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Partie 3. Méthodes et techniques microbiologiques
REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHE RCHE SCIENTIFIQUE
UNIVERSITE FRERES MENTOURI CONSTANTINE 1INSTITUT DE LA NUTRITION, DE L’ALIMENTATION ET DES TE CHNOLOGIES AGRO-ALIMENTAIRES
DEPARTEMENT DE TECHNOLOGIE ALIMENTAIRE
1
Pr. KHARROUB K.Laboratoire de recherche BIOQUAL
INATAA, UFMC1
Licence 1 (Technologies Alimentaires ;2020-2021)
Toutes les manipulations microbiologiques doivent
s’effectuer en évitant les contaminations par le
manipulateur ou l’environnement;
�La stérilisation est indispensable lors de la préparation du
1- Introduction
matériel et des milieux de cultures;
� L’identification d’un microorganisme ne peut avoir lieu
que lorsqu’il a été isolé à l’état pur.
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2- Stérilisation
La stérilisation a pour objet de tuer (détruire) tous les
microorganismes d’une préparation par des agents
chimiques ou physiques (température, radiations).
2.1. Agents chimiques
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2.1. Agents chimiques
1- Désinfectants : détruisent les germes
pathogènes dans les milieux extérieurs à
l’homme : l’eau, l’air, le sol, les objets et les
matériaux les plus divers. Ces substances
agissent sur des objets inanimés..Eau de Javel
2- Antiseptiques : détruisent les
microorganismes ou arrêter leur
croissance. Ils désignent les agents qui
exercent une action locale chez les êtres
vivants, au niveau d’une plaie, sur une
muqueuse, etc.Eau oxygénée 10v
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Remarque:
un milieu est dit septique lorsqu’à son niveau, des
microorganismes pathogènes peuvent être présents ou se
développer, et aseptique dans le cas contraire.
La désinfection et l’antisepsie sont des opérations
momentanées, éliminent ou tuent les microorganismes
et/ou inactivent les virus. Les désinfectants et les
antiseptiques, ne peuvent être administrés à l’homme par
voie générale.
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Certains agents chimiques sont très actifs mais toxiques
pour les tissus qui ne peuvent être utilisés que pour les
objets inanimés.
3- Antibiotiques : substances chimiques exerçant un
pouvoir destructeur sur les microorganismes mais
dépourvues de toxicité pour les cellules humaines ou
animales.
Ces substances peuvent avoir un effet bactériostatique
ou fongistatique lorsqu’elles empêchent la multiplication
et bactéricide ou fongicide lorsqu’elles détruisent
totalement les bactéries et les champignons.
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4- Stérilisation par les gaz: elle est utilisée dans le cas
des produits instables à la chaleur, pour la désinfection des
locaux (chambres des malades) ou encore pour la
stérilisation des objets en plastique. Parmi les gaz utilisés,
on a le formaldéhyde, l’oxyde d’éthylène….
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2.2. Agents physiques
1-Température: chaleur humide a un effet supérieur à
celui de la chaleur sèche. L’autoclave est un appareil qui
fournit de la chaleur humide. La stérilisation atteindra son
but lorsque la T° de 120°C est maintenue durant 15 à 20
minutes.
8 Photos de 2 types d’autoclaves
-Pasteurisation: appliquée à certains produits naturels
pour pouvoir les conserver momentanément sans les
altérer (ex. lait, vin…). Cette méthode permet l’inactivation
des microorganismes pathogènes et non la destruction de
l’ensemble des microorganismes.
2- Radiations: peuvent avoir un effet bactéricide, Ex.2- Radiations: peuvent avoir un effet bactéricide, Ex.
radiations électromagnétiques comme les UV (salles
chirurgicales, des surfaces de travail (tables, paillasses…)
mais les moins efficaces, rayons X, radiations
électroniques..
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3- Filtration: utilisée dans la stérilisation des solutions ne
supportant pas les températures élevées (thermolabiles)
comme les sucres, acides aminés..
