(p.a.c. balard · l’analyse élémentaire organique (c, h, n, s, o) magalie lefeuvre, lmp,...
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PLATEFORME D’ANALYSE ET DE CARACTÉRISATION (P.A.C. BALARD)
Pr. Enjalbal [email protected]
04 67 14 38 19
A quoi sert … la Spectrométrie de Masse Haute Résolution couplée à la Mobilité Ionique?
PLATEFORME D’ANALYSE ET DE CARACTÉRISATION (P.A.C. BALARD)
Programme
Nacelles ‘spectrométrie de masse’ et ‘analyse élémentaire’ dans la PAC Chimie Balard: des outils de détermination de formules brutes de composés organiques Pr Christine Enjalbal, IBMM, Co-responsable de la PAC Chimie Balard
L’analyse élémentaire organique (C, H, N, S, O) Magalie Lefeuvre, LMP, Université de Montpellier 2
Principes généraux de la spectrométrie de masse haute résolution (HR-MS) et de la mobilité ionique (IM-MS) Gilles Valette, LMP, Université Montpellier 2
L’apport du Synapt G2-S pour la caractérisation structurale. Guillaume Cazals, LMP, Université Montpellier 2
Question-Réponses
PLATEFORME D’ANALYSE ET DE CARACTÉRISATION (P.A.C. BALARD)
10- Analyses élémentaires/mesures chiroptiques
11- Spectrométrie de masse 12- Nanoséparation et analyses
2
PAC 12 nacelles
1
3 4 5
6
8 9
10
11
12
7
détermination de formules brutes de composés organiques
PLATEFORME D’ANALYSE ET DE CARACTÉRISATION (P.A.C. BALARD)
Nacelles 10, 11 et 12
Localisation:
Université Montpellier 2,
Bâtiment 17, Rez-de-chaussée
Laboratoire de Mesures Physiques
Service commun de recherche UM2
http://www.univ-montp2.fr/recherche-menu-principal/services-communs-de-la-recherche/lmp
Plateau technique Institut des Biomolécules Max Mousseron http://www.ibmm.univ-montp1.fr/?-presentation,195-
PLATEFORME D’ANALYSE ET DE CARACTÉRISATION (P.A.C. BALARD)
Composés organiques
Echantillons de synthèse ou extraits naturels
Poids moléculaires faibles à élevés (petites molécules / Biomolécules)
Identification
Formule brute (composition élémentaire de type CHNO)
Formule semi-développée (informations structurales/connectivité)
Structure tridimentionnelle (configuration absolue des centres de chiralité)
PLATEFORME D’ANALYSE ET DE CARACTÉRISATION (P.A.C. BALARD)
Outils analytiques usuels
RMN liquide: Formule semi-développée / Etudes structurales
Spectrométrie de masse: Mesure de la masse moléculaire
Analyse élémentaire: Mesure de la quantité d’éléments non métalliques
Rayon X: Configuration absolue des centres stéréogéniques
Conditionnement de l’échantillon
Liquide: RMN et spectrométrie de masse
solubilité dans solvants organiques /eau
Solide : Analyse élémentaire et RX
poudre amorphe ou cristal
PLATEFORME D’ANALYSE ET DE CARACTÉRISATION (P.A.C. BALARD)
Détermination de formule brute (CxHyNzOWX)
RMN liquide: Formule semi-développée / Etudes structurales
Spectrométrie de masse: Mesure de la masse moléculaire
Analyse élémentaire: Mesure de la quantité d’éléments non métalliques
Rayon X: Configuration absolue des centres stéréogéniques
Objectifs
Contrôle qualité de produits de synthèse
Confirmation de structure (molécule attendue)
Confirmation de pureté (molécule unique )
Aide à l’identification de structures inconnues
Impureté/sous-produit de synthèse, produits naturels, …
PLATEFORME D’ANALYSE ET DE CARACTÉRISATION (P.A.C. BALARD)
Réponses apportées par la Spectrométrie de masse
Détermination de la masse moléculaire (g/mol):
Mesure de la valeur m/z (masse/nombre de charge de l’ion détecté)
Précision de mesure : basse résolution / haute résolution (HR-MS)
Détermination de la composition élémentaire:
Petites molécules (< 500 g/mol , délicat au-delà)
Mesure haute résolution (HR-MS) impérative
Confirmation de formule brute (molécule attendue )
!! Pas d’information sur la pureté de l’échantillon !!
