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MODELAMIENTO POR HOMOLOGÍA DE LA ESTRUCTURATRIDIMENSIONAL DE LA FOSFOLIPASA A2 CITOSÓLICA PANCREÁTICA

DEPENDIENTE DE CALCIO PRESENTE EN Rattus norvegicus

HOMOLOGY MODELLING BY THREE-DIMENSIONAL STRUCTUREOF PHOSPHOLIPASE A2 CYTOSOL-DEPENDENT PANCREATIC CALCIUM

IN Rattus norvegicus

MODELAGEM POR HOMOLOGIA DE ESTRUTURA TRIDIMENSIONALDA ENZIMA FOSFOLIPASE A2 PANCREÁTICAS CITOSSOL

CÁLCIO-DEPENDENTE EM Rattus norvegicus

Ricardo Vivas-Reyes1,2, Maicol Ahumedo1, José Cabezas1

Recibido: 1/12/09 – Aceptado: 10/08/10

La fosfolipasa A2 dependiente de calcio esde vital importancia en la biosíntesis demediadores lipídicos, inflamatorios o ei-cosanoides, tales como: tromboxanos,leucotrienos y prostaglandinas. Para lafosfolipasa A2 dependiente de calciode 85kDa presente en Rattus norvegicus, se co-noce su estructura primaria (secuencia deaminoácidos), pero a pesar de su relevan-cia no existen reportes de sus estructurassecundarias y terciarias.

En este estudio se obtuvieron y eva-luaron los modelos de estructura terciariamediante el uso de servidores de modela-do y evaluación de proteínas vía Internetpara la fosfolipasa A2 dependiente de cal-

cio presente en células beta del páncreasde Rattus norvegicus.

Los modelos 3D obtenidos de lacPLA2 estudiada pueden ser útiles en eldiseño racional de experimentos de muta-génesis dirigida, para elucidar y com-prender cuál puede ser el mecanismo defuncionamiento de dicha enzima o para eldiseño de fármacos que se unan a ella.

modelamiento, fosfo-lipasa A2, bioinformática.

Calcium-dependent phospholipase A2(cPLA2) is of vital importance in biosyn-thesis of lipid, inflammatory or eicosanoid

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REVISTA COLOMBIANA DE QUÍMICA, VOLUMEN 39, nro. 2 DE 2010

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1 Programa de Química, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad de Cartagena, Campus de Zaragocilla.Cartagena, Colombia.

2 [email protected]

mediators, such as thromboxanes, leuko-trienes and prostaglandines. For the 85KDa cPLA2 present in Rattus norvegicus,its primary structure (AA sequence) iswell known, but there is no report of its se-cundary and tertiary structures.

In this study tertiary structure modelsof cPLA2 present in pancreatic beta cellsof rattus norvegicus were obtained andevaluated using protein modelling andevaluation via internet servers.

The cPLA2 3D models obtained can beuseful to the rational design of site-direc-ted mutagenesis experiments, for elucida-ting and understand which might be theoperation mechanism of this enzyme or forthe design of drugs which may bind to it.

modelling, phospholipaseA2, bioinformatics.

A Fosfolipase A2 dependente do calcio éde vital importância na biosíntese de me-diadores lipídicos, inflamatórios ou eico-sanóides, tais como: tromboxanos, leuco-trienos e prostaglandinas. Para a fosfoli-pase A2 dependente de cálcio de 85 kDapresente em rattus norvegicus, se conhecesua estrutura primaria (sequência de ami-noácidos), mas não existem reportes desuas estruturas secundárias y terciarias.

Neste estudo foram obtidos e avalia-dos os modelos de estrutura terciaria,através do uso de servidores de modela-gem e avaliação de proteínas, via Internetpara a fosfolipase A2 dependente do cal-cio presente em células betas do pâncreasde rattus norvegicus.

Os modelos 3D obtidos da cPLA2 estu-dada podem ser úteis no desenho racionalde experimentos de mutagénese dirigida,para elucidar y compreender qual podeser o mecanismo de funcionamento destaenzima ou para o desenho de fármacosque se liguem a ela.

modelagem, fosfoli-pase A2, bioinformática.

