optimización para la extracción de bioquimica antocianinas
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UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO
FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA
ESCUELA ACADEMICO PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA
“Optimización para la extracción de
antocianinas en Vaccinium corymbosum
L. (Arándano), Noviembre 2015.”
TESIS I
AUTORES:
o BURGOS AGUILAR MARTHA PAOLA
o IBAÑEZ AHUANARI ERWIN ALEXANDER
ASESOR:
Mg. Q.F. Roger Antonio Rengifo Penadillos
TRUJILLO – PERÚ
2016
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Dedicatoria A Dios:
Por habernos dado sabiduría, fortaleza,
salud, coraje, y no dejarnos solos en los
momentos difíciles, y habernos permitido
llegar a la meta en este trabajo de
investigación
A Nuestros Padres:
Porque ellos han dado razón a
nuestra vida, por sus consejos, su
apoyo incondicional y su
paciencia.
Los Autores.
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AGRADECIMIENTO
A nuestros maestros
De la facultad de Farmacia y Bioquímica que
con este andar por la vida influyeron con sus
lecciones y experiencias en formarnos como
personas de bien y prepararnos para los
retos que pone la vida, a todos y cada uno de
ellos les dedicamos las páginas de esta tesis.
Los Autores.
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INDICE
DEDICATORIA
AGRADECIMIENTO
RESUMEN .......................................................................................................... i
ABSTRACT ........................................................................................................ ii
INTRODUCCIÓN ............................................................................................... 1
MATERIAL Y METODO ..................................................................................... 6
RESULTADOS ................................................................................................. 13
DISCUSIÓN ..................................................................................................... 16
CONCLUSION ................................................................................................. 19
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS ................................................................ 20
ANEXOS………………………………………………...………………...………….23
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RESUMEN
El presente trabajo de investigación tiene por objetivo determinar la
optimización para la extracción de antocianinas en Vaccinium corymbosum L.
(arándanos), procedentes de la ciudad de Virú, Provincia de Virú, La Libertad.
Se procedió a extraer las antocianinas del fruto de arándano con etanol al 20%
y 40% y agua, pH 2 y 4, temperatura de 25°C, 60°C, 75°C y 90°C, tiempo de
30, 60, 120 y 240 minutos, cuantificando las mismas mediante el método de
Giusti&Wrosltad de pH diferencial. Las condiciones óptimas para la extracción
de antocianinas del fruto de Vaccinium corymbosum L. (arándanos),
procedentes de la ciudad de Virú, Provincia de Virú, La Libertad, fue etanol al
40%, pH 2, temperatura de 75°C y un tiempo de 60 minutos; dando una
concentración máxima de 2,377 mg de antocianinas/ L de solvente.
Palabras clave: Vaccinium corymbosum L, arándano, antocianinas, pH
diferencial.
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ABSTRACT
This research aims to determine the optimal conditions for the extraction of
anthocyanins in Vaccinium corymbosum L. (blueberry), from the town of Viru,
Viru province, La Libertad. Proceeded to extract anthocyanins from blueberry
fruit with 20% and 40% ethanol and water, pH 2 and 4, temperature 25°C,
60°C, 75°C and 90°C, time 30, 60, 120 y 240 minutes, quantifying them through
Giusti&Wrosltad differential pH method. The optimum amount of anthocyanins
extracted from Vaccinium corymbosum L. fruit (blueberries ) , from the town of
Viru, Viru province , La Libertad, was 40% ethanol, pH 2, , temperature of 75 °C
and time of 60 minutes; giving a maximum concentration of 2,377 mg
anthocyanins / L solvent.
Keywords: Vaccinium corymbosum L, blueberry anthocyanins, differential pH.
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I. INTRODUCCIÓN
El empleo de las plantas medicinales con fines curativos es una práctica que se
ha utilizado desde tiempos remotos. Desde hace décadas los remedios
naturales, y sobre todo las plantas medicinales fueron el principal e incluso el
único recurso de que disponían los médicos. Esto hizo que se profundizaran el
conocimiento de las especies vegetales que poseen propiedades medicinales y
ampliar su experiencia en el empleo de los productos que de ella se extraen 1.