PLATEFORME D’ANALYSE ET DE CARACTÉRISATION (P.A.C. BALARD)
Réponses apportées par l’Analyse élémentaire
Mesure de la quantité massique des éléments C, H, N, S, O
CxHyNzOWX : Adéquation entre valeurs mesurées et théoriques
CxHyNzOWX : Inadéquation entre valeurs mesurées et théoriques
Confirmation de formule brute et de la pureté de l’échantillon (molécule attendue et pureté validée)
Formule brute non valide (molécule différente de celle attendue) OU
Echantillon contaminé (pureté non validée)
PLATEFORME D’ANALYSE ET DE CARACTÉRISATION (P.A.C. BALARD)
Programme
Nacelles ‘spectrométrie de masse’ et ‘analyse élémentaire’ dans la PAC Chimie Balard: des outils de détermination de formules brutes de composés organiques Pr Christine Enjalbal, IBMM, Co-responsable de la PAC Chimie Balard
L’analyse élémentaire organique (C, H, N, S, O) Magalie Lefeuvre, LMP, Université de Montpellier 2
Principes généraux de la spectrométrie de masse haute résolution (HR-MS) et de la mobilité ionique (IM-MS) Gilles Valette, LMP, Université Montpellier 2
L’apport du Synapt G2-S pour la caractérisation structurale. Guillaume Cazals, LMP, Université Montpellier 2
Question-Réponses
PLATEFORME D’ANALYSE ET DE CARACTÉRISATION (P.A.C. BALARD)
Magalie LEFEUVRE [email protected]
04 67 14 49 47
Les rencontres 2014
A quoi sert… L’Analyse élémentaire
PLATEFORME D’ANALYSE ET DE CARACTÉRISATION (P.A.C. BALARD)
Nacelle 10 Analyses élémentaires et Mesures chiroptiques
Laboratoire de Mesures Physiques Institut des Biomolécules Max Mousseron
Localisation: Université Montpellier 2
Bâtiment 17, Rez de chaussée CC0010
PLATEFORME D’ANALYSE ET DE CARACTÉRISATION (P.A.C. BALARD)
L’analyse élémentaire est une technique qui permet de déterminer le pourcentage en masse du Carbone, de l’Hydrogène, de l’Azote, du Soufre et de l’Oxygène dans les composés organiques.
A quoi sert l’analyse élémentaire?
PLATEFORME D’ANALYSE ET DE CARACTÉRISATION (P.A.C. BALARD)
Flash EA 1112 series
Thermo Finnigan
CHNS-O
PLATEFORME D’ANALYSE ET DE CARACTÉRISATION (P.A.C. BALARD)
UMX5 Comparator
Mettler Toledo
Précision 0.1µg et Max 5.1g
PLATEFORME D’ANALYSE ET DE CARACTÉRISATION (P.A.C. BALARD)
Préparation de l’échantillon
Le LMP n’est pas équipé pour peser des produits sensibles à l’air ni les liquides.
Il est demandé de fournir un échantillon solide d’une quantité de produit voisine de 10mg.
Le produit non utilisé pour les analyses pourra être récupéré en même temps que les résultats.
2 pesées par échantillons Entre 0.8mg et 3mg
CHNS Capsules en Etain
O Capsules en Argent
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Méthode CHNS
L’analyseur permet de doser simultanément par combustion les éléments: Azote, Carbone, Hydrogène, Soufre.
Méthodologie: Introduction de l’échantillon dans le four de combustion à 940°C Combustion éclair de la nacelle et de l’échantillon Conversion catalytique des gaz au fur et à mesure de la combustion et fixation de l’oxygène en excès dans un tube unique en quartz Séparation chromatographique Détection du signal par un catharomètre TCD (sensiblité, grande vitesse de réponse…)
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Méthode CHNS
Chromatogramme CHNS
Azote
Carbone
Hydrogène Soufre
PLATEFORME D’ANALYSE ET DE CARACTÉRISATION (P.A.C. BALARD)
Méthode O
L’analyseur permet de doser par pyrolyse l’Oxygène. Méthodologie: Introduction de l’échantillon dans le four régulé à 1000°C Conversion des gaz de pyrolyse en CO Séparation chromatographique Détection du signal par un catharomètre TCD
PLATEFORME D’ANALYSE ET DE CARACTÉRISATION (P.A.C. BALARD)
Méthode O
Chromatogramme O
Oxygène
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Methionine Methionine avec 5% de H2O
Methionine avec 10% de H2O
% C 40.24 38.21 36.21
%H 7.44 7.63 7.82
%N 9.39 8.91 8.45
%S 21.49 20.40 19.34
%O 21.44 24.84 28.18
Exemple n°1:produit pas sec
PLATEFORME D’ANALYSE ET DE CARACTÉRISATION (P.A.C. BALARD)
Methionine Methionine avec 5% de CH3CN
Methionine avec 10% de CH3CN
% C 40.24 41.15 42.05
%H 7.44 7.44 7.44
%N 9.39 10.62 11.84
%S 21.49 20.42 19.36
%O 21.44 20.38 19.32
Exemple n°2:produit avec trace de solvant
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Précision de l’analyseur Précision garantie par le fournisseur pour les déterminations CHNS et O
Valeur théorique Valeur expérimentale et écart maximal tolérable
(en % absolu)
0.01% (100ppm) 100ppm ± 10
0.10% 0.1% ± 0.01
1.00% 1.00% ± 0.02
10.00% 10.00% ± 0.1
50.00% 50.00% ± 0.3
90.00% 90.00% ± 0.3
Tests réalisés sur des produits organiques supposés purs, avec 10 déterminations.
