organizacija nukleusa interfazne diferencirane celije

Organizacija nukleusa interfazne diferencirane ćelije

NUKLEUS

1) STRUKTURA (hromozomske teritorije, nukleusne organele)

2) FUNKCIJA (formiranje nukleusnih prekursora za sintezu proteina u citoplazmi)

Saznanja o ćelijama do kojih se došlo posredstvom novih citoloških metoda i

kombinacijom citoloških sa metodima molekularne biologije, biohemije, strukturne biologije

bacila su potpuno novo svetlo na organizaciju nukleusa kao ćelijske organele. Dosadašnja

saznanja predstavljala su nukleus kao najvažniju, centralnu organelu ćelije, osnovni kriterijum

po kome se eukarioti razlikuju od prokariota ″zaduženu″ za pakovanje dugačkih molekula

DNK koji u okviru svake vrste čine genom. Takođe, nukleus je izdvajan kao kompartment

ćelije u kome se odigravaju esencijalni procesi za ćeliju: (1) transkripcija molekula RNK i

biogeneza preribozoma u smislu ″opsluživanja″ translacione mašinerije (sinteze proteina) u

citoplazmi, i (2) replikacije/reparacije molekula DNK u smislu održavanja stabilnosti,

umnožavanja i diseminacije genoma tokom života ćelije. Danas se uviđa da je nukleus po

značaju za ćeliju potpuno ravnopravan sa ostalim organelama.

Ipak, tokom života ćelije (ćelijski ciklus sisarske ćelije) nukleus ima potpuno

»podeljenu« organizaciju: interfazni je orjentisan na formiranje prekursora citoplazmatične

translacione mašine, a mitotički na pravilnu segregaciju genoma i održanje funkcije ćerki

ćelija. Kako je 90 % ćelija adultnog sisarskog organizma u stanju diferenciranosti (Go faza

ćelijskog ciklusa) i nema mitotički potencijal (nikada ne prolazi ostale faze ćelijskog ciklusa i

mitozu) može se, citološki, razmatrati organizacija interfaznog nukleusa diferencirane ćelije u

kontekstu sinteze prekursora potrebnih za translaciju u citoplazmi, tj. sintezu proteina.

Interfazna, diferencirana ćelija ima citološke zadatke da nasledni materijal (diploidna

garnitura/homologi hromozomi) spakuje u nukleus dijametra do 10 mikrometara, a da pri tome

aktivni geni budu pristupačni za transkripciju (iRNK, rRNK, tRNK), obradi iRNK, rRNK, i da

obrađen, upakovan materijal iRNK, tRNK i preribozoma »transportuje« u citoplazmu.

1


Struktura interfaznog nukleusa diferencirane ćelije

Kako je to bilo nekad

Struktura interfaznog nukleusa proučavana pola veka na elektronskim mikrografijama

bila je identična onoj na nivou svetlosnog mikroskopa: unutrašnjost nukleusa je iz hromatina

koji se po bojenim karakteristikama »deli« na tamni- heterohromatin i svetli-euhromatin i

strukturno uobličenog nukleolusa. Nikakva pravilnost u rasporedu genoma nije bila uočljiva

iako se znalo za mitotičke hromozome.

Naime, jedina citološki uočljiva organizacija genoma ćelije postojala je u mitozi. U

mitozi ćelija sisara (otvorena ortomitoza) nukleus gubi svoju interfaznu organizaciju,

nukleusni ovoj vizuelno nestaje i hromatin se transformiše (kondenzacijom) u set strukturno

uobličenih mitotičkih hromozoma definisane strukture (označavaju se i kao metafazni

hromozomi jer se najbolje vide i proučavaju u metafazi mitoze). Svaka vrsta ima tačno

određeni broj mitotičkih hromozoma. Citogenetičke studije metafaznih hromozoma pokazuju

stalnost njihove organizacije: na krajevima hromozoma su regioni koji se označavaju kao

telomere. Centromera je primarno suženje i u odnosu na njen položaj metafazni hromozomi se

klasifikuju kao metacentrični, telocentrični, akrocentrični itd. Telo hromozoma pruža se od

centromere ka telomerama, i u odnosu na položaj centromere »deli« se na kraći i duži krak.

