渡辺 明朗

平成23年 12月 18日

PAM・Masson trichrome 染色１）染色の原理と染色のポイント

２）試薬・染色液成分の役割、調製のポイント

３） MT染色/１％酢酸水洗浄の意義、色素の溶解性と分別

愛知県臨床衛生検査技師会病理細胞検査研究班 基礎講座

テーマ：腎臓の病理細胞診検査

Elastica-Masson(ゴールドナー変法）の原理

PAM染色(Periodic Acid-Methenamine Silver Stain)

・Gomoriは、Bauer反応（クロム酸酸化―シッフ試薬）を基に、銀アンモニア液を使用して糖関連物質の染色を試みたが、安定した染色結果が得られないので、種々アミン（窒素Nを含む）を検討し、 メセナミンが最も適していることを見出し、メセナミン銀液を使用。

・JonesはGomoriのメセナミン銀法を応用して、腎糸球体鍍銀染色のPAM染色へと発展させた。

糖関連物質の染色

腎糸球体の染色

クロム酸 ＋ メセナミン銀

過よう素酸＋ メセナミン銀Periodic acid + Methenamin Silver

GomoriJones

19461953

メセナミン

Ag＋

メセナミン銀液では、銀イオンに対してメセナミンが過剰に存在する（Jones原法では銀/メセナミン=1/約14(モル比) 。

メセナミン銀液中では、銀イオン(Ag+) がメセナミンの窒素Nに親和し、さらに

その周りに多くのメセナミンが存在していると考察される。

M

グリコール

組織多糖類

H-CH-OH|

-CH-OHH

組織多糖類

H-C＝O

-C＝OH

過よう素酸

酸化 メセナミン銀

Ag+- M

アルデヒド

H5IO6

PAM染色の原理

過よう素酸で多糖類等のグリコールを酸化してアルデヒド(CHO)を生成させる。このアルデヒドにより、メセナミン銀の銀イオン(Ag+) が還元され、金属銀(Ag)の微粒子(銀核)として多糖類の存在部位へ沈着する。さらに、周りの銀イオン(Ag+) が還元されて生じる金属銀が、その銀微粒子（銀核）の上に沈着し、大きな銀粒子になり、発色する。

組織多糖類

O-C-OH

-C-OHO

H-C＝O

-C＝OH

Ag+- M

Ag+- M

Ag+- M

Ag+- M

組織多糖類

MAg

Ag+- M

Ag+- M加温

加温

メセナミン銀

Ag

組織多糖類

O-C-OH

-C-OHO

Ag

Ag

AgAg

Ag

Ag

銀微粒子(銀核）

アルデヒド(還元性)

蒸留水洗浄水道水由来の不純物を除去

TSC増感剤チオセミカルバジド

銀粒子へ成長

色調は銀粒子サイズに依存

組織多糖類

O-C-OH

-C-OHO

Ag

Ag

AgAg

Ag

Ag

組織多糖類

O-C-OH

-C-OHO

Ag

Ag

AgAg

Ag

Ag

塩化金酸の金イオンが金属金として銀粒子の上へ沈着。銀イオンは塩化銀AgClとして沈着

3Ag ＋ [AuCl4]－ →Au ↓＋3AgCl ＋Cl-

2[AuCl4]－ ＋ 3H2C2O4 →2Au ↓ ＋6CO2 ＋6H＋＋ 8Cl－

残留する塩化金酸をシュウ酸で金属金にして金を沈着させる。また還元性のホルマリンにより未反応の銀イオンAg+が還元され、銀粒子の上に

沈着すると考えられる。ただし本操作はきわだった効果がないので、本操作の省略は可。

AuClAuCl3

H[AuCl4]）

Gold(I) chlrodieGold(III) trichloride

Tetrachloroauric(III) acid

塩化金塩化金酸

（テトラクロロ金酸）

(塩化金酸液は長期安定)

イオン化傾向 Ag ＞Au

Au

Au

AgCl

[AuCl4]－（残留分）

塩化金酸で調色

シュウ酸ホルマリン液(ジョーンズ補強液)