A diferencia de otros organismos las plantas destinan una cantidad significativa
del carbono asimilado y de la energía a la síntesis de una amplia variedad de
moléculas orgánicas que no parecen tener una función directa en procesos
fotosintéticos, respiratorios, asimilación de nutrientes, transporte de solutos o
síntesis de proteínas, carbohidratos o lípidos. El consumo de frutas y verduras
ha demostrado su efectividad en la prevención de algunas enfermedades en
los seres humanos y en los animales1, 2.
La planta del arándano es un arbusto, de tipo perenne, de crecimiento lento y
con una altura de 10 a 20 cm. Es nativa del este de Estados Unidos, aunque se
han introducido plantas silvestres en la Costa del Pacífico. Los tallos de la
planta son rastreros, delgados y presentan una longitud hasta de un metro.
Éstos recorren la superficie donde se cultiva formando una estera gruesa. A
partir de las yemas axilares de estos tallos rastreros, surgen ramas verticales
rectas que tienen una altura de 5 a 7 cm3, 4.
Las hojas son ovales, alternas, coriáceas, de color verde claro, con los
márgenes finamente dentados, caducas y con peciolo corto. Contienen
sustancias que reducen el contenido de glucosa en la sangre, son ricas en
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flavonoides derivados de la quercetina, los cuales son compuestos con
múltiples efectos positivos debido a su acción antioxidante y eliminadora de
radicales libres, lo cual indica que la tisana de hojas de arándano es buena
para evitar el deterioro prematuro de la piel. Útiles en el tratamiento de
problemas intestinales. En estado fresco, las hojas tienen aproximadamente 64
miligramos de vitamina C, y como tres veces más cuando están secas5.
Las flores son insignificantes, de color verde rosado con cinco pétalos y
sépalos, se producen aisladas o de dos en dos axilares en racimos colgantes.
El fruto es una baya de color negro azulado de sabor agradable y agridulce6.
El arándano americano, conocido también como arándano rojo americano o
mirtilo americano, es el fruto del Vaccinium macrocarpon (llamado en inglés
cranberry). Su fruto tiene por lo general de 1 a 2 centímetros de diámetro, pesa
de 1 a 2 gramos y se distingue por su intenso color rojo carmesí. Existen 3
especies que tienen importancia: Vaccinium angustifolium (arándano bajo o
“lowbush " ), Vaccinium ashei Reade (arándano ojo de conejo o "rabbiteye") y
Vaccinium corymbosum L. (arándano alto o "highbush"). Éste último es una
baya casi esférica, que dependiendo de la especie y cultivar puede variar en
tamaño de 0,7-1,8 cm de diámetro y posee un color azul metálico7,8.
El pigmento que le confiere el color azul al fruto (la antocianina), interviene en
el metabolismo celular humano disminuyendo la acción de los radicales libres,
asociados al envejecimiento, cáncer, enfermedades cardíacas y Alzheimer.
También tiene propiedades como astringentes, antisépticas, antidiarreicas,
hipoglucemiantes.7
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Los constituyentes fitoquímicos presentes en el zumo del arándano son
diversos, tales así, que se ha demostrado la presencia de flavonoles, los cuales
tienen parte responsable en la coloración del fruto y el zumo; entre los
principales tenemos, hiperósido, quercetina, miricetina, quercitrina, avicularina.
