1: Bloque generalidades

Organización de las clases de regulación

2: regulación del inicio de la transcripción

3: organización de la cromatina

4: procesos post transcripcionales

1

Control Post-transcripcional de genes que codifican para proteínas

2

* Modificaciones: splicing, capping, cola de PoliA, EDICION * Transporte a través del poro nuclear * Estabilidad * Localización del mRNA

Mecanismo de Importe nuclear

(i) Splicing alternativo: Combinación de exones en diferentes combinaciones

Control del procesamiento del RNA

3

Estabilidad de mARNs en citoplasma

4

Degradación de mRNA

Los niveles de ARNm reflejan el equilibrio entre la síntesis (transcripción) y la degradación del ARNm. Un ARNm estable permite la síntesis de proteínas

Importancia de las proteínas de unión al ARN (RBP), que se unen a los subconjuntos de los ARNm y coordinan su regulación post-transcripcional. Cabe destacar que son cientos de RBP que se prevé en cada genoma eucariótico.

5

Poliadenilación:

Mutaciones en la secuencia de poliadenilación (AAUAAA ) se ha asociado con patologías como:

•TALASEMIAS: En el gen HBA2, que codifica para la subunidad α2 de la hemoglobina en pacientes con talasemia, •Gen ATP1B1que codifica para subunidad β1 (Na++K+)ATPase, encontrado en pacientes con

problemas de alta presión sanguínea. •LUPUS ERITEMATOSO

Control de la expresión génica por metabolito IRE (Iron Response Element) es una proteína que controla la traducción de Ferritina, la principal proteína almacenadora de hierro en vertebrados, y la degradación del mRNA que codifica para el receptor de transferrina (TrRmRNA). El mecanismo es dependiente de la concentración de Fe en sangre.

Regulación a niveles de mRNA en 5´UTR y 3´

Importancia de las proteínas de unión a DNA: RNA Binding Proteins (RBP)

6

Modificaciones post-transcripcionales: capping, splicing, cola de poliA y EDICION y metilación de RNA

7

EDICION: “Mecanismo genético y bioquímico por le cual secuencias de ARN nuclear mitocondrial y t-ARN son modificadas de su versión “establecida” en el genoma”.

Mecanismo: modificación somática que altera nucleótidos en el ARN en lugar del ADN, generando un proceso por el cual la secuencia del tránscripto es diferente de la establecida en el genoma.

EDICION DEL RNA: ocurre después que se transcribió

y antes de ser traducidoLa edición ocurre en núcleo, en mitocondrias o en plástidos. Ocurre por dos mecanismos: 1) Sustitución : alteración química de nucleótidos

en forma individual (equivalente a mutación puntual). Ej. Caso de ApoB

2) Inserción o deleción de nucleótidos, interviene el gRNA

En mamíferos:

Proceso de EDICION de RNA: alteración de las secuencias de pre.mARNs

8

Otros ejemplos en animales:

•Adaptación de los pulpos a

cambios de temperatura del agua

• Receptor de Glutamato y la

memoria a corto plazo.

9

Otras Modificaciones post-transcripcionales del RNA Metilación de Adenosinas Metilación de Citosinas Modificaciones químicas Enzimas responsables: (metil transferasas para RNA) N6-methyladenosine (m6A) 5-methylcytosine (m5C) Afectan estabilidad, procesamiento (splicing), localización de RNA (m y T) Boxuan Simen Zhao, Ian A. Roundtree and Chuan He. “Post-transcriptional

gene regulation by mRNA modifications.” doi:10.1038/nrm.2016.132

Patologías: cáncer, obesidad, diabetes, malformaciones de desarrollo embrionario.

Cómo empiezo a estudiar el RNA?

Trabajando con RNA… •Trabajar rápido

• utilizar inhibidores de RNAsa •Trabajar siempre en frío •Utilizar siempre guantes •Seleccione sus pipetas y tips

Qué método aplicar?

Todo es cuestión de cómo se lo mire

Características de la Hibridación de Ac. Nucleicos

Sistemas para estudiar generación de tránscriptos

1) Nuclear run on: establece la frecuencia de iniciación de producción de tránscriptos 2) Nuclear run off: establece la velocidad de generación de tránscriptos

3) G-Less cassette: establece la fuerza de un promotor

4) Mapeo s1 del extremo 5´ y método de “primer extension”, (otra manera de mapear extremos 5´ de los genes): Localiza extremos de RNAs y determina la cantidad de RNA en un momento celular específico. 5) Ensayo de protección de nucleasas para definir extremos 3´de un gen

Un nuclear run-on assay se lleva a cabo para

identificar los genes que están siendo

transcriptos en un cierto punto de tiempo. Es un

método utilizado para medir la tasa de

transcripción de genes in vivo.