El conocimiento de la estructura tridimen-sional de una proteína es imprescindible sise desea comprender a fondo su mecanis-mo de funcionamiento o llevar a cabo el di-seño racional de fármacos que se unan aella. Sin embargo, la determinación expe-rimental de estructuras de proteínas es unatarea que a menudo resulta difícil de ejecu-tar, debido a la imposibilidad de obtenercantidades suficientes de proteína purifi-cada, y también a dificultades durante elproceso de cristalización (grupo espacial yempaquetamiento en la estructura cristali-na, presencia o ausencia de ligandos, dife-rente grado de hidratación, presencia desales, etc.), o cualquier otro de los muchosproblemas técnicos que pueden surgir du-rante los estudios estructurales (1). Dadoel marcado interés que muestran los inves-tigadores por la estructura de las macro-moléculas biológicas, y conscientes de laestrecha relación que existe entre la es-tructura de una molécula y su función, asícomo de los grandes avances que se hanproducido en las técnicas experimentalespara el estudio de estructuras, especial-mente en las técnicas de cristalización demacromoléculas y complejos de interésbiológico, de resolución de estructuras apartir de los patrones de difracción de ra-yos X y de estudios de macromoléculas en

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disolución mediante resonancia magnéticanuclear (RMN) (1, 2), han aumentado demanera notoria, el número de estudios en-focados al diseño de fármacos basados enla estructura del receptor (métodos direc-tos) y además son el punto de referenciavital en los métodos de modelado por ho-mología de proteínas.

Muchos de los avances en estas técni-cas se deben al desarrollo de métodoscomputacionales específicos de análisisde datos, que han facilitado en gran medi-da la interpretación de los resultados ex-perimentales. En este estudio nos limita-remos solo al estudio de algunas técnicasbioinformáticas más generales, que hanresultado ser de gran utilidad para los in-vestigadores en biología molecular, comoson la búsqueda y visualización de estruc-turas depositadas en las bases de datos, ola modelización molecular, que consisteen predecir de forma teórica la estructurade una macromolécula de la cual se cono-ce únicamente su secuencia o estructuraprimaria. La modelación en este caso seve justificada, ya que de la fosfolipasa A2

dependiente de calcio (cPLA2) presenteen Rattus novergicus, se conoce su es-tructura primaria, pero no existen re-portes de sus estructuras secundarias yterciarias. Estos hechos se complementancon las dificultades experimentales exis-tentes para la obtención de estructuras tri-dimensionales resueltas, y por tanto siem-pre existe un desequilibrio entre elnúmero de secuencias conocidas y las re-sueltas experimentalmente. No es sor-prendente, por consiguiente, que los mé-todos de predicción de estructuras deproteínas a partir de su secuencia seanuna solución alterna para los estudio deelucidación estructural de macromolécu-las, y objeto de un creciente interés (2).

Las fosfolipasas A2 (PLA2) pertene-cen a una familia de enzimas que hidroli-zan el enlace éster SN-2 de los glicero-fosfolípidos liberando ácidos grasos,principalmente el ácido araquidónico yun lisofosfolípido. Dependiendo de susisoformas, el sustrato para la PLA2 pue-de ser fosfatidilcolina, fosfatidiletanola-mina, plasmalogenos u otros. El ácidoaraquidónico sirve como un precursorpara la generación de una familia de me-diadores lipídicos bioactivos conocidoscomo eicosanoicos, que incluyen a pros-taglandinas, tromboxanos y leucotrie-nos. Más recientemente, el ácido araqui-dónico, así como otros ácidos grasosinsaturados, ha mostrado realizar fun-ciones importantes como mensajero se-cundario (1, 3). La fosfolipasa A2 citosó-lica (cPLA2) hidroliza el enlace SN2-aciléster de los fosfolípidos, y muestra unapreferencia por los sustratos que contie-nen ácido araquidónico.

Se ha reportado que la serina 228 esesencial para la actividad enzimática yfunciona como un nucleófilo en el centrocatalítico de la enzima (2, 4). La cPLA2

contiene un motivo catalítico ácido as-partico, común para la familia de subtili-sina serinas proteasas. La sustitución dealanina por ácido aspartico 549 inactivacompletamente la enzima, y sustitucio-nes con ácido glutámico o asparraginareduce la actividad 2.000 y 300 veces,respectivamente. Se encontró tambiénque al sustituir arginina 200 por alaninao histidina, la enzima se inactiva. Dichosresultados están soportados experimen-talmente por dicroísmo circular, el cualha provisto evidencia de que la Asp-549y la Arg-200 son esenciales para la fun-ción enzimática (5).