8
Cabe resaltar también la presencia de ácidos fenólicos, los cuales son
responsables también de potentes efectos benéficos para la salud, así tenemos
el ácido benzoico, clorogénico, 4-hidroxicinámico, 3,4-dihidroxibenzoico,
vaníllico, cafeico.8
Dentro de la gran gama de metabolitos secundarios presentes en el zumo del
arándano, se reconoce a los antocianósidos o antocianinas, los cuales, al igual
que los flavonoles, le brindan la coloración al fruto y al zumo.8
Las antocianinas son un grupo de pigmentos de color rojo, hidrosolubles,
ampliamente distribuidos en el reino vegetal. Químicamente las antocianinas
son glucósidos de las antocianidinas, es decir, están constituidas por una
molécula de antocianidina, que es la aglicona, a la que se le une un azúcar por
medio de un enlace β-glucosídico.9
La estructura química básica de estas agliconas es el iónflavilio, también
llamado 2-fenil-benzopirilio, que consta de dos grupos aromáticos: un
benzopirilio (A) y un anillo fenólico (B). De todas las antocianidinas que
actualmente se conocen (aproximadamente 20), las más importantes son la
pelargonidina, delfinidina, cianidina, petunidina, peonidina y malvidina, nombres
que derivan de la fuente vegetal de donde se aislaron por primera vez; la
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combinación de éstas con los diferentes azúcares genera aproximadamente
150 antocianinas.10
El color de las antocianinas depende de varios factores intrínsecos, como son
los sustituyentes químicos que contenga y la posición de los mismos en el
grupo flavilio; por ejemplo, si se aumentan los hidroxilos del anillo fenólico se
intensifica el color azul, mientras que la introducción de metoxilos provoca la
formación del color rojo. Las antocianinas son interesantes por dos razones. La
primera por su impacto sobre las características sensoriales de los alimentos,
las cuales pueden influenciar su comportamiento tecnológico durante el
procesamiento de alimentos, y la segunda, por su implicación en la salud
humana a través de diferentes vías.11
Diversos estudios presentan evidencia científica que los extractos ricos en
antocianinas pueden mejorar la agudeza visual, mostrar actividad antioxidante,
atrapar radicales y actuar como agentes quimioprotectores, mostrar capacidad
antibacteriana, antifúngica y antimutagénica. Las antocianinas también juegan
un papel en las propiedades antidiabéticas, tales como control de lípidos,
secreción de insulina y efectos vasoprotectivos mejorando la fragilidad
capilar.12
En la medicina tradicional, el arándano está ganando gran realce, por sus
propiedades antes mencionadas, gracias a su contenido de metabolitos
secundarios entre ellos las antocianinas, es por ello que la presente tesis,
busca determinar la optimización para la extracción de antocianinas Vaccinium
corymbosum L. (arándanos), procedentes de la ciudad de Virú, Provincia de
Virú, La Libertad, para un mejor aprovechamiento, y así ser de gran ayuda para
la población.
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OBJETIVOS
1. Determinar la máxima cantidad de antocianinas, obtenidas a diferentes
condiciones de extracción.
2. Establecer las condiciones a los cuales se procede la optimización de la
extracción
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II. MATERIAL Y METODO
1. MATERIAL
MATERIAL BIOLÓGICO:
1 Kg de fruto de Vaccinium corymbosum L. (arándano) procedentes
de la ciudad de Virú, Provincia de Virú, Región La Libertad,
recolectadas en Noviembre de 2015.
MATERIAL DE LABORATORIO
Material de vidrio
Material de uso común en los Laboratorios de análisis químico.
Material Químico
Reactivos
o Ácido Clorhídrico 0.1 M
o Acetato de Sodio 0.1M
o Ácido Acético 0.2M
Solventes
o Alcohol 96° G.L
o Agua destilada
Equipos
o Balanza Analítica.
o Baño María.
o Espectrofotómetro UV-Visible Genesys 20
o PH metro
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2. METODO
2.1. RECOLECCIÓN DE MUESTRA
El fruto de Vaccinium corymbosum L. (arándano) fué recolectado en
la ciudad de Virú, provincia de Virú. Situada a 68 msnm; estando a
una latitud y longitud de 08°24'56'' S y 78°45'06'' O, respectivamente.
2.2. IDENTIFICACIÓN TAXONÓMICA DE LA MUESTRA
Un ejemplar de la muestra fue llevado al Herbarium Truxillensis
(HUT) de la Universidad Nacional de Trujillo para su identificación y
posterior verificación taxonómica según el sistema filogenético de la
especie, el cual tiene como código de registro N°58210.
2.3. PREPARACIÓN DE LOS SOLVENTES13
Se preparó 100 mL de etanol al 20% y al 40% usando un
alcoholímetro; ambos solventes se ajustaron a pH 2 y pH 4 con
solución de ácido clorhídrico 1N usando un pH metro.