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Tarification
Tarifs UM2 Tarifs Académiques Tarifs industriels
1 ou 2 éléments = 6€ 3 éléments = 8€
4 éléments = 10€ Oxygène = 8€
1 ou 2 éléments = 12€ 3 éléments = 16€ 4 éléments = 20€
Oxygène = 16€
1 ou 2 éléments = 50€ 3 éléments = 70€ 4 éléments = 90€
Oxygène = 70€
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Programme
Nacelles ‘spectrométrie de masse’ et ‘analyse élémentaire’ dans la PAC Chimie Balard: des outils de détermination de formules brutes de composés organiques Pr Christine Enjalbal, IBMM, Co-responsable de la PAC Chimie Balard
L’analyse élémentaire organique (C, H, N, S, O) Magalie Lefeuvre, LMP, Université de Montpellier 2
Principes généraux de la spectrométrie de masse haute résolution (HR-MS) et de la mobilité ionique (IM-MS) Gilles Valette, LMP, Université Montpellier 2
L’apport du Synapt G2-S pour la caractérisation structurale. Guillaume Cazals, LMP, Université Montpellier 2
Question-Réponses
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Spectre de masse
Massif isotopique
Résolution
Exactitude
Mobilité ionique
Synapt G2S
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Petit rappel:
La spectrométrie de masse permet de transformer des
molécules dans leur état naturel en ions à l’état gazeux et
d’obtenir leur mase moléculaire m en analysant leur
rapport masse / charge, noté m/z, où z est la charge de
l’ion. C’est une balance moléculaire.
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100 200 300 m/z
Intensité ou
intensité relative
Abscisse: Rapport m/z
Ordonnée: Intensité ou intensité relative
Spectre de masse:
400
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29
Quelles informations nous donne une SM
La masse moléculaire grâce à la valeur du rapport m/z du pic moléculaire
Informations sur la composition élémentaire grâce à la précision de la mesure
et du massif isotopique
Informations sur la structure grâce aux fragmentations
100 200 300 m/z
Intensité ou
intensité relative
400
M
PLATEFORME D’ANALYSE ET DE CARACTÉRISATION (P.A.C. BALARD)
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Unité de mesure:
- La masse moléculaire s’exprime en g/mol, en Dalton (Da)
ou en unité de masse atomique unifiée (U).
- Unités parfaitement identiques
- Da = 1/12 de la masse d’un atome de carbone 12 soit
1,66 x 10-27 kg
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La molécule a été ionisée grâce à la perte ou au gain d’un proton. On observe
l’ion [M + H]+ en positif ou [M - H]- en négatif.
La masse moléculaire est déduite de la rapport m/z du pic moléculaire.
Si l’ion observé, en mode, positif a une masse de m/z = 327g/mol, la masse
moléculaire du produit sera :
[M + H]+ = 327 M = 327 - H = 327 -1 = 326 g/mol
L’ existence d’isotopes se traduit par la présence de plusieurs pics moléculaires
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Quelle masse mesure-t-on?
Masse chimique ou moyenne:
C’est le barycentre (centroïde) des masses
des pics constituant le profil isotopique, c’est-
à-dire la masse qui prend en compte la masse
des éléments donnée par le tableau
périodique (C = 12,011; …).
Masse monoisotopique:
C’est la masse du premier pic du profil
isotopique, c’est-à-dire celle qui ne prend en
compte que les masses des isotopes les plus
stables (H1, C12, O16, S32, N14, …).
m/z
Masse Moyenne
m/z
Masse monoisotopique
PLATEFORME D’ANALYSE ET DE CARACTÉRISATION (P.A.C. BALARD)
• Massif isotopique
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PLATEFORME D’ANALYSE ET DE CARACTÉRISATION (P.A.C. BALARD)
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Isotopes: Un élément est souvent constitué de plusieurs isotopes présents
dans diverses proportions nommées abondance.
PLATEFORME D’ANALYSE ET DE CARACTÉRISATION (P.A.C. BALARD)
35
Elément Masse atomique
Nucléide Masse Exacte
Abondance relative %
H 1,00797 1H
D 1,00783 2,01410
99,985 0,0151
C 12,01115 12C
13C
12,00000 13,00336
98,90 1,10
N 14,0067 14N
15N
14,0031 15,0001
99,63 0,37
O 15,9994
16O
17O
18O
15,9949 16,9991 17,9992
99,76 0,04 0,20
P 30,974 31P 30,974 100
Isotopes: Un élément est souvent constitué de plusieurs isotopes présents
dans diverses proportions nommées abondance.
