes.� Impact des systèmes de couverture végétale (SCV) et des engrais verts.� Caractérisation biologique des sols pour accroître la productivité des pommes de terre et pour conserver la santé des sols.

Proposer des approches intégrées de valorisation des biomasses.� Dévelopement d’une pile bioélectrochimique.� Valorisation agro-énergétique des résidus organiques putrescibles.

Mettre au point des techniques pour réduire les émissions dans l’environnement.� Développement d’un biofiltreur de l’air émis des porcheries.

Développer des pratiques pour lutter contre des microorganismes pathogènes.� Alternatives écologiques à la biofumigation des sols en production de fraises.� Emploi d’inocula pour la plantation dans une framboisière en dépérissement.

)

Le LEMMise au point de techniques d’analyses microbiennes:� Analyses microbiologiques classiques (milieux spécifiques, microscopie)

� Analyses biochimiques (EcoPlate BIOLOG, tests enzymatiques)

� Analyses sérologiques (ELISA et immunocpature)

� Analyses moléculaires (PCR, PCR-DGGE, PCR-SSCP, qPCR)

� Analyses génétiques (Pyroséquençage 454, Illumia MiSeq, RNAseq sur ion Torrent)

Site web: http://www.irda.qc.ca/fr/lab/laboratoire-d-ecologie-microbienne-lem/

� Personnes à contacter et services d’analyses microbiologiques

� Projets complétés et en cours

� Articles et conférences

Services d’analyses microbiologiques

)

Capacité du sol à:• promouvoir le cycle vital des plantes, des animaux et des microorganismes,• soutenir la productivité végétale, animale et microbienne, • maintenir les cycles des éléments et des structures d’un environnement durable,

au sein d’un écosystème dynamique.

La santé des sols?

ChimiePhysique

Biologie

Tiré de: Rodale Institute et Cornell Soil Health Assessment Training Manual 2009

)

1. Bonne structure physique du sol

2. Bon profil de sol

3. Éléments nutritifs présent mais pas en excès

4. Nombre faible de ravageurs et de microorganismes pathogènes

5. Bon drainage du sol

6. Nombre élevé des populations d’organismes bénéfiques

7. Faible compétition des mauvaises herbes

8. Absence ou très faible concentration d’éléments toxiques

9. Capacité à résister à l’érosion, la sécheresse, la compaction

10. Capacité de résilience et de promouvoir l’agrégation et la

séquestration des éléments vitaux

Caractéristiques d’un sol en santé

Tiré de: Cornell Soil Health Assessment Training Manual 2009

Nécessite des analyses physiques, chimiques et biologiques

)

Tiré de: Cornell soil health assessment training manual 2009

Éléments structurauxÉléments chimiques

MicroorganismesMésofaunes

VégétauxMacrofaune

)

Programme Gessol, Ademe 2010

Des organismes de toutes les taillesD

Les organismes vivant du sol de quelques individus à des milliards par gramme de sol sont généralement subdivisés en plusieurs groupes :

• la mégafaune comme les taupes, les crapauds et les serpents

• la macrofaune, visible à l’œil nu (vers de terre, fourmis, larves d'insectes)

• la mésofaune, visible à la loupe (acariens, collemboles)

• la microfaune, et les microorganismes, visibles seulement au microscope

(nématodes, protozoaires, algues, champignons, bactéries)

)

Programme Gessol, Ademe 2010

Diversité des communautés biologiques

)

MorphologiquesMorphologiques BiochimiquesBiochimiques

EnzymatiquesEnzymatiques MoléculairesMoléculaires

Les différents outils

Indicateurs biologiques

)

Indicateurs morphologiques et de quantification (AS)

� Microscopie et milieux nutritif spécifiques ou non.

� Détermination du C et du N de la biomasse.

� Extraction des matières organiques du sol (qualification).

� Extraction des matières humiques et fulviques du sol.

)

Indicateurs biochimiques et enzymatiques (AF)

� Tests enzymatiques C, N, P, S et autres (tube, bande, gel,

EcoPlate).

� Analyse lipides méthyl-esters (FAME) ou ac. gras

phospholipides (PLFA)

� Détermination CO2 - respiration microbienne.

� Pouvoir de minéralisation N et C.

)

Indicateurs moléculaires (AS et AF):

� Analyses PCR, PCR-DGGE, PCR-SSCP.

� Amplification quantitative qPCR.

