PCR 常见问题、原因分析及其对策

主讲人：欧阳志荃

PCR 技术简介

PCR 常见问题、原因分析及其解决方案

提高 PCR 反应特异性的策略

主讲内容

PCR 技术简介

PCR 标准反应体系

• DNA 模板 • 引物• 反应缓冲液• dNTP

• ddH2O

• 耐热聚合酶

反应体系对 PCR 扩增的影响

DNA 模板 • 纯度 蛋白、多糖、酚类等杂质会抑制 PCR 反应

• 完整性 模板降解会导致 PCR 扩增无产物

• 浓度 加量过多导致非特异性扩增增加

• 特异性 长度适当、避免二级结构和二聚体

• 完整性 避免反复冻融

• 浓度 应适当 , 过高导致非特异性增加 , 过低则

引 物

扩增产物太少

反应体系对 PCR 扩增的影响

反应 Buffer• pH 值 , 盐离子浓度• 稳定剂 , 增强剂

Mg 2 ＋浓度 • 过高非特异性严重• 过低无扩增产物

dNTP Mixture• 浓度适当• 避免反复冻融

ddH2O• pH 值适当• 避免污染

PCR 标准反应体系

• DNA 模板 • 引物• 反应缓冲液• Mg 2 ＋

• dNTP

• ddH2O

• 耐热聚合酶

如何选择最合适的 DNA聚合酶

• DNA 聚合酶的特性

• PCR 实验的不同需求

如何选择最合适的 DNA聚合酶 －－ DNA 聚合酶的特性

纯 度

稳定性

酶活性

如何选择最合适的 DNA聚合酶 －－ PCR 实验的不同需求

长片段扩增

PCR 试剂盒

扩增效率

保 真 性

特 异 性 基因组扩增、 RT-PCR

基因筛选、测序、 基因克隆

复杂模板扩增（ GC 含量高、二级结构）

构建基因图谱、测序、分子遗传学

复杂模板扩增、大规模基因检测

特异性 － 热启动 Taq 酶

原 理

• 蜡封• 抗体抑

制• 化学修

饰

特 点

• 避免非特异性扩增• 提高 PCR 反应的

特异性

用 途

• 基因组扩增

• RT-PCR

－ 热启动 Taq酶

特异性

产 品 类 型 产 品 名 称 产 品 性 能

化学修饰

• 天为时代 : HotStart Taq • Roche : FastStart Taq • Abgene: Thermo-start® DNA Polymerase • Stratagene: SureStart™ Taq

•大大提高 PCR反应的特异性

• 化学修饰不影响后续实验

抗体抑制• Invitrogen ： AccuPrimeTM Taq Platinum® Taq • TaKaRa ： ExTaqTM HotStart Version

蜡封 Promega ： TaqBeadTM HotStart

保真性 — 高保真酶

原 理

用 途• 3’ － 5’ 核酸

• 表达基因的克隆

• 基因的定点突变

• 细胞内基因点突变分析（ SNP ）

外切酶活性• 降低碱基错配率

保真性 — 高保真酶产 品 类 型 生 物 公 司 性 能 比 较

PfuDNA Polymerase

• 天为时代• Stratagene• Promega 在目前已发现的所有

耐热聚合酶中 , Pfu保真度最高碱基错配率最低PyrobestTM

DNA Polymerase TaKaRa

Tli DNA Polymerase

Promega

高保真 ＋ 高扩增效率

原 理

• 混合酶－高扩增效率－ 3’ － 5’ 核酸外切

用 途

• 超长片段扩增 －测序 －构建基因图谱• 复杂模板扩增

－ GC 含量高－二级结构

高保真 ＋ 高扩增效率特 点 产 品 性 能

高扩增效率•天为时代： Taq Plus

• TaKaRa ： Ex TaqTM 复杂模板扩增

高保真•天为时代： Taq Platinum

• Invitrogen ： Pfx Platinum Taq High Fidelity

保真度低于 Pfu 聚合酶但扩增效率较高

长片段扩增

•天为时代： Long Taq

• TaKaRa ： LA Taq • Invitrogen ： Elongase Amplificaiton System

特别适用于保真度较高的 超长片段扩增

PCR MasterMix

原 理预配好的 PCR 反应液 DNA 聚合酶 反应缓冲液 dNTP

PCR 增强剂

PCR Master Mix

特 点 • 快速简便 减少加样误差和污染• 灵敏度高 可扩增低至 2 个拷贝的目的模板• 特异性强 降低 PCR 反应的要求，增强特异性• 稳定性好 长期放置活性无改变