PLATEFORME D’ANALYSE ET DE CARACTÉRISATION (P.A.C. BALARD)
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Cas des isotopes de faible abondance: exemple 1
CH4 M/z = 17
13CH4 M/z = 18
CH3D M/z = 18
13CH3D M/z = 19
1,1 %
100 %
13CH4
CH3D
CH4
PLATEFORME D’ANALYSE ET DE CARACTÉRISATION (P.A.C. BALARD)
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Cas des isotopes de faible abondance: exemple 2
C100H202 M/z = 1404,5
13CC99H202 ; C100H201D M/z = 1405,5
13C2C98H202 ;
13C1C98H201D ;C100H200 D2 M/z = 1406,5
13C3C97H202 ;
13C2C98H201D ; 13CC99H200D2 ; C100H200 D3 M/z = 1407,5
…
PLATEFORME D’ANALYSE ET DE CARACTÉRISATION (P.A.C. BALARD)
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Cas des isotopes de faible abondance: exemple 2
C100H202 M/z = 1404,5
13CC99H202 ; C100H201D M/z = 1405,5
13C2C98H202 ;
13C1C98H201D ;C100H200 D2 M/z = 1406,5
13C3C97H202 ;
13C2C98H201D ; 13CC99H200D2 ; C100H200 D3 M/z = 1407,5
100 %
90,5 %
54,7 %
19,7 %
Massif isotopique
PLATEFORME D’ANALYSE ET DE CARACTÉRISATION (P.A.C. BALARD)
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Cas des isotopes très abondants (Cl et Br) : exemple 1
Brome a deux isotopes 79Br (50,69 % ) et 81Br (49,31 %)
100 %
1,08 %
97,3 %
1,05 %
CH3Br Mmonoisotopique = 93,9 g/mol Mmoyenne = 94,9 g/mol
P
P+1
P+2
P+3
PLATEFORME D’ANALYSE ET DE CARACTÉRISATION (P.A.C. BALARD)
40
Cas des isotopes très abondants: exemple 1
Brome a deux isotopes 79Br (100 % ) et 81Br (97,3 %)
CBr4 Mmonoisotopique = 327,7 g/mol Mmoyenne = 331,6 g/mol
17,6 %
0,19 %
68,5 %
0,7 %
100 %
1,08 %
64,8 %
0,7 % 15,7 %
0,17 %
P+4
PLATEFORME D’ANALYSE ET DE CARACTÉRISATION (P.A.C. BALARD)
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Nombre et l’intensités relatives des pics du massif isotopique: (a+b)n
a = abondance relative de l’isotope le plus léger
b = abondance relative de l’isotope le plus lourd prise égal à 1
n = Nombre d’atomes de l’élément considéré
Cas du Chlore
Deux isotopes 35Cl (100%) et 37Cl (32,5%)
a = 3 pour l’atome de 35Cl (car environ 3 fois plus abondant que 37Cl)
b = 1 pour l’atome de 37Cl
PLATEFORME D’ANALYSE ET DE CARACTÉRISATION (P.A.C. BALARD)
42
Cl
(a+b)
3+1
Cl2
(a+b)2
a2+2ab+b2
9+6+1
Cl3
(a+b)3
a3+3a2b+3ab2+b3
27+27+9+1
Cl4
(a+b)4
a4+4a3b+6a2b2+4ab3+b4
81+108+54+12+1
PLATEFORME D’ANALYSE ET DE CARACTÉRISATION (P.A.C. BALARD)
• La résolution (R)
43
PLATEFORME D’ANALYSE ET DE CARACTÉRISATION (P.A.C. BALARD)
44
H
H/2
M
DM
R = M/DM
Résolution: Rapport de la masse du composé sur la
largeur du signal à mis hauteur.
PLATEFORME D’ANALYSE ET DE CARACTÉRISATION (P.A.C. BALARD)
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C50H102
R = 5 000
Q-tof
PLATEFORME D’ANALYSE ET DE CARACTÉRISATION (P.A.C. BALARD)
46
C50H102
R = 35 000
Synapt G2S
PLATEFORME D’ANALYSE ET DE CARACTÉRISATION (P.A.C. BALARD)
47
Une mesure dite « Haute Résolution » est surtout
effectuée pour obtenir une valeur de masse exacte.
Attention: La résolution permet d’obtenir des
mesures précises, mais pas nécessairement des
mesures exactes.
L’exactitude dépend de l’étalonnage.
PLATEFORME D’ANALYSE ET DE CARACTÉRISATION (P.A.C. BALARD)
48
Exactitude & precision
Exactitude, Pas de precision
Precision, Pas d'exactitude
Pas de precision, Pas d'exactitude
PLATEFORME D’ANALYSE ET DE CARACTÉRISATION (P.A.C. BALARD)
• L’exactitude
49
PLATEFORME D’ANALYSE ET DE CARACTÉRISATION (P.A.C. BALARD)
50
Exactitude: Obtenue par la qualité de la calibration.
Avant sur Q-tof: Ajout d’une « lock mass »
dans la solution d’analyte.
Inconvénients: Interférences potentielles,
suppression d’ionisation, …
Sur SYNAPT: source lockSpray
PLATEFORME D’ANALYSE ET DE CARACTÉRISATION (P.A.C. BALARD)
51
Lock mass infusée par un
second sprayer
Basculement du baffle
programmé
Enregistrement séparé du
spectre de référence et du
spectre de l’analyte.