Neki hromozomi (kod čoveka je pet takvih hromozoma) poseduju i sekundarno suženje.

Bojenje Gimsa metafaznih hromozoma »otkrilo« je još jednu stalnu strukturu: tamne

(G) i svetle (R) trake (pruge) na telu hromozoma. Biohemijskim i molekularno-biološkim

metodima utvrđeno je da su svetle trake regioni bogati G-C parovima (aktivni geni, rano

replicirajući geni DNK), dok su tamne trake bogate A-T parovima (heterohromatin,

»besmisleno ponavljajuće« sekvence, kasno replicirajući regioni). Sa punim pravom G i R

trake mogle su se poistovetiti sa hetero-, tj. eu-hromatinom, respektivno. Ovo otkriće postavilo

je centralno citološko pitanje: »Da li ovakva organizacija postoji i u interfaznom jedru,

odnosno da li postoji interfazni hromozom kao organizacioni kontrapunkt mitotičkog

hromozoma«?

Kako je to danas: organizacija interfaznog hromozoma

Interfazni hromozom zaista poseduje sve organizacione domene mitotičkog,

metafaznog hromozoma (telomere, centromere, sekundarna suženja, G i R trake) koji su na

specifičan način uobličeni u nukleusu. Njegova organizacija studirana je na modelu

hromozoma limfocita i HeLa ćelija (a-g).

2


Svaki od homologih interfaznih hromozoma okupira u nukleusu diskretnu teritoriju

koja se naziva hromozomskom teritorijom (najčešće nisu lokalizovani jedan pored drugog).

Većina hromozomskih teritorija lokalizovana je uz nukleusni ovoj iako postoje i centralno

pozicionirani hromozomi.

(a) Interfazni hromozom limfocita broj 18 leži na nukleusnoj lamini, telomerama je

vezan za nukleusni ovoj (preko lamine i specifičnih receptora unutrašnje membrane

nukleusnog ovoja, vidi *Organizacija nukleusne lamine). Telo hromozoma u vidu

hromozomske teritorije radijalno se pruža ka centru nukleusa i »naslanja« na nukleolus.

Površina hromozomske teritorije oivičava interhromozomski prostor i nije glatka jer na sebi

nosi brojne duboke uvrate i izvrate sa hromatinsime petljama (aktivni geni su na površini

hromozomske teritorije). Celokupni interfazni hromozom upakovan je u tu strukturu-

hromozomsku teritoriju- pomoću nukleoskeleta. Sekvence DNK hromozoma kojima se vezuje

za nukleoskelet specifične su po broju i rasporedu za svaki od hromozoma.

(b) Centromera je u slučaju hromozoma 18 humanog limfocita prikačena za nukleusnu

laminu. To je transkripciono inaktivan domen. Centromera (a kod kvasca i telomere) ima

sposobnost gašenja gena: aktivacijom geni se udaljuju od centromere, a gašenjem joj se

približavaju.

(c) Stupanj kondenzacije je različit u okviru jedne hromozomske teritorije.

Konstitutivni heterohromatin se nalazi uz nukleusnu laminu, delimično u unutrašnjosti

hromozomske teritorije (srž) i kao nukleolusni heterohromatin (na vrhu). Konstitutivni

euhromatin je lokalizovan na površini hromozomske teritorije. Ostali, veći deo hromozoma u

stanju je dinamičke izmene između fakultativnog hetero- i euhromatina (ako je potrebna

transkripcija napr. gena 23 koji je u unutrašnjosti hromozomske teritorije i visoko

kondenzovan, heterohromatičan doći će do njegove aktivacije i on će rasplitanjem preći u

euhromatin i pomeriti se ka površini teritorije, i obrnuto).

(d) Raspored regiona interfaznog hromozoma bogatih A-T i G-C parovima, odnosno

regiona siromašnih genima/bogatih genima je relativno stalan unutar hromozomske teritorije.

