orbitrap eclipsetm 三合一超高分辨质谱仪 · 2019. 10. 30. · • 与orbitrap fusion lumos...
TRANSCRIPT
The world leader in serving science
Orbitrap EclipseTM 三合一超高分辨质谱仪性能比尖，通用万间
2
Thermo ScientificTM Orbitrap EclipseTM TribridTM mass spectrometer
是最灵敏和最多功能的 MS 系统
定性蛋白质组学
定量蛋白质组学
结构生物学
生物药物分析
小分子结构鉴定
复杂样品，动态范围宽
高通量和最准确的蛋白质组范围定量
蛋白质复杂结构表征
蛋白质 - 药物结构解析，杂质鉴定
异构体结构表征
无与伦比的分析性能和多功能性
• QR5 分段四极杆质量过滤器具有出色的
前体母离子选择性和灵敏度
• 实时检索 TMT 分析的卓越的深度和准
确性
• 高质量范围 MSn（HMRn）用于非变性
蛋白质复合物的结构分析
• 质子转移电荷减少（PTCR）用于简化
复杂谱图和改进自上而下的数据解释
• 与 Orbitrap Exploris 480 和 TSQ MS 的
接口通用
改进的线性离子阱质量分析仪
五种碎裂类型的 MSn 和灵敏的质量分
析：CID，HCD，ETD/ EThcD/ETciD 和
UVPD;HMRn; 扩展了高压池的前部，以
改善对 ETD 和 PTCR 反应的控制
Ion Routing Multipole 多级离子通道
启用并行分析 ; 在任何 MSn
阶段执行 HCD; 可调节气压（0.5-20 mTorr）具有出色的自上而下性能
超高真空
UHV 区域的压力降低改善了
Orbitrap 质量分析仪中的离子检测
EASY- IC/ETD/PTCR
离子源
基于 Townsend 放电原
理 ; 可靠且易于使用
具有双曲面的 QR5 分
段四极杆质量过滤器
在 0.4 m/z 母离子隔离
宽度时提高灵敏度
超高场 Orbitrap
提供分辨率 > 500K
FWHM 和高达 40 Hz 的
采集速率，TurboTMT，
HMRn
Real-Time Search
肽段鉴定实时检索
功能，提高 TMT定
量的深度、通量和
准确性
电动离子漏斗
HCTT后聚焦离子 ; 广泛的调整曲线 ; Broad tuning curves
Advanced Active Ion
Beam Guide
主动离子传输组件
防止中性和高电荷离子
进入四极杆
高容量转移管
增加进入质量的离子通量
3
定性蛋白质组学QR5 质量过滤器：在 60 分钟内可靠地鉴定出近 50,000 个 Unique 肽段
Precursor Isolation Width, m/z
QR5 分段四极杆质量使 Orbitrap Eclipse MS 成为
最灵敏的 Orbitrap 质谱仪
• 内径半径 5.25 mm（增加 30％）
• 使用 0.4 m/z 母离子隔离宽度时传输效率增加（~2X）
• 实验细节
• 上样量 2μg K562 胰蛋白酶肽
• OTIT DDA，梯度为 60 分钟
• Thermo ScientificTM Proteome DiscovererTM 2.3 软件，标准修饰设
定，<1％ FDR
• 在 0.4 m/z 的隔离宽度下，MS/MS 谱图具有更高的特异性，从而
提高了 ID 鉴定效率
• 与 Orbitrap Fusion Lumos MS 相比，肽和蛋白质多 10％
FAIMS Pro 显著提升单细胞蛋白质组学鉴定深度
单次进样鉴定到 829 个蛋白（只依赖
Proteome Discoverer 二级谱图匹配）
Protein groups
Eclipse Eclipse + FAIMS
1 Cells 551 829
100 cells 2109 3067
40,000
42,500
45,000
47,500
50,000
0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6
Uni
que
Pep
tides
12% 10% 7% 3%
0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6
50,000
47,500
45,000
42,500
40,000
0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6
Pro
tein
Gro
ups
4,000
4,500
5,000
5,500
0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6
5,500
5,000
4,500
4,000
典型的单细胞蛋白质组 TIC 图
未加载 FAIMS Pro
TMT_MouseCell_30um30cm_CHIP3D_MS2 05/10/19 06:34:48
RT: 0.00 - 160.00
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160Time (min)
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
5.5
6.0
Rela
tive
Abun
danc
e
133.20
74.90 90.3167.21
90.71
74.60 91.1437.7791.67 112.3038.4437.5724.89 68.0492.0841.39 72.31 92.73 143.58
46.44 93.1033.41103.30 145.9432.52 128.46109.7293.92 126.92 153.2332.33
24.19 117.6694.72 154.50151.8128.00 122.30
13.281.54 20.102.02
NL:3.72E10Base Peak MS TMT_MouseCell_30um30cm_CHIP3D_MS2
TMT_MouseCell_30um30cm_CHIP3D_MS2 #10798 RT: 44.77 AV: 1 NL: 3.17E7T: FTMS + p NSI Full ms [375.0000-1575.0000]
400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900 950 1000 1050 1100 1150 1200 1250 1300 1350 1400 1450 1500 1550m/z
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Rela
tive
Abun
danc
e
396.21z=1
435.77z=2
501.97z=3
467.20z=1 631.87
z=2540.67
z=3596.44
z=1661.85
z=2591.33z=2
870.54z=1
752.45z=2
715.35z=2
810.50z=2
927.41z=?