Elimination des interférences
entre le lock mass et les
analytes.
PLATEFORME D’ANALYSE ET DE CARACTÉRISATION (P.A.C. BALARD)
52
Lock mass infusée par un
second sprayer
Basculement du baffle
programmé
Enregistrement séparé du
spectre de référence et du
spectre de l’analyte.
Elimination des interférences
entre le lock mass et les
analytes.
Exactitude sur la mesure
PLATEFORME D’ANALYSE ET DE CARACTÉRISATION (P.A.C. BALARD)
53
Grace à la précision de la mesure, nous pouvons simuler
l’analyse élémentaire de la molécule, c’est-à-dire déterminer la
nature et le nombre d’atomes qui constituent la molécules
étudiées.
C’est un traitement mathématique, qui peut être renforcé par
la comparaison des massifs isotopiques (théorique et
expérimental)
PLATEFORME D’ANALYSE ET DE CARACTÉRISATION (P.A.C. BALARD)
Haute résolution
Calcul de l’écart de masse :
Masse exacte : 400,0000
Masse mesurée : 400,0020
Erreur en ppm : 0,002 / 400 x 106 = 5 ppm
(erreur limite maximum tolérée)
PLATEFORME D’ANALYSE ET DE CARACTÉRISATION (P.A.C. BALARD)
55
Limitations de la mesure de masse exacte :
Pour une composition élémentaire C0-100H3-74N0-4O0-4
Masse nominale de 118 Da : le plus proche voisin est à 34 ppm (soit à 0,004
g/mol)
Masse nominale de 500 Da : 5 composés pour une erreur de 5 ppm (soit
0,0025 g/mol)
Masse nominale de 750,4 Da : 626 composés pour une erreur de 5 ppm (soit
0,0375 g/mol). Pour avoir une seule masse, il faut une erreur de 0,018 ppm.
PLATEFORME D’ANALYSE ET DE CARACTÉRISATION (P.A.C. BALARD)
56
L’apport de la haute résolution
PLATEFORME D’ANALYSE ET DE CARACTÉRISATION (P.A.C. BALARD)
• La mobilité ionique
57
PLATEFORME D’ANALYSE ET DE CARACTÉRISATION (P.A.C. BALARD)
58
- Théorie proposée en 1903 par P Langevin
- Première mesure de mobilité ionique en 1931
- Elle consiste à soumettre des molécules ionisées à un champ
électrique dans un courant de gaz. Les ions se déplacent suivant le
champ électrique à une vitesse qui dépendra de leur interaction avec
le gaz, c'est-à-dire de leur masse, de leur taille et de leur forme : on
parle de séparation suivant la mobilité.
PLATEFORME D’ANALYSE ET DE CARACTÉRISATION (P.A.C. BALARD)
59
PLATEFORME D’ANALYSE ET DE CARACTÉRISATION (P.A.C. BALARD)
60
Vitesse de diffusion: Vd = K.E
PLATEFORME D’ANALYSE ET DE CARACTÉRISATION (P.A.C. BALARD)
61
Vitesse de diffusion: Vd = K.E
PLATEFORME D’ANALYSE ET DE CARACTÉRISATION (P.A.C. BALARD)
62
Quand la charge augmente, le temps de drift diminue.
Si la section efficace de collision augmente (taille ou forme
plus grande), le temps de drift augmente aussi.
PLATEFORME D’ANALYSE ET DE CARACTÉRISATION (P.A.C. BALARD)
Programme
Nacelles ‘spectrométrie de masse’ et ‘analyse élémentaire’ dans la PAC Chimie Balard: des outils de détermination de formules brutes de composés organiques Pr Christine Enjalbal, IBMM, Co-responsable de la PAC Chimie Balard
L’analyse élémentaire organique (C, H, N, S, O) Magalie Lefeuvre, LMP, Université de Montpellier 2
Principes généraux de la spectrométrie de masse haute résolution (HR-MS) et de la mobilité ionique (IM-MS) Gilles Valette, LMP, Université Montpellier 2
L’apport du Synapt G2-S pour la caractérisation structurale. Guillaume Cazals, LMP, Université Montpellier 2
Question-Réponses
PLATEFORME D’ANALYSE ET DE CARACTÉRISATION (P.A.C. BALARD)
L’apport du Synapt G2-S pour la caractérisation
structurale.
Guillaume Cazals
Tél: 04-67-14-38-04
PLATEFORME D’ANALYSE ET DE CARACTÉRISATION (P.A.C. BALARD)
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Appareillage complet de LC-HRMS installé en Avril 2013
Chaîne chromatographique : Acquity UPLC H-Class (Waters)
Spectromètre de masse : Synapt G2-S (Waters)
PLATEFORME D’ANALYSE ET DE CARACTÉRISATION (P.A.C. BALARD)
66
Schéma de principe
PLATEFORME D’ANALYSE ET DE CARACTÉRISATION (P.A.C. BALARD)
67
Schéma de principe
Cellule de mobilité ionique et de collision
Source d’ionisation
Analyseur Quadripolaire
Analyseur Temps de vol
PLATEFORME D’ANALYSE ET DE CARACTÉRISATION (P.A.C. BALARD)
- Couplage avec la chromatographie liquide (LC/MS).
