partielle resistenz chorea huntington transgener mäuse...

Partielle Resistenz Chorea Huntingtontransgener Mäuse gegen

globale cerebrale Ischämie

Anke Alexandra Alberty

Partielle Resistenz Chorea Huntingtontransgener Mäuse gegen

globale cerebrale Ischämie

Von der Medizinischen Fakultät derRheinisch-Westfälischen Technischen Hochschule Aachen

zur Erlangung des akademischen Gradeseiner Doktorin der Medizingenehmigte Dissertation

vorgelegt von

Anke Alexandra Alberty

aus Mönchengladbach

Berichter: Herr UniversitätsprofessorDr.med. Johannes Noth

Herr ProfessorDr.med. Norbert Schrage

Tag der mündlichen Prüfung: 24. Mai 2004

Diese Dissertation ist auf den Internetseiten der Hochschulbibliothekonline verfügbar.

für

TE & OH

Inhaltsverzeichnis

1. Einleitung Seite 3

1.1 Chorea Huntington1.2 Exzitotoxizitätstheorie und Glutamatrezeptoren1.3 Exzitotoxizitätstheorie bei Chorea Huntington1.4 Tiermodell1.5 Resistenz gegen Quinolinsäureinjektionen bei transgenen Mäusen1.6 Ziel der Arbeit

2. Material und Methoden Seite 11

2.1 Tiere und Tierhaltung2.2 Globale Ischämie2.3 Perfusion und Gehirnentnahme2.4 Fixation und Schneiden2.5 Färbungen2.6 Analyse2.7 Statistische Auswertung

3. Ergebnisse Seite 25

3.1 Gefäßstatus3.2 Genotypisierung3.3 15 min Ischämie3.4 20 min Ischämie3.5 60 min Ischämie3.6 Cycloheximid-Behandlung/20 min Ischämie3.7 Vergleich der Unterschiede in den mittleren Läsionsgrößen3.8 Photos

4. Diskussion Seite 45

5. Zusammenfassung Seite 53

6. Referenzenliste Seite 55

7. Danksagung Seite 65

8. Lebenslauf Seite 67

Einleitung

3

1. Einleitung

1.1 Chorea Huntington

1.2 Exzitotoxizitätstheorie und Glutamatrezeptoren

1.3 Exzitotoxizitätstheorie bei Chorea Huntington

1.4 Tiermodell

1.5 Resistenz gegen Quinolinsäureinjektionen bei transgenenMäusen

1.6 Ziel der Arbeit

Einleitung

4

1.1 Chorea Huntington

1.1.1 Epidemiologie und Symptomatologie

Die Chorea Huntington (CH) wurde im Jahre 1841 erstmals von C.O. Waters

beschrieben. Benannt wurde die Krankheit jedoch nach dem Amerikaner George

Huntington, der sie im Jahre 1872 als Erbkrankheit von der Chorea minor abgrenzte.

Huntington hatte bei seinen Studien von Familien auf Long Island das klassische

Muster einer autosomal dominant vererbten Erkrankung beobachtet.

CH betrifft alle Rassen und hat in Europa und Nordamerika mit 4-8 Fällen/ 100000

Einwohner die höchste Prävalenz. Männer und Frauen sind gleich häufig betroffen

(Meierkord, 1994).

Die Krankheit manifestiert sich typischerweise zwischen dem 35. und 45. Lebensjahr,

allerdings beginnen ca. 10 % der Erkrankungen vor dem 20. Lebensjahr. Diese als

Westphal-Variante bezeichnete Verlaufsform unterscheidet sich zusätzlich in den

Symptomen und in der Schwere der Erkrankung (Westphal, 1883).

Die Symptome bei CH sind durch die Trias choreatische Hyperkinesen, psychotische

Symptome und Demenz gekennzeichnet und lassen sich in Früh- und

Spätsymptome einteilen (vgl. Tab. 1).

Adulte Form Juvenile Form

Frühstadium Persönlichkeitsveränderungen, Persönlichkeitsveränderungen.Evtl. Depressives Syndrom, Kognitive Beeinträchtigung.Choreatische Hyperkinesen, Hypokinese, Hypomimie,Dysdiadochokinese, Ruhetremor.Dysarthophonie, Blicksakkaden-verlangsamung

Spätstadium Demenz, chronisch organische Demenz, Dysarthrie.Psychose.Dystone Hyperkinesen, Rigor, Ruhetremor,Rigor, Mutismus. Epileptische Anfälle.

Tab. 1 Symptome bei Chorea Huntington

Einleitung

5

Die adulte Form führt innerhalb von 15-20 Jahren zum Tod, die juvenile Form schon

nach 7-10 Jahren. Im Laufe der Erkrankung kommt es zu starkem Gewichtsverlust

und Kachexie. Der Tod tritt in den meisten Fällen durch Ateminsuffizienz oder durch

Infektionen, z.B. Aspirationspneumonie, ein.

1.1.2 Genetischer Defekt

CH gehört zu der wachsenden Gruppe der CAG-Triplet Erkrankungen. Hierbei

handelt es sich um Krankheiten, denen eine pathologisch verlängerte Cytosin-

Adenosin-Guanin Sequenz gemeinsam ist. Zu diesen Krankheiten zählen unter

anderem die Spinale Muskelatrophie (La Spada, 1991) und Formen der

Spinocerebellären Atrophien (Orr, 1993).

Der Gendefekt bei CH konnte im Jahre 1983 auf dem kurzen Arm des Chromosoms

4 (4p16.3) lokalisiert werden (Gusella, 1983) und wurde 10 Jahre später durch die

Huntington’s Disease Collaborative Research Group entschlüsselt.

Bei Normalpersonen schwankt die Anzahl von CAG-Triplets zwischen 9 und 34.

Eine Erhöhung der Wiederholungsrate auf über 38 macht ein Ausbrechen der

Krankheit sehr wahrscheinlich. Der Bereich zwischen 35 und 38 Wiederholungen ist

eine Indifferenzzone, in der eine genaue Aussage über einen eventuellen Ausbruch

der Krankheit nicht gemacht werden kann.

Zwischen Wiederholungsrate und Manifestationsalter gibt es eine inverse Beziehung:

Je höher die Wiederholungsrate, desto früher die Manifestation und desto schwerer

die Ausprägung der Krankheit. Bei der juvenilen Form findet sich daher eine

besonders hohe Wiederholungsrate, nicht selten mehr als 100 CAG-Triplets

(Wellington, 1997).

Die Sequenz CAG kodiert für die Aminosäure Glutamin. Die bei CH erhöhten Triplet-

Wiederholungen liegen in der Gensequenz, die für das Protein „Huntingtin“ kodiert.

Daher findet sich bei CH entsprechend der Triplet-Wiederholungen auch eine stark

verlängerte Polyglutaminkette im Huntingtin.

Huntingtin ist beim Gesunden ein rein zytoplasmatisches Protein, dessen Funktion

noch nicht vollständig geklärt werden konnte. Es ist innerhalb der Zelle mit dem

Cytoskelett und den Endosomen assoziiert, weshalb eine Beteiligung an

Transportvorgängen angenommen wird (DiFiglia, 1995). Huntingtin wird im gesamten

Organismus exprimiert.

Einleitung

6

Huntingtin ist für eine normale embryonale Entwicklung essentiell, die Ruptur des

Gens bei „knock-out“ Mäusen führt schon in der Embryonalphase zum Tod (Nasir,

1995). Eine protektive Wirkung des normalen Huntingtin bei exzitotoxischen Reizen

wird diskutiert (Sun, 2001).

Die normale Funktion des Huntingtins bleibt auch mit dem Gendefekt bestehen,

allerdings entwickelt es noch eine zweite, bislang nicht geklärte Wirkung, welche die

Pathologie der Chorea Huntington bewirkt. Dieses Prinzip bezeichnet man als „Gain

of Function“ (Sharp, 1996). Während bei Gesunden Huntingtin nur im Zytoplasma

vorhanden ist, wird das pathologisch verlängerte Polyglutamin vom Restprotein

abgespalten und bei CH Patienten auch im Zellkern gefunden. Im Zellkern haben die

Polyglutaminketten die Fähigkeit, sich aneinanderzulagern und große

Proteinaggregate zu bilden. Diese Proteinaggregate sind in der Lage, intranukleäre

Vorgänge zu stören (Cha, 2000).

1.1.3 Neuropathologie

Pathologisch-anatomisch kommt es bei CH zu einem Untergang von Neuronen und

einer Astrogliose, die vorwiegend das Striatum betrifft. Der Verlust von Neuronen

beginnt im Schwanz des Ncl. Caudatus und schreitet nach anterior und lateroventral

in Richtung Putamen fort. Die Reduktion der Neurone im Striatum kann bis zu 60 %

betragen (Vonsattel, 1985).

Auch im Neocortex findet sich ein Verlust an Neuronen, so dass das gesamte Gehirn

im Verlauf der Erkrankung bis zu 30 % an Gewicht verlieren kann.

Sowohl im Striatum als auch im Cortex sind nicht alle Neurone gleichmäßig

betroffen. Im Striatum degenerieren in erster Linie mittelgroße bedornte

Projektionsneurone, die GABA und Substanz P oder Enkephalin enthalten. Diese

Neurone wirken in erster Linie inhibitorisch auf die Substantia nigra und den Globus

pallidus pars medialis. Ausgespart bleiben cholinerge Interneurone, die mit ihren

Endigungen das Striatum nicht verlassen und unbedornte GABAerge Interneurone,

die Somatostatin, Neuropeptid Y und NADPH-Diaphorase enthalten.

Außerdem findet man in betroffenen Gehirnen später eine Atrophie im

Hypothalamus, im Corpus amygdaloideum und im Thalamus (Schmitz, 1999).

Immunhistochemisch lassen sich bei CH Patienten sog. intranukleäre

Einleitung

7

Einschlußkörper in vielen Bereichen des Gehirns nachweisen (Paulson, 1997). Diese

nehmen im Laufe der Erkrankung zu.

Intranukleäre Einschlußkörper sind immunhistochemisch positiv für Ubiquitin und

konnten außerdem mit Antikörpern gegen Polyglutamine nachgewiesen werden.

1.2 Exzitotoxizitätstheorie und Glutamatrezeptoren

Unter Exzitotoxizität versteht man den möglichen toxischen Effekt exzitatorischer

Neurotransmitter im Zentralen Nervensystem. Durch eine unphysiologisch hohe

Konzentration endogener exzitatorischen Neurotransmitter, z.B. Glutamat, im

synaptischen Spalt werden postsynaptische Glutamatrezeptoren übermäßig erregt.

Es kommt zum Öffnen von Ionenkanälen und einer Überladung der Zelle mit

Calciumionen, mit der vermehrten Aktivierung calciumabhängiger Proteasen.

Dadurch kommt es zu einer Kaskade von Stoffwechselvorgängen, an deren Ende

der neurotoxische Zelltod steht (Pavon, 1998).

Eine pathogenetische Rolle der Exzitotoxizität wird bei verschiedenen

neurodegenerativen Erkrankungen, z.B Morbus Alzheimer, Morbus Parkinson und

vor allem CH diskutiert. Auch bei akuten Ereignissen, wie Traumen oder Ischämie

sind exzitotoxische Vorgänge ursächlich beteiligt (Faden, 1989). 1984 konnte durch

Mikrodialyse gezeigt werden, dass nach globaler und fokaler Ischämie die

extrazelluläre Glutamatkonzentration um das 10fache ansteigt (Benveniste, 1984).