Au

AuAu

○ ×

Ag+

AgCl

Ag+

実習では本操作省略

S2O32-

未還元の銀イオンや塩化銀を、チオ硫酸ナトリウムで処理し、溶出除去する。

定着に使用したチオ硫酸ナトリウムを、十分な水洗で洗い流す。チオ硫酸ナトリウムが残留すると、経時的に硫化銀Ag2Sが生じ、標本が変色する。

Ag+ ＋ 2Na2S2O3 → Na+ ＋Na3[Ag(S2O3)2](水溶性）

参考：ハイポは弱アルカリのため、切片剥離のリスクがあり、そのリスクのほぼない写真酸性硬膜定着液が有用

AgCl + 2Na2S2O3 →Na3[Ag(S2O3)2] ＋ NaCl水溶性

組織多糖類

O-C-OH

-C-OHO

Ag

Ag

AgAg

Ag

Ag

Au

AuAu

定着(2%ﾁｵ硫酸ナトリウム)

組織多糖類

O-C-OH

-C-OHO

Ag

Ag

AgAg

Ag

Ag

Au

AuAu

十分に水洗(約５分）

(未反応Ag+を洗浄除去)

(残留するS2O32-を洗浄除去）

S2O32-

ﾁｵ硫酸ナトリウムによる定着処理をしないと、残留する銀イオンが光により還元され金属銀が生じ、部分的な過染や共染のリスクあり。

メセナミン（正式名:Hemamethylenetetramine、

ヘキサメチレンテトラミン） 分子式：C6H12N4メセナミンはホルムアルデヒトとアンモニアから製造される。

メセナミン銀液調製時の現象硝酸銀水溶液をメセナミン水溶液へ少量添加すると、最初液が白濁し注)、さらに添加すると無色透明になる。

注）硝酸銀とメセナミン1：1の非水溶性錯体[C6H12N4・AgNO3]が生成するか、ま

たは白色の非水溶性水酸化銀(AgOH)が生じるため、最初白濁する。

銀を含む試薬水溶液の調製には、蒸留水（できれば再蒸留水）の使用を厳守する。塩素等が微量でも含まれると、塩化銀AgClなどの沈殿が生じるので。

メセナミン銀液は不安定（特に、高温ほど）→使用時調製がベター経時的にメセナミンが分解して生じるホルムアルデヒドにより、メセナミン銀液中の銀イオン(Ag+)が還元されて、灰白色の金属銀(Ag)が沈殿する。

メセナミン銀液の保存液が白濁してきたら新調する。C6H12N4 ＋ 6H2O → 6HCHO ＋ 4NH3

メセナミン ホルムアルデヒド アンモニア

（還元性のホルマリン）

メセナミンとメセナミン銀液調製及びその液の非安定性

１．ホウ砂（正式名：四ホウ酸ナトリウム、Sodium tetraborate）通称Borax（ボラックス）通常安定な四ホウ酸ナトリウム10水和物(Na2B4O7・10H2O)を使用役割：銀イオン還元促進用アルカリ化剤メセナミン銀の還元反応は通常遅いが、弱アルカリ領域ではこの還元反応が促進され、アルカリ化剤としてホウ砂が添加される。

銀イオン同士の間にゼラチン蛋白が入り込むことにより、一度に多くの銀イオン(Ag+) が連鎖反応的に還元されて起こる非特異的染色を抑制する効果、またスライドガラス上への銀粒子の沈着を抑制する効果がゼラチンにある。

黒白フィルムは、酢酸セルロース膜へ硝酸銀とゼラチンの混合物が塗布されて製造される。ゼラチンは銀の連鎖反応によるカブリを抑制するために混合されている。

メセナミン銀液/ホウ砂とゼラチンの役割

２．ゼラチン：共染防止の効果

AgBr AgBr AgBr AgBr黒白フィルムゼラチン

酢酸セルロース膜

重要！！ホウ砂水溶液は使用直前メセナミン銀液へ添加する。ホウ砂液を添加すると、メセナミン銀は、常温でも経時的に灰白色の銀の沈殿が生じる。

ホウ砂液を添加後加温する方法、またメセナミン銀液加温後ホウ砂液を加える方法あり。

銀イオン還元速度のファクターと共染のリスク/切片の厚さ

小 ← 共染のリスク → 大

短い ← 染色時間 → 長い

低い ← 染色温度 → 高い

弱い←PAM染色の染色強度→強い

C6H12N4 ＋ 6H2O → 6HCHO ＋ 4NH3

メセナミンは高温ではホルマリン(HCHO)とアンモニアへ分解する。その分解により生成したホルマリンにより、銀イオン(Ag+)が激しく還元され、金属銀(Ag)がバックに共染すると考察される 。