适用范围 • 大规模基因检测• 目的基因拷贝数极低的样本• GC 含量高 , 有二级结构的模板• 复杂基因组样本• 可直接检测菌落，基因点突变检测 ,

或者阳性克隆的筛选。

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PCR 常见问题、原因分析及其解决方案

提高 PCR 反应特异性的策略

PCR 常见问题、原因分析及其解决方案

PCR 常见问题

• 无扩增产物• 非特异性扩增• 拖尾

• 假阳性

PCR 常见问题之一• 无扩增产物

1. 模板 : 含有抑制物，含量低

2. Buffer 对样品不合适3. 引物设计不当或者发生降

解4. 反应条件：退火温度太高，延伸时间太短

原因

对策

1. 纯化模板或者使用试剂盒提取模板 DNA 或加大模板的用量

2. 更换 Buffer 或调整浓度3. 重新设计引物（避免链间二聚

体和链内二级结构）或者换一管新引物

4. 降低退火温度、延长延伸时间

现象：正对照有条带，而样品则无；

PCR 常见问题之二• 非 特 异 性 扩增 现象： PCR 扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或

大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带。

PCR 常见问题之二

1. 引物特异性差2. 模板或引物浓度过高3. 酶量过多4. Mg2+ 浓度偏高5. 退火温度偏低6. 循环次数过多

原因

对策

1. 重新设计引物或者使用巢式 PCR

2. 适当降低模板或引物浓度3. 适当减少酶量4. 降低镁离子浓度5. 适当提高退火温度或使用

二阶段温度法6. 减少循环次数

• 非 特 异 性 扩增

PCR 常见问题之三• 拖尾 现象：产物在凝胶上呈 Smear状态。

M 1 2

PCR 常见问题之三

1. 模板不纯2. Buffer 不合适3. 退火温度偏低4. 酶量过多5. dNTP 、 Mg2+ 浓度偏高6. 循环次数过多

原因

对策

1. 纯化模板2. 更换 Buffer3. 适当提高退火温度4. 适量用酶5. 适当降低 dNTP 和镁离子

的浓度6. 减少循环次数

• 拖尾

PCR 常见问题之四

• 假阳性（筛选转基因、检测基因表达情况 )

原因：靶序列或扩增产物的交叉污染

现象：空白对照出现目的扩增产物

对策：1. 操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外；2. 除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管

及加样枪头等均应一次性使用。3. 各种试剂最好先进行分装，然后低温贮存。

PCR 技术简介

PCR 常见问题、原因分析及其解决方案

提高 PCR 反应特异性的策略提高 PCR 反应特异性的策略

• 巢式 PCR （ Nest-PCR ）

四种策略

• 递减 PCR （ TouchDown PCR ）

• 热启动 PCR （ HotStart PCR ）

• 使用 PCR 增强剂

策略之一• 巢式 PCR （ Nest-PCR ）

P1P2P3

P4

巢式 PCR 的使用降低了扩增多个靶位点的可能性，因为同多套引物都互补的靶序列很少。

巢式 PCR 可以增加有限量靶序列（如稀有 mRNA ）的灵敏度，并且提高了困难 PCR （如 5' RACE ）的特异性。

策略之二• 递减 PCR （ TouchDown PCR ）

递减 PCR通过在 PCR 的前几个循环使用严谨的退火条件提高特异性。循环设在比估算的 Tm 高大约 5℃ 的退火温度下开始，然后每个循环降 低 1-2℃, 直到退 火 温 度 低 于 Tm 5℃ 。

特异性最高的目的模板会被优先扩增，这些产物在随后的循环中继续扩增占据优势。

递减 PCR 对于那些不了解引物和目的模板同源性程度的方法更为有用，如 AFLP 、 DNA指纹分析等。

策略之三

• 热启动 PCR （ HotStart PCR ）

热启动主要是通过抑制一种基本成分延迟 DNA 合成，直到 PCR 仪达到变性温度；

现在有很多公司都有 HotStart Taq 酶出售，该酶具有热启动的性能，使用简单方便，适合于高通量应用；

热启动 PCR是除了好的引物设计之外，提高 PCR 特异性最重要的方法之一。

策略之四• 使用 PCR 增强剂

甲酰胺， DMSO ，甘油，甜菜碱等都可充当 PCR 的增强剂。

其可能的机理是降低熔解温度，从而有助于引物退火并辅助 DNA 聚合酶延伸通过二级结构区。

增强剂浓度要适当

谢谢！

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