Exzitatorische Neurotransmitter wie Glutamat vermitteln ihre exzitatorische Wirkung

in erster Linie über Glutamatrezeptoren. Im Säugetiergehirn werden nach

pharmakologischen Gesichtspunkten verschiedene Rezeptoren für exzitatorische

Aminosäuren unterschieden:

I. α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolpropionat-Rezeptor (AMPA)

II. Kainat-Rezeptor

III. N-methyl-D-Aspartat-Rezeptor (NMDA)

IV. Metabotroper, Quisqualat-sensitiver Rezeptor (5 Untergruppen)

Die ersten drei Rezeptoren sind an Ionenkanäle gekoppelt, während der letzte G-

Protein assoziiert ist. Alle vier Rezeptoren gehören zu den Glutamat-Rezeptoren.

Glutamat ist der wichtigste exzitatorische Neurotransmitter im ZNS.

Einleitung

8

1.3 Exzitotoxizitätstheorie bei Chorea Huntington

Zum ersten Mal wurde das Phänomen der Exzitotoxizität mit CH im Jahre 1976 in

Verbindung gebracht. Nach einer Injektion von Kainat-Rezeptor-Agonisten in

Rattengehirne konnten neurochemische und neuropathologische Veränderungen

beobachtet werden, die denen bei CH ähnlich waren (Coyle, 1976). Allerdings waren

alle Zelltypen von der neurotoxischen Wirkung betroffen, so dass auf diese Weise

der typische selektive Zellschaden bei CH nur in eingeschränktem Maße reproduziert

werden konnte.

10 Jahre später wurde Ratten verschiedene Dosen Quinolinsäure (QA) injiziert.

Quinolinsäure ist ein endogener Tryptophan-Metabolit und wird im Gehirn

hauptsächlich zu Serotonin abgebaut. Nur über alternative Abbauwege können

Quinolinsäure und Kynurensäure entstehen. Quinolinsäure wirkt agonistisch am N-

Methyl-D-Aspartat-Rezeptortyp der Glutamatrezeptoren (NMDA-R). Bei der

immunhistochemischen Auswertung konnte festgestellt werden, dass nur Substanz-

P-haltige und GABAerge Projektionsneurone vom Zellschaden betroffen waren.

Somatostatin und Neuropeptid Y enthaltende Interneurone blieben ausgespart.

Damit imitiert dieses Modell deutlich mehr den bei CH beobachteten differenzierten

Zellschaden (Beal, 1986).

Durch intrastriatale Injektionen von Quinolinsäure konnten im Tierversuch einige der

bei CH auftretenden Verhaltensauffälligkeiten reproduziert werden (Block, 1993).

Aufgrund der Ähnlichkeit neuropathologischer Veränderungen nach exzitotoxischem

Zellschaden im Striatum mit den neuropathologischen Beobachtungen bei CH wird

angenommen, dass Exzitotoxizität bei der Pathogenese der CH eine ursächliche

Rolle spielen könnte.

1.4 Transgenes Tiermodell

Geeignete Tiermodelle sind für die Erforschung der Pathogenese, aber auch für die

Testung neuer Therapiemöglichkeiten unerlässlich.

Durch Übertragung des Exon 1 eines humanen Huntington Gens mit 130 CAG-

Triplet-Wiederholungen unter Kontrolle des humanen Promotors in das Mäusegenom

konnte 1996 ein zuverlässiges und bis heute genutztes Mausmodell für CH

entwickelt werden (Mangiarini, 1996). Es entstanden vier transgene Linien, von

Einleitung

9

denen die R6/1 Linie mit bis zu 115 CAG-Wiederholungen in vielen Studien

verwendet wird. Die Mäuse der R6/1-Linie entwickeln im Alter von 22-26 Wochen

einen charakteristischen, progredienten Phänotyp. Aufgrund der hohen Anzahl der

Triplet-Wiederholungen und des frühen Auftretens der ersten Symptome ist das

transgene Mausmodell am ehesten mit der humanen juvenilen Form („Westphal“) der

CH vergleichbar.

Die Symptome beginnen mit einem zunächst diskreten Ruhetremor und - ähnlich wie

beim Menschen - einer ataktischen Gangstörung. Eines der ersten Symptome bei

Mäusen ist das sogenannte „Clasping“. Werden gesunde Mäuse am Schwanz

hochgehoben, so strecken sie ihre Hinterbeine zur Seite, um sich zu stabilisieren.

Symptomatische Mäusen sind nicht in der Lage, ihre Beine auszustrecken, sie halten

die Extremitäten am Körper und rollen sich zusammen (to clasp, englisch:

umklammern) (Mangiarini, 1996). Transgene Mäuse können bis zu 60% ihres

Körpergewichtes verlieren. Im Endstadium treten vermehrt generalisierte epileptische

Anfälle auf, in deren Verlauf die Mäuse versterben können.

Neuropathologisch weisen die Gehirne transgener Mäuse eine deutliche globale

Atrophie auf. Allerdings konnten mit Beginn der Symptome keine fokalen

Degenerationsvorgänge festgestellt werden, insbesondere das Striatum ist zwar

verkleinert, Zeichen eines Zelluntergangs fehlen aber. Wie im menschlichen Gehirn

finden sich auch in den Gehirnen transgener Mäuse intranukleäre Einschlußkörper

(Davies, 1997).

Die R6/1 Linie des transgenen Mausmodells zeigt also in Neuropathologie und

Symptomatik deutliche Parallelen zu den Befunden beim Menschen. Es stellt somit

eine wertvolle Grundlage zur Erforschung der Pathogenese der CH und zur Testung

neuer therapeutischer Interventionen dar. Das transgene Mausmodell löste das

lange Zeit bei CH-Studien verwendete exzitotoxische Quinolinsäure-Tiermodell ab.

1.5 Resistenz gegen Quinolinsäureinjektionen beitransgenen Mäusen

Wie oben beschrieben kann durch stereotaktische Injektionen von Quinolinsäure der

spezifische striatale Neuronenuntergang bei CH imitiert werden. Sollte Exzitotoxizität

ursächlich an der Pathogenese der CH beteiligt sein, so wäre zu erwarten, dass

Huntington-transgene Mäuse besonders sensibel auf eine Injektion von

Quinolinsäure oder NMDA, also einen weiteren exzitotoxischen Reiz, reagieren.

Einleitung

10

Jedoch konnte gezeigt werden, dass transgene Mäuse der R6/1 Linie im Vergleich

zu Wildtyp-Mäusen resistent gegen diese Noxe sind (Hansson, 1999). Während es

bei nicht transgenen Mäusen zu den typischen exzitotoxischen Zelluntergängen kam,

wurde bei transgenen Mäuse bei gleicher Dosis keine oder eine deutlich geringere

Degeneration im Striatum beobachtet.

Eine Hypothese, die versucht, diesen scheinbaren Widerspruch aufzuklären, ist,

dass transgene Mäuse einer chronischen, aber nur subletal erhöhten

Glutamatkonzentration ausgesetzt sind. Durch eine reaktive Heraufregulation

potentiell protektiver endogener Schutzmechanismen der Neurone wären sie im

Sinne einer „Präkonditionierung“ gegen eine Überstimulation von Glutamat

geschützt. Dieses Phänomen ist bereits aus der Ischämieforschung bekannt.

In Ischämieversuchen haben kurzzeitige Gefäßokklusionen nach einem bestimmten

Zeitintervall einen protektiven Effekt bei einer weiteren Hypoxie. Dieses Phänomen

konnte sowohl am Herzen (Murry, 1986) als auch am Gehirn (Himori, 1991) gezeigt

werden.

1.6 Ziel der Arbeit

Aus der Beobachtung, dass transgene Mäuse gegen einen von außen eingebrachten

exzitotoxischen Reiz, nämlich eine Injektion von Quinolinsäure, resistent sind,

erwächst die Frage, ob diese Protektion nur auf direkte exzitotoxische Reize

beschränkt ist, oder ob eine eher generalisierte Protektion gegen Noxen, in deren

Pathogenese Exzitotoxizität eine Rolle spielt, vorliegt. Aufgrund der oben

beschriebenen Ähnlichkeiten und des schon bekannten Glutamatanstiegs bei

Ischämie, wird untersucht, ob CH transgene Mäuse auch gegen transiente globale

Ischämien verschiedener Dauer resistent sind. Hierbei wird insbesondere darauf

geachtet, ob der gegen exzitotoxische Noxen, wie z.B. Ischämie, besonders sensible

Hippocampus ebenfalls protektioniert ist. Sollte eine Protektionierung vorliegen, wird

in einem zweiten Schritt untersucht, ob diese durch eine vermehrte Synthese

protektiver Proteine bedingt ist. Die Gabe eines Proteinsyntheseinhibitors vor der

Durchführung der Ischämie müsste dann die Protektionierung aufheben.

Material und Methoden

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2. Material und Methoden

2.1 Tiere und Tierhaltung

2.2 Globale Ischämie2.2.1 Materialien2.2.2 Methode

2.3 Perfusion und Gehirnentnahme2.3.1 Materialien2.3.3 Methode

2.4 Fixation und Schneiden2.4.1 Materialien2.4.3 Methode

2.5 Färbungen2.5.1 Cresylviolett

2.5.1.1 Materialien2.5.1.2 Methode

2.5.2 Fluoro Jade2.5.2.1 Materialien2.5.2.2 Methode

2.5.3 Ubiquitin2.5.3.1 Materialien2.5.3.2 Methode

2.6 Analyse2.6.1 Geräte2.6.2 Methode

2.7 Statistische Auswertung


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2.1 Tiere und Tierhaltung

Für die Tierversuche wurden transgene Mäuse der Jackson Laboratory Texas, sowie

nicht transgene Kontrolltiere verwendet. Es wurden Mäuse des Stammes R6/1

[B6CBATgN(Hdexon1)61gpb], die 115 Tripletwiederholungen aufweisen und im Alter

von 22-26 Wochen symptomatisch werden, verwendet. Das Alter der verwendeten

Mäuse betrug im Durchschnitt 26 Wochen. Die Mäuse wurden im Alter von 2

Wochen mittels PCR genotypisiert. Die Tierhaltung erfolgte im Gentechnischen

Arbeitsbereich S1 des Instituts für Versuchstierkunde und Zentrallaboratorium für

Versuchstiere der RWTH Aachen unter der Leitung von Prof. Dr. med. vet. W.

Küpper. Die Haltungsbedingungen entsprachen denen einer Trockenbarriere.

Materialhygiene wurde durch Sterilisation bzw. Desinfektion gewährleistet,

Personalkontrolle erfolgte durch Tragen von Schutzkleidung, Handschuhen,

Überschuhen, Mund- und Haarschutz. Die Mäuse wurden in einem vollklimatisierten

Tierstall bei einer Temperatur von 20°C +/- 2°C und einer relativen Luftfeuchte von

50% +/- 10% gehalten. Sie lebten in Makrolonkäfigen Typ II und III mit entstaubter

Weichholzfaser als Einstreu. Zugang zu Futter (Alleinfutter zur Haltung von Ratten

und Mäusen) und Wasser (entkalkt, durch zweifache Ozonierung und anschließende

UV-Bestrahlung entkeimt, Darreichung in Makrolonflaschen) erfolgte ad libitum. Der

Hell/Dunkel-Rhythmus betrug zwölf Stunden.