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Photo d’un appareil de filtration sur membrane
3- Milieux de culture
Classés selon plusieurs critères :
- Consistance : liquide ou solide
- Mode de stérilisation : autoclavage, filtration ou
tyndallisation
- Utilisation : isolement, identification ou conservation- Utilisation : isolement, identification ou conservation
-Mode de préparation et composition : milieux
synthétiques, semi-synthétiques, milieux empiriques.
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3-1- Milieux synthétiques ou définis
Ils comprennent des corps chimiquement définis en
proportions déterminées de façon à constituer une solution
tamponnée.
Ex. De milieu: N4HCl, 1g ; KH2PO4, 1,2g ; NaHP2O4.2H2O,
8,6 g ; MgSO .H O ; 200 mg ; FeSO .7H O ; 1 mg ; CaCl ;
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8,6 g ; MgSO4.H2O ; 200 mg ; FeSO4.7H2O ; 1 mg ; CaCl2 ;
10 mg ; Traces de Mn, Mo, Cu, Zn, 0,02-0,5mg ; 5 g
glucose, compléter à 1000 mL avec de l’eau distillée.
3-2- Semi synthétique
Certains germes exigent des facteurs de croissance
apportés sous forme d’un extrait organique complexe
(extraits de levure très riches en vitamines)
Ex. Milieu minéral minimum supplémenté de 5 g de glucose
et 5 g d’extraits de levure.
3-3-Milieux empiriques complexes
Ils ont une composition chimique indéterminée comme les
peptones, les extraits de viande et es extraits de levure
sérum sanguin, l’œuf incorporé dans le milieu de culture, la
pomme de terre…13
On obtient les milieux solides en ajoutant un agent
gélifiant à un milieu liquide. Le gélifiant le plus utilisé est
l’agar-agar ou gélose.
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Se laver les mains
aussitôt que vous entrez
dans le laboratoire
ETAPE 1
15
dans le laboratoire
Aide à prévenir la
contamination des
cultures avec des
microorganismes de votre
flore naturelle
Désinfection de l’espace
de Travail.
Aide à prévenir la
ETAPE 2
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Aide à prévenir la
contamination des
cultures avec des
microorganismes de votre
environnement
Robinetcontrôlant laflammeprincipale
Veilleuse
Virole
Bec Bunsen17
ManchePorte fil
Serre- filAnse
Le fil à ensemencer18
4- Principales techniques d’isolement et de
purification
: opération qui consiste à déposer des
bactéries sur ou dans un milieu de culture.
: transplantation d’une culture pure sur milieu
neuf.
: ensemencement effectué dans un but de
séparation, ce qui permet l’obtention de colonies nettement
distinctes et en culture pure.
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- Pour le cas des pipettes Pasteur, ne
jamais pipeter à la bouche et celles qui
sont bordées ou boutonnées doivent
être utilisées fermées et stérilisées par
flambage.flambage.
Le refroidissement des instruments est
important car souvent l’emploi
d’instruments chauds est une
faute de technique fréquente.
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4-1- Ensemencement par des stries
transversales
- tubes : la semence prélevée à l’aide de l’anse de platine
ou d’une pipette recourbée à son extrémité sera déposée
sur la pente d’une gélose inclinée puis on remonte ensuite
22
sur la pente d’une gélose inclinée puis on remonte ensuite
en décrivant des stries parallèles allant d’un bord à l’autre
et aussi serrées que possible.
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- en boites : dépôt de l’inoculum sur un point
périphérique du milieu et disséminé par l’anse de platine
ou par la pipette boutonnée.
Faire des ensemencements
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parallèle avec la surface de
la gélose.
Faire des stries de gauche
à droite.
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4-2- Ensemencement par étalement
o Inondation : inonder la surface du milieu gélosé avec 3 à
4 ml d’inoculum puis aspirer l’excès.
o Pipette râteau : l’inoculum est étalé à l’aide d’une pipette
râteau que l’on glisse sur la surface du milieu tout en
faisant tourner la boite.
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faisant tourner la boite.
o Par touches : l’inoculum riche est ensemencé par touches
circulaires (1 à 2 cm de diamètre) ou par petites stries
épaisses (2 cm de long environ).