1235.54z=3
984.45z=?
1263.74z=1
1025.74z=?
1403.53z=?
1370.01z=?
1169.03z=?
1545.39z=?
1492.75z=?
高峰度 +1 的污染离子抑制了
肽段信号
FAIMS_TMT_MouseCell_30um30cm_CHIP5C_MS2 05/10/19 18:51:02
RT: 15.09 - 130.74
20 40 60 80 100 120Time (min)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
23.79
122.20
45.2630.32
120.8030.98 105.7693.8840.75 55.68
70.5383.21
NL: 1.19E9TIC F: FTMS + p NSI cv=-60.00 Full ms [375.0000-1575.0000] MS FAIMS_TMT_MouseCell_30um30cm_CHIP5C_MS2
FAIMS_TMT_MouseCell_30um30cm_CHIP5C_MS2 #7047 RT: 44.77 AV: 1 NL: 4.03E6T: FTMS + p NSI cv=-60.00 Full ms [375.0000-1575.0000]
400 450 500 550 600 650 700m/z
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Rel
ativ
e A
bund
ance
637.87z=2
550.66z=3
594.68z=3
543.36z=2515.34
z=2460.29z=2
624.85z=2
438.76z=2
588.36z=2
660.32z=2
394.09z=2
688.85z=2
710.85z=2
FAIMS Pro 去除了高峰度的
+1 污染离子
FAIMS_SingleHelaCell_20um50cm_OTIT_MS... 05/11/19 19:40:46
RT: 0.00 - 160.02
0 20 40 60 80 100 120 140 160Time (min)
0
20
40
60
80
100
Re
lativ
e A
bu
nd
an
ce
130.18
134.15
127.02
119.67140.94
43.60 76.80 156.5361.76 87.9825.16 114.0316.09
NL:6.66E7TIC MS FAIMS_SingleHelaCell_20um50cm_OTIT_MS2_2_7
FAIMS_SingleHelaCell_20um50cm_OTIT_MS2_2_7 #1912 RT: 12.44 P: + NL: 9.41E2
400 500 600 700 800 900 1000m/z
0
20
40
60
80
100
Re
lativ
e A
bu
nd
an
ce
452.73
607.61455.19
654.77981.86686.58
462.73584.82
416.86754.24 830.12 933.52
513.14 894.95
555.26
典型的单细胞蛋白质组 TIC 图
加载 FAIMS Pro
4
实时检索提高TMT分析的深度，通量和准确性
Full Scan Full ScanOT MS3 OT MS3 OT MS3 OT MS3
ITMS2
ITMS2
ITMS2
ITMS2
ITMS2
ITMS2
ITMS2
ITMS2
ITMS2
ITMS2
Real-Time Search SPS MS3: 4 肽段定量
没有肽段 ID 的 Spectra
实时搜索事件需要几毫秒，与 ITMS2 并行运行
MS2SPS MS3
Real-Time Search
SPS MS3
6660
919610599
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
23
Real-Time Search Increases SPS MS3 Throughput
Real-Time Search: results of SPS MS3 in half the time
• Real-Time Search doubles the throughputof SPS MS3 workflow
• Results shown here are for HHM sample:three human cell lines labeled asbiological replicates in 10-plex (3-3-4)
61822 63698
0
20000
40000
60000
80000
SPS MS3 Real-Time Search SPS
MS3
180 min 90 min
90 m
in
0
100
200
300
400
500
600
700
800
Quantified Peptides/min
SPS MS3 Real-Time Search SPS
MS3
Expect from Fusion Lumos MS Orbitrap
Eclipse MS
343
708
For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
Data: D. Schweppe , Q. Yu and S. GygiHarvard Medical School
更高的准确性
最高的准确性 高准确性
定量肽段
定量肽段
Expect from Fusion Lumos MS
Expect from Fusion Lumos MS Orbitrap
Eclipse MSOrbitrap
Eclipse MS