2.2 Globale Ischämie

2.2.1 Materialien

Für die Durchführung einer globalen Ischämie wurden folgende Hilfsmittel verwendet:

• Gerät zur Überwachung der Atemfrequenz TC-ELEKTRONIK• Operationsmikroskop ZEISS• Narkosegerät DRÄGER• Inhalationskammer Eigene Herstellung• Inhalationsmaske Eigene Herstellung• Absaugvorrichtung für Narkosegase Eigene Herstellung• Temperatur-kontrollierter Operationstisch Eigene Herstellung• Rektales Thermometer HARVARD• Wattestäbchen HANDELSÜBLICH• Tupfer HANDELSÜBLICH


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• Durapore Klebeband DURAPORE• Skalpell FEATHER• Wundhaken Laborbestand• Verschiedene Pinzetten und Scheren Laborbestand• Gefäßclips Laborbestand• Hautfaden VICRYL• Nadelhalter Laborbestand• Schläuche verschiedener Dicke Laborbestand• Drei-Wege-Hahn Laborbestand• Halothan ASID• Distickstoffoxid LINDE• Sauerstoff LINDE• Bepanthen Augensalbe ROCHE• 0,9 %ige Kochsalzlösung DELTA-PHARMA• Aqua destillatum DELTA-PHARMA• Wärmelampe Laborbestand• Cycloheximid (C15H23NO4) CALBIOCHEM• Ethanol absolut Klinikumsapotheke• Waage Laborbestand

2.2.2 Methode

Die Operationen wurden im Gentechnischen Arbeitsbereich Sicherheitsstufe 1 der

Tierexperimentellen Abteilung der RWTH Aachen durchgeführt. Hierfür wurde uns

ein eigener, abgetrennter Operationsraum zur Verfügung gestellt, um Störungen und

die damit verbundene zusätzliche Belastung der Mäuse so gering wie möglich zu

halten.

Die Narkoseeinleitung erfolgte in einer Inhalationskammer mit 1 l O2, 1 l N2O und 3,5Vol% Halothan. Nach ca. 3 min setzte die Narkosewirkung ein und die Maus wurde

auf dem Rücken auf dem temperaturkontrollierten Operationstisch gelagert.

Die Temperatur des Operationstisches wurde auf 37°C eingestellt. Über die Nase der

Maus wurde die Inhalationsmaske gestülpt und die Halothandosis auf 1-1,5 Vol%

reduziert. Die entströmenden Narkosegase wurden durch eine eigene Vorrichtung

abgesaugt. Vorder- und Hinterbeine der Maus wurden vorsichtig gespreizt und mit

Durapore-Band befestigt.

Das rektale Thermometer wurde mit 0,9%iger Kochsalzlösung befeuchtet und

vorsichtig in den Enddarm der Maus eingeführt. Die Körpertemperatur der Maus

konnte so überwacht und konstant bei 37°C gehalten werden. Die Augen wurden mit

Bepanthen Augensalbe betupft, um ein Austrocknen während der Narkose zu


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verhindern. Durch gezielte Schmerzreize an den Hinterbeinen der Maus wurde die

Narkosetiefe überprüft und gegebenenfalls angepasst. Erst bei sicherer

Ausschaltung der Schmerzempfindung erfolgte der Hautschnitt.

Die Haut wurde vom Brustbeinansatz nach distal auf einer Länge von ca. 1½ cm

eröffnet. Nun erfolgte die stumpfe Präparation von Fettgewebe und Thymus in der

Mittellinie bis zur Tracheavorderwand. Das OP-Feld wurde dann mit 4 Wundhaken

vorsichtig gespreizt. Die weiteren Schritte erfolgten nun unter mikroskopischer

Kontrolle. Der Gefäß-Nerven-Strang um die Arteria carotis communis wurde stumpf

freigelegt und stellte sich wie folgt dar:

Innen: A. carotis communis

Mitte: N. vagus

Außen: V. jugularis interna.

Die Carotisloge wurde noch bedeckt vom M. sternocleidomastoideus, der ebenfalls

stumpf durchtrennt wurde. Die Carotisloge war nun gut einsehbar, und die A. carotis

communis wurde über eine Länge von 5-6 mm freigelegt. Der N. vagus und die V.

jugularis interna wurden hierbei vorsichtig nach lateral abpräpariert. Die A. carotis

communis wurde selektiv untertunnelt. Nun wurden auf beiden Seiten unter

sorgfältiger mikroskopischer Kontrolle passagere Gefäßclips angelegt und so für die

folgenden Zeiten der Blutdurchfluß durch die A. carotis communis unterbrochen:

(1) 15 Minuten 10 Mäuse



(4) 20 Minuten/vorherige Cycloheximidgabe 10 Mäuse

Das Operationsfeld wurde mit 0,9%iger Kochsalzlösung befeuchtet, um ein

Austrocknen zu verhindern. Meist konnte die Narkose nach Unterbrechung des

Blutflusses um weitere 0,5 Vol% reduziert werden. Diese Reduktion erfolgte unter

ständiger Kontrolle der Schmerzempfindung und der Atemfrequenz. Nach der

bestimmten Zeit wurden die Gefäßclips auf beiden Seiten entfernt und die

Kochsalzlösung wurde vorsichtig abgetupft. Die Reperfusion der beiden Aa. carotes

communes wurde unter dem Operationsmikroskop kontrolliert. Der Wundverschluss

erfolgte durch chirurgische Hautnaht. Nach der Operation wurden die Mäuse noch

eine Stunde unter einer Wärmelampe überwacht. 10 Mäuse wurden zusätzlich einen

Tag vor der Durchführung der globalen Ischämie mit Cycloheximid behandelt, um

unspezifisch die Proteinbiosynthese zu hemmen. Die Mäuse wurden hierfür


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gewogen. Sie erhielten eine intraperitoneale Injektion von 10mg Cycloheximid pro

Kilogramm Körpergewicht. Cycloheximid war zuvor in unvergälltem Ethanol gelöst

worden.

Am nächsten Tag wurde an diesen 10 Mäusen nach oben beschriebenem Protokoll

eine 20minütige globale Ischämie durchführt.

2.3 Perfusion und Gehirnentnahme

2.3.1 Materialien

• 1 ml Spritze AMEFA• 20 ml Spritzen AMEFA• Nadeln verschiedener Größen TERUMO• Butterfly Nadelsystem VALUSET• Diverse Scheren, Pinzetten, Nadelhalter Laborbestand• Scharfer Löffel Laborbestand• Dickes Korkbrett Laborbestand• Aufbewahrungsgefäß für Gehirn Laborbestand• 0,9%ige Kochsalzlösung DELTA-PHARMA• Pentobarbital MERCK• 4%iges Paraformaldehyd (PFA), pH 7,4 Eigene Herstellung• Schüttler GFL 3005• PH-Meter mit Eichlösungen SCHOTT• Reinstes Paraformaldehyd MERCK• Aqua destillatum MILLIPORE• 0,2 M Phosphate Buffer Saline (PBS) Eigene Herstellung• Heizplatte Laborbestand• Natriumhydroxid Pellets MERCK• 5N Hydrochlorid MERCK• 1N Natriumhydroxid MERCK• Magnetische Rührplatte mit Magnetrühren JANKE & KUNKEL

und Heizfunktion JANKE & KUNKEL• Grammwaage SARTORIUS• Pipetten EPPENDORF

2.3.2 Methode

Nach einer Überlebenszeit von 3 Tagen erfolgte die Gefäßdarstellung und Fixation.

Hierbei wurde die Maus zuerst durch eine intraperitoneale Injektion von 0,1 mg/kg

Körpergewicht Pentobarbital in eine finale Narkose gelegt.


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Zuerst wurde intrakardial mit 20 ml 0,9%ige Kochsalzlösung perfundiert, um das Blut

aus den Gefäßen zu waschen. Dann wurden 0,5ml eines Gemisches aus 10%

Gelatine und 50 % Tinte zur Darstellung der Gefäße des Circulus arteriosus Willisi

injiziert. Dies erfolgte so lange, bis die Schleimhäute der Maus dunkel wurden.

Das beschriebene Gemisch aus Gelatine und Tinte ist flüssig bei Raumtemperatur

und fest bei 4% C. Daher wurde die tote Maus vor der Gehirnentnahme für 10 min in

den Kühlschrank gelegt. Danach erfolgte die Dekapitation und vorsichtige

Gehirnentnahme einschließlich der Gefäße. Das Gehirn wurde nun für 2 Tage in

4%igem PFA auf dem Schüttler bei ca. 50 Umdrehungen pro Minute (rpm) und 4°C

weiter fixiert.

2.4 Fixation und Schneiden

2.4.1 Materialien

• Diverse Aufbewahrungsgefäße Laborbestand• Schüttler GFL 3005• Löffel Laborbestand• Kimwipes Labortücher KIMBERLEY & CLARK• -80°C Tiefkühlschrank JEWETT• Kryostat LEICA CM 3050• Schneideklingen FEATHER• Pinsel Laborbestand• Pinzette Laborbestand• Rasierklingen Handelsüblich• Mit Silan beschichtete Objektträger ENGELBRECHT• Kryoboxen Laborbestand• 20%ige Sucrose Eigene Herstellung• flüssiges Isopentan Laborbestand• Jung’s Einbettmedium JUNG’S• Ethanol 100% Klinikumsapotheke• Auflichtmikroskop ZEISS

2.4.2 Methode

Nach der Fixation mit 4%igem PFA wurden die Gehirne für zwei Tage in 20%iger

Sucrose gelagert. Durch die Sättigung mit dieser Zuckerlösung wird die Gefahr der

Entstehung von Gefrierartefakten beim Einfrieren minimiert.


Die Sättigung mit Sucrose erfolgte bei 4°C auf einem Schüttler.

Vor dem Einfrieren wurde der Status des Circulus Arteriosus dokumentiert. Dies

erfolgte unter einem Binokular. Abb. 1 zeigt in schematischer Weise den Aufbau des

Circulus arteriosus Willisi bei Mäusen und insbesondere den Verlauf der A.

communicans posterior.

ACA: A. cerebri ante

ACM: A. cerebri med

ACI: A. carotis inter

ACP: A. cerebri pos

ACS: A. cerebellaris

AB: A. basilaris

PcomA: A. communica

Es wurde bei allen Gehirnen

Die Einteilung erfolgte in die

Gut Ausgeprägt („+“)

Hypoplastisch oder N

ACIPco

ACA

rior

ia

na

terior

superior

ns posterior

der Zustand

Gruppen:

icht Ausgeprä

mA

ACM

d

g

ACP

Abb. 1 Darstellung des Circulusarteriosus bei Mäusen
ACS AB
17

er PcomA auf beiden Seiten dokumentiert.

t („-“)


18

Die Gehirne wurden auf einem Kryostaten bei –20°C in 20 µm dicke Schnitte

geschnitten. Die Gehirne wurden bis zum Ende des Hippocampus aufgeschnitten,

hierfür wurden in der Regel 40 Objektträger benötigt.

