Odreivanje nivoa superoksid anjon radikala u plazmi optimiziranom Auclair-Voisin-ovom metodom

Odreivanje nivoa superoksid anjon radikala u plazmi optimiziranom Auclair-Voisin-ovom metodom

Odreivanje brzine stvaranja superoksid anjon radikala je zasnovano na metodi koju su dali Auclair i Voisin (130). Metoda je zasnovana na sposobnosti superoksid anjon radikala da redukuje hinin, tetranitrometan i citohrom c, a takoe i nitro grupu supstituisanih aromatinih jedinjenja kao to je nitrobluetetrazolijum [NBT, 2,2-di-p-nitrofenil-5,5-difenil-3,3-(3,3-dimetoksi-4,4-difenilen)-ditetrazolium hlorid].

Redukcija uto obojenog NBT-a do plavog formazana se koristi kao mera stvaranja superoksidnog radikala u hemijskim i biolokim sistemima. Redukcija NBT-a se odvija u dva stupnja i to: a) nepotpuna redukcija do monoformazana; b) potpuna redukcija do diformazana. U oksidovanoj formi NBT je rastvorljiv u vodi. Redukcijom u diformazan se smanjuje rastvorljivost u vodi, zbog ega se dodaje elatin koji odrava formazan u rastvornom obliku. Kada je pH sredine u kojoj se odvija reakcija blizak neutralnom pH, molarni ekstinkcioni koeficijent na talasnoj duini od 515 nm za monoformazan iznosi 15 000 Lxmol-1xcm-1, a za diformazan 30 000 Lxmol-1xcm-1. U vodenim rastvorima, u reakcijama u kojima se stvara O2-., dolazi do nepotpune redukcije NBT-a do monoformazana. Stimulacija redukcije NBT-a pri viim pH vrednostima je rezultat inhibicije reakcije spontane dismutacije kiseonika, koja kompetira sa reakcijom redukcije NBT-a. Redukcija NBT-a se stoga poveava smanjenjem pritiska kiseonika u medijumu, to se postie uvoenjem azota pod pritiskom i to 1h pre odreivanja.

Spektri NBT reagensa pre (A) i posle reakcije sa superoksidnim anjonom iz uzorka (B).

Na slici su prikazani spektri NBT reagensa (A) i nakon reakcije sa superoksidnim anjonom iz uzorka plazme (B). Analizom snimljenih spektara se vidi da je apsorpcioni maksimum nastalog formazana na 550 nm pa smo bili u mogunosti da primenimo modifikaciju ove metode sa itanjem na Elisa readeru koji je imao optiki filter na 550 nm. Hemikalije

Kalijum-dihidrogenfosfat (Mm=136,1, Calbiochem); dinatrijum-monohidrogenfosfat (Mm=142, Calbiochem), etilendiaminotetrasiretna kiselina (EDTA, dinatrijumova so, dihidrat, C10H14N2Na2O8x2H2O, Mm=372,24, Merck); nitrobluetetrazolijum (NBT, 2,2-Di-p-nitrofenil-5,5-difenil-3,3-(3,3-dimetoksi-4,4-difenilen-ditetrazolijum hlorid, Mm= 817,7, Sigma(.

Reagensi

1. Fosfatni pufer, 0,05 mol/L, pH 8,6, uz dodavanje EDTA u koncentraciji od 0,1 mmol/L.

2. Radni reagens

1 mmol/L NBT-a se rastvori u svee pripremljenom fosfatnom puferu uz dodatak 0,1 mg/mL elatina.Bioloki materijal

Iskljuivo plazma, primeeno je da u serumu nema nikakve reakcije sa NBT supstancom, ne dolazi do njegove redukcije koja bi bila merljiva kao da se u procesu koagulacije istroi sav superoksidni anjon.

Izvoenje

Pipetirati u kivetu (mL):

Radni reagens1,00

Plazma0,05

Promeati i pratiti poveanje apsorbancije na 515 nm, na svakih 15 sekundi u toku jednog minuta. Izraunati ( A / ( t.

Izraunavanje

Brzina generisanja superoksidnog anjona se izraava preko brzine stvaranja redukovanog NBT-a. Brzina redukovanja NBT-a se odreuje kinetikim postupkom, a izraunava se upotrebom molarnog ekstinkcionog koeficijenta monoformazana.

gde su:

Vuk - 1,05 mL (ukupna zapremina u kiveti ).