实时检索增加了 SPS MS3 定量的肽数量
• TKO 标准品：使用实时搜索，与传统的 SPS MS3 实验
相比，多定量 38％的肽段，接近经典 MS2 实验的结果
• 对于因通量问题而未采用 SPS MS3 工作流程的实验室，
使用实时搜索的新方法提供了强大的替代方案。
实时检索达到 SPS MS3 的结果只需要一半的时间
• 对于已经采用 TMT SPS MS3 工作流程的实验室，实时检索将提
高您的通量（2 倍）
• 此处显示的结果是标记为 10 重（3-3-4）生物重复的三种人细
胞系的样品
5
实时检索提高了 SPS MS3 实验的定量准确性
25
Using the right fragments for MS3 with Real-Time Search: a real data example
• We are comparing the MS2 spectra for the BSA peptide shown
• Standard SPS MS3 – 9 ions selected
• 5 correct TMT-tagged fragments
• 4 untagged or contaminant fragments
• Real-Time Search SPS MS3
• 5 correct TMT-tagged fragments (b-ions)
• System excluded un-tagged and unidentified fragments
• This results in greater specificity of TMT reporter ions, leading to improved quantitation accuracy
Real-Time Search Improves Quantitative Accuracy of SPS MS3 Experiment
b1 b3 b5 b6b4
y6y4 y5
SPS MS3
SPS MS3
with Real-Time
Search
TMT-YLYEIARb
y
使用正确的 MS3 碎片
实时检索：一个真实的数据示例
• 我们正在比较所示 BSA 肽的 MS2 谱
• 标准 SPS MS3-9 个离子
• 5 个正确的 TMT 标记碎片
• 4 个未标记或污染的碎片
• 实时检索 SPS MS3
• 5 个正确的 TMT 标记片段（b- 离子）
• 系统排除未标记和未标识的片段
• 这导致 TMT 报告离子的更高特异性，改善定量准
确性
28
MS2 FAIMS Pro
MS2
SPSMS3
Real-Time Search
SPS MS3
SPS MS3 with Real-Time Search Provides the Most Accurate Results
• 24X is expected ratio
• Average ratios for 6 proteins are shown
• MS2 provides the least accurate results
• FAIMS Pro interface rescues MS2 results to an extent
• Results with Real-Time Search provide themost accurate measure of the magnitude of
change
For each TMT channel, 4-100 pmol of 6 protein digest was added to 40 ug of HeLa digest, and then labeled, resulting in a spiked-in standard mixed in ratios 2-24. Only results for the expected large ratio of 24 are shown here.
8.8
11.6
15.2
21.2
1
5
9
13
17
21
25
Expect from
Fusion Lumos
MS
Orbitrap Eclipse
MS
LARGE CHANGE
For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
29
MS2 FAIMS Pro
MS2
SPSMS3
Real-Time Search
SPS MS3
SPS MS3 with Real-Time Search Allows Detecting Change
1.21.3
1.4
1.7
1
1.2
1.4
1.6
1.8
2 • 2X is expected ratio
• Average ratios for 6 proteins are shown
• MS2 provides the least accurate results, making itdifficult to ascertain a SMALLER CHANGE
• SPS MS3 rescues the accuracy somewhat
• Results of SPS MS3 with Real-Time Search are themost accurate,enabling the detection of a SMALLER CHANGE
For each TMT channel, 4-100 pmol of 6 protein digest was added to 40 ug of HeLa digest, and then labeled, resulting in a spiked-in standard mixed in ratios 2-24. Only results for the expected large ratio of 24 are shown here.