Etanol
20%
pH 2 100 mL
pH 4 100 mL
Etanol 40% pH 2 100 mL
pH 4 100 mL
Agua destilada pH 2 100 mL
pH 4 100 mL
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2.4. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA13
Se pesaron 50 g de fruto de arándano y se colocaron en un balón
aforado de 250cc, añadiéndose el solvente respectivo, preparado
anteriormente. Se procedió a la extracción de acuerdo a la siguiente
tabla:
SOLVENTE pH T° TIEMPO
Etanol 20%
pH 2
25 °C
30’
60’
120’
240’
60 °C
30’
60’
120’
240’
75 °C
30’
60’
120’
240’
90 °C
30’
60’
120’
240’
pH 4
25 °C
30’
60’
120’
240’
60 °C
30’
60’
120’
240’
75 °C 30’
60’
120’
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9
240’
90 °C
30’
60’
120’
240’
Etanol 40%
pH 2
25 °C
30’
60’
120’
240’
60 °C
30’
60’
120’
240’
75 °C
30’
60’
120’
240’
90 °C
30’
60’
120’
240’
pH 4
25 °C
30’
60’
120’
240’
60 °C
30’
60’
120’
240’
75 °C
30’
60’
120’
240’
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10
90 °C
30’
60’
120’
240’
H2O
pH 2
25 °C
30’
60’
120’
240’
60 °C
30’
60’
120’
240’
75 °C
30’
60’
120’
240’
90 °C
30’
60’
120’
240’
pH 4
25 °C
30’
60’
120’
240’
60 °C
30’
60’
120’
240’
75 °C
30’
60’
120’
240’
90 °C
30’
60’
120’
240’
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2.4.1. ANÁLISIS CUANTITATIVO POR
ESPECTROFOTOMETRIA UV-VIS DE ANTOCIANINAS13
Una alícuota de 1 mL del extracto se diluyó en una fiola de
10mL con soluciones de HCl (pH 1) y acetato de sodio (pH
4,5), por separado. En las soluciones preparadas se
determinó el contenido de antocianinas según el método
Giusti & Wrosltad de pH diferencial, utilizando un
espectrofotómetro UV-VIS Genesys 20, registrando las
absorbancias (por triplicado) a longitudes de onda de 510
nm y 700 nm, expresando el contenido de antocianinas
como cianidina-3-glucósido de acuerdo a la siguiente
formula:
Total antocianinas (mg/L)=A×PM×FD×1000/(ε xl)
Donde:
A (absorbancia) = (A510 - A700) pH 1,0 - (A510 - A700)
pH 4,5;
PM (Peso molecular): 449,2 g/mol para cianidina-3-
glucósido;
FD: factor de dilución
ε(coeficiente de extinción molar para cianidina-3-
glucósido) :26900 M-1.cm-1
1000: factor de conversión de g a mg.
Todos los análisis fueron realizados por triplicado(n = 3)
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2.4.2. ANÁLISIS DE LOS RESULTADOS13
A los datos obtenidos se les analizará estadísticamente
mediante ANOVA.
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III. RESULTADOS
Tabla 1. Extracción de antocianinas con Etanol 20%.
N° Solvente pH T t concentración
(°C) (min) (mg/L)
1
Etanol 20%
2
25
30 0.137
2 60 0.141
3 120 0.148
4 240 0.162
5
60
30 0.515
6 60 0.806
7 120 1.169
8 240 1.611
9
75
30 2.281
10 60 2.335
11 120 2.307
12 240 2.307
13
90
30 1.785
14 60 1.555
15 120 1.290
16 240 0.936
17
4
25
30 0.025
18 60 0.047
19 120 0.050
20 240 0.052
21
60
30 0.172
22 60 0.302
23 120 0.443
24 240 0.642
25
75
30 0.758
26 60 0.793
27 120 0.840
28 240 0.879
29
90
30 0.830
30 60 0.920
31 120 0.828
32 240 0.709
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Tabla 2. Extracción de antocianinas con Etanol 40%.
N° Solvente pH T t concentración
(°C) (min) (mg/L)
1
Etanol 40%
2
25
30 0.149
2 60 0.158
3 120 0.162
4 240 0.168
5
60
30 0.487
6 60 1.310
7 120 1.839
8 240 2.211
9
75
30 2.360
10 60 2.377
11 120 2.154
12 240 1.811
13
90
30 2.007
14 60 1.814
15 120 1.576
16 240 1.024
17
4
25
30 0.023
18 60 0.035
19 120 0.048
20 240 0.097
21
60
30 0.258
22 60 0.340
23 120 0.494
24 240 0.822
25
75
30 1.065
26 60 1.142
27 120 1.266
28 240 1.348
29
90
30 1.748
30 60 1.821
31 120 1.669
32 240 1.286
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Tabla 3. Extracción de antocianinas con Agua.
