pcr reakcija
DESCRIPTION
PCR reactionTRANSCRIPT
![Page 1: PCR Reakcija](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022081501/563dba54550346aa9aa4a8a9/html5/thumbnails/1.jpg)
(polymerase chain reaction – reakcija lančane polimerizacije)
![Page 2: PCR Reakcija](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022081501/563dba54550346aa9aa4a8a9/html5/thumbnails/2.jpg)
Osnovni principi:Fenomeni “ topljenja ”
(denaturacije) DNKRaskidanje vodoničnih veza i
prelazak sekundarne u primarnu strukturu na tački topljenjaSniženjem temperature dolazi do ponovnog uspostavljanja vodoničnih veza izmedju parova baza
![Page 3: PCR Reakcija](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022081501/563dba54550346aa9aa4a8a9/html5/thumbnails/3.jpg)
Komplementarnost azotnih baza
![Page 4: PCR Reakcija](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022081501/563dba54550346aa9aa4a8a9/html5/thumbnails/4.jpg)
Koraci tokom analize:1.Ekstrakcija i prečišćavanje DNK iz ćelije2.Testiriranje čistoće izolovane DNK3.PCR reakcija4.Utvrdjivanje broja i veličine dobijenih fragmenata
![Page 5: PCR Reakcija](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022081501/563dba54550346aa9aa4a8a9/html5/thumbnails/5.jpg)
Ekstrakcija DNKZavisno od vrste organizma i lokalizacije u okviru istog4 principijelna koraka:1. liziranje ćelije (mehanički,enzimski, ultrazvukom, ..) i oslobadjanje ćelijskog sadržaja2. Uklanjanje membranskih lipida (primena
pufera sa dodatkom detergenata)3.Otklanjanje proteina ( dejstvom proteinaza, uz
dodatak helirajućih agenasa)4. precipitacija DNK (najčešće nekim alkoholom)
![Page 6: PCR Reakcija](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022081501/563dba54550346aa9aa4a8a9/html5/thumbnails/6.jpg)
Medjutim,...Danas se sve češće koriste
kitovi koji sadrže tzv. spin kolone i već pripremljene pufere za ekstrakciju
Spin kolone napunjene su modifikovanim silika gelovima i funkcionišu po principu apsorpcione i jonoizmenjivačke hromatografije
Čistoća izolovane DNK utvrdjuje se spektrofotometrijski-
odnos A260/A280 treba da bude izmedju 1,7 i 1,9
Kvantifikacija izolovane DNK- na osnovu merenja apsorbance referentnog rastvora i uzorka na 260 nm
![Page 7: PCR Reakcija](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022081501/563dba54550346aa9aa4a8a9/html5/thumbnails/7.jpg)
Princip PCR metode:Za PCR reakciju neophodno je: prajmeri specifični
za krajeve željene sekvence, matrica, komplementarni nukleotidi, Taq polimeraza, ligaza, pufer (pH 8,3-8,8), MgCl2
Koraci:1.Denaturacija DNK (96° C)2.“