Expect from
Fusion Lumos
MS
Orbitrap Eclipse
MS
SMALLER CHANGE
For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
理论比值是 24X
理论比值是 2X
大的比值
• 预期比值为 24 倍
• 显示了 6 种蛋白质的平均比值
• MS2 提供最不准确的结果
• FAIMS 在一定程度上改善了 MS2 的结果
• 实时检索的结果可以最准确地衡量变化幅度
对于每个 TMT 通道，将 4-100pmol 的 6 蛋白质酶切肽段加入到 40μg HeLa 酶
切肽段中，然后进行标记，得到掺入比例为 2-24 的掺入标准品。 此处仅显示预
期的比值为 24 的结果。
微小变化
• 预期比值是 2 倍
• 显示了 6 种蛋白质的平均比值
• MS2 提供的结果最不准确，因此很难确定更小的变化
• SPS MS3 稍微挽救了准确性
• 具有实时搜索的 SPS MS3 的结果是最准确的，使得能够检测到更小的变化。
对于每个 TMT 通道，将 4-100pmol 的 6 蛋白质酶切肽段加入到 40μg HeLa 酶
切肽段中，然后进行标记，得到掺入比例为 2-24 的掺入标准品。 此处仅显示预
期的比值为 2 的结果。
6
增强 top-down 分析
直接输注 100 fmol /μL 碳酸酐酶 II（牛）
增强型真空技术
提高完整蛋白质的 S / N
• 中间（5 mTorr）和超低（1mTorr）IRM 压力与 Orbitrap
Fusion Lumos MS 相比 S/N 提高 2-4 倍
• 重新设计的硬件用于更好的抽 OT 区域真空 ; Orbitrap 质量
分析仪的压力较低
• IRM 中的可调压力为 0.5-20 mTorr，可对包括非变性复合
物在内的完整蛋白质进行最佳分析
单个实验中的高序列覆盖率
• 合并 ETD, EThcD, UVPD 和 HCD 结果
• 轻链序列覆盖 57%
• 重链序列覆盖 36%
• 完整 IgG 的序列覆盖为 43%，质量偏差 3.7 ppm RMS
在 50mM 醋酸铵中直接输注非变性 Herceptin® mAb（148 kDa）。在
离子阱中分离出 27+ 的 5,500 m/z，并使用 ETD，EThcD，UVPD 和
HCD 进行碎裂。用 R 240'000 @ 200 m/z 获得 MS/MS 谱图。 使用
Biopharma Finder 4.0 软件使用 S/N 10 和 10ppm 质量偏差进行数据
处理。
SEC-LC/MS 分析非变性 Hecerptin®
• Herceptin® 的五种主要糖型均以其非变性的形式以高质量高准确度进行了完美分
辨和测量
新HMRn 选项分析非变性单克隆抗体
Top-down HMRn 单克隆抗体的自上而下分析
34
0
50
100
150
200
250
300
350
400
5 mtorr 2 mtorr 1 mtorr
Sig
nal-t
o-N
oise
IRM pressure
Carbonic Anhydrase IICharge State 36+ at 806 m/z
Improved Performance For Intact Protein And Top-down Experiments
Enhanced Vacuum Technology
improves S/N of intact proteins
• 2-4X S/N improvements at intermediate (5 mTorr) and ultra-low (1 mTorr) IRM pressures vs. Orbitrap Fusion Lumos MS
• Redesigned manifold for better differential pumping of OT region; lower pressure in the Orbitrap mass analyzer
• Adjustable pressure in the IRM from 0.5-20 mTorr for optimal analysis of intact proteins including native complexes
Orbitrap EclipseOrbitrap Fusion Lumos
Direct Infusion of a 100 fmol/µL of Carbonic Anhydrase II (Bovine) MP 328
碳酸酐酶 II（Carbonic Anhydrase II）电荷 36+ at 806 m/z
信噪比
IRM 压力
37
SEC-LC/MS of the intact Herceptin®
• Five major glycoforms of Herceptin® were perfectly resolved and measured with high mass accuracy in their native form
• LC-MS analysis was performed using Thermo Scientific™ MabPac™ SEC-1 column and 250 µL/min flow rate. Orbitrap spectral information was recorded with a resolving power of 30,000 at 200 m/z. The spectra were deconvoluted using the ReSpectTM algorithm in Thermo Scientific™ BioPharma Finder™ software