Genima-siromašni hromatin lociran je na periferiji, u bliskom kontaktu sa nukleusnom

laminom u nivou nukleusnog ovoja i infoldacijom lamine u srž teritorije kao i oko nukleolusa.

Genima-bogati hromatin lociran je između.

(e) Funkcioni domeni interfaznog hromozoma su petljaste strukture sa kojih se aktivno

transkribuje. Interhromozomski kompartment nukleusa (interhromozomski kanali) »prihvata«

transkripte, obrađuje ih i transportuje u formi multimernih kompleksa splajsozoma.

3

Organizacija nukleusa interfazne diferencirane ćelije Dakle, osim petlje kao strukturne forme u nukleusu se susreću fibrili i globule, odnosno

granule. Njihovo formiranje, pozicija i pokretljivost duboko reflektuju funkciju nukleusa.

Specifično organizovane hromozomske teritorije

Ćelije ženki sisara poseduju u genomskoj garnituri dva X-hromozoma od koji je samo

jedan aktivan i organizovan u opisanu hromozomsku teritoriju. Drugi X-hromozom inaktiviran

je, heterohromatizovan i formira tzv. Barovo telo (bukalna sluzokoža) ili »bubanjski štapić«

(heterofilni granulocit).

Nukleusne organele

Hromatin nije jedina strukturno uočljiva komponenta nukleusa. Postoji čitav niz

strukturno uobličenih domena, nukleusnih tela koja se sa pravom mogu označiti kao nukleusne

organele. Iako organele nisu uspostavljene membranom specifična organizacija nukleoskeleta

i pridruženih proteina »odvaja« ih funkciono od ostatka nukleusa.

Nukleolus je najranije uočena i najbolje studirana organela nukleusa. »Nastaje« iz oblasti

sekundarnog suženja (citološki se označava kao organizator nukleolusa, B. McClintock, 1934)

metafaznih hromozoma u telofazi uporedo sa restauracijom interfaznog nukleusa. Može biti

pozicioniran i centralno i periferno, uz nukleusni ovoj. Broj nukleolusa varira (1-5), ali je

njihova površina u odnosu na nukleus konstantna (veći broj sitnijih nukleolusa ili manji broj

krupnijih). Odlikuje se bazofilijom– na nivou svetlosne mikroskopije uočava se kao plava

granula.

Pod elektronskim mikroskopom uočavaju se tri domena, organizovana i obojena na

specifičan način. Bledi, »prazni« ili fibrilarni kružni regioni u centru označeni su kao pars

chromosoma. To je region hromozoma u kome su smešteni višestruko ponovljeni ribozomalni

geni. Oko njih se koncentrično raspoređuju tamne, guste oblasti od tankih fibrila (koji

dominiraju) i sitnih granula– pars fibrosa. A oko njih se lepezasto, zrakasto pruža pars

granulosa, koju čine mnogobrojne krupne granule. U zavisnosti od broja i pozicije

hromozoma koji poseduju sekundarno suženje u interfaznom nukleusu mogu se formirati

različite morfološke forme nukleolusa: prstenasti ili mrežasti nukleolusi. Ne radi se o

različitim tipovima nukleolusa već o razlici u broju i rasporedu ribozomalnih gena u pars

chromosoma koji formiraju jednu ili više transkripciono aktivnih petlji. U slučaju jedne petlje,

vizuelno će se formirati prstenasti, a u slučaju više petlji mrežasti nukleolus. Strukturnu

»podršku« organizaciji nukleolusa daje specifičan nukleoskelet i protein nukleolin.

4


Nukleolusu su pridružene dve nukleusne organele: perinukleolarni (perinukleolusni)

kompartment, koji je »prilepljen« uz nukleolus i SAM68. Ima ih od 1-10, i varijabilne su

veličine (0.25-1μm).

Kahalovo (Kajalovo) telo– ima ih od 1-10, loptastog su oblika (0.1-1μm). Njima se

najčešće pridružuju tzv. blizanac telo (gemini) i seckajuće telo. Broj im je isti kao i broj

Kahalovih tela (blizanci) ili je upola manji od njih (seckajuće telo).