加温

メセナミン ホルマリン アンモニア

PAM染色のポイント

染色温度と染色時間の調節・管理

温度管理の正確さ・再現性

恒温槽 ＜ 湯浴恒温槽

小 ← 共染のリスク → 大

薄い ← 染色の濃さ → 濃い

低い ←染色に関与する組織成分濃度→高い

薄い ← 切片の厚さ → 厚い切片の厚さ→1～1.5umが望ましい。

厚い切片では、糸球体や毛細血管の基底膜が真っ黒に過染し、観察が困難になる。

超薄切切片のHE染色→通常より時間を延長

Ag2S

SRCHO + H2NNHCNH2

SH2O ＋ RCH=NNHCNH2

チオセミカルバジド

チオセミカルバゾン

←メセナミン銀錯体(Ag+-M)S

RCH=NNHCNH2

Ag+-M

Ag+-MAg+-M RCH=NNHCN

Ag+-M

Ag+-M硫化銀

RCH=NNHCN Ag2SAg

Ag

加温

加温

チオセミカルバジド(TSC)とその増感作用の考察

Thiosemicarbazide(TSC)

TSCは、高感度発色、また共染のリスクを少なくする効果あり。

TSCは毒物に該当

医薬用外毒物

組織多糖類グリコール

過よう素酸酸化

アルデヒド

硫化銀Ag2Sの上

に銀がさらに沈着し、銀粒子が大きくなり強く発色。要取扱・保管注意

マッソン・トリクローム染色（原法と変法）

①原法 細胞質：赤色

（Acid Fuchsin）核：青～黒色

（Hematoxylin）

結合組織：青色

（Aniline blue）

②変法 赤血球：オレンジOrange G （野口変法)

Fuchsia②変法 細胞質：赤色

1929年 Masson trichrome staining

Methyl blueもMT・AZAN染色

に利用可能。

Mallory染色(酸性フクシン/オレンジＧ・アニリン

ブルー）などを基にして考案された染色法

（Tri: 3 chrom:色素）

Aniline blueはMethyl blueと

Water blueの混合物）

コントラスト改善のため、少し異なる色調の赤色色素を混合使用。

546nm503nm

540, 502nm

Acid fuchsinPonceau xylidineAzophloxine

吸収極大波長赤色色素

Ponceau xylidineの別名:Ponceau de xylidine（仏語)Ponceau 2R

Biebrich Scarletの混合使用例あり

O

OH

O

OHHO

HOO

OH

O

OHHO

O

Al++

O

OH

OH

OHHO

HO

Fe(Cl)3

核DNA PO4－

(橙～赤色）

媒染

剤Fe+++

レーキ

酸化

細胞核 Fe++黒褐色

塩化第二鉄（Fe３＋）は

酸化剤及び媒染剤として機能

塩化第二鉄

核への結合力（分別されにくさ）

鉄（Fe) ＞ アルミニウムAlイオン化傾向 Fe < Al

鉄ヘマトキシリンの染色メカニズム

Fe３＋＋e- → Fe2+

鉄ヘマトキシリンの非耐久性

（混合後、１～３週間安定）

①高濃度のヘマトキシリン 0.5％

②過剰の酸化剤（塩化第二鉄）

ﾍﾏﾄｷｼﾘﾝ ﾍﾏﾃｲﾝ

ヘマトキシロンカンペチアナム

（メキシコユカタン半島に産生する木）

[Hema:血液の赤色+ Xyl：木]