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La clasificación de las fosfolipasasestá determinada por el sitio de acción decada una, su distribución, su modo de ac-ción y su hidrofobicidad. Las fosfolipasasA son acil-hidrolasas y se clasifican deacuerdo con su sitio de acción hidrolítica;por ejemplo, la fosfolipasa A1 hidrolizasolo 1-aciléster, mientras que la PLA2 hi-droliza solo la 2-aciléster (6). La hidróli-sis catalizada por la PLA2 es exergónica yunidireccional, liberando el araquidonatode los fosfolipidos (6). Otras fosfolipasashidrolizan ambos grupos y se denominanfosfolipasa B; por tanto, se consideranfosfolipasas de gran actividad. Las fosfo-lipasas C catalizan la rotura del enlace gli-cerol-fosfato; mientras que la fosfolipasaD puede remover grupos polares básicos.Las fosfolipasas C y D son fosfodieste-rasas (6).

Usando la base de datos UniProtKB seobtuvo la estructura primaria de la cPLA2

presente en los islotes pancreáticos de laRattus norvegicus (grupo IVA), la cualposee 752 aminoácidos con un peso mole-cular de 85 kDa, cuyo código de acceso esP50393. Se utilizó el algoritmo de bús-queda BLAST (herramienta de alinea-miento básico local) para analizar nuestrasecuencia de interés y buscar secuenciasde proteínas potencialmente similares a lanuestra, ya que este programa puedeusarse gratuitamente desde el servidor delCentro Nacional para la Información Bio-tecnológica (NCBI). Posteriormente aeste alineamiento se analizaron los domi-nios de la cPLA2 a través del servidorPfam (7).

El método empleado para la predic-ción de la estructura secundaria fue:JPRED (10), y se compararon con los re-sultados de los métodos -SSPRO (9) yHNN (8). Estos métodos clasifican cadaaminoácido según tres posibles estados deestructura secundaria: alfa-hélice, hoja-beta u otro. A la predicción de cada resi-duo se le asigna un índice de fiabilidad,que varía entre 0 y 9, y que se correlacio-na con la exactitud de la predicción. Esteíndice permite identificar las regiones dela proteína que se han predicho con ma-yor exactitud (11). Se realizó un alinea-miento de las secuencias de la cPLA2 uti-lizando el programa Clustal-W y la basede datos PDB, para encontrar moldesadecuados para la proteína en estudio.

Para motivos de comparación, a partir dela secuencia de la cPLA2 (P50393) seconstruyeron modelos teóricos usando losservidores Swiss model (12), CPH models(13), 3D-Jigsaw (14), Modweb (15).

Los modelos fueron evaluados en tér-minos estereoquímicas por el programaWhatcheck empleando la interfaz Webdel servidor Whatif y por el programaProcheck (16, 17). Además, fueron con-sideradas las restricciones de los ángulosdihedros psi y phi proporcionados por eldiagrama de Ramachadram, a través delservidor imoltalk (18). De igual forma,fue revisada por potenciales energéticosutilizando el programa Prosa 2003, elservidor ProQ que emplea redes neurona-les para evaluar la calidad del modelo, ba-sado en contactos intraatómicos y propie-dades fisicoquímicas y por último elservidor 3D Evaluation (19, 20).

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La caracterización de la estructura se rea-lizo a través del programa Promotif (21)que ejecuta una implementación local delalgoritmo DSSP (Diccionario estándar deestructuras secundarias) (22). Asimismo,se analiza la superficie y el sitio activo,calculando la accesibilidad de cada unosde los residuos que la componen a partirdel programa Mol mol (23).