Von jedem Gehirn wurden außerdem 5 Schnitte aus einem für die Auswertung

unwichtigen Bereich „free floating“ in PBS gegeben und für eine spätere Ubiquitin-

Färbung aufbewahrt.

In Kryoboxen konnten die restlichen Schnitte für mehrere Monate im –80°C

Tiefkühlschrank aufbewahrt werden.

2.5 Färbungen

2.5.1 Cresylviolett

• 4%iges Paraformalinaldehyd eigene Herstellung• 0,1 M Phosphate Buffer Saline (PBS) eigene Herstellung• Cresylviolettlösung eigene Herstellung• 70%iger Alkohol Klinikumsapotheke• 80%iger Alkohol Klinikumsapotheke• 96%iger Alkohol Klinikumsapotheke• 100%iger Alkohol Klinikumsapotheke• Xylollösung Klinikumsapotheke• DPX-Eindeckmedium FLUKA• Deckgläser ENGELBRECHT• Natriumacetat Klinikumsapotheke• Reine Essigsäure MERCK• Aqua destillatum MILLIPORE• PH-Meter mit Eichlösungen SCHOTT• Wärmeplatte MEDAX• Magnetische Rührplatte mit Magnetrührern JANKE & KUNKEL• Wärmeschrank HERAEUS• Küvetten Labor der Neurol.Klinik• Messzylinder SCHOTT DURAN• Erlenmeyerkolben SCHOTT DURAN• Bechergläser SCHOTT DURAN• Pipetten EPPENDORF

Cresylviolett wurde wie folgt hergestellt:

• 5,44 g Natriumacetat wurden in 200 ml Aqua destillatum (pH 3,8-4) gelöst

• Auf 800 ml Aqua destillatum wurden nun 9,8 ml Essigsäure gegeben

• Zu dieser Lösung wurde die Cresyl-Natriumacetatlösung gegeben


19

• Die Lösung wurde über Nacht im Wärmeschrank bei 37°C inkubiert und am

darauffolgenden Tag filtriert

Zur Färbung mit Cresylviolett mußten die Schnitte mindestens eine Stunde vorher auf

einer Wärmeplatte bei 40°C aufgetaut und getrocknet werden.

Nach dem Trocknen erfolgte eine Postfixation für 5 min in 4% PFA. Danach wurden

die Schnitte für 3 x 5min in 0,1M PBS gespült.

Die Cresylfärbung wurde dann folgendermaßen durchgeführt:

• 2 min Aqua destillatum

• 5 min Cresylviolett (je nach Frische der Lösung)

• zum Differenzieren jeweils15 sec. 70%iger Alkohol

15 sec. 80%iger Alkohol

15 sec. 96%iger Alkohol

3 min. 100%iger Alkohol

• 5 min Xylollösung, um die Schnitte völlig zu dehydrieren und so auf das

Einbettmedium DPX, das auf Xylolbasis hergestellt wird, vorzubereiten

• Nach der Xylollösung wurden die Schnitte für ca. 1 min getrocknet, dann

wurde auf jeden Schnitt ein dicker Tropfen DPX gegeben und die Schnitte

vorsichtig eingedeckt. Hierbei war es besonders wichtig, Luftblasen unter dem

Deckgläschen zu verhindern.

• Die fertigen Objektträger wurden nun für einige Stunden bei Raumtemperatur

getrocknet und konnten danach ausgewertet werden.

2.5.2 Fluoro-Jade-B

Für die Fluoro-Jade-B-Färbung wurden die folgenden Chemikalien und Hilfsmittel

verwendet:

• 4%iges PFA Eigene Herstellung• 0,1 M PBS Eigene Herstellung• Fluoro-Jade-B Stock Solution HISTO-CHEM• 0,06%ige Kaliumpermanganat-Lösung Eigene Herstellung• Reine Essigsäure MERCK• Aqua destillatum MILLIPORE• Schüttler GFL 3005• Wärmeplatte MEDAX• Xylollösung Klinikumsapotheke• DPX-Eindeckmedium FLUKA


20

• Deckgläser ENGELBRECHT• Küvetten Labor der Neurol.Klinik• Messzylinder SCHOTT DURAN• Erlenmeyerkolben SCHOTT DURAN• Bechergläser SCHOTT DURAN• Pipetten EPPENDORF

Auch für die Fluoro-Jade-B-Färbung wurden die Objektträger mindestens eine

Stunde vorher auf der Wärmplatte bei ca. 40°C aufgetaut und getrocknet.

Danach erfolgte die Postfixation wie oben beschrieben.

Fluoro-Jade-B ist ein anionisches saures Fluorescein-Derivat und hat eine

spezifische Affinität für degenerierende Neurone.

Für jeden Färbevorgang wurde eine frische Fluoro-Jade-B-Gebrauchslösung

angesetzt. Hierzu wurde die Stammlösung 1:10 mit Aqua destillatum verdünnt.

Reine Essigsäure wurde ebenfalls mit Aqua destillatum im Verhältnis 1:1000

verdünnt. Zu 96 ml dieser 0,1%igen Essigsäure wurden nun 4 ml der verdünnten

Fluoro-Jade-B-Lösung gegeben, so daß eine 0,0004%ige Gebrauchslösung

entstand.

Die Fluoro-Jade-B-Färbung wurde nach folgendem Protokoll durchgeführt:

• Nach der Postfixation 10 min 0,06%iges Kaliumpermanganat bei

Raumtemperatur auf dem Schüttler

• Danach 2 min Spülen mit Aqua destillatum

• Für 20 min Inkubation in 0,0004%iger Fluoro-Jade-B-Gebrauchslösung,

hierbei wurde die Küvette lichtdicht abgedeckt

• Spülen für 3x1min in Aqua destillatum

• Danach wurden die Schnitte für ca. 10 min auf der Wärmeplatte bei 40°C

getrocknet

• Dehydrierung mit Xylol für 30 sec

• Danach wurden die Schnitte für ca. 1 min getrocknet und dann wie oben

beschrieben eingedeckt.

• Die Schnitte wurden nun für einige Stunden abgedunkelt getrocknet und

konnten danach unter dem Fluoreszenzmikroskop ausgewertet werden.


21

2.5.3 Ubiquitinfärbung

• 0,1 M PBS Eigene Herstellung• Methanol Klinikumsapotheke• 30%ige Peroxidase (H2O2) ALDRICH• Triton X Eigene Herstellung• Normal Goat Serum (NGS) SIGMA• Anti-Ubiquitin, made in rabbit DAKO• Anti-Rabbit, made in goat, biotyniliert VECTOR• Vectastain ABC-Kit Standard VECTOR

(Avidin Biotin Complex)• Diaminobenzidin (DAB) SIGMA• DAB-Puffer (10x) Eigene Herstellung• Aqua destillatum MILLIPORE• Pipetten EPPENDORF• Milligrammwaage SARTORIUS• Grammwaage SARTORIUS• Magnetische Rührplatte mit Magnetrührern JANKE & KUNKEL• Schüttler GFL 3005• Bechergläser SCHOTT DURAN• Erlenmeyerkolben SCHOTT DURAN• Meßzylinder SCHOTT DURAN• Ethanol 50%, 70%, 80%, 96%, 100% Klinikumsapotheke• Xylol Klinikumsapotheke• Deckgläser ENGELBRECHT• Bleach Klinikumsapotheke• Pipettierplatten Labor der Neurol.Klinik• Mikroskop ZEISS• Gelatinierte Objektträger ENGELBRECHT

Für die Ubiquitinfärbung wurden die während des Schneidevorgangs in 0,1M PBS

gesammelten „free floating“ Schnitte verwendet. Für jedes Gehirn standen 5 Schnitte

zur Verfügung.

Diese Schnitte wurden zuerst für 3 x 3 min in 0,1M PBS gespült. Dann erfolgte die

Ubiquitinfärbung nach folgendem Protokoll:

• Endogener Peroxidase-Block: für 10 min in einer Lösung aus 50% 0,1M PBS,

47% Methanol, 3% 30%ige Peroxidase (H2O2) bei Raumtemperatur auf dem

Schüttler, ca. 40 rpm

• Danach für 3 x 3 min Spülen in 0,1M PBS

• Die Blocking Solution für den Serum Block wurde zu 95% aus 0,5%igem

Triton X und 5% NGS hergestellt. Es wurde die doppelte Menge hergestellt,


22

da auch bei der Inkubation mit dem Primärantikörper Blocking Solution

verwendet wurde

• Der Serum Block erfolgte für 30 min bei Raumtemperatur auf dem Schüttler

• Der Primärantikörper Anti-Ubiquitin wurde im Verhältnis 1:1000 zur Blocking

Solution gegeben. Hierin wurden die Schnitte über Nacht auf dem Schüttler

bei 4°C inkubiert.

• Am darauffolgenden Tag wurden die Schnitte zunächst für 3 x 3 min in

0,1M PBS gespült

• Danach erfolgte die Inkubation mit dem biotinylierten Zweitantikörper

Anti-Rabbit in einer Lösung aus 5% Normal Goat Serum und 95% 0,5%iges

Triton X. Der Zweitantikörper wurde in einem Verhältnis von 1:250 zugegeben.

• Die Inkubation erfolgte für eine Stunde auf dem Schüttler bei Raumtemperatur

• Danach erfolgte wiederum ein Waschschritt wie oben beschrieben

• Das ABC-Kit wurde mit einem Tropfen Avidin und einem Tropfen Biotin auf

5 ml 0,1M PBS angesetzt. Die Schnitte wurden hierin für eine Stunde auf dem

Schüttler bei Raumtemperatur inkubiert.

• Danach erfolgte wiederum ein Waschschritt wie oben beschrieben

• Für die Farbreaktion wurden 5 mg DAB, 1 ml DAB-Puffer, 9 ml Aqua

destillatum und 2µl H2O2 gemischt. Da DAB sehr giftig ist, wurden spezielle

Handschuhe getragen sowie unter dem Abzug gearbeitet.

• Die Farbreaktion dauerte zwischen 4 und 6 min, aber immer für alle Schnitte

gleich lang, um einen Vergleich zwischen den verschiedenen Gehirnen ziehen

zu können.

• Die Farbreaktion wurde durch Übertragen der Schnitte in PBS gestoppt

• DAB wurde durch Bleichlösung inaktiviert und gesondert entsorgt

• Die Schnitte wurden auf gelatinierte Objektträger aufgezogen und über Nacht

getrocknet

• Am nächsten Tag erfolgt die Dehydrierung in einer aufsteigenden Alkoholreihe

nach folgendem Protokoll:

o Aqua destillatum 2 min

o Ethanol 50% 2 min

o Ethanol 70% 2 min

o Ethanol 96% 2 min


23

o Ethanol 100% I 2 min

o Ethanol 100% II 2 min

o Xylol I 2 min

o Xylol II 2 min

• Danach wurden die Objektträger für ca. eine Minute luftgetrocknet und

anschließend mit DPX eingedeckt.