- Méthodes d’ionisation douces : Peu de fragmentation.
- Elle est utilisée pour l’étude de molécules comme des peptides, proteines,
sucres, carbohydrates, …
- Les solvants protiques utilisés doivent être volatils (MeOH, ACN, H2O).
68
Sources d’ionisation
Source Dual EScI : ESI et APCI
PLATEFORME D’ANALYSE ET DE CARACTÉRISATION (P.A.C. BALARD)
- Analyse de composé solide, liquide, en solution.
- Polymères, molécules apolaires, hydrocarbures.
- Désorption thermique
- Risque de pyrolyse
69
Sources d’ionisation
Source ASAP (Atmospheric Solids Analysis Probe)
PLATEFORME D’ANALYSE ET DE CARACTÉRISATION (P.A.C. BALARD)
70
Principe de l’ASAP
PLATEFORME D’ANALYSE ET DE CARACTÉRISATION (P.A.C. BALARD)
71
Exemple d’application : petite molécule
I
Br S
CH3
CH3
CH3
C4H2BrIS
M+·
α-pinene
C10H16
[M+H]+
PLATEFORME D’ANALYSE ET DE CARACTÉRISATION (P.A.C. BALARD)
72
Exemple d’application : polymère
PEG400
44Da
44Da
44Da
PLATEFORME D’ANALYSE ET DE CARACTÉRISATION (P.A.C. BALARD)
73
Composé issue de la pyrolyse du PP
Lattimer, R. P. J. Anal. Appl. Pyrolysis 1993, 26, 65-92
Polypropylene
PLATEFORME D’ANALYSE ET DE CARACTÉRISATION (P.A.C. BALARD)
- Résolution du temps de vol = 35 000
- Précision de mesure :
1 mDa pour m/z < 400Da
1 ppm pour 400Da < m/z < 700Da
- Accès aux expériences de MSMS
74
Analyseur
Analyseur en Tandem Q-Tof
PLATEFORME D’ANALYSE ET DE CARACTÉRISATION (P.A.C. BALARD)
L’apport de la haute résolution
Ecart entre P et P+1 = 0.17 donc z = 6 Signature isotopique de certains éléments
0,17
0,17
56Fe
54Fe
PLATEFORME D’ANALYSE ET DE CARACTÉRISATION (P.A.C. BALARD)
Elemental Composition Report
Single Mass Analysis
Tolerance = 5.0 PPM / DBE: min = -1.5, max = 50.0
Element prediction: Off
Number of isotope peaks used for i-FIT = 3
Monoisotopic Mass, Even Electron Ions
212 formula(e) evaluated with 1 results within limits (up to 20 best isotopic matches for each mass)
Elements Used: C: 0-100 H: 0-150 N: 0-30 O: 0-30
Mass Calc. Mass mDa PPM DBE i-FIT Norm Conf(%) Formula
195.0881 195.0882 -0.1 -0.5 5.5 775.6 n/a n/a C8 H11 N4 O2
C8 H10 N4 O2
Mmonoisotopique = 194.08 g/mol
PLATEFORME D’ANALYSE ET DE CARACTÉRISATION (P.A.C. BALARD)
77
C28 H37 N5 O7
Mmonoisotopique = 555.27 g/mol
PLATEFORME D’ANALYSE ET DE CARACTÉRISATION (P.A.C. BALARD)
78
Elemental Composition Report
Single Mass Analysis
Tolerance = 5.0 PPM / DBE: min = -1.5, max = 50.0
Element prediction: Off
Number of isotope peaks used for i-FIT = 3
Monoisotopic Mass, Even Electron Ions
2830 formula(e) evaluated with 12 results within limits (up to 20 closest results for each mass)
Elements Used:
C: 0-100 H: 0-150 N: 0-30 O: 0-40
Minimum: -1.5
Maximum: 1.0 5.0 50.0
Mass Calc. Mass mDa PPM DBE i-FIT Norm Conf(%) Formula
556.2772 556.2771 0.1 0.2 12.5 719.7 0.026 97.45 C28 H38 N5 O7
556.2785 -1.3 -2.3 17.5 723.4 3.742 2.37 C29 H34 N9 O3
556.2758 1.4 2.5 7.5 726.2 6.529 0.15 C27 H42 N O11
556.2758 1.4 2.5 18.5 727.8 8.184 0.03 C25 H30 N15 O
556.2744 2.8 5.0 13.5 729.9 10.241 0.00 C24 H34 N11 O5
556.2790 -1.8 -3.2 -0.5 732.5 12.850 0.00 C16 H42 N7 O14