Los resultados de los cálculos obtenidospor BLAST muestran que existe una se-cuencia de proteínas que tienen un altogrado de similitud a la secuencia de ami-noácidos de la proteína en estudio, lo quesugiere que esta secuencia pueden serusada como plantilla, ya que se encontróque posee estructura tridimensional re-suelta en el PDB (Protein Data Bank) y sucódigo es 1BCI. Por otro lado, utilizandola opción búsqueda de secuencia disponi-ble en el PDB, se encontraron varias se-cuencias homólogas a nuestra secuenciaproblema; un alineamiento secuencialcon la proteína blanco fue ejecutado y seencontraron secuencias homólogas conestructura tridimensional resuelta. La se-cuencia de aminoácidos de cPLA2 pre-sentó un porcentaje de identidad superioral 90% con los mejores moldes encontra-dos. Con el molde 1CJY se halló una se-mejanza en la secuencia del 94% sobre708 AA; con el molde 1RLW se encontróuna semejanza del 98% sobre 135 AA, yel molde 1BCI mostró una semejanza enla secuencia del 97% sobre 120 AA. Unalineamiento en pareja (pairwise align-

ment) se realizó entre nuestra secuencia yel molde 1CJY, ya que esta posee un

número de aminoácidos muy parecido alde nuestra secuencia (Figura 1).

El análisis de las similitudes y diferen-cias en aminoácidos individuales buscainferir relaciones estructurales, funciona-les y evolutivas entre las secuencias en es-tudio. Por tal motivo se puede decir queexisten pocas diferencias entre la fosfoli-pasa 2 humana (1cjy) y la de rata, mos-trando una semejanza en la secuencia del94% y una identidad en la secuencia del97%. La similitud entre dos secuencies esuna variable continua que mide el nivel decoincidencia. La homología se reservacomo una variable dicotómica, la cual in-dica si dos secuencias son homólogas ono, dependiendo del grado de similitud yla significancia estadística del alinea-miento. Esto deja claro que la fosfolipasa2 humana (1CJY) es el molde adecuadopara realizar el modelado por homologíabasado en la alta similitud presente entreestas proteínas.

La predicción de la estructura secundariase hizo mediante el uso del servidorJPRED, donde se muestra que la proteínapresenta una mayor proporción de loops,lo cual implica una estructura secundariapoco definida (Tabla 1). JPRED posee va-rios algoritmos, como Jnet que realiza unapredicción de la estructura más exacta.

Los dominios se obtuvieron con la ayu-da del programa Pfam, donde se encuentraque la cPLA2 blanco P50393 posee dos do-minios: uno del tipo C2, el cual se une alcalcio, cuya región abarca los aminoáci-dos que están entre el aminoácido 20 hastael 106, y un dominio catalítico que com-prende los aminoácidos entre el 190 y 675,

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Alineamiento en pareja entre la secuencia de cPLA2 y la secuencia 1CJY, utilizando BLAST. El ali-neamiento mostró una semejanza en la secuencia del 94% y una identidad en la secuencia del 97%. Las colum-nas en negro y en gris indican las variaciones presentes en el alineamiento.

Loops

% en proteína 34,57 16,76 48,67

Composición de los residuos de AA de la proteína estudiada.

del cual se encontró que se conserva el mo-tivo lipasa GLSGS (Figura 3).

Se obtuvo el modelo de la cPLA2usandoel servidor de Swiss model empleando losmoldes mencionados, y se halló un porcen-taje mínimo de identidad de 93,42%, co-rrespondiente al molde 1CJYA, con un má-ximo de identidad de 97,6%, corres-pondiente al molde 1BCI; además, los valo-res de P(N) fueron cercanos a cero, lo cualconfirma la semejanza de los modelos conel molde. El modelo obtenido se visualizóusando el programa Deep View, el cualmuestra una pequeña proporción de hélicesalfa y hojas beta y una alta proporción deestructuras aleatorias.

También se emplearon los programas3D-Jigsaw, Modeller y CPH model paraobtener el modelo 3D. Este último mostróvalores de semejanza cercanos al 85%, y

además fue visualizado utilizando un lí-mite de confiabilidad de 0,05, mientraslos programas 3D-Jigsaw y Modellermostraron buenos resultados con porcen-tajes de identidad de 95,7% y 96%, res-pectivamente (Figura 4). Las principalespropiedades de los modelos obtenidosfueron evaluadas y consideran los facto-res predominantes para la calidad del mo-delo (Tabla 2).