� Analyses métagénomiques, pyroséquençage 454,

RNAseq

)

Ranjard 2000

Sol

ADN/ARN

Analyse partielle

(PCR)

Analyse partielle des populations

(PCR)

Analyse complète des populations

Clonage

Séquençage

Diversité génétique

• Hybridation• Hybridation• Gradient de

densité

Structure génétique

Taxonomie et fonctions

Analyses électrophorétiques

(DGGE, TGGE, ARDRA, T-RFLP, RISA, RAPD)

Méthodes moléculaires

Tiré de: Medini et als, 2008Tiré de: Myrold 2014

Protéines

ARN

ADN

Mesure l’activité de classes spécifiques d’enzymes

Quantification des séquences ribosomaleset des gênes fonctionnels transcrits

Analyses fonctionnelles (AF)

Quantification des séquences ribosomaleset des gênes fonctionnels

Analyses structurales (AS)

Caractérisation des populations d’organismes et de microorganismespour répondre à la question « Qui est là et que font-ils ? »

)

Les outils de NTS

• Séquençage complet des génomes

(Shotgun)

• RNA seq : ARNm et ARNr

• Séquençage d’amplicon: 16s ADNr; ITS

etcD

)

Principe des NTS

Pyroséquençage (Roche) MiSeq et HiSeq (Illumina)

Ion Torrent (Life Technologies)

)

ÉtapesConstruction de librairies

• PCR

• Shotgun

• ARNm

Séquençage

• ULaval

• McGill

• …

Bioinformatique

• Assemblage

• OTUs

• …

Présentation des résultats

PCoA, Courbes de rarefactions …

454

Ion torrent

Illumina

᧠г

Bioinformatique

Pour la diversité bactérienne à partir du 16sADNr sur plateforme Qiime

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Applications et opportunités

Environnement(sol; biofilm; airD)

Ensemble des ADN

Ensemble des ARN

ADN totalZone ciblée

Phylogénie

Assemblage

Analyse et prédiction des gènes

Comparaisonsdes environnements

RT (ADNc)

Métatranscriptomique

Normalisation

Analyse et prédiction des gènes

Caffrey 2011

A B C

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Myrold, Zeglin & Jansson 2013

Etudes scientifiques sur les sols avec NTS

Nombreuses études sur les sols forestiers

Pyroséquençage très populaires entre 2007 et 2011 (longueur de fragment)

Fort développement de la technologie d’Illumina (MiSeq et HiSeq)

屠ͻ

Exemple 1

• Projet

Projet: Alternatives à la fumigation en production de fraisesPartenaires: François Demers

� 2 fraisières� Parcelles fumigées et non-fumigées� Parcelles Témoin et avec ajout de Compost-FSLP (+strep)� Diversité bactérienne (pluralité bactérienne- Comparaison)

뻐б

Courbes de raréfactions présentant la pluralité bactérienne de sols de

fraisiers 8 semaines après plantation en parcelles fumigées et non

fumigées pour des parcelles témoins et amendées en compost à la

plantation.

Pyroséquençage 454 (Diversité alpha)

Projet LEM-IRDA 2012-2013

Non-Fumigé

Fumigé

Pluralité Élevée

Pluralité faible

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Exemple 2

• Projet

Projet: Étude de l’incidence sur les régies de culture sur la productivité des sols et les maladies de la pomme de terre

Partenaires: Agrinova (Samuel Morissette)

� 3 sites en régie conventionnelle� 4 rotations� Analyse de la diversité bactérienne des sols et de la rhizosphère

R

PCoA présentant la diversité bactérienne des sols et de la rhizosphère de

parcelles de pomme de terre ayant quatre sortes de précédent cultural.

Projet LEM-IRDA 2011-2013

Pyroséquençage 454 (PCoA)

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Exemple 3

• Projet

Projet: Pile Bio-électrochimique au lisier de porc (BioVeeVMD)

� Valorisation de la fraction liquide de lisier de porc� Identification de populations bactériennes électrophiles du biofilm anodique

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Proportions relatives des populations bactériennes majeures

sur le support bactérien d’une pile bio électrochimique

fonctionnant au lisier de porc.

Projet LEM-IRDA 2011-2013

Proportions relatives des populations bactériennes

屠ͻ

Exemple 4

• Projet

RNA Seq (Illumina; Ion Torrent)

Yergeau 2014 Plus les cases sont foncées plus les ARN sont abondants

Analyse structurale Analyse fonctionnelle

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Exemple-Microbiome

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Exemple-Microbiome

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ConclusionSélectionner des indicateurs biologiques liés aux indicateursphysico-chimiques qui permettent de déterminer l’état de santé du sol et sa dynamique agroenvironnementale.

État initial du sol

Caract. bio. Les intrants

ImpactsGérer

Prédire

� Au laboratoire� Sur le terrain

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Merci !

irda.qc.ca