Vuz - 0,05 mL ( zapremina uzorka u kiveti ).

l - duina svetlosnog puta (1 cm).

( - molarni ekstinkcioni koeficijent monoformazana (15 000 Lxmol-1xcm-1).

106 - faktor za prevoenje mol u (mol.

Krajnji izraz za izraunavanje glasi:

red. NBT, (mol/min/L = ( A/min x 1400

Napomena

Reakcija redukcije NBT-a pomou superoksidnog anjona je jako brza, tako da se posle 60 sekundi reakcija zavrava. Uoeno je da je samo u prvih 60 sekundi reakcija linearna.

Odreivanje ukupnog sadraja sulfhidrilnih grupa

Ukupni sadraj sulfhidrilnih grupa u plazmi se odreuje Ellman-ovom metodom (132). Ova metoda se zasniva na reakciji 2,2-dinitro-5,5-ditio-benzojeva kiseline (DTNB) sa alifatinim tiolnim jedinjenjima u baznoj sredini (pH 9.0) , pri emu se stvara jedan mol p-nitrofenol anjona po jednom molu tiola. Reakcija je prikazana na slici. Poto je ovaj anjon u baznoj sredini jako uto obojen, merenje njegove apsorbancije je mogue na 412 nm. Na sledeoj slici su prikazani spektri DTNB reagensa pre reakcije (A) i nakon reakcije sa tiolnim grupama iz uzorka.

Redukcija Ellmanovog reagensa slobodnim sulfhidrilnim grupama

Spektri DTNB reagensa (A) i nastalog TNB jedinjenja (B) u reakciji izmeu DTNB reagensa i SH grupa iz uzorka

Hemikalije

Dikalijum-hidrogen fosfat (Mm = 174,2, Calbiochem); etilendiaminotetra siretna kiselina (EDTA, dinatrijumova so, dihidrat, Mm = 372,24, Merck); 2,2-dinitro-5,5-ditio-dibenzojeva kiselina (DTNB, Mm = 396,0 Merck); redukovani glutation (GSH, Mr=307.02, 98%, ACROS ).

EMBED Unknown

EMBED Unknown Reagensi

1. 0,2 mol/L K 2HPO4, 2 mmol/L EDTA, pH 9,0

2. 10 mmol/L DTNB, rastvoren u 50 mmol/L fosfatnog pufera, pH 7,0

Aparati, pribor i uslovi odreivanja

Spektrofotometar, vorteks-mealica, automatske pipete, epruvete, laboratorijski sat, talasna duina 412 nm, temperatura 25(C.

Izvoenje

U epruvete pipetirati (mL):

Slepa probaAnaliza

Pufer0,950,90

Plazma-0,05

DTNB reagens0,020,02

Inkubirati 25 minuta na 25(C, u mraku, a zatim oitati apsorbancije na 412 nm, prema slepoj probi.

Koncentracija ukupnog sadraja SH grupa u plazmi izraunava se preko molarnog ekstinkcionog koeficijenta p-nitrofenola na 412 nm, koji za date uslove ima vrednost od

13600 Lmol-1cm-1. Koncentracija ukupnog sadraja SH grupa se moe izraunati i uz upotrebu standardne krive korienjem vodenog rastvora redukovanog glutationa (GSH) kao standarda. Napomena: Redukovani glutation je jako nestabilan u vodenom rastvoru i najbolje je svakog dana praviti sve rastvor. Pravi se koncentrovani standard od 1 mmol/L GSH a od njega se dalje prave razblaenja, standardi niih koncentracija koji pokrivaju opseg referentnih vrednosti ali i vrednosti nie i vie od toga (0,1 mmol/L -1 mmol/L). Za 100 mL rastvora osnovnog standarda 1 mmol/L GSH odmeri se 0.031g supstance. Dalje se razblaenja prave sa destilovanom vodom.Izraunavanje

SH grupe, mmol/L =

gde su

( = 13 600 Lx mol-1xcm-1

Vuk - ukupna zapremina (0,97 mL

Vuz - zapremina uzorka (0,05 mL)

Referentne vrednosti

Poznate su referentne vrednosti za humanu plazmu:0,400 - 0,500 mmol/L .

PAGE 1

_1253818531.unknown

_1254828024.unknown

_1255333264.psd

_1254828007.unknown

_1253341880.psd

_1253345326.psd

_1253342065.psd

_1253341861.psd

_1253030296.unknown