U nekim ćelijama uz nukleusnu laminu uočava se specifično loptasto telo-PCG telo (to

je region gde je centromera prikačena za nukleusni ovoj-pericentromerni heterohromatin). Ima

ih 2-100, veličine 0.2-1.5μm.

PML telo se uočava u ćelijama obolelih od promijeloidne leukemije. Ima ih od 10-30,

veličine od 0.3- 1μm.

Pored loptastih, u nukleusu postoje i kompartmenti koju su nukleusne pege (tačke,

mrlje, eng. speckles), perihromatinske fibrile, perihromatinske granule i interhromatinske

granule. Nukleusne pege su brojne, ima ih 25-50, citološki se javljaju u dve forme: klaster

(0.8-1.8μm) i granule (20-25nm).

Perihromatinski fibrili i perihromatinske granule, kako im ime kaže, nalaze se na

periferiji hromatina, odnosno hromozomskih teritorija i to: fibrili svuda oko hromozomske

teritorije, a granule su uglavnom pojedinačne i uz nukleusne pore. Fibrili su različitih dužina i

debljina, a granule su dijametra 25-30nm sa »praznim« oreolom.

Interhromatinske granule lokalizovane su u interhromozomskim prostorima, veličine

oko 20nm, najčešće su u klasterima koji »odgovaraju« mestima lokalizacije nukleusnih pega.

Zapravo, kada se posmatra pod svetlosnim mikroskopom vide se pega, a pod elektronskim

mikroskopom su interhromatinske granule.

Funkcija nukleusnih organela

Nukleus interfazne diferencirane ćelije sintetiše, obrađuje i transportuje u citoplazmu iRNK,

tRNK, preribozome i male ribonukleoproteinske komplekse kao SRP (vidi ***Poliribozomi-

citoplazmatični i granuliranog retikuluma). Nukleusne organele su zapravo dinamične oblasti

nukleusa koji učestvuju i kompartmentalizuju ove procese. Kako?

Transkripcija rRNK, tRNK i biogeneza ribozoma

Da je nukleolus vitalan za život ćelije uočio je još Kasperson 1940. god. U nukleolusu se

odigrava sinteza rRNK i tRNK kao i asambliranje preribozoma. U pars chromosoma nalaze se

mnogo puta ponovljeni geni za rRNK, koji se prepisuju policistronski u jedan dugačak

5

Organizacija nukleusa interfazne diferencirane ćelije primarni transkript- 45 S rRNK. Kako se sintetiše, 45 S (forma fibrila) se istovremeno

udaljava od pars chromosoma ka pars fibrosa.

U pars fibrosa on će biti iseckan na tri rRNK koje ulaze u sastav ribozomalnih

subjedinica (18 S, 28 S i 5.8 S rRNK), savijen u prostoru i udružen sa proteinima, dajući

sukcesivno preribozom. Njima će se pridružiti 5 S rRNK koja se sintetiše u oblasti

euhromatina. Zato se u pars fibrosa vide fibrile (međustupnjevi seckanja, 18 S, 28 S i 5.8 S

rRNK) i sitne granule (splajsozomi i asamblirajući preribozomi). U pars granulosa dospevaju

gotovo formirani preribozomi na finalnu doradu (kompletiranje ribozomalnih proteina). Zato

su regioni nukleolusa zapravo »proces praćen na putu«.

Transkripcija i obrada iRNK

Transkripcija iRNK odigrava se na petljastim domenima hromozomskih teritorija.

Nasintetisanim iRNK molekulima pridružuju se proteini koji će ih štititi i obrađivati tokom

vođenja do nukleusnih pora kroz interhromozmske hodnike. Obrađivanje primarnog

transkripta iRNK prilično je složen proces koji uključuje isecanje introna, povezivanje egzona,

formiranje specifičnih krajeva itd. Zatim se obrađene iRNK kompleksovane sa proteinima

transportuju kroz kompleks nukleusne pore.