Se calculó el RMSD, superponiendo el mol-de 1CJYA con la secuencia de aminoácidoscPLA2 P50393 modelada por los diferentesservidores de modelado por homología em-pleando el programa Swiss pdb Viewer(Deep View), haciendo uso de la opciónMagic Fit e Interactive Magic Fit del pro-grama, donde se ajustaron los carbonos alfade los modelos AAAa05Zac.pdb, mo-

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--------EEEE-----EEEEEEEEE-----------------EEEEEE---------EEEEE-----

--EEEEE-------EEEEEEE------------EEE----------EEEEEE-------HHHHH-----

----------HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH---------------EEEEE----HHHHHHHHHHHHH

HH----HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH---------HHHHHHHHHHH----------

HHHHHHHHHHHHHHH-----EEHHHHHHHHHHHH---------HHHHHHHHH------EEEEE------

------EEEE---------------------------------------HHHHHHHHHHHHHHHHHH--

HHHHHHHHHHHHHHHHHHHH----HHHHHH-H-----------------------HHHHHHHHHHH---

--------HHHHHHHHHHHHHH-HH---------------------------------------

EEEE---HHHH------------EEEEEE-------------HHHHHHHHHHHHH-----------

HHHH----EEEE-----------EEEEEEEEE----------------HHHHHH------------

EEE-----HHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHHH-------EE--HHHHHHHHHH----

-----

Resultado del consenso de estructura secundaria de cPLA2 obtenida con 3 métodos, las “H” en Grisrepresentan alfa hélices, las “E” en negro representan hojas beta y las “-” representan loops.

752 residuos

C2 20-106 PLA2_B 190-675: Dominio catalítico lisofosfolipasa

Dominios de la cPLA2 generados por Pfam.

del.pdb, P50393.pdb y Modweb.pdb con elmolde 1CJYA de estructura conocida porcristalografía de rayos X de resolución 2,5Å. De este modo, para modelos que presen-ten un porcentaje de identidad mayor al90%, se esperaría que el RMSD calculadode los modelos con respecto al molde1CJYA sea de 0,5 Å. Sobre la base de estehecho se espera que los modelos que presen-ten un RMSD inferior al valor mencionadocon anterioridad sean estructuralmente con-

fiables, como es el caso para los modelosAAAa05Zac.pdb y P50393.pdb (Tabla 3).

También se utilizó el servidor Whatcheckpara evaluar la calidad de los modelos. Eneste servidor se considera el valor deZ-value,el cual indica la normalidad de un resultado;este puede ser expresado como un Z-value oZ-score. Este es sólo el número de desviacio-nes estándar que el resultado se desvía del va-lor esperado. Una propiedad de Z-values es

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Moldes 1cjyA,B 1.000 - 25 29

Swiss model AAAa05Zac.pdb 903,5 4 480 73 30 24

CPH Model Model.pdb 883,0 8 511 85 23 27

3D-Jigsaw P50393.pdb 973,3 1 475 73 21 28

Modeller Modweb.pdb 1.050,5 1 23 26

Descripción de los diferentes modelos.

Modelo generado por Swiss model

Modelo generado por 3D-JIGSAW

Modelo generado por CPH models

Modelo generado por Modeller

Modelos obtenidos mediante el uso de diferentes servidores. En cada caso se muestra la cadena prin-cipal y las cadenas laterales. Hojas beta (gris), hélices alfa negro y loops (gris).

que la desviación cuadrática media relativa deun grupo de Z-values (el RMS Z-value) espe-rado es de 1,0. Z-values mayor a 4,0, y me-nor que -4,0 es muy poco común.

Otro tipo de imprecisión lo constituyenlas desviaciones de los valores estereoquí-micos ideales para las longitudes y los án-gulos de enlaces, de acuerdo con los resul-tados reportados por Whatcheck para losdiferentes modelos (Tabla 4), y el valor es-

perado para Z-score. El modelo AAAa05-Zac.pdb presenta una mejor precisión conrespecto a los otros modelos, aunque paraevaluar la calidad de los modelos es necesa-rio ver otros parámetros que sean comple-mentarios, para así determinar si un mode-lo es útil o simplemente no lo es. Gracias aque existen herramientas computacionalesautomáticas vía Internet para evaluar la ca-lidad de un modelo, como por ejemplo3D-Evaluation, el cual hace uso de tres pro-gramas de evaluación de estructura basadoen potenciales: Eval23D, Verify3D yEvTree, los resultados arrojados por dichosprogramas muestra cuál de los distintosmodelos obtenidos por los diferentes servi-dores de modelado por homología son losadecuados (Tabla 5).