(無色）

O

OH

O

OHHO

O

Al++Fe++

カラッチヘマトキシリン

→分別されやすいので、共染・過染ぎみに染色し、分別操作を省く。

(核染後、酸溶液にさらさ

れ分別されるため）

分別(Differentiation)（鉄ヘマで共染が強い場合）

Ｈｅ

Fe＋

O－

CO蛋白質

ＰＯ４－

DNA

細胞質

O－

CO蛋白質

ＰＯ４－

DNA

Ｈｅ

Fe＋

Ｈｅ

Fe＋

Ｈｅ

Fe＋ レーキ

O－

CO蛋白質

ＰＯ４－

DNA

細胞質

O－

CO蛋白質

ＰＯ４－

DNA

Ｈｅ

Fe＋

Ｈｅ

Fe＋

分別 Ｈ＋ （塩酸）

強い→要分別

染色操作過程で、酢酸酸性

溶液（染色液と洗浄液）を使い、

分別される。

但し、鉄ヘマは分別されにくい

→ 結合組織のくすみの原因Ｈ＋ Ｈ＋

核

核

色出しについて 色出し後、染色過程で切片を酸にさらす→色出しの効果は低い

共染

弱い→分別不要

HCｌ →Ｈ+ ＋Ｃｌ

低 ←塩酸濃度→高

穏やか←分別力→強

共染状態

酸性色素 分子量 染色部位の構築の疎密

オレンジＧ 452.4

酸性フクシン 585.5

アニリンブルー 800

リンタングステン酸 2880

密

（赤血球）

中

（細胞質）（線維素）

疎

（膠原線維）

×

マッソン・トリクローム染色の原理

(ポンソーキシリジン 480)

異なる酸性色素の染色には、色素分子サイズと組織部位の構築の疎密が染色に関与

(小さい色素分子は動きが速く、短時間で染める.)

（Azanやパパニコロウ染色においても同じ役割） ・小さい色素から順次染色する

先に大きい色素で染めると染め分け困難

(0.75%オレンジＧ 染色時間：通常１分）

染色の三要素

①化学的親和性

②濃度

③色素の組織部位への入り込み

(大きい色素は動きが遅く、

染色に時間を必要とする。一旦部位へ入り込むと、分別されにくい特徴がある。)

(アゾフロキシン 509.4)

（染色の選択性に関与）

[P(W3O10)4]3-リンタングステン酸(陰イオン性錯体)

+NH2-H

+NH2-H

蛋

+NH2-H

酸性フクシン

アニリンブルー

白

質

リンタングステン酸の特性と役割(染色の選択性）

(MT染色において、特にアニリンブルーの過染を防止する)(染色において、他の酸性色素と染着部位の席の奪い合いをする)

(酸性フク

シン、アニリンブルー、リンタングステン酸は負（－）に荷電し、化学的挙動は同じである。リンタングステン酸は、色素同士が重ならないよう、選択的染色に関与する）

酸性フクシン PTA

適切処理

PTA処理不足

PTA過剰処理

アニリンブルー

アニリンブルー

アニリンブルー

構築密赤血球

構築中間細胞質

構築疎膠原線維

A B

C DオレンジＧ

酸性フクシン

リンタン処理時間(2.5%リンタン→15-30分)