2.6. Analyse

2.6.1 Geräte

Für die Auswertung und photographische Dokumentation der Gehirne wurden

folgende Geräte verwendet:

• Licht-und-Fluoreszenzmikroskop Axiocam ZEISS

• Kameravorrichtung ZEISS

• Bildbearbeitungsprogramm Axiovision ZEISS

• Tabellenkalkulationsprogramm EXCEL MICROSOFT

2.6.2 Methode

Zur Bewertung der Läsionsgröße wurde folgende Einteilung vorgenommen, wie sie

von Pulsinelli et al 1979 beschrieben wurde:

Läsionsgruppe 0 : keine neuronale Schädigung

Läsionsgruppe 1 : bis zu 30% der Neurone geschädigt

Läsionsgruppe 2 : 31 bis 60% der Neurone geschädigt

Läsionsgruppe 3 : mehr als 60% der Neurone geschädigt

Zur Bestimmung der Läsionsgruppe wurde der gesamte Hippocampus betrachtet. Es

wurde jeweils der Hippocampus in beiden Hemisphären auf Höhe des Nucleus

subthlamicus ausgewertet.

Die Einteilung in Läsionsgruppen wurde anhand der Cresylfärbung vorgenommen.

Hierbei wurde besonders darauf geachtet, daß dem Untersuchern nicht bekannt war,


24

ob es sich um ein transgenes oder ein nicht transgenes Tier handelt.

Die Fluoro-Jade-Färbung wurde in erster Linie dazu verwendet, die mit der

Cresylfärbung vorgenommene Einteilung zu verifizieren.

Mit der Ubiquitinfärbung konnte der Genstatus des jeweiligen Tieres noch einmal

bestätigt werden.

2.7 Statistische Auswertung

Die statistische Auswertung erfolgte mit der exakten Version des Mann-Whitney-U-

Test. Hierbei handelt es sich um einen nicht-parametrischen Test, der zwei nicht

gepaarte Gruppen vergleicht.

Das Ergebnis des Tests ist der sogenannte P-Wert. Der P-Wert beschreibt die

Wahrscheinlichkeit, daß ein Unterschied im Mittelwert der beiden Gruppen rein

zufällig ist. Der P-Wert reicht also von 0 bis 1.

Es wurde ein Schwellenwert von p < 0,01 festgelegt. Als „Null-Hypothese“ wurde

festgelegt, daß transgenen und nicht transgene Mäuse die gleiche mittlere

Läsionsgröße aufweisen.

Ist der P-Wert nun kleiner als der Schwellenwert von 0,01, so kann die Nullhypothese

verworfen werden und ein Unterschied in der mittleren Läsionsgröße der transgenen

und nicht-transgenen Mäuse kann als signifikant angesehen werden.

Da die Hippocampi beider Hemisphären ausgewertet wurden, also zwei Hippocampi

pro Gehirn, kommt es bei der statistischen Auswertung zu Gesamtsummen von 20

Werten pro Ischämie-Gruppe, bzw. 24 Werten in der Gruppe „20 min Ischämie“.

Um zu prüfen, ob der Genstatus einen statistisch signifikanten Einfluß auf die

Ausprägung des Circulus arteriosus Willisi hat, wurde der Χ2-Test durchgeführt. Mit

dem Χ2-Test für Unabhängigkeit wird untersucht, ob ein Zusammenhang zwischen 2

Variablen, hier dem Genstatus und der Ausprägung des Circulus arteriosus Willisi,

besteht. Das Ergebnis des Χ2-Tests ist der P-Wert, der die Wahrscheinlichkeit einer

Abhängigkeit der Variablen voneinander angibt. Es wurden außerdem X2-Tests

durchgeführt, um die Korrelation zwischen Ausbildung des Circulus arteriosus und

der Läsionsgröße, bzw. der Verteilung auf die Ischämiezeiten, zu prüfen.

Ergebnisse

25

3. Ergebnisse

3.1 Gefäßstatus

3.2 Genotypisierung

3.3 15 min Ischämie



3.6 Cycloheximid-Behandlung / 20 min Ischämie

3.7 Vergleich der Unterschiede in den mittleren Läsionsgrößen

3.8 Photos

3.8.1 Circulus arteriosus

3.8.2 Ubiquitinfärbungen

3.8.3 Übersichtsaufnahmen Cresyl/Fluoro Jade

3.8.4 Detailaufnahmen 15 min Ischämie



Ergebnisse

26

3.1 Gefäßstatus

Der Status der Arteria commnunicans posterior (PcomA) wurde bei allen operierten

Tieren mittels Auflichtmikroskopie an den mit Tinte perfundierten Gefäßen

festgestellt. Die Verteilung des Gefäßstatus wird in der folgenden Tabelle deutlich:

15 min Ischämie 20 min Ischämie 60 min Ischämie Cyclo/20 min Isch.

tg nt tg nt tg nt tg nt

+ 6 4 4 6 6 8 5 8

- 4 6 8 6 6 0 5 2

Tab. 2 Vorhandensein einer PcomA in bezug auf die Ischämiezeiten und den Genstatus

+ PcomA ist gut erhalten nt: nicht transgen- PcomA ist hypoplastisch oder fehlt tg: transgen

Mittels X2-Tests wurde geprüft, ob eine Abhängigkeit besteht zwischen

Vorhandensein einer PcomA und:

1. - Genstatus

2. - Läsionsgröße

3. - Verteilung auf die Ischämiezeiten durchgeführt.

Zu 1: Der Χ2-Test ergab mit einem P-Wert von 0,1699 keinen statistisch

signifikanten Zusammenhang zwischen Ausbildung des Circulus arteriosus und

Genstatus der Mäuse.

Zu 2: Der X2-Test ergab mit einem P-Wert von 0,2831 keinen statistisch

signifikanten Zusammenhang zwischen Ausbildung des Circulus arteriosus und der

Läsionsgröße.

Zu 3: Der X2-Test ergab mit einem P-Wert von 0,0139 keinen statistisch

signifikanten Zusammenhang zwischen Ausbildung des Circulus arteriosus und der

Läsionsgröße.

Ergebnisse

27

3.2 Genotypisierung

Bei allen operierten Tieren wurde der durch PCR im Alter von 2 Wochen bestimmte

Genstatus durch eine Ubiquitinfärbung geprüft. Bei den transgenen Mäusen fanden

sich entsprechend zahlreiche Ubiquitin-positive intranukleäre Einschlußkörper, vor

allem in Neuronen des Cortex und Hippocampus, die bei nicht transgenen Mäusen

nie zu finden sind. (vgl Abb. 9 und 10)

Nur bei einer Maus (60 min Ischämie) konnte der Genstatus nicht bestätigt werden.

Bei dieser als nicht transgen genotypisierten Maus fanden sich im Cortex und

Hippocampus intranukleäre Einschlußkörper, die als eindeutiges Zeichen für

Transgenität gewertet werden müssen. In der Gruppe 60-min-Ischämie gingen daher

6 transgene und 4 nicht transgene Mäuse in die Auswertung ein.

Bei allen anderen Mäusen konnte der durch PCR bestimmte Genstatus bestätigt

werden.

Ergebnisse

28


Die Läsionsgrößen nach 15 minütiger Ischämie sind in Tabelle 2 und 3

zusammengefasst. Bei den transgenen Mäusen zeigte sich eine durchschnittliche

Läsionsgröße von 0,4 +/- 0,21 (x +/- SEM). Bei den nicht transgenen Mäusen betrug

die mittlere Läsionsgröße 2,3 +/- 0,28 (x +/- SEM). In Abbildung 2 ist dies graphisch

dargestellt.

Der Unterschied zwischen den mittleren Läsionsgrößen der transgenen und nicht

transgenen Tiere ist signifikant.

Maus Seite LGre 0

127 C1 ♀ B1li 0

re 0127 C1 ♀ A3

li 0

re 1125/1 ♀ A1

li 2

re 0128 B1 ♀ A1

li 1

re 0128 B1 ♀ A2

li 0

Maus Seite LGre 3

126/1 ♀ A2li 3

re 3130 A1 ♂ A1

li 1

re 1135 A1 ♀ A3

li 1

re 3130 A1 ♀ A2

li 3

re 2126/1 ♀ A5

li 3

Tab. 3 Läsionsgrößender einzelnen transgenenMäuse nach 15 minIschämie

Tab. 4 Läsionsgrößender einzelnen nichttransgenen Mäuse nach15 min Ischämie

Ergebnisse

0

0,25

0,5

0,75

1

1,25

1,5

1,75

2

2,25

2,5

2,75

3Lä

sion

sgrö

ße

Transgene

Abb. 2 Graphische Darstellung von MitteMäuse in der Gruppe „15 min Ischämie“

Mäuse Nicht tra

lwert und SEM für

*

29

nsgene Mäuse

transgene und nicht transgene

Ergebnisse

30


Die Läsionsgrößen nach 20 minütiger Ischämie sind in Tabelle 4 und 5

zusammengefasst. Bei den transgenen Tieren fand sich eine durchschnittliche

Läsionsgröße von 0,45 +/- 0,10 (x +/- SEM) und bei nicht transgenen Tieren von 1,5+/- 0,29 (x +/- SEM) (vgl. Abb. 3).

Der Unterschied in den mittleren Läsionsgrößen der transgenen und nicht

transgenen Mäusen ist statistisch signifikant.

Maus Seite LGre 2129 B1 ♂ A5li 1re 0129 B1 ♀ A1li 1re 0122/2 ♂ A3li 0re 0120/2 ♂ A1li 0re 0129 B1 ♀ A2li 0re 1129 B1 ♂ A4li 1

Maus Seite LGre 1128 C2 ♂ A4li 1re 0128 C2 ♂ A3li 1re 2128 C2 ♂ A1li 2re 0128 C2 ♀ A1li 1re 3128 C2 ♂ A2li 3re 3128 C2 ♀ A2li 1



Ergebnisse

0,00

0,25

0,50

0,75

1,00

1,25

1,50

1,75

2,00Lä

sion

sgrö

ße

Transgene

Abb. 3 Graphische Darstellung von MiMäuse in der Gruppe „20 min Ischämie“

Mäuse

ttelwert u

*

31

Nicht transgene Mäuse

nd SEM für transgene und nicht transgene

Ergebnisse

32


In Tabelle 6 und 7 sind die Läsionsgrößen der transgenen und nicht transgenen

Tiere nach 60-minütiger Ischämie dargestellt. Die mittlere Läsionsgröße bei

transgenen Tieren betrug 0,58 +/- 0,23 (x +/- SEM). Bei den nicht transgenen Tieren

fand sich eine mittlere Läsionsgröße von 0,75 +/- 0,34 (x +/- SEM) (vgl Abb. 4).

Die Null-Hypothese kann nicht verworfen werden. Der Unterschied in den mittleren

Läsionsgrößen der transgene und nicht transgenen Mäuse ist nicht signifikant.

Maus Seite LGre 0

120 ♀ B3li 1

re 1130 C ♀ A3

li 0

re 0123/2 ♀ A2

li 2

re 0120/2 ♀ A1

li 0

re 0120/2 ♀ B2

li 2

re 1128 C ♀ E A3

li 0

Maus Seite LGre 1

123/2 ♀ A3li 1

re 0120/2 ♀ B1

li 0

re 0130 C1 ♀ A1

li 1

re 0130 C1 ♂ A1

li 3



Ergebnisse

0,00

0,25

0,50

0,75

1,00

1,25

Läsi

onsg

röße

Transgene Mäuse Nicht trans

Abb. 4 Graphische Darstellung von Mittelwert und Stransgene Mäuse in der Gruppe „60 min Ischämie“

33

gene Mäuse

EM für transgene und nicht

Ergebnisse

34

3.6 Cycloheximid-Behandlung/20 min Ischämie

Die Läsionsgrößen nach Vorbehandlung mit Cycloheximid und 20 minütiger Ischämie

sind in Tabelle 8 und 9 dargestellt. Bei den transgenen Mäusen zeigte sich eine

durchschnittliche Läsionsgröße von 0,9 +/- 0,22 (x +/- SEM), während sie bei nicht

transgenen Tieren 2,8 +/- 0,13 (x +/- SEM) (vgl Abb. 5)

Der Unterschied in den Mittelwerten der Läsionsgrößen der transgenen und nicht

transgenen Mäuse ist signifikant.