4-3- Purification
Toutes les études d’identification doivent s’effectuer sur des
souches pures obtenues par repiquages successifs sur géloses.
La description d’une colonie n’est possible qu’à partir d’un
isolement correct (souche pure).
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isolement correct (souche pure).
La taille d’une colonie ne peut être appréciée que si elle est
isolée. L’aspect des colonies et leurs tailles varient en fonction du
milieu de culture, de la température et du temps d’incubation.
Après ensemencement des boite de Pétri ou tubes, on
procède à leur marquage. Il comprend la date, nature du
produit (souche bactérienne…).
5-Incubation dans une étuve
Les températures, les durées d’incubations ainsi que lesv
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exigences atmosphériques particulières (CO2, anaérobiose,
etc.) doivent être respectées.
v
Etuve
6- Techniques d’identification desmicroorganismes
L’identification des microorganismes s’effectue sur des
souches pures et elle comprend:
- détermination des caractères culturaux (aspect des
colonies sur milieu solide ou aspect des bouillons sur
milieu liquide);
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milieu liquide);
- détermination de la morphologie des cellules (après
coloration);
- caractérisation biochimique, physiologique,
immunologique, pouvoir pathogène et lysotypie;
- caractérisation génétique.
Résultat d’un isolement sur milieu solide
Colonies
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6-1- Détermination de la morphologie cellulaire
La morphologie et l’association cellulaire sont déterminées
par microscopie (examen à l’état frais des bactéries
vivantes, Gram, coloration des structures bactériennes:
flagelles, capsules, spores, inclusions cytoplasmiques, etc.)
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6-1-1- Observation à l’état frais
Observation des cellules vivantes sans fixation et
coloration. Elle peut se faire sur des cultures jeunes en
milieu solide ou liquide ou à partie d’échantillons naturels
comme l’eau, le sol, produit pathologique, etc.
6-1-2- Observation après coloration
Les microorganismes doivent souvent être fixés et colorés
pour augmenter leur visibilité:
-Coloration au bleu de méthylène: coloration simple
-Coloration de Gram: coloration différentielle
Réalisation d’un frottis: dépôt des bactéries sur la lame
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Réalisation d’un frottis: dépôt des bactéries sur la lame
Réalisation d’un frottis: séchage du frottis
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Réalisation d’un frottis: fixation à l’alcool
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Réalisation d’un frottis: flambage à l’alcool
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Coloration de Gram: coloration au violet de gentiane
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Coloration de Gram: fixation par le lugol
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Coloration de Gram: décoloration à l’alcool
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Coloration de Gram: coloration à la fuchsine
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Coloration de Gram: rinçage à l’eau suivi d’un séchage de la coloration
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Cette coloration différentielle permet de distinguer entre
les bactéries à Gram positif gardent leur coloration
violette après décoloration par l’alcool alors que les
bactéries à Gram négatif sont décolorées par l’alcool et
tintées par la fuchsine en rose ou rouge. Cette distinction
est basée sur des différences de structure pariétale.
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Bactérie à Gram négatif Bactérie à Gram positif
6-2- Détermination des caractères culturaux
Aspect des colonies sur milieu solide
- taille : le diamètre de la colonie
- forme générale: allure des contours (bords réguliers,
irréguliers, déchiquetés), forme du relief (colonies
bombées, plates, centre surélevé ou ombiliqué)
- colonies transparentes, translucides ou opaques
42
- colonies transparentes, translucides ou opaques
- Aspect de la surface : colonies lisses parfois brillantes,
colonies rugueuses à surface mate, muqueuse
Aspects des colonies bactériennes
Aspect des colonies sur milieu liquide: présence de trouble,
présence de voile, présence de dépôt…
6-3- Caractérisation biochimique et
physiologique
6-3-1- Influence des paramètres physico-chimiques
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6-3-1- Influence des paramètres physico-chimiques
Etude de l’influence de la température, du pH et de la
concentration en sel sur la croissance microbienne.