556.2753 1.9 3.4 25.5 732.8 13.143 0.00 C40 H34 N3
556.2776 -0.4 -0.7 5.5 735.0 15.316 0.00 C13 H34 N17 O8
556.2790 -1.8 -3.2 10.5 735.1 15.431 0.00 C14 H30 N21 O4
556.2763 0.9 1.6 0.5 735.5 15.796 0.00 C12 H38 N13 O12
556.2763 0.9 1.6 11.5 738.3 18.603 0.00 C10 H26 N27 O2
556.2749 2.3 4.1 6.5 738.4 18.771 0.00 C9 H30 N23 O6
PLATEFORME D’ANALYSE ET DE CARACTÉRISATION (P.A.C. BALARD)
- Exemple avec la fragmentation de peptides Nomenclature des ions fragments de peptides , schéma général :
2 séries d’ ions
Ions b : partie N-terminale
Ions y : partie C-terminale
2 séries d’ ions
Ions b : partie N-terminale
Ions y : partie C-terminale
Ions b : partie N-terminale
Ions y : partie C-terminale
H2NNH
HN
NH
HN
OH
O
O
O
O
O
R1
R2
R3
R4
R5
H2N
OH
1 2 3 4 5
12345
b4
a4
y1
Ions b Ions a- CO
Ions y
H2NNH
HN
NH
HN
OH
O
O
O
O
O
R1
R2
R3
R4
R5
H2N
OH
1 2 3 4 5
12345
b4
a4
y1
Ions b Ions a- CO
Ions b Ions a- CO
Ions y
“Proteomics, peptide sequencing and the fragmentation mechanisms of small organic ions” Journal of massspectrometry (2000), 35
Roepstorff P., Fohlman J. Biomed. Mass Spectrom. 1984; 11: 601
Expérience MSMS
PLATEFORME D’ANALYSE ET DE CARACTÉRISATION (P.A.C. BALARD)
Fragmentation d’un pentapeptide [M+H]+ = 556.2772 Da
[M+H]+
iY
b4
0.5ppm
a4
0.8ppm
iF
1.6ppm
b3
0ppm
Y – G – G – F – L
y2
1.1ppm
b2
0.5pmm
b4 b3 b2
y2
iY
0ppm
GF-CO
2.2ppm
M+H 0.2ppm
PLATEFORME D’ANALYSE ET DE CARACTÉRISATION (P.A.C. BALARD)
81
Expérience de mobilité ionique : Caractérisation structurale
81
Cellule de mobilité ionique et de collision
Source d’ionisation
Analyseur Quadripolaire
Analyseur Temps de vol
PLATEFORME D’ANALYSE ET DE CARACTÉRISATION (P.A.C. BALARD)
Expérience de mobilité ionique : Caractérisation structurale
Collision CID Collision CID
PLATEFORME D’ANALYSE ET DE CARACTÉRISATION (P.A.C. BALARD)
Expérience de mobilité ionique : séparation de composé isobarique
PGAHIWEAGAK
Mmonoisotopique = 1135.58 g/mol
VEYLASITLK
Mmonoisotopique = 1135.65 g/mol
PLATEFORME D’ANALYSE ET DE CARACTÉRISATION (P.A.C. BALARD)
Monochargé Dichargé
©2012 Waters Corporation 76
PLATEFORME D’ANALYSE ET DE CARACTÉRISATION (P.A.C. BALARD)
MD Tri 13
5450_024.raw : 1
2 mobilités pour m/z 1136.6
5450_024.raw : 1
©2012 Waters Corporation 78
+1
+2 +3
PLATEFORME D’ANALYSE ET DE CARACTÉRISATION (P.A.C. BALARD)
B
A
©2012 Waters Corporation 79
PLATEFORME D’ANALYSE ET DE CARACTÉRISATION (P.A.C. BALARD)
Ions B
Ions A
Spectre avant séparation
PLATEFORME D’ANALYSE ET DE CARACTÉRISATION (P.A.C. BALARD)
5450_028.raw : 2
Ions B
Ions A
5450_028.raw : 2
©2012 Waters Corporation 82
PLATEFORME D’ANALYSE ET DE CARACTÉRISATION (P.A.C. BALARD)
Ions B
Ions A
Spectre complet
b2 b3
b4
y6
b5
b4
b7
PLATEFORME D’ANALYSE ET DE CARACTÉRISATION (P.A.C. BALARD)
Expérience de mobilité ionique : Etude d’une molécule « lasso »
Coutrot et al., A pH-Sensitive Peptide-Containing Lasso Molecular Switch, Molecules, 2013, 18, 11553-11575.
PLATEFORME D’ANALYSE ET DE CARACTÉRISATION (P.A.C. BALARD)
Coutrot et al., A pH-Sensitive Peptide-Containing Lasso Molecular Switch,
Molecules, 2013, 18, 11553-11575.