短→赤と青の重なり、また青の過染傾向

長→構築中の部位の赤が弱い

かなり長い→構築の疎の部位にリンタンが多く浸透し、アニリンブルーの染まりも淡くなる

アニリンブルー

リンタングステン酸(PTA)リンタンに

切片を浸すと、非目的部位へ入り込んでいた酸性フクシンに代わり、リンタンが

その部位に親和ないし浸透し、その後アニリンブルーに切片を浸すと、膠原線維等に親和しているリンタンに代わりアニリンブルーが少しずつ入り込む。

重クロム酸カリウム/トリクロロ酢酸酸化処理の効果

①ホルマリン固定による蛋白分子内・分子間のメチレンブリッジの開裂

→好酸性の増大→酸性色素(酸性フクシン、アニリンブルー）の親和性が大

Ｒ-ＮＨ-ＣＨ２-ＮＨ-Ｒ‘ → Ｒ-ＮＨ２ ＋ ＮＨ２-Ｒ‘

②蛋白質の酸化開裂 → 酸性フクシン、アニリンブルー等の色素の入り込み容易

③蛋白質の酸化分解（処理時間：通常15-40分） → 構築の疎密への寄与

処理時間短め →構造疎→青色が優勢

処理時間長め→分解物が構築疎の間隙を一部埋める（？）→赤色の染まりが強く、

Aniline blueの青色が淡い染色

１）重クロム酸カリウム（固定作用）と皮のなめし

Cr6+ 皮の蛋白質

還元

Cr3+

Cr－O－O－C－

OH2H2O

皮の蛋白質 －C－O－

O| |

2

[Cr(H2O)6]3+

－C－O－O| |

H2O OH2 O皮の蛋白質 皮の蛋白質

+

+ H2O

水和

３）強酸化剤・重クロム酸カリウム/トリクロロ酢酸の効果

メチレンブリッジ

蛋白質-NH3+ Cr2O72－

2Na+

オレンジＧ -

-

×重クロム酸イオン

２）媒染剤の可能性は小（革の製造）（ツェンカー液成分）

クロムなめし

(蛋白質が凝固)

ホルマリン固定標本で赤色で強く染まるよう導入された手法

リジン

染色液の酢酸酸性条件の理由/①組織蛋白の好酸性化

赤色色素混合物（ポンソーキシリジン、他） in 約0.2％酢酸

約0.4％アニリンブルーorメチルブルーin 約7.4％酢酸

１）組織蛋白の好酸性化 → 酸性色素がより結合しやすい

NHHC(CH2)

NH

蛋白質

NHHC(CH2)2COOH

C=O

C=OHC(CH2)4NH2

蛋白質

NHHC(CH2)2COOH

C=O

C=OHC(CH2)4NH2

NH NH

蛋白質

NHHC(CH2)2COOH

C=O

C=OHC(CH2)4NH2

酸 H+

酸性色素

アニリンブルー－

H＋

グルタミン酸

..（好酸性化）

エオジン染色液へ、通常酢酸を少量添加し、染色対象の細胞・組織蛋白質を正(＋)に荷電させ、

好酸性を増大させ、負（－）荷電のエオジンを親和させやすくする手法と同じ。

染色液の酢酸酸性条件の理由/②酸性色素の染色強度の増大

オレンジG

エオシンY

ライトグリーン

染色強度

染色強度

pH

7.0

２）色素はpHによりその染色強度が変化する。

アニリンブルーin 約7.4%酢酸

Light green SF yellowish

Light green とAniline blueの化学構造は類似

オレンジＧin 約0.15%酢酸pH

オレンジＧ

7.0

3%酢酸のpH

3%酢酸のpH

SO3Na基を有する酸性色素はｐHが低い方が染色力大

色素-SO3－・・・ NH3＋-蛋白質

水

Na+

Na+Orange G

Na+Na+

Na+

OH H O

H H

水素結合

δ＋

δ-

ＨＯ Ｈ

ＨＯ Ｈ

ＯＨＨ

ＯＨ

Ｈ OH H

δ＋

δ-

δ-

δ＋

イオン化することにより、水

分子間にイオン化したオレ

ンジＧが入り込み拡散、溶解OG２－

Orange G OG２－

OG２－

何故洗浄に１％酢酸を使用？/ 酸性色素の溶解性

参考：酸性色素は色素分子同士の静電気的親和性が大→ アルコールに難溶

--

蛋白質 -NH3+ 酸性フクシン-O3S-

蛋白質 -NH3+ 酸性フクシン-O3S-酸性水で洗浄 中性~アルカリ水で洗浄H+ OH－

蛋白質 -NH2 (色素が溶出・脱色)

アニリンブルー染色後の分別・脱水

・アニリンブルー過染ぎみの場合 → エタノールが適す

・繊細な分別 →アニリンブルーが溶出しにくいイソプロ

ピルアルコールが適す

10.9％5％

10-12.5％7％

水

0.2％0.1％

0.1％0.4％

min.80％

min.60％

Orange GPonceau 2R(Ponceau de xylidine)