N° Solvente pH T t concentración
(°C) (min) (mg/L)
1
H2O
2
25
30 0.131
2 60 0.134
3 120 0.145
4 240 0.150
5
60
30 0.377
6 60 0.686
7 120 1.070
8 240 1.542
9
75
30 2.272
10 60 2.314
11 120 2.183
12 240 1.817
13
90
30 1.512
14 60 1.278
15 120 0.989
16 240 0.540
17
4
25
30 0.019
18 60 0.021
19 120 0.022
20 240 0.024
21
60
30 0.084
22 60 0.164
23 120 0.220
24 240 0.299
25
75
30 0.377
26 60 0.388
27 120 0.409
28 240 0.432
29
90
30 0.459
30 60 0.476
31 120 0.435
32 240 0.330
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IV. DISCUSIÓN
Los colorantes naturales presentan demanda considerable en la industria
alimentaria, cosmética y farmacéutica para reemplazar a los colorantes
sintéticos, debido a su naturaleza química, inocuidad y funcionalidad. Entre
estos colorantes naturales se encuentran las antocianinas que se distribuyen
ampliamente en el reino vegetal y están presentes en raíces, tallos, hojas,
flores y frutos de las plantas superiores12.
Las características estructurales de las antocianinas, determinan una mayor
estabilidad frente a cambios de pH, temperatura y exposición a la luz, debido a
procesos de copigmentación y asociación intermolecular e intramolecular que
se desarrollan en el medio, convirtiendo a estos compuestos en fuentes
potenciales de colorantes naturales, sustancias activas de alimentos
funcionales, nutracéuticos y medicamentos12, 14.
En relación a la extracción, el método usual de extracción es la extracción
sólido-líquido. El carácter polar de la molécula de antocianina permite su
solubilidad en variados solventes, tales como alcoholes, acetona y agua. Su
estabilidad es afectada fácilmente por modificaciones estructurales con grupos
hidroxilo, metoxilo, glucósidos y grupos acilos14.
El método de extracción debe ser el más adecuado para cada aplicación
concreta. Las condiciones de extracción, tales como relación sólido-líquido,
temperatura, tiempo, tipo y concentración de disolvente influyen en la
estabilidad de las antocianinas, así como también en la concentración de éstos
metabolitos en el extracto. Así, se debe maximizar la extracción de pigmentos,
y limitar la degradación o alteración del estado natural del extracto. El
conocimiento de los factores involucrados en su estabilidad y de los
mecanismos de degradación es sumamente vital para una eficiente extracción,
y uso de las antocianinas como colorantes de alimentos14.
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Si bien es cierto, las antocianinas son altamente hidrofilicas, son moléculas
polares, por la presencia de grupos hidroxilos en su molécula, éstas son
altamente extraídas en soluciones alcohólicas como etanol. El agua del medio
causa degradación de las antocianinas probablemente debido a una mayor
interacción entre el agua y el catión flavilio para formar la pseudobase
inestable8, 12,14.
Al comparar los resultados de la tabla 1, 2 y 3 en lo que respecta al solvente,
se puede notar que la mayor concentración de antocianinas se encuentra en la
tabla 2; donde se utiliza etanol al 40% como solvente.
Al comparar la acción extractora de los solventes queda comprobado que el
medio etanólico favorece una mejor extracción de antocianinas, que el agua.
Cabe resaltar que a mayor concentración etanólica se da un mejor resultado en
la extracción, puesto que existe menor polaridad en el medio.
En cuanto al pH, está siendo favorecido por un medio ácido, en donde existe
una mejor estabilización y protección de la molécula antocianina obteniendo así
una mejor extracción de las mismas. La sensibilidad de las antocianinas a los
cambios de pH se debe a que el núcleo flavilio es deficiente en electrones y por
lo tanto muy reactivo. En el caso de medios con pH por encima de 4, podría
producirse una degradación rápida de las antocianinas, produciendo
hemiacetal y chalcona, ambas inestables; por lo que es probable que gran
parte de éstas (antocianinas) se perdieran en el proceso extractivo12, 14, 15.