La evaluación de los modelos con ProsaII muestra que la curva del modelo

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Å

AAAa05zac.pdb 0,33

CPHmodel.pdb 0,72

P50393.PDB (3D-Jigsaw) 0,25

modwed.pdb (Modeller) 1,47

Cálculo de RMSD empleando DeepView, superponiendo los C-alfa de los mode-los con los diferentes moldes.

Calidad de empaquetamientode 1a. generación

-1,102 -1,603 -1,199 -1,127 -1,157

Calidad de empaquetamientode 2a. generación

-2,479 -3,683 -2,585 -2,686 -3,353(Pobre)

Apariencia del diagrama deRamachandran

-1,948 -0,829 -2,719 -5,976 -0,361

Normalidad de rotámerochi-1/chi-2

-0,994 -1,271 1,897 -1,303 -0,331

Conformación de la cadenaprincipal

-0,627 -1,209 -0,883 -2,947 -2,138

Longitud de enlace 0,320 0,906 1,231 0,514(Ajustado)

1,814(Suelto)

Ángulo de enlace 0,641 1,318 1,108 0,983 1,524

Restricción del ÁnguloOmega

0,227 0,726 0,748 1,205 1,488(Suelto)

Planaridad de la cadenalateral

0,200 0,403 2,805(Suelto)

2,929(Suelto)

2,708(Suelto)

Distribución dihedralimpropio

0,436 1,250 1,548(Suelto)

2,424(Suelto)

2,250(Suelto)

Distribución Inside/ Outside 1,010 1,063 1,034 1,044 1,079

Reporte Whatcheck de los diferentes modelos de la cPLA2 P50393 blanco.

AAAa05Zac.pdb se ajusta más a la curvadel molde 1CJYA, con respecto a las otrascurvas de los otros modelos model.pdb yP50393.pdb. Al analizar la estructura crista-lina de la 1CJY, se encontró que posee re-giones sin estructura como lo son las regio-nes que abarcan los aminoácidos L405-S415, N432-N460 y L498-D539; además,los modelos arrojados por los diferentes ser-vidores de modelado por homología les asig-nan estructuras a dichas regiones, y este he-cho implica que la región que va desde elaminoácido 400 hasta el 575 aproximada-mente de los modelos con respecto al moldedifiera de manera notable (Figura 5).

La evaluación de los modelos con Pro-check determina la calidad estereoquími-

ca de la estructura de una proteína dada(24). Los valores mayores de 90% paralas regiones favorecidas en el diagramade Ramachandran indican que el paráme-tro estereoquímico Phi - Psi es ideal parael modelo propuesto (25). Los valores delas regiones favorecidas (núcleo y permi-tida) para los cuatro modelos (Tabla 6)son mayores a 90%, lo cual pone demanifiesto la calidad de los modelos.

Estudios recientes proponen un mecanis-mo catalítico de la cPLA2 de 85 kDa. La1CJYA, que implica el retiro de una capacerca al sitio activo por la repulsión elec-trostática no específica, del movimiento

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Molde 1CJYA.PDB 0,133 0,314 0,222

Swiss model AAAa05Zac.pdb 0,118 0,271 0,161

CPH model CPHmodel.pdb 0,117 0,277 0,140

3D-Jigsaw P50393.pdb 0,087 0,271 0,140

ModWeb Modwed.pdb 0,117 0,262 -0,354

Evaluación de los modelos por Eval23D, Verify3D y EvTree.

Evaluación de los modelos AAAa05Zac.pdb, model.pdb, 3DJigsaw y el molde 1cjyA empleandoProsa II.

del interdominio inducido por el despla-zamiento de PtdIns (4,5)P2 y la penetra-ción parcial de la membrana por los resi-duos hidrofóbicos del dominio catalítico(26), por lo que la cPLA2 blanco modela-da se espera que posea un mecanismo si-milar debido a su alta homología en cuan-to a secuencia y estructura molecular.