66--33--22-- EtudeEtude dudu typetype respiratoirerespiratoire etet misemise enen
évidenceévidence desdes enzymesenzymes
• Type respiratoire
Détermination du caractère aérobie-anaérobie en utilisant
une gélose viande-foie (VF.
La gélosé est régénérée par un chauffage d’environ 30 minutes à 75-
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La gélosé est régénérée par un chauffage d’environ 30 minutes à 75-
80°C (pour réduire son potentiel redox). Après son refroidissement
(45°C), la pipette contenant la culture est introduite jusqu’au fond du
tube puis ramenée à la surface en décrivant une spirale.
Incubation à température optimale puis lecture.
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Figure. Détermination du type respiratoire
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Figure. Type respiratoire (suite)
• Recherche de la catalase: cette enzyme empêche
l’accumulation de H2O2 (produit issu de l’oxydation de
substrat).
La présence de la catalase est mise
en évidence en une quantité
suffisante de la culture sur une
lame de verre contenant une
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Figure. Photo montrant la présence d’une catalase
lame de verre contenant une
goutte d'eau oxygénée à 10
volumes.
La présence d'une catalase se
traduit, en quelques secondes, par
la formation de bulles d'oxygène.
• Recherche de la catalase: une partie de la colonie est
prélevée à l'aide d'une pipette Pasteur et dissociée sur le
papier filtre imbibé d’eau distillée. La présence d'une
cytochrome-oxydase se traduit, en 20 à 60 secondes, par
l'apparition d'une coloration rouge virant rapidement au
violet très foncé.
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Figure. Recherche de la cytochrome oxydase
•Recherche de la nitrate réductase: respiration des
nitrates
49 Figure. Mise en évidence de la nitrate réductase
6-3-3- Etude du métabolisme oxydatif oufermentaireDeux milieux de culture (Hugh et Leifson) sont utilisés
lors de l’étude du métabolisme du glucose qui peut se
faire par voie oxydative ou fermentaire.
Aux milieux précédents stériles en surfusion, on rajoute
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une solution de sucre stérile à une concentration finale de
1%. Homogénéisation et régénération du milieu de
culture (10 minutes à 75°C).
Ensemencement de 2 tubes par bactérie et sur un des tubes,
ajouter une couche de 1cm environ d’huile de paraffine stérile et
incubation à T° optimale.
La production d’acide se manifeste par un virage au jaune du
colorant au jaune pour le cas du milieu de culture.
Si elle a lieu dans les deux tubes, il s’agit d’une une fermentation
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Si elle a lieu dans les deux tubes, il s’agit d’une une fermentation
(Bactéries fermentatives).
Si l’acidification a lieu uniquement dans le tube non recouvert
d’huile de paraffine, implique une oxydation (bactéries oxydatives).
Dans le cas où aucun des deux tubes ne vire au jaune, le germe
est dit inerte ou inactif.
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Figure. Utilisation du milieu de Hugh et Leifson
53 Figure. Lecture du milieu de Hugh et Leifson
6-3-4- Etude du métabolisme glucidique
Elle permet de suivre l’attaque des glucides. Plusieurs
milieux de culture liquides (bouillons) ou solides peuvent
être utilisés.
- Réactions de Vogues Proskauer (VP) et au Rouge
de Méthyle
Ensemencement du milieu de Clark et Lubs et après
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Ensemencement du milieu de Clark et Lubs et après
incubation, la lecture se fait en ajoutant 0,5 ml de KOH à
40 % (p/v) (réactif VP1) et 0,5 ml d'alpha-naphtol (v/p)
(réactif VP2) pour la mise en évidence de la présence
d'acétoïne (souche VP positive) qui se traduit par une
coloration rose.
La production d’acides mixtes est recherchée sur le même milieu. Lalecture se fait par addition de quelques gouttes de réactif au rougeméthyle, une réaction positive se traduit par le virage de la couleur dubouillon au rouge.
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La mobilité bactérienne ainsi que la fermentation du mannitol ont
été étudiées en ensemençant le milieu semi-solide mannitol-
mobilité par piqure centrale à l’aide d’un fil droit.