Nukleusne organele su vizuelni «dokaz« kompartmentalizacije transkripcije, obrade

iRNK i preribozoma u nukleusu i transporta do kompleksa nukleusnih pora

Sa citološkog gledišta opisana priča izgleda ovako: perihromatinski fibrili (primarni

transkripti iRNK) pomeraju se iz oblasti periferije hromozomskih teritorija u unutrašnjost

interhromatinskih prostora i postupno obrađuju (interhromatinske granule u nukleusnim

pegama- splajsozomalna ostrvca) i »postaju« perihromatinske granule koje su pristigle u

oblast nukleusnih pora. A šta sa ostalim, brojnim nukleusnim organelama? One su depoi svih

proteina, enzima (pol I, II i III), transkripcionih faktora, splajsozomalnih faktora i dr., koji su

neophodni za odigravanje gore opisanih procesa. Tako se Kahalovo telo smatra najvećim

depoom pobrojanih faktora koji se u njemu asambliraju u komplekse- transkrptozome ili

splajsozome i kao preformatirani kompleksi »prilaze« mestima delovanja. Nepostojanje

membrana oko nukleusnih organela može se objasniti upravo zahtevom za brzom izmenom

molekularnih kompleksa i molekula između domena.

Jedino što se citološki u interfaznom nukleusu ne može uočiti u opisanom putu jeste

transkripcija (najverovatnije usled brzine procesa, i maskiranosti transkriptozomima i pratećim

proteinima). Ovaj proces moguće je citološki studirati in vitro, tako na elektron-

mikrografijama uočavamo strukturu »božićno drvce«- citološki dokaz sinteze i obrade

6

Organizacija nukleusa interfazne diferencirane ćelije primarnih transkripata iRNK (odn. rRNK): RNK-polimeraza kao niz granula na niti DNK, niz

rastućih fibrila u jednom smeru (rastući primarni transkript), a na njihovim vrhovima granule-

splajsozomi.

Ipak, u živom svetu postoje ćelije koje poseduju posebne, specijalizovane hromozome

koji su usled svoje »preuveličane« funkcije sami strukturno »preuveličani« tako da je moguće

uočiti procese transkripcije i in vivo.

Specijalizovani hromozomi

Četkasti (petljasti) hromozomi su mejotički spareni hromozomi u oocitama, spojeni

hijazmama (4 molekula DNK). To su džinovski hromozomi, dobro se vide pod svetlosnim

mikroskopom, poseduju džinovske petlje i ekstremno su aktivni u transkripciji (oocite imaju

veliku potražnju za preribozomima).

Politeni, višenitni, paf-hromozomi (puff) nalaze se u nukleusima pljuvačnih žlezdi

Drosophila. Jako su zadebljali i na njima se uočavaju svetle i tamne trake (potpuno liče na

zadebljale metafazne hromozome) i balončići odn. pafovi sa leve i desne strane u nivoima

pojedinih gena. Izgled i višenitnost hromozoma potiču od mnogostruke duplikacije DNK,

(funkciona poliploidija). Interesantno je da replikacija DNK duž hromozoma nije homogena,

odnosno telo hromozoma je višenitno, dok je nukleolus loptast, sa mnogo manje niti. Naime,

strukturni geni nalaze se u jednoj kopiji u telu hromozoma, a u nukleolusu ribozomalni geni su

višestruko ponovljeni, tako da se različitim stepenom replikacije nukleolusa i tela hromozoma

kompenzuje razlika u »dozi« gena. U nivou pafova dominantne su petlje (mesta aktivne

transkripcije) – Balbijanijevi prstenovi, sa kojih se transkripcijom formiraju Balbijanijeva

telašca (iRNK) sa proteinima.

Transport translacione mašine u citoplazmu kroz kompleks pore

Kompleks nukleusne pore je dijametra 9nm. Sve što je veće od toga transportuje se

aktivnim transportom pomoću regulatornih faktora. Regulatorni faktori prepoznaju s jedne

strane to što želimo da transportujemo, i sa druge strane- kompleks pore. (Citološki je

ispravnije reći transport kroz kompleks nukleusne pore, a ne nukleo-citoplazmatski transport).

