optimali zácia aktivity termofilných enzýmov

Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov

Mgr. Kamil Tóth

Univerzita Pavla Jozefa ŠafárikaKatedra biochémie

Yellowstone 1969... …Danišovce 2006

●biokatalyzátory chemických reakcií

●enzýmy proteíny

●metabolické premeny urýchľujú ~ 106

x●najrýchlejší enzým orotidín monofosát dekarboxyláza ~ 1017 molekúl/sek.

●v primárnej sekvencii zložené z 20 AMK

Enzýmy

Kamil Tóth Optimalizácia aktivity termofilných enzýmov


●aktívne miesto – oblasť katalýzy

●dynamické štruktúry

●vysoká špecificita ”key and lock”

●evolúcia – selekcia katalytických skupín

●prevaha nekovalentných interakcií

●ich štruktúra je tvorená:

kofaktor

apoenzým


Kde sa enzýmy vyskytujú?... všade tam, kde prebieha život

●bunka živých sústav ~ 3000 enzýmov●niektoré organizmy sa prispôsobili

extrémnym podmienkam...

●metabolické dráhy ●imunitný systém ●proteosyntetický

aparát...


Extrémofily

Termofily

Psychrofily

BarofilyAcidofily

Halofily

(Mezofily)

● odolnosť v extrémnych podmienkach-vnútorná vlastnosť„dynamická povaha termostability“

50-105°C25-40°C -10 až 20°C

1-700 atmosférpH 1-5

>2M soľ

termofily 50-80°Chypertermofily >80

°C


NADH oxidáza z Thermus thermophiluskooperácia Prof. Sprinzl, Lehrstuhl Biochemie, Universität Bayreuth,

Nemecko

●50 kDa homodimér ●FMN alebo FAD ako kofaktor/monomér

●NADH dehydrogenáza

●pI 9,26●hypertermofil Topt.=82°C●neznáma fyziologická

funkcia


NADH oxidáza je flavoproteín●proteíny, ktoré majú ako kofaktor naviazaný FAD, FMN alebo iný flavínový derivát●až 65% flavoproteínov viaže FAD ako

kofaktorBiologická všestrannosť ●Citrátový cyklus●oprava poškodených reťazcov

DNA●rezistencia na tetracyklínové antibiotiká

●indikátory metabolického a nutričného stavu buniek

●Cirkadiálny rytmus – regulácia biologických hodín


Štruktúra FAD

adenozín

izoalloxazín flavín

D-ribitol

flavínadenindinukleotid (FAD)

adenozínmonofosfát (AMP)

flavínmononukletid (FMN)

ribolflavín


Chinón Semichinón Hydrochinón

NN

NNH

R

O

O NN

NH

NH

R

O

O NNH

NH

NH

R

O

O

e-, H+ e-, H+

●flavínový kruh pôsobí ako reverzibilný redoxný systém

zbalená forma rozbalená forma

„Motýlí ohyb“


Ciele práce:

●aktivácia termofilného enzýmu NADH oxidázy

●sledovanie preferenčných konformácií voľného FAD a viazaného v aktívnych

miestach

●charakteristika interakcií kofaktora a proteínovej časti

A

B ●vytvorenie nehomológnej databázy FAD viažúcich proteínov


Význam:

●biotechnologický priemysel

●základný výskum


Aktivácia termofilného enzýmu NADH oxidázyi) zásahom do primárnej sekvencie – bodové

mutácieii) pôsobením externe modulovaných podmienok

soli Hofmeisterovej sérieNa+, Gdm+, NH4+, Li+,

K+ ,Cs+...ako je to in vivo

?●cytozol 300mg

proteínov/ml●existencia voľnej H2O?

●priama interakcia s proteínom●nepriama s molekulami

H2O


KM,NADH KM,FMN

Mechanizmus pôsobenia

●KM konštanta- miera afinity enzýmu pre substrát

max,

[ ][ ] NADH

m app

NADHv VNADH K

rovnica Michaelis-Mentenovej

●v ~ aktivita enzýmu


6543210

3

2

1

0

Salts (M)

Rel

ativ

e ac

tivity

NH4+

Cs+

Na+ K+

Li+

Gdm+

●pozitívne nabité aktívne miesto

●nešpecifická aktivácia

●nepriamy efekt na oblasť aktívneho miesta

●nízka koncetrácia solíelektrostatické interakcie●vysoká koncetrácia

solíHofmeisterov efekt


K+ Na+ Cs+ > NH4+ > Li+ >> Gdm+

?