La mobilité est révélée par un envahissement plus ou moins grand
du milieu à partir de la piqure d’inoculation
- Utilisation du milieu mannitol-mobilité
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du milieu à partir de la piqure d’inoculation
L’utilisation du mannitol est traduite par un virage de la couleur
du rouge au jaune.
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Milieu Mannitol- Mobilité Mannitol+, Mobilité – (1) Mannitol+, Mobilité+ (2)
Figure. Test mannitol-mobilité
- Utilisation des sucres sur le milieu Triple Sugar Iron (TSI)
La gélose Triple Sugar Iron permet la mise en évidence de la
fermentation du glucose (avec ou sans production de CO2),
l’oxydation du lactose et/ou du saccharose et la production de sulfure
d’hydrogène.
L’utilisation de l’un des sucres contenus dans le milieu se traduit par
une acidification, jaunissement du culot dans le cas de glucose et de la
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une acidification, jaunissement du culot dans le cas de glucose et de la
pente dans le cas du lactose et/ou du saccharose.
La production de sulfure d’hydrogène à partir du thiosulfate est mise
en évidence par la formation d'une coloration noire.
Le dégagement de CO2 est révélé par l’apparition de bulles d’air dans
le culot ou le décollement de la gélose.
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Figure. Test Triple Sugar Iron
-Recherche de la β-galactosidase
Un disque d’Ortho-Nitro-Phényl β-Galactoside (ONPG) est
ajouté à des suspensions denses de culture.
Après incubation pendant 18 à 24 heures, l’apparition
d’une coloration jaune indique l’hydrolyse de l’ONPG et en
conséquence la présence de la β-galactosidase.
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Figure. Recherche de la β-galactosidase
7-3-5- Etude du métabolisme protéique
-Recherche de la gélatinase
La gélatine est une protéine des tissus de soutien animaux.
Plusieurs méthodes sont utilisés pour sa mise en évidence.
L’ensemencement se fait par touche sur milieu de base
supplémenté de 1% (p/v) de gélatine.
L’hydrolyse est révélée par addition de 1 à 2ml du réactif
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L’hydrolyse est révélée par addition de 1 à 2ml du réactif
suivant : HgCl2 15g, HCl concentré : 20 ml, complété à 100
ml. Une zone claire indique résultat +.
Figure. Recherche de la gélatinase
Recherche de la caséinase
Le milieu de base est supplémenté de 1% (p/v) de caséine.
Après ensemencement, les boites de Pétri sont incubées. La
présence de cette activité est détectée par un halo clair
autour des colonies indiquant une hydrolyse de la caséine
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Figure. Recherche de la caéinase
-Décarboxylation des acides aminés
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Figure. Recherche de la lysine décarboxylase
- Mise en évidence de la production d’indole sur eau
peptonée et addition de réactif de Kovacs après incubation
Figure. Test production d’indole
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- Mise en évidence de la production d’uréase
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Figure. Recherche de l’uréase sur bouillon urée-indole
Cette activité est recherchée sur milieu de base contenant
1% (v/v) de Tween 80 ou de Tween 20, soit 2,5% (v/v)
d’huile d’olive.
L’ensemencement des souches est effectué par touches.
Après incubation, le développement d’un halo clair autour
des stries témoigne la présence d’une lipase.
6-3-6- Etude du métabolisme lipidique
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des stries témoigne la présence d’une lipase.
Figure. Mise en évidence de la lipase
Étude de molécules qui résultent d’une série de réactions
enzymatiques et donc de l’expression de plusieurs gènes
(contre un seul pour de nombreux tests simples).
Paroi:
Acides gras, acides aminés, sucres
7- Chimiotaxonomie
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Membrane cellulaire:
Lipides
Cellule:
protéines
Plusieurs approches, souvent complémentaires:
- Étude du génome complet:
� G+C %
� Hybridation ADN/ADN total
� Polymorphisme de restriction de l’ADN total
8- Taxonomie génomique
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� Polymorphisme de restriction de l’ADN total
� Séquençage du génome
-Étude d’une portion du génome :
�Polymorphisme de restriction d’une portion d’ADN
� Séquençage de gènes