Cerca de 106 núcleos celulares se aíslan e

incuban con NTPs marcados. Los genes que

están siendo procesados (transcriptos) son

detectados por hibridación del RNA extraído

utilizando zondas específicas en una

membrana.

La transcripción por nueva RNAPol se inhibe

por la adición de sarkosil (detergente). Por lo

tanto, sólo se detectan (marcan) los genes que

está siendo transcriptos (incorporando NTPs

marcados)

Los transcriptos que fueron sintetizados antes

de la adición de la marca, no serán detectados

porque carecen de la marca.

Esta técnica puede utilizarse para comparar

patrones de transcripción de genes en núcleos

de diferentes tipos de células, o en diferentes

momentos

1) Nuclear RUN ON:

Núcleos de células hepáticas, riñón y cerebro: son incubados con rNTPs (32P-UTP) marcado radiactivamente con 32P. RNA marcado se hibrida a diferentes cDNA y se revela por autorradiografía. 1 a 12 cDNA fijos en membranas de nitrocelulosa-filtros (proteínas de hígado) A-Actina aT a-tubulina bT b-tubulina pV plásmido (negativo) tRNA (positivo) 3 antitripsina 4 BSA 6 transferrina Se puede realizar también con células: se exponen las células durante un corto tiempo (5min) a un precursor de RNA marcado y luego se determina la cantidad de RNA por hibridización con un DNA clonado

Aplicación: Síntesis Diferencial de 12 mRNAs que codifican genes específicos de hígado aplicando run on o análisis de cadenas nacientes

2) Run-off transcription Determina velocidad de transcripción

• Un fragmento de DNA conteniendo el gene a transcribir es cortado con enzimas de restricción dentro de la región que se transcribe.

• Transcribir in vitro el fragmento truncado por ER con NTPs marcados. Cuando la RNA pol alcanza el “trunque” esto detiene (run-off) la transcripción.

• Determine la longitud de transcripto y compare con la localización de la ER utilizada.

Transcripción in vitro: Incubo: * Extracto Núcleos aislados * NTPs * UTP* * Inhibidor de RNAsas * Buffer

3) G-free cassete o G-less cassette

• Se realiza transcripción “in vitro” con CTP, ATP y UTP* y sin GTP.

• La transcripción se detendrá cuando la primer G sea requerida resultando en un stop de transcripción, pero a una longitud de transcriptos conocida (355pb)

• Separar los transcriptos en un gel y determine la actividad autoradiográfica

Es una técnica que determina fuerza de un promotor utilizando un plásmido sintético de 355 pares de bases, que carece de guanosinas en la hebra 5´-3´ y se inserta a partir del final del promotor cuya fuerza se desea evaluar.

3´ 5´

El nucleótido en DNA que codifica el extremo 5´del mRNA es el sitio de inicio de la transcripción. Este método constituye una primera etapa para definir una región PROMOTORA.

Mapeo S1 del extremo 5’

Primer extension assay, otra manera de mapear extremos 5´de un gen

Mapeo del extremo 5´con la endonucleasa S1 y extensión con cebador

Resumiendo ambos métodos comparativamente

Ensayo de protección a nucleasa para definir el extremo 3´de un gen

22

5: control de inicio de síntesis proteica

Las levaduras y su adaptación al medio

hidrocarbonado que las nutre

• Proceso fundamental en la mayoría de las interacciones biológicas

– Traducción de señales

– División celular y diferenciación

– Expresión de genes

– Metabolismo, secreción

– Replicación

– Transcripción, splicing y traducción

– Control del ciclo celular

Interacción proteína-proteína

Doble hibrido

Sistema de Doble Híbrido para estudiar interacción Proteína-Proteína Aplicada por primera vez por Stanley Fields y Song en 1989, esta técnica fue diseñada originalmente para detectar interacciones proteína-proteína usando el activador transcripcional GAL4 de la levadura Saccharomyces cerevisiae. La transcripción activada por GAL4 daba lugar a una proteína implicada en la utilización de galactosa, lo que constituía la base para la selección. Desde entonces, el mismo principio se ha ido adaptando para dar lugar a otros métodos alternativos, incluyendo algunos capaces de detectar interacciones ADN-proteína y ADN-ADN

• El ensayo de doble híbrido rinde información sobre la interacciones proteínas-proteínas

• Basado en los sistemas de GAL4: su dominio de activación y su dominio de unión a AND.

• X e Y son las proteínas de interés

• Si X e Y interaccionan, hay expresión del gen reportero.