Maus Seite LGre 1

123/1 ♀ A1li 1

re 1130 A1 ♂ A2

li 0

re 0123/1 ♀ A3

li 0

re 2123/1 ♂ A3

li 1

re 1130 B1 ♂ A4

li 2

Maus Seite LGre 3

138 B1 ♂ A2li 2

re 3138 B1 ♂ A4

li 3

re 2138 B1 ♂ B2

li 3

re 3138 B1 ♂ B3

li 3

re 3138 B1 ♂ B6

li 3

Tab. 9 Läsionsgruppender transgenen Mäusenach Behandlung mitCycloheximid und 20 minIschämie

Tab. 10 Läsionsgruppender nicht transgenenMäuse nach Behandlungmit Cycloheximid und 20min Ischämie

Ergebnisse

00,25

0,50,75

11,25

1,51,75

22,25

2,52,75

33,25

Läsi

onsg

röße

Transgene

Abb. 5 Graphische Darstellung dertransgenen Mäuse in der Gruppe „Cyclohe

*

35

Mäuse Nicht transgene Mäuse

Mittelwerte und SEM der transgenen und nichtximid und 20 min Ischämie“

Ergebnisse

36

3.7 Vergleich der Unterschiede in den mittlerenLäsionsgrößen

Da die Läsionsgröße bei nicht transgenen Mäusen mit der Ischämiedauer variierte,

wurde die Läsionsgröße der nicht transgenen Mäuse mit 100 % gleichgesetzt, so

dass ein direkter Vergleich für jeden Zeitpunkt möglich ist. Die Läsionsgröße der

transgenen Mäuse ist in Prozent der Kontrollen (+/- SEM) angegeben. Nach 15 und

20 Minuten globaler Ischämie sind die Läsionen der transgenen Mäuse signifikant

kleiner, während nach 60 minütiger Ischämie der Unterschied nicht mehr signifikant

ist. Eine Vorbehandlung mit Cycloheximid hatte keinen Einfluß auf die Läsionsgröße

nach 20 min globaler Ischämie.

Nicht transgeneKontrollmäuse Transgene Mäuse

Umrechnung % % der Kontrolle

SEM SEM

15 min Ischämie 100 12,17 17,4 9,13

20 min Ischämie 100 19,33 30 6,67

60 min Ischämie 100 22,4 77,3 24,4

Cycloheximid +20 min Ischämie 100 4,64 32,1 7,86

Tab. 11 Tabellarische Darstellung der Läsionsgrößen nach globaler Ischämie bei nichttransgenen Kontrollmäusen und transgenen Mäusen

Ergebnisse

0

20

40

60

80

100

120

140Lä

sion

sgrö

ße in

Pro

zent

Nicht transgene Kontrollmäuse Transgene Mäuse

Abb. 6 Graphische und tabellariscIschämie bei nicht transgen

15 min 2 Ischämie Is

*
*
he Darstellung der Läsionsgrößen naen Kontrolltieren und transgenen Mä

0 min 60 min Cyclochämie Ischämie 20 m

*

37

ch globalerusen

heximid+in Ischämie

Ergebnisse

38

3.8 Photos

3.8.1 Circulus arteriosus

Abb. 7 Abb. 8

ACP

AB ACS A. communicans post

Abb. 7 und 8 zeigen beispielhaft die Variabilität im Gefäßstatus der von uns

behandelten Mäuse. Deutlich sind die A. basilaris (AB), die Aa. cerebellares

superiores (ACS) und die Aa. cerebri posteriores (ACP) erkennbar.

Auf Abb. 7 ist zwischen den ACS und ACP auf keiner Seite eine Verbindung sichtbar,

die A. communicans posterior fehlt. Besonders deutlich wird dies im Vergleich mit

Abb. 8, in der auf beiden Seiten eine gut ausgeprägte A. communicans posterior

erkennbar ist.

Ergebnisse

3.8.2 Ubiquitinfärbungen

200 µm 200 µm

Abb. 9

Abb.9 zeigt dieÜbersichtsvergrößerung desHippocampus eines nichttransgenen Tieres, Abb.10die eines transgenen Tieres.In stärkerer Vergrößerung(Abb.10a und Abb.10b) sinddeutlich die intranukleärenEinschlußkörper erkennbar

25 µm

Abb.10a

10 µm

Abb.10b

Abb.10

39

Ergebnisse

40

3.8.3 Übersichtsaufnahmen Cresyl und Fluoro Jade nach15 min Ischämie

Abb.11 Abb.12

Abb.13 Abb.14

Abb. 11- 14 zeigen repräsentativ die Übersichtsaufnahmen des Hippocampus eines

transgenen Tieres mit LG 0 (links) und eines nicht transgenen Tieres mit LG 3

(rechts) nach 15 min Ischämie (beide x50).

Insbesondere in der Fluoro Jade Färbung (Abb. 14) wird deutlich, dass nach 15

minütiger Ischämie der gesamte Hippocampus geschädigt ist (beide x50).

200 µm 200 µm

200 µm 200 µm

Ergebnisse

41


Abb.15 Abb.16

Abb.17 Abb.18

In der Detailvergrößerung (x200) bei Cresylviolettfärbung ist in der oberen Reihe

deutlich der Unterschied in der Zelldichte als Hinweis auf den durch die Ischämie

hervorgerufenen Neuronenverlust des Hippocampus zu erkennen. Abb. 15 zeigt den

Hippocampus eines transgenen Tieres mit LG 0 nach 15 min Ischämie. Die Zellen

sind gleichmäßig groß mit gut abgrenzbaren Nuclei. Es sind keine Lücken oder

Ausdünnungen im Zellband erkennbar.

Abb. 16 zeigt eine deutliche Ausdünnung des CA 1-Sektors des Hippocampus einer

nicht transgenen Maus. Die Zellen wirken plump und aufgequollen. Einige Vakuolen

sind sichtbar. Dieser Zellschaden entspricht der LG 3, d.h. über 70 % der Neurone

sind geschädigt.

In der Fluoro-Jade-Färbung (x200) in der unteren Reihe konnte die Einteilung zu den

Läsionsgruppen 0, bzw. 3 bestätigt werden.

25 µm 25 µm

25 µm 25 µm

Ergebnisse

42


Abb.19 Abb.20

Abb.21 Abb.22

Auf der linken Seite ist repräsentativ der intakte Hippocampus (LG 0) einer

transgenen Maus nach 20 min Ischämie dargestellt.

Rechts stellt ist ein kompletter segmentaler Zelluntergang im CA1-Sektor des

Hippocampus einer nicht transgenen Maus erkennbar (LG 2).

25 µm 25 µm

25 µm 25 µm

Ergebnisse

43

3.8.6 60 min Ischämie

Abb.23 Abb.24

Abb.25 Abb.26

Nach 60 min Ischämie konnte kein statistisch signifikanter Unterschied in der Größe

der Läsionen festgestellt werden. Beispielhaft ist in Abb. 23 und 25 eine transgene

Maus mit LG 2 und in Abb. 24 und 26 eine nicht transgenen Maus mit LG 3

dargestellt. Besonders in der Fluoro Jade wird deutlich, dass bei der nicht transgenen

Maus (Abb.26) ein geringfügig größerer Schaden als bei der in Abb. 25 dargestellten

transgenen Maus vorliegt.

25 µm 25 µm

25 µm 25 µm

Diskussion

44

Diskussion

45

4. Diskussion

Zusammenfassend ist festzustellen, dass nach 15 minütiger und 20 minütiger

globaler Ischämie die Läsionen im CA-1-Sektor des Hippocampus bei transgenen

Tieren signifikant kleiner sind als bei nicht transgenen Mäusen. Mit Zunahme der

Ischämiedauer nimmt der Unterschied der mittleren Läsionsgrößen zwischen

transgenen und nicht transgenen Tieren ab. Nach 60 Minuten globaler Ischämie ist

dabei der Unterschied in der mittleren Läsionsgröße der transgenen, bzw. nicht

transgenen Tiere nicht mehr signifikant. Eine Protektion der transgenen Mäuse

gegen Ischämie besteht also nur innerhalb eines engen zeitlichen Rahmens.

Um zu prüfen, ob die Expression protektiver Proteine mit kurzer Halbwertszeit für die

Ischämietoleranz verantwortlich ist, wurde eine Vorbehandlung mit dem

Proteinsynthesehemmer Cycloheximid durchgeführt. Diese hat keinen Einfluss auf

die Resistenz der transgenen Mäuse, so dass andere Ursachen der Protektion in

Betracht gezogen werden müssen. In der Literatur wird vielfach auf die Abhängigkeit

des Ausmaßes des neuronalen Schadens des Hippocampus bei globaler oder

fokaler Ischämie von der Vollständigkeit des Circulus arteriosus hingewiesen.

Es ist bekannt, dass vor allem Mäuse des Stammes CBA (Barone, 1993) und des

Stammes C57Black/6 (Fujii, 1997 und Kitagawa, 1998) eine nur hypoplastisch

angelegte oder komplett fehlende Arteria communicans posterior (PcomA) haben.

Bei Nagetieren wird der Hippocampus durch die A. choroidea anterior, ein Ast der

A. carotis interna, und über die Arteria cerebri posterior versorgt. Durch die

Unterbrechung des Blutflusses in der A. carotis communis kann der Hippocampus

über den oben beschriebenen Weg nicht mehr versorgt werden. Die Blutversorgung

kann somit nur noch über die PcomA erfolgen (Özdemir, 1992). Daraus kann

gefolgert werden, dass bei einer fehlenden oder nur hypoplastisch angelegten

PcomA die Läsion nach globaler Ischämie im Hippocampus größer sein muss als bei

einem gut angelegten Gefäß.

Auch bei den von uns verwendeten Mäusen des Stammes CBA & C57Black/6 konnte

eine starke Variabilität des Circulus arteriosus Willisi festgestellt werden. Eine

Beziehung zwischen der Vollständigkeit des Circulus arteriosus Willisi und dem

Genotyp bestand jedoch nicht. Ferner konnte eine Beziehung zwischen Ausprägung

der PcomA und Läsionsgröße, wie oben beschrieben, bei unseren Experimenten

nicht festgestellt werden. Es zeigte sich keine signifikante Abhängigkeit zwischen der

Diskussion

46

Anlage einer A. com. post. und Läsionsgröße in der CA1 Region des Hippocampus.

Insgesamt waren die Zahl der analysierten Hippocampi mit und ohne kollateraler

Blutversorgung innerhalb der verschiedenen Gruppen überwiegend ausgeglichen

verteilt (Tab. 2). Die einzige Ausnahme waren die Tiere mit 60 min Ischämiezeit. Die

post mortem durchgeführte Analyse ergab, daß die A. com. post. in der

Kontrollgruppe zufällig bei allen Tieren gut angelegt war und bei den transgenen

Mäusen hingegen in der Hälfte der Fälle fehlte.