Glycoform Average Mass (theoretical)
Average Mass (measured)
Delta Mass (ppm)
G0, G0F 147910.06 147909.30 5.1G0F, G0F 148056.20 148055.95 1.7G0F, G1F 148218.34 148219.14 5.4
G1F, G1F 148380.48 148381.52 7.0
G1F, G2F 148542.63 148543.70 7.2
Analysis of a Native Monoclonal Antibody with the New HMRn Option
AVERAGED SPECTRUM (1 MIN)
SINGLE SCAN (2 SEC)
148219.14
148055.95 148381.52
148543.70
147909.30
147500 148000 148500 149000Mass
DECONVOLUTED SPECTRUM
LC
Herceptin® is a registered trademark of GenentechTP 018For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
糖型 平均分子量（理论） 平均分子量（测定） 质量偏差（ppm）
G0, G0F 147910.06 147909.30 5.1
G0F, G0F 148056.20 148055.95 1.7
G0F, G1F 148218.34 148219.14 5.4
G1F, G1F 148380.48 148381.52 7.0
G1F, G2F 148542.63 148543.70 7.2
39
Top-down Analysis of a Native Monoclonal Antibody with HMRn
Heavy Chain
36%
High sequence coverage in a single experiment
• Combined results of ETD, EThcD, UVPD and HCD
• LC coverage was 57%• HC coverage was 36%• The combined sequence coverage for intact
IgG was 43% with 3.7 ppm RMS
Direct Infusion of a Native Herceptin® mAb (148 kDa) in 50 mM of Ammonium Acetate. The 27+ at 5,500 m/z was isolated in the ion trap and fragmented using ETD, EThcD, UVPD and HCD. The MS/MS spectra were acquired with RP 240,000 at 200 m/z. The spectra were processed with Bioharma Finder 4.0 software using S/N cutoff of 10 and 10 ppm tolerance
Light Chain
57%
FRAGMENTSa/x b/y c/z TP 018
For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.
7
Proton Transfer Charge Reduction（PTCR）质子转移电荷降低
电荷减少揭示了两种不同化合物的电荷状态分布
CH1 CH2hinge
Human Immunoglobulin G4 (IgG4) Fc
Cytokine-Fc fusion protein原始的 MS 谱图去唾液酸化的细胞因子 -Fc 融合蛋白
PTCR MS2: PTCR of 80 amu
质量窗口 m/z 5677-5757
去卷积结果
• 3 N- l inked
糖基化位点
• 非变性质谱降低了谱图的复杂性，但不足以产
生可解释的质谱图
• 非变性质谱与 PTCR 电荷减少结合使得细胞因
子 -Fc 融合蛋白在预期质量下解卷积
平均分子量( 测定值 )
相对峰度 电荷分布
96048.02 100 14-17
96070.80 53.65 14-17
101705.31 51.10 14-18
83872.73 12.48 13-15
43
PTCR Reveals Charge State Distributions of Two Different Species
751.0073 m/z
?
m/z751.0073
--
---
---
---
--
- -
1001
.0073
844.7
573
1501
.0073
3003
.0073
965.2
930
1126
.0073
1351
.0073
1688
.5073
2251
.0073
3376
.0073
m/z844.7573
m/z965.2930
m/z1126.0073
m/z1001.0073
m/z1501.0073
m/z3001.0073
m/z1351.0073
m/z1688.5073
C14F24
8+
7+
6+
5+
4+
3+2+
8+ 7+ 6+ 5+ 4+
3+ 2+ 1+
3+ 2+
1+
M=6750 DaM=3000 Da
Coon et. al. PNAS (2005), 102, 9463-9468
ThOG pm 03:10
赛默飞色谱
与质谱中国
赛默飞
官方微信
热线电话
800 810 5118 400 650 5118
www.thermofisher.com