Acid fuchsinAniline blue WS

エタノール含有量注酸性色素

Isopropylalcohol ＜変性アルコール< Ethanol ＜ Methanol ≪水(CH3)2CHOH C2H5OH CH3OH

酸性色素の水とアルコール類への溶解性/分別・脱水用アルコール

酸性色素のアルコール類への溶解性

注：色素含有量：米国Biological Stain Commissionの規格

色素含有量や不純物の種類及び量→メーカーや製造ロットにより異なる(特に、非汎用色素)

→染色強度が異なり、また溶解性が異なる（文献上の色素溶解性数値は一つの参考値）

エタノール 88 %

イソプロピルアルコール 9 %

メタノール 3 %

ドライゾール組成（関東化学）

エタノール脱水操作で、Aniline blueがAcid fuchsinより少し

多く溶出・分別される。

ロイシン HOOCCH-CH2CHCH3NH2 CH3

イソロイシン HOOCCH－CHCH2CH3NH2 CH3

バリン HOOCCH－CHCH3NH2 CH3

プロリン HOOC NH

グリシン HOOCCH2NH2

CH2 CH2

CH2 赤色部分が親油性

弾性線維膠原線維

線維

92 ％53 ％

エラスチンコラーゲン

側鎖に親油性官能基を有するアミノ酸の構成比率主要蛋白質

エラスチンとコラーゲン蛋白の違い（アミノ酸の種類）

○

○

○

BCAA(分岐鎖アミノ酸）

(Branched Chain Amino Acid)

筋肉に多く存在し、運動時のエネルギー源

燃焼系スポーツドリンクエラスチンは親油性アミノ酸を多く含むので、弾性線維の染色にはアルコール溶性の色素が適す。

エラスチン蛋白質中の主要アミノ酸(約90％）

（バーム、アミノバイタル）

Elastica-Masson（ゴールドナー変法）染色/弾性線維の特性

ロイシン HOOCCH-CH2CHCH3NH2 CH3

Indamine

＋

＋

R=CH3

レゾルシン・フクシンの染色メカニズム/弾性線維への親和

②疎水結合

①物理的要素：弾性線維の分子構造間隙の壁面に色素が浸透

＋

疎水結合親油性蛋白質と親油性色素同士が溶け合うような結合（疎水結合）エラスチン蛋白質中主要アミノ酸

弾性線維の特徴

・構造間隙の壁面に富む

・伸張性

コイル状エラスチンの模式図（コイルの内側は親油性）

デスモシン

他の部位へ入り込んだレゾルシン・フクシンは(塩酸)アルコー

ルで洗い流される

ギリシャ語でBandの意、リ

ジンから生成

参考：レゾルシンフクシン染色液の非安定性レゾルシンフクシン液は経時時に分解ないし変化し、徐々に共染のリスクが大きくなる。（冷蔵保存すると、レゾルシンフクシンの分解ないし変化が遅くなる）

レゾルシンフクシンの推定構造式(Horobin) フクシンの２，３，４・・・

量体混合物

+

電子陽子

++

原子

+

Indamine

＋ ＋

R=CH3

レゾルシン・フクシンの染色メカニズム/弾性線維への親和

③ファンデルワールス力：分子間引力

④塩酸酸性→斥力

包装用ラップ

ポリ塩化ビニリデン

－Ｃ－Ｃ－

Ｈ Cl

Ｈ Clσ－

σ＋

σ－

10-11μm

σ+ σ－ σ+ σ－

ファンデルワールス力

＋

非対称の分子構造で、分極（＋と－）しやすい色素と弾性線維が親和 ラ

ップ

包装対象物

NH3-

×疎水結合

CH3-

+H+

塩酸

CH3-

NH2-

弾性線維

膠原線維斥力による染色の選択性

ファンデルワールス力の例

酸性色素 分子量 染色部位の構築の疎密

オレンジＧ 452.4

酸性フクシン 585.5

ライトグリーン 793

密

（赤血球）

中

（細胞質）

疎

（膠原線維）

×

ゴールドナー変法染色の原理

リンタングステン酸（染色の選択性に関与）

リンタングステン酸の役割は、MT染色と同じ。

リンモリブデン酸も同じ効果あり。

(ポンソーキシリジン 480)(アゾフロキシン 509.4)

MT染色のアニリンブルーに代えて、ライトグリーンを使用