Auffällig ist, daß bei diesen Kontrolltieren der Mittelwert der Läsionsgröße nach 60-

minütiger Ischämie überraschenderweise kleiner war als bei den Kontrolltieren

kürzerer Ischämie von 15- bzw. 20-minütiger Dauer. Im Vergleich zu den transgenen

Mäusen, die trotz teilweise fehlender A. com. post. ebenfalls durchschnittlich nur

kleine Läsionsgrößen aufwiesen, ergab sich kein signifikanter Unterschied im

Ausmaß des ischämischen Schadens.

Dadurch ergibt sich eine alternative Möglichkeit der Interpretation der Ergebnisse:

Vielleicht ist der nach 60-minütiger Ischämie scheinbar fehlende Unterschied der

ischämischen Toleranz zwischen den transgenen und den nicht-transgenen Tieren

auf eine unterschiedliche Variabilität des Circulus Arteriosus Willisi zurückzuführen

und nicht auf die bei den transgenen Mäusen in ihrer Kapazität bereits überforderte

Kompensationsmechanismen.

Da die Frage nach der Anlage einer A. com. post. für jedes einzelne Versuchtier nur

post mortem zweifelsfrei geklärt werden konnte, war eine gleichmäßigere Verteilung

der Tiere im vorhinein unter diesem Gesichtspunkt nicht möglich. Nur eine

Wiederholung des Experimentes mit weiteren Versuchstieren könnte hier letztlich

eine zweifelsfreie Klärung bringen.

Für die fehlende Übereinstimmung zwischen Ausprägung der PcomA und der

Läsionsgröße in den anderen Ischämiegruppen gibt es mehrere mögliche Gründe.

Einer dieser Gründe liegt in der Durchführung der transienten globalen Ischämie. In

der Literatur sind mehrere Methoden zur Durchführung einer fokalen oder globalen

Ischämie an Mäusen oder Ratten beschrieben worden. Eine transiente globale

Ischämie wurde zuerst an Ratten 1977 von Siemkowicz und Hansen durch Anlegen

einer aufblasbaren Halsmanschette und gleichzeitiger Hypotension auf 50 mm Hg

durchgeführt. Auch von anderen Experimentatoren wurde eine globale Ischämie

immer in Verbindung mit einer Hypotension durchgeführt (Benveniste, 1984).

Allerdings handelte es sich auch hierbei um Ratten.

Diskussion

47

Da es aufgrund des geringen Blutvolumens bei Mäusen nicht möglich ist, eine

kontrollierte Hypovolämie und konsekutive Hypotension durchzuführen, musste bei

unserer Versuchsdurchführung darauf verzichtet werden.

Es ist zu erwarten, dass zusätzliche Schwankungen des Blutdruckes zur Variabilität

des hippocampalen Schadens beitragen, so dass dies eine Grenze der

Zuverlässigkeit unserer Versuchsdurchführung darstellt. Der Einfluss des Genotyps

auf das Ausmaß des neuronalen Schadens war jedoch so dramatisch, dass trotz der

zu erwartenden hohen Variabilitäten bereits bei normalen Gruppengrößen deutlich

signifikante Ergebnisse zustande kamen.

Ein zweites methodisches Problem ist das bis heute nicht letztlich befriedigend

gelöste Problem der einwandfreien histologischen Identifizierung aller

degenerierender Neurone. Wir benutzten zur Einteilung in die Läsionsgruppen die im

19. Jahrhundert eingeführte Kresylviolett-Färbung (Herxheimer, 1899). Kresylviolett

färbt Zellkerne und Nisslschollen blauviolett an, rot färben sich die Granula von

Mastzellen und z.B. Knorpelgrundsubstanz. Das restliche Gewebe bleibt farblos.

Zeichen einer neuronalen Degeneration in der Kresylviolett-Färbung sind

Schrumpfung, Vakuolisierung und hyperchromatische Nucleoli (Schmued, 1997).

Diese Zeichen können jedoch auch durch Artefakte während der Fixation oder des

Schneidens oder durch nicht-letale Veränderung in der Morphologie der Zelle

hervorgerufen werden. Auf der anderen Seite können die ersten Anzeichen einer

neuronalen Degeneration so unauffällig sein, dass sich die betroffenen Zellen kaum

von gesunden Zellen unterscheiden lassen und es zu einem falsch negativen

Ergebnis kommt.

Fluoro-Jade hingegen ist spezifisch für degenerierende Neurone, ein Phänomen, das

in Anlehnung an die Silbernitratfärbung, die ebenfalls nur degenerierende Neurone

anfärbt, als „Argyrophilie“ bezeichnet wird (Schmued, 1997). Fluoro-Jade-B zeigt eine

noch höhere Affinität für degenerierende Neurone bei nahezu keiner

Hintergrundfärbung (Schmued, 2000). Fluoro-Jade-B färbt degenerierende Neurone

unabhängig vom Mechanismus ihrer Degeneration an. Dies konnte für verschiedene

Neurotoxine, verschiedene Glutamatagonisten, das mitochondriale Toxin 3-

Nitropropionsäure, diverse Metalle, Methamphetamin (Eisch, 1998) und bei

einseitiger Enukleation gezeigt werden (Schmued, 1997).

Aufgrund der unabhängigen Übereinstimmung in den beiden Techniken ist davon

auszugehen, dass die erhobenen Ergebnisse tatsächlich ein zuverlässiges Maß für

Diskussion

48

die Anzahl degenerierender Neurone, bzw. das Ausmaß des hypoxischen

hippocampalen Schadens darstellen.

Das von uns beobachtete Phänomen einer ischämischen Toleranz wurde bereits

mehrfach an Gehirnen von Versuchstieren gezeigt. 1991 entdeckten Himori et al,

dass nach repetitiven transienten cerebralen Attacken Mäuse mit jeder neuen

Attacke weniger sensibel wurden, einen ischämischen Schaden zu entwickeln

(Himori, 1991). In weiteren Versuchen konnten sie zeigen, dass sowohl eine gerade

noch nicht schädigende 10- minütige Ischämie als auch die Gabe von 1nmol NMDA

intraventrikulär 30 Minuten vor einer erneuten Gabe einer toxischen NMDA-Dosis die

sonst später auftretenden Verhaltensauffälligkeiten weitgehend verhindern konnten.

Außerdem war die Mortalität durch diese Vorbehandlung stark erniedrigt (Himori,

1991). Hiermit wurde gezeigt, dass es dieses am Herzen schon bekannte, und als

„Ischämische Präkonditionierung“ bezeichnete Phänomen, auch am Gehirn gibt.

Es stellt sich somit die Frage, ob auch bei der von uns beobachteten ischämischen

Toleranz bei CH-transgenen Mäusen ähnliche Mechanismen wie bei der

ischämischen Präkonditionierung zugrunde liegen. Es wird davon ausgegangen,

dass die Ursache der Protektion bei ischämischer Präkonditionierung im

wesentlichen in einer verstärkten Exprimierung kurzlebiger protektiver Proteine, z.B.

sog. heat-shock-Proteine (HSP) liegt. So konnte 1992 von Marini et al in Zellkulturen

gezeigt werden, dass zur Ausbildung der Neuroprotektion de-novo-mRNA- und

Proteinsynthese notwendig waren (Marini, 1992). HSP werden durch zellulären

Stress, wie z.B. Ischämie, (Lindquist, 1986) induziert . HSP sind zur Reparatur

fehlgefalteter Proteine durch Rückfaltung in ihre physiologische Tertiärstruktur

notwendig. Im Zusammenhang mit cerebraler Ischämie ist besonders das HSP70

von Bedeutung. Es kommt physiologischerweise im Mäuse- oder Rattengehirn nicht

vor und wird nach verschiedenen Stimuli sehr rasch induziert.

Gonzalez et al konnten 1991 zeigen, dass HSP70 Expression nach globaler

cerebraler Ischämie zuerst in den Zellen des CA-1-Sektors, und erst später in

anderen Sektoren induziert wird (Gonzalez, 1991). Auch nach ischämischer

Präkonditionierung steigt HSP-70 an, wie Kitagawa et al. 1990 zeigen konnten. Sie

beobachteten gleichzeitig eine weitgehende Toleranz gegenüber einem zweiten,

stärkeren ischämischen Reiz und postulierten eine protektive Wirkung der HSP

(Kitagawa, 1990).

Diskussion

49

Ebenso werden nach verschiedenen Stimuli, z.B. durch globale und fokale Ischämie,

sog. „Immediate-Early-Genes“ (IEG) exprimiert. Während die Synthese der meisten

„messenger-Ribonukleinsäuren“ (mRNA) und ihrer Proteine nach cerebraler

Ischämie abnimmt, werden einige IEG spezifisch induziert (Kinouchi, 1994). So

konnten 1993 An et al zeigen, dass nach fokaler Ischämie die Expression der IEG c-

fos, c-jun und junB erhöht war, während junD unverändert war (An, 1993). Die

Expression der IEG’s ist reversibel. Durch die IEG kommt es zur Aktivierung

sogenannter „late-genes“, die wichtige Funktionen im Zellstoffwechsel oder

Überleben der Zelle ausüben. Eines dieser „late-genes“ ist der „nerve-growth-factor“

(NGF), der das Nervenwachstum und –regeneration fördert (An, 1993). NGF wird

nach cerebraler Ischämie vermehrt exprimiert (Guégan, 1998) und spielt eine Rolle

bei der Inaktivierung freier Radikale (Guégan, 1998).

Läge der ischämischen Toleranz tatsächlich eine vermehrte Produktion solcher

kurzlebiger protektiver Proteine zugrunde, so müsste die Toleranz durch eine

kurzfristige Blockierung der Proteinbiosynthese aufzuheben sein. So konnten Barone

et al zeigen, dass eine vorherige Gabe von Cycloheximid die Toleranzentwicklung

durch ischämische Präkonditionierung komplett eliminierte (Barone, 1998).

Zur Überprüfung, ob auch bei der von uns bei CH-transgenen Mäusen beobachteten

ischämischen Toleranz die Expression kurzlebiger protektiver Proteine eine Rolle

spielt, wurden einige Mäuse vor der cerebralen Ischämie mit Cycloheximid

behandelt. Überraschenderweise konnte hierdurch die Protektion nicht aufgehoben

werden, so dass vermutlich andere Mechanismen der Toleranzentwicklung bei CH-

transgenen Mäusen zugrunde liegen müssen. In guter Übereinstimmung mit unseren

Ergebnissen stehen die Beobachtungen von Hansson et al, dass HSP70 im Gehirn

transgener Mäuse im Vergleich zu nicht transgenen Mäusen nicht erhöht sind

(Hansson, 1999).