(a) CH3CN
(b) CH3CN/CH2Cl2 30/70
(c) CH3CN/CH2Cl2 20/80
(d) CH3CN/CH2Cl2 10/90
(e) CH2Cl2
PLATEFORME D’ANALYSE ET DE CARACTÉRISATION (P.A.C. BALARD)
Expérience de mobilité ionique : Caractérisation structurale
Exemple de triterpénoïde
Extrait naturel de plantes aux propriétes anti-inflammatoires
PLATEFORME D’ANALYSE ET DE CARACTÉRISATION (P.A.C. BALARD)
Expérience de mobilité ionique : fragmentation CID en ‘Trap’
PLATEFORME D’ANALYSE ET DE CARACTÉRISATION (P.A.C. BALARD)
94
Y-LMP14022107.raw : 1
PLATEFORME D’ANALYSE ET DE CARACTÉRISATION (P.A.C. BALARD)
Y-LMP14022107.raw : 1
95
Même m/z mais temps de dérive (drift time)
différents
PLATEFORME D’ANALYSE ET DE CARACTÉRISATION (P.A.C. BALARD)
Expérience de mobilité ionique : fragmentation CID en ‘Trap’ + ‘Transfer’
PLATEFORME D’ANALYSE ET DE CARACTÉRISATION (P.A.C. BALARD)
97
Y-LMP14022106.raw : 1
PLATEFORME D’ANALYSE ET DE CARACTÉRISATION (P.A.C. BALARD)
98
Y-LMP14022106.raw : 1
Même temps de dérive
A
B
PLATEFORME D’ANALYSE ET DE CARACTÉRISATION (P.A.C. BALARD)
99
Temps de dérive A
Temps de dérive B
PLATEFORME D’ANALYSE ET DE CARACTÉRISATION (P.A.C. BALARD)
Expérience de mobilité ionique : séparation d’isomères de position
- En collaboration avec l’équipe 12 de l’IBMM et CEA, DSV, Marcoule
- Greffage du TMPP sur un l’amine N-ter d’un pentapeptide de séquence PICAK
- Fragmentation en MALDI-TOF-TOF donne un ion non attendu
TMPP-PICAK
PLATEFORME D’ANALYSE ET DE CARACTÉRISATION (P.A.C. BALARD)
101
572.976
1103.291
180.992
975.256
606.955
755.157
858.144
929.224500.990
364.908 1057.39470.029 150.981 826.205642.034
540.894
302.973
0
1000
2000
3000
4000
5000
Inte
ns. [a
.u.]
200 400 600 800 1000 1200m/z
a2a3
a4iP
*
*
*
*
- K
*
MH+TMPP*-P I C A K
a2a3
a4
b4+H2O
b4+H2O
C29H36O10PS
- CH=SH
d3d2
- Fonctionalisation de la cystéine ? Présence d’isomères ?
PLATEFORME D’ANALYSE ET DE CARACTÉRISATION (P.A.C. BALARD)
Analyse du composé en ESI-IMS-MS
- Mobilogramme obtenu pour l’ion 1103.5 Da (TMPP-PICAK)
- Deux composés isomères séparés en mobilité ionique
PLATEFORME D’ANALYSE ET DE CARACTÉRISATION (P.A.C. BALARD)
Analyse du composé en ESI-IMS-MSMS
(A)
(B)
a2
TMPP-SH
a3 a4
b4+H2O
TMPP
TMPP
TMPP
M+
Molécule A : TMPP
greffé sur l’amine N-
terminale du peptide
Molécule B : TMPP greffé sur le
groupement sulfhydryle de la chaîne
latérale de la cystéine (C)
PLATEFORME D’ANALYSE ET DE CARACTÉRISATION (P.A.C. BALARD)
104
Retour sur l’analyse de PP : ASAP-IMS-MS
PLATEFORME D’ANALYSE ET DE CARACTÉRISATION (P.A.C. BALARD)
105
Composé issue de la pyrolyse du PP
Lattimer, R. P. J. Anal. Appl. Pyrolysis 1993, 26, 65-92
Polypropylene
PLATEFORME D’ANALYSE ET DE CARACTÉRISATION (P.A.C. BALARD)
106
Retour sur l’analyse de PP : ASAP-IMS-MS
PLATEFORME D’ANALYSE ET DE CARACTÉRISATION (P.A.C. BALARD)
Programme
Nacelles ‘spectrométrie de masse’ et ‘analyse élémentaire’ dans la PAC Chimie Balard: des outils de détermination de formules brutes de composés organiques Pr Christine Enjalbal, IBMM, Co-responsable de la PAC Chimie Balard
L’analyse élémentaire organique (C, H, N, S, O) Magalie Lefeuvre, LMP, Université de Montpellier 2
Principes généraux de la spectrométrie de masse haute résolution (HR-MS) et de la mobilité ionique (IM-MS) Gilles Valette, LMP, Université Montpellier 2
L’apport du Synapt G2-S pour la caractérisation structurale. Guillaume Cazals, LMP, Université Montpellier 2
Question-Réponses
PLATEFORME D’ANALYSE ET DE CARACTÉRISATION (P.A.C. BALARD)
108