Da li se produkti transkripcije- iRNK i rRNK transportuju odvojeno ili zajedno kroz kompleks

pore? Stara citološka teorija informozoma postulira da iRNK iz nivoa euhromatina prolazi

kroz nukleolus gde vezuje »svoje« preribozome i tRNK čineći funkcioni paket. Citološki, u

kontekstu strukture nukleusa, deluje »rasipnički« da ćelija sintetiše iRNK, rRNK i tRNK na

7

Organizacija nukleusa interfazne diferencirane ćelije različitim mestima, da one izlaze kroz različite komplekse pora, a onda u citoplazmi

nasumično formiraju poliribozome.

Balbijanijevi prstenovi, tj. Balbijanijeva telašca su citološki dokaz da kroz kompleks

nukleusne pore prolaze informozomi (raspliće se Balbijani telašce, prateći proteini ostaju u

nukleusu, pora se širi, iRNK prelazi u citoplazmu, pri čemu se odmah asamblira sa već

prisutnim ribozomima u poliribozome i translacija odmah započinje).

Signali za smer transporta kroz kompleks nukleusne pore- nukleus-lokalizujuša

sekvenca (NLS) i nukleus eksportna sekvenca (NES)

Šta određuje u kom smeru će se dešavati transport kroz poru? (nukleus i citoplazma

aktivno komuniciraju). Smer određuju regulatorni proteini: importini (unose u nukleus) i

eksportini (iznose iz nukleusa). Najpoznatije klase su a i ß importin, i eksportin1.

Sistem prepoznavanja – određeni domeni proteina koji se transportuje kroz kompleks pore od

1-8 aminokiselinasu- nukleus lokalizujući signal, (NLS sekvenca) i nukleus eksportna

sekvenca (NES). Importin se vezuje za NLS, dok eksportin prepoznaje NES. Citoplazmatični i

nukleusni domeni kompleksa pore prihvataju transportne komplekse, pora se širi i omogućava

transport. Širenje pore omogućava vezivanje importina ili eksportina za nukleoporine

kompleksa pore, jer dovodi do »otpuštanja« određenog broja nukleoporina. Kako se importini

i eksportini transportuju zajedno sa molekulima neophodno je njihovo vraćanje u matični

kompartment (nukleus ili citoplazma). Ran-GTP –azni sistem vrši vraćanje

importina/eksportina tako što postoji u dve forme Ran-GTP i Ran-GDP koji predominantno

imaju različitu distribuciju u nukleusu, odnosno citoplazmi i to je »sila« koja ih tera da se

vraćaju u matični kompartment, noseći pri tome i importine/eksportine.

Prstenaste lamele

Poseban način transporta translacionih mašina u citoplazmu jesu prstenaste lamele. To

su paketi paralelno poređanih membrana organizovanih kao nukleusni ovoj sa dvema

membranama, cisternom i porama, jer i potiču od njih. Naime, u slučaju kada ćelija ima

izrazitu potrebu za sintezom proteina i to na granulisanom retiklulumu, nukleus je prinuđen da

osim informozoma citoplazmi transportuje i membrane. Ti paketi membranskih lamela

sukcesivno sazrevaju u granulirani endoplazmin retikulum. Sadržaj nukleusnih pora

transformiše se u poliribozome, membrane fuzionišu i formira se sistem endomembrana za

sintezu proteina.

8


Sinteza proteina odigrava se u različitim kompartmentima ćelije

Iako se sinteza proteina na modelu poliribozma školski studira u citoplazmi ili na

membranama endoplazminog retikuluma (granulirani endoplazmin retikulum), u ćeliji postoje

i drugi kompartmenti na i u kojima se odigrava translacija. Tako, mitohondrije poseduju

sopstvene ribozome i vrše translaciju u matriksu, poliribozomi se mogu prikačiti i za

spoljašnju membranu nukleusnog ovoja, ali i sam nukleus može vršiti sintezu proteina

(procenjuje se na 10-15% ukupne sinteze proteina u ćeliji).

9

organizacija nukleusa interfazne diferencirane celije

Documents