15

10

5

0

300

200

100

cations

KM

, NA

DH [

M]

no cation

Cs+

Na+ K+

NH4+

Li+

Gdm+

chaotropic kosmotropic

Stanovenie KM konštanty pre substrát NADH

●pre 2M soli

●charakteristika interakcie enzým-substrát

●konformačná bariéra


Stanovenie KM konštanty pre FMN ako kosubstrát

●komplexný problém objasnenia Hofmeisterovho efektu

30

25

20

15

10

5

0

cations

KM

, FM

N [

M]

no cation

Cs+

Na+ K+ NH4

+

Li+

chaotropic kosmotropic

●vytienenie nevýhodných elektrostatických interakcií

●chaotrópne katióny znižujú afinitu

●kozmotrópne Li+ stabilizuje štruktúru


B.Analýza flavínových kofaktorov v aktívnych miestach

●početnosť tvorby vodíkových väzieb subštruktúry FAD

,(%) 100 ligand ligand proteinburial

ligand

ASA ASAA x

ASA

●plocha prístupná pre rozpúšťadlo: ASA v Å2

N

i iig rmM

R1

21

●gyračný polomer: Rg v Å


Databáza flavoproteínov

●537 flavoproteínov (RCSB Protein Databank)

●55 ortológov

●100 kofaktorov●priemerné rozlíšenie

~ 2.06 Å

46% α/β štruktúra

98% oxidoreduktázy


Distribúcia vodíkových väzieb v aktívnych centrách enzýmov

● kritérium rozlíšenia: < 2Å

● 24 flavoproteínov

● parameter popisujúci interakcie v aktívnych miestach

sila interakcie vodíkovej väzby:izoalloxazín < pyrofosfát ~ adenozín <

ribityl

108642

0.6

0.4

0.2

0

Rg (A)

Hus

tota

dis

tribu

čnej

funk

cie

I.

II.

Obr.1 Flavodoxin Reductase

FAD 259, Rg = 4.87

Obr. 2 Ferredoxin Reductase

FAD 259, Rg = 5.69

Obr. 3 Nitric Oxide Synthetase

FAD 1501, Rg = 6.28

Obr. 4 Cholesterol Oxidase

FAD 510, Rg = 7.50

Obr. 5 Apoptosis iducting factor

FAD 1449, Rg = 7.67


Konformácia kofaktorov v aktívnych miestach enzýmov


Charakteristika rozbalenej konformácie FAD● ASA – plocha prístupná pre

rozpúšťadlo ● Rg - gyračný polomer ● schopnosť tvorby vodíkových

väzieb

121086420

1400

1200

1000

800

600

400

200

0

Rg (A)

AS

A

(A) kofaktor FAD

tota

l

o

o

●korelácia ASA – plochy prístupnej pre rozpúšťadlo a

gyračného polomeru Rg (R=0.844)


Zhrnutie:

537 flavoproteínov → databáza 55 nehomológnych flavoproteínov → 100 kofaktorov

určená ASA a bimodálna distribúcia konformácie kofaktora pre oblasť aktívnych miest

75% FAD v rozbalenej a 25% v zbalenej konformácii

úspešná aktivácia NADH oxidázy katiónmi Hofmeisterovej série


...čo do budúcna?

●stanovenie nitroreduktázovej aktivity NADH oxidázy z Thermus thermophilus

●viazanie flavínového derivátu do apoformy enzýmu

●sledovanie aktivity NADH oxidázy v nepolárnych prostrediach


Poďakovanie

RNDr. Gabrielovi Žoldákovi, PhD.

RNDr. Erikovi Sedlákovi, PhD.Prof. Dr. Mathiasovi Sprinzlovi

Vám za vašu pozornosť!

optimali zácia aktivity termofilných enzýmov

Documents