Estudios previos demostraron que laenzima de 85 kDa cPLA2 posee una tríadacatalítica situada en una hendidura pro-funda en el centro de un embudo predo-minante hidrofóbico que rompe selectiva-mente el araquidonil de los fosfolípidos,la serina 228, el ácido aspártico 549 y laarginina 200 (27) (Figura 7). Se determi-nó que dichos residuos de aminoácidos seencuentran en el interior o núcleo de la es-tructura de la proteína (Figura 6). Al ha-cer un análisis de superficie ASA (accesi-bilidad del área superficial) empleando elprograma Mol- Mol, los resultados mues-tran que los residuos de aminoácidos quepresentan una accesibilidad igual o mayor

a 30% se encuentran en la superficie de laestructura, y los restantes en el núcleo dela proteína (28). La estructura revela unatapa flexible (Figura 8) que debe moversepara permitir el acceso del sustrato al sitioactivo, explicando así la activación inter-facial de esta importante lipasa. LacPLA2 de 85 kDa media el lanzamientoagonista-inducido del ácido araquidónicoen muchos modelos de la célula, inclu-yendo macrófagos peritoneales del ratón.La cPLA2 es regulada por un aumento decalcio intracelular, el cual se enlaza a unamino-terminal del dominio C2 e inducesu desplazamiento sobre la membrana nu-clear y el retículo endoplasmático. Lafosforilación de la cPLA2 en S505 por laproteína kinasa mitogen-activados(MAPK) también contribuye a la activa-ción. Para que la cPLA2 pueda cumplir sufunción catalítica, debe cambiar su con-formación estructural de tal modo que losresiduos que hacen parte del centro catalí-tico queden expuestos, para así estar lomás próximo al sustrato y poder interac-

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Residuos en núcleo ypermitida

98,0% 96,6% 98,0% 98,4%

Residuos en núcleo 87,1% (542) 79,4% (497) 85,6% (524) 88,2% (548)

Residuos en la regiónpermitida

10,9% (68) 17,3% (108) 12,4% (76) 10,1% (63)

Residuos en la regióngenerosa

1,0% (6) 2,4% (15) 1,3% (8) 0,8% (5)

Residuos en la región nopermitida

1,0 (6) 1,0 (6) 0,7 (4) 0,8% (5)

No. de Gly 37 37 36 37

No. de Pro 44 44 43 44

Porcentajes de los residuos entre las distintas regiones para los diferentes modelos(AAAa05Zac.pdb), (Mdel.pdb), (P50393.pdb), (Modweb.pdb).

cionar con el fosfolípido de la membranay liberar el ácido araquidónico.

Se encontró teóricamente que los resi-duos que conforman la tríada catalítica(R-193, S-221 y D-542) se encuentran enel interior (núcleo) de la estructura de laproteína. Además se observa que esta re-gión está ubicada en el interior de la pro-teína modelada (Figura 6a).

Reportes anteriores muestran que losresiduos hidrofóbicos (F-35, M-38 yL-39) están expuestos en la cara de unsegmento helicoidal y los residuos (Y-96,V-97 y M98) están expuestos en los ápi-ces de un loop. Estos residuos del domi-nio C2 pueden contribuir significativa-mente a enlazarse con la membrana.

Dichos residuos están en la superficie dela proteína (Figura 6b).

La información obtenida a partir de losresultados de BLAST permite explicarque los modelos construidos serán esta-dísticamente confiables, dado que se con-sidera que las técnicas de modelado porhomología son aplicables cuando la pro-teína problema es similar a una de estruc-tura tridimensional conocida, y su identi-dad a nivel de secuencia entre ambasproteínas sea mayor de 30%. Esto últimopermite afirmar que las plantillas utiliza-das son idóneas para construir un modelo3D. Además de estadísticamente confia-ble, es un modelo estructuralmente ade-cuado para servir de receptor al realizarestudios de acoplamiento molecular.

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a) Accesibilidad superficial de dominio catalítico

%A

SA

No. de residuo

40

15

3530

25

20

105

0

190G 19

3R19

6V 199S

202M 20

5L20

8S21

1L21

4A21

7V 220L

223S

228Y

229T

b) Accesibilidad superficial del dominio C2

No. de residuo

%A

SA

60

80

70

50

40

30

20

10

38Y

0

20A

26G

32L

44S

50R

56F

62P

68F

74P

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Análisis superficial del modelo AAAa05Zac.pdb empleando el programa Mol-Mol, en donde: a) semuestran los aminoácidos S-228 y R-200 del dominio catalítico; están en el interior de la proteína; b) los ami-noácidos F-35, M38, L39, Y96, V97 y M98 del dominio C2 poseen gran afinidad por la membrana.