Ante ello, según la tabla 2, corroboramos que las antocianinas al ser moléculas
inestables, interactúan mejor en un pH 2, puesto que dichas moléculas se
estabilizan y queda favorecida la extracción de las mismas.
Fan y col. (2008), investigando la optimización de las condiciones de extracción
de antocianinas de batata morada, concluyeron que la mejor extracción es a 80
°C14.
Gorriti-Gutierrez y col. (2009a y 2009b) al estudiar la extracción de antocianinas
a partir de maíz morado concluyeron que la mejor temperatura de extracción es
a 75 °C14.
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Con respecto a la temperatura, las antocianinas se presentan inestables, ya
que a mayor temperatura, existe una mayor degradación de color, la elevación
de la temperatura estaría favoreciendo la extracción al aumentar la solubilidad
de los antocianos y el coeficiente de difusión, pero, Incrementos de
temperatura resultan en pérdida del azúcar glicosilante en la posición 3 de la
molécula y apertura de anillo con la consecuente producción de chalconas
incoloras.14, 15, 16.
Es así que, al analizar los resultados de la presente investigación en la tabla 2,
para el factor temperatura de extracción, las mejores condiciones se obtienen a
75°C.
En el caso del tiempo de extracción, el mejor rendimiento se obtiene cuando el
tiempo de extracción es menor de 1 hora lo que indicaría, que en este tiempo
se alcanzaría el equilibrio entre las fases sólida y líquida12, 14, 16.
Esto queda respaldado con los resultados de la presente investigación en la
tabla 2, para el factor tiempo de extracción, las mejores condiciones se dan a
los 60 minutos (1 hora) y a pH 2.
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V. CONCLUSION
1. Se determinó la optimización para la extracción de antocianinas del fruto
de Vaccinium corymbosum L. (arándanos), procedentes de la ciudad de
Virú, Provincia de Virú, La Libertad, con etanol al 40%, pH 2,
temperatura de 75°C y un tiempo de 60 minutos, obteniendo 2,377 mg
de antocianinas/ L de solvente.
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ANEXOS
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Anexo 1
Identificación de la especie vegetal en el HerbariumTruxillense de Trujillo
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Anexo 2
MUESTRA DE ARÁNDANO
SOLVENTES
ALCOHÓLICOS Y
MUESTRA DE ARÁNDANO
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MUESTRA DE ARANDANO Y
SOLVENTE
BALANZA ANALÍTICA
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BAÑO MARÍA
pH Metro
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ESPECTROFOTÓMETRO UV
– VIS GENESYS 20
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Anexo 3
Análisis estadístico
Post Hoc Tests
MultipleComparisons
DependentVariable:ABS
(I) Horas (J) Horas
Mean Difference (I-
J) Std. Error Sig.
95% ConfidenceInterval
LowerBound UpperBound
LSD 1 2 -,025333* ,000471 ,000 -,02642 -,02425
3 -,057333* ,000471 ,000 -,05842 -,05625
4 -,102000* ,000471 ,000 -,10309 -,10091
2 1 ,025333* ,000471 ,000 ,02425 ,02642
3 -,032000* ,000471 ,000 -,03309 -,03091
4 -,076667* ,000471 ,000 -,07775 -,07558
3 1 ,057333* ,000471 ,000 ,05625 ,05842
2 ,032000* ,000471 ,000 ,03091 ,03309
4 -,044667* ,000471 ,000 -,04575 -,04358
4 1 ,102000* ,000471 ,000 ,10091 ,10309
2 ,076667* ,000471 ,000 ,07558 ,07775
3 ,044667* ,000471 ,000 ,04358 ,04575
*. The mean difference is significant at the 0.05 level.
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Anexo 4
Cálculos para determinar la cantidad de antocianinas en muestras de
Arándano:
2,377 mg de Antocianinas 1000 mL de Solvente
X 100 mL de Solvente
0,2377 mg de Antocianinas 50 g Muestra de Arándano
X 100 g Muestra de Arándano
X = 0,2377 mg de Antocianinas
X = 0,4754 mg de Antocianinas/100 g
de Muestra de Arándano
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