CH-transgene Mäuse weisen nicht nur eine Toleranz gegen ischämische Reize auf,

sondern auch gegen eine Vielzahl weiterer Noxen. Hickey et al konnten 2000 zeigen,

dass R6/2 Mäuse im Alter von 7-10 Wochen im Vergleich zu Kontrolltieren kleinere

striatale Läsionen nach Injektion des mitochondrialen Toxins 3-Nitropropionsäure (3-

NP) aufwiesen (Hickey, 2000). 3-NP ist ein irreversibler Inhibitor der

Succinatdehydrogenase (Komplex II der Atmungskette), der nach systemischer

(Gould, 1982) und intrastriataler Injektion (Beal, 1993 A) normalerweise im Striatum

und Putamen einen deutlichen Neuronenverlust mit beginnender Gliose hervorruft

Diskussion

50

(Beal, 1993A). Weiterhin besteht bei transgenen CH-Mäusen eine Resistenz gegen

Exzitotoxizität durch Glutamatagonisten, z.B. Quinolinsäure und Kainat (Hansson,

1999). Will man die eher generalisierte Toleranz gegenüber unterschiedlichen Noxen

mit einem Mechanismus abklären, so müsste dieser an einem Stoffwechselschritt

ansetzen, der allen oben beschriebenen Noxen gemeinsam ist, bzw. das

gemeinsame Ergebnis ihrer Wirkungen ist.

Eine solche mögliche Hypothese zur Toleranzentwicklung bei CH-transgenen

Mäusen, die die Toleranz auf alle verschiedenen Noxen erklären könnte, beschäftigt

sich mit der Fähigkeit der Mitochondrien, freies übermäßiges Calcium zu speichern.

Danach könnten die Mitochondrien der transgenen Mäuse durch ein ständiges

Überangebot an Calcium Mechanismen aufgebaut haben, Calcium vermehrt

abzufangen und die Zelle somit vor einem Calcium-vermittelten Zelltod zu schützen.

Auch nach ischämischer Präkonditionierung durch kurze subletale Ischämie war bei

den dadurch resistenten hippocampalen Neuronen der Calcium-Einstrom in die Zelle

während einer zweiten Ischämie unverändert hoch. Die Mitochondrien der

resistenten Neurone waren jedoch in der Lage, das erhöhte intrazelluläre Calcium

vermehrt zu eliminieren und dadurch die Aktivierung calciumabhängiger Proteasen

zu verhindern und den Zelltod zu verringern (Ohta, 1996). Die Zelle hat also durch

ischämische Präkonditionierung Mechanismen aufgebaut, mit einem erhöhtem

intrazellulären Calciumgehalt umzugehen. An CH-transgenen Mäusen konnten

Hansson et al zeigen, dass der basale cytoplasmatische Calciumspiegel in

resistenten striatalen R6/2 Neuronen um das 5fache erhöht war (Hansson, 2001).

Diese Neurone unterliegen also einem kontinuierlich erhöhten, subletalen

Calciumreiz, der eine Anpassung der Zelle, vergleichbar mit der Präkonditionierung

bei ischämischer Toleranz, bewirkt und die Induktion von

Kompensationsmechanismen induziert. Da auch die von uns durchgeführte

ischämische Toxizität im Anfang wesentlich über Exzitotoxizität vermittelt wird,

könnte hier eine mögliche Erklärung für die beobachtete Resistenz liegen. Eine

Erklärung für die von uns beobachtete zeitliche Begrenzung der Toleranz könnte die

Erschöpfung der Kompensationsmechanismen nach 60 minütiger Ischämie sein.

Überraschenderweise wurde kürzlich festgestellt, dass nicht alle CH-transgenen

Mäuse eine erhöhte Toleranz gegen exzitotoxische Reize aufweisen.

Eine Mauslinie, die nicht wie die R6/1-Linie nur Exon 1 des Huntington-Gens,

sondern das gesamt mutierte Huntington-Gen exprimieren, weist sogar eine erhöhte

Diskussion

51

Empfindlichkeit gegenüber Exzitotoxizität auf (Zeron, 2002). Die fehlende Co-

Expression des nicht mutierten Anteils des Huntingtin könnte also bei der

Toleranzentwicklung CH-transgener Mäuse eine Rolle spielen. Weitere

vergleichende Untersuchungen in den verschiedenen Modellen werden notwendig

sein, den protektiven Effekt des mutierten Huntingtins in dem von uns verwendeten

Modell besser zu verstehen.

Zusammenfassung

52

Zusammenfassung

53

5. Zusammenfassung

Exzitotoxizität beschreibt den neurotoxischen Effekt übermäßiger Freisetzung

erregender Neurotransmitter wie Glutamat im zentralen Nervensystem. Es wird

vermutet, dass Exzitotoxizität eine wichtige Rolle sowohl bei akuten ischämischen

neuronalen Zellschäden als auch bei chronisch neurodegenerativen Erkrankungen

wie Chorea Huntington (CH) spielt. Überraschenderweise hat man jedoch

herausgefunden, dass CH transgene Mäuse resistent gegen intrastriatale Injektionen

von exzitotoxischen Substanzen wie Glutamatagonisten sind.

In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, ob CH transgene Mäuse auch resistent

gegenüber einer globalen cerebralen Ischämie sind. Hierbei wurden die Neurone des

Hippocampus untersucht, die die niedrigste ischämische Toleranz aufweisen. Eine

globale cerebrale Ischämie wurde durch beidseitige vorübergehende Okklusion der

A. carotis communis unter Narkose an CH transgenen Mäusen und Kontrollmäusen

durchgeführt. Wir konnten zeigen, dass transgene Mäuse nach 15 und 20 minütiger

Ischämie einen signifikant geringeren neuronalen Zellschaden im Hippocampus

aufweisen als Kontrolltiere. Nach 60 minütiger Ischämie zeigen beide Tiergruppen

keine signifikanten Unterschiede im Ausmaß des Zellschadens mehr.

Eine derartige Toleranz gegenüber globaler cerebraler Ischämie kann experimentell

auch durch sogenannte „Präkonditionierung“ erzeugt werden, wobei vorausgehende

kurzzeitige Ischämien zu einer ischämischen Toleranz durch Überexpression

kurzlebiger Proteine, wie z.B. sogenannten heat-shock-Proteine, führt. Um zu prüfen,

ob eine vermehrte Synthese kurzlebiger Proteine auch der Grund der Protektion CH

transgener Mäuse ist, wurde Mäusen 24 Stunden vor Durchführung der globalen

cerebralen Ischämie der unspezifische Proteinsynthesehemmer Cycloheximid

verabreicht. Dies hatte jedoch keinen Effekt auf das Ausmaß der ischämischen

Toleranz der CH transgenen Tiere. Es ist daher anzunehmen, dass die kurzzeitige

Überexpression kurzlebiger protektiver Proteine nicht die Ursache der vermehrten

Resistenz gegenüber der ischämischen Noxe bei CH transgenen Mäusen ist. Es

handelt sich somit um einen anderen Toleranzmechanismus als er der ischämischen

Präkonditionierung zugrunde liegt, wie er bisher noch nicht beschrieben wurde.

Diese Ergebnisse belegen, dass eine erhöhte Toleranz nicht nur im Striatum sondern

auch im Hippocampus CH transgener Mäuse besteht und diese Toleranz nicht nur

gegen Exzitotoxizität, sondern auch gegenüber einer globaleren Noxe wie Ischämie

Zusammenfassung

54

nachweisbar ist. Während der Gendefekt der CH letztlich zu einer chronischen

Neurodegeneration führt, induziert er im transgenen Mausmodell zumindest

vorübergehend eine Toleranz gegenüber akuten Noxen.

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Danksagung

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Danksagung

65

7. Danksagung

Mein Dank gilt Herrn Universitätsprofessor Dr. J. Noth, der es mir als Direktor der

Neurologischen Klinik ermöglicht hat, eine anspruchsvolle und interessante

Dissertation durchzuführen.

Besonders möchte ich mich bei meinem Betreuer, Herrn Priv-Doz. Dr. Christoph

Kosinski bedanken, der mir sowohl während der experimentellen Arbeit als auch

während des Verfassens der Dissertationsschrift stets unterstützend zur Seite

gestanden hat. Unter seiner Betreuung konnte ich wissenschaftliche Arbeits – und

Denkensweisen erlernen, die mir in meinen weiteren Berufsweg eine große Hilfe sein

werden. Für das freundschaftliche Verhältnis, auch mit Herrn Dr. Johannes Schiefer,

danke ich ganz besonders. Herrn Dr. Johannes Schiefer gilt weiterhin mein Dank für

die aussergewöhnliche Hilfe bei den Tierexperimenten.

Desweiteren gilt ein besonderer Dank Frau Barbara Müller, die mir während der

immunhistochemischen Aufarbeitung im Labor immer mit Rat und Tat zur Seite

gestanden hat. An dieser Stelle möchte ich auch meinen Mitdoktoranden,

insbesondere Sabine Oliva und Mirjam Kaul für die gute Zusammenarbeit und das

freundschaftliche Arbeitsklima danken.

Herrn Universitätsprofessor Dr. Küpper und den Mitarbeitern der

Tierversuchsabteilung möchte ich für die Anleitung im Umgang mit den

Versuchstieren und die Zurverfügungstellung der Räumlichkeiten danken.

Lebenslauf

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Lebenslauf

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8. Lebenslauf

Persönliche AngabenName : Anke Alexandra AlbertyAdresse : Venner Strasse 7

41068 MönchengladbachTelefon : 02161-561899e-mail : [email protected] : 05.11.1976Geburtsort : Mönchengladbach

Schulbildung1983 - 1987 Gemeinschaftsgrundschule Wegberg1987 - 1996 Maximilian-Kolbe-Gymnasium, Wegberg1993 - 1994 Internatsaufenthalt in England, Woldingham School of the

Sacred Heart, Surrey05/1996 Abitur am Maximilian-Kolbe-Gymnasium, Wegberg

Studium1996 - 1998 Vorklinische Ausbildung an der Martin-Luther-Universität

Halle-Wittenberg1998 - 2003 Klinische Ausbildung an der RWTH Aachen07/1998 Ärztliche Vorprüfung mit der Note „Befriedigend“ (3,0)07/1999 Erstes Staatsexamen mit der Note „Befriedigend“ (3,0)04/2002 Zweites Staatsexamen mit der Note „Gut“ (1,6)05/2003 Drittes Staatsexamen mit der Note „Gut“ (2,0)

Klinische Erfahrung03/1999 Famulatur in der Inneren Abteilung des Luisenhospitals,

Aachen03/2000 Praxisfamulatur bei Dr. Arnulf Stefes, Facharzt für

Allgemeinmedizin, Aachen08 - 09/2000 Famulatur in der Neurologischen Abteilung des Grey Bruce

Regional Health Centre, Owen Sound, Kanada04 - 08/2002 Erstes Tertial des Praktischen Jahres in der Chirurgischen

Klinik der Kliniken Maria-Hilf, Mönchengladbach08 - 11/2002 Zweites Tertial in der Klinik für Innere Medizin an der Tulane

University, New Orleans, USA12/2002 - 3/2002 Drittes Tertial in der Neurologischen Klinik der Kliniken Maria-

Hilf, Mönchengladbach

Berufliche Tätigkeitab 6/2003 Ärztin im Praktikum in der Neurologischen Klinik der Kliniken

Maria-Hilf, Mönchengladbach

Private Interessenab 1982 Geigen - und Klavierunterricht

Mitglied des Niederrheinischen JugendsinfonieorchestersMitglied des Euregio-Jugendorchesters

1994 - 1996 Gemeinnützige Arbeit im Altenheim Wegberg

partielle resistenz chorea huntington transgener mäuse...

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