La predicción de estructura secundariahecha para cPLA2 utilizando los métodosHNN, SSPRO y JPRED indican quecPLA2 es una proteína con una estructurasecundaria formada principalmente poruna conformación de alfa-hélices, conuna pequeña proporción de hoja-beta yuna cantidad muy considerable de estruc-tura no regular. Esta estructura se obtuvohaciendo un consenso entre los tres tiposde métodos utilizados para hacer dichapredicción (Figura 2).

El análisis de dominios de cPLA2

mostró que en el dominio C2, el cual seune al calcio, cuya región abarca los ami-noácidos que están entre el aminoácido 20y el 106, la cPLA2 es activada por nivelesbajos de calcio, pero el calcio no está in-

volucrado en la catálisis, sino que es re-querido para enlazarse con la membrana,en donde los aminoácidos de unión con elcalcio son: D-40, T41, D43, N65, D93,A94, N95 (29). En el otro dominio, undominio catalítico que comprende losaminoácidos entre el 190 y el 675, delcual se encontró que se conserva el moti-vo lipasa L S, revela que la serina228 es un centro catalítico, y el mecanis-mo catalítico de la cPLA2 es similar aotras lipasas que contienen esta tríada ca-talítica (30).

En general, la evaluación hecha por losdiferentes servidores de evaluación de mo-delos como Whacheck, Procheck y3D-Evaluation, permiten inferir que di-chos modelos son aptos y útiles para com-

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Visualización de la tríada catalítica “sitio activo” de la cPLA2 modelada P50393 y la de la estructu-ra cristalina 1CJYA.

prender a fondo su función catalítica. Si seobserva la aplicabilidad de los modelos ob-tenidos y los altos grados de identidad (ma-yor del 90%), de las secuencias de los mol-des y la proteína en blanco, se puedenencontrar inhibidores artificiales que inte-raccionen con la proteína modelada.

Se observa, igualmente, que existendiferencias entre los resultados obteni-dos por cada servidor de evaluación delos modelos construidos por los diferen-tes servidores de modelado por homolo-gía. Estas diferencias conducen a esco-ger con qué servidor de modeladotrabajar para obtener buenos modelosde proteínas. Por último, la calidad delos modelos comparativos de proteínassólo puede evaluarse a posteriori, por-que, a diferencia de las técnicas experi-mentales, normalmente no intervienenen su construcción datos obtenidos en ellaboratorio que sirvan de control.

Los servidores de modelado por homo-logía, como: Swiss model, 3D Jigsaw,CPH model y Modeller, entre otros, re-sultan ser herramientas computaciona-les idóneas para el diseño estructural deproteínas, siempre que en las bases dedatos de proteínas exista una plantilla omolde con un porcentaje de identidadmuy alto y que abarque toda la longitudde la proteína.

Swiss model aventaja a los otros servi-dores gracias a que puede construir mode-los de forma automática. Además, es demuy fácil manejo: solo se necesita que elinvestigador envíe la secuencia, y en po-cos minutos le devuelve un modelo de laproteína. Pese a esta automatización, aun-que puede ser útil para generar ideas, serecomienda hacer ciertos ajustes al mode-lo antes de proseguir a trabajar con él.

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Los residuos de la tríada (negro), capa de residuos aniónica (gris).

Los servidores de evaluación de pro-teínas, como: Procheck, Whatcheck,3D-Evaluation, Prosa II, resultan idóneospara evaluar la calidad de los modelos ob-tenidos para la cPLA2 estudiada.

Los modelos 3D obtenidos de lacPLA2 estudiada pueden ser útiles en eldiseño racional de experimentos de muta-génesis dirigida, para elucidar y com-prender cuál puede ser el mecanismo defuncionamiento de dicha enzima o para eldiseño de fármacos que se unan a ella, asícomo también para hacer estudios de inte-racción ligando-proteína, proteína-pro-teína, y por último realizar la caracteriza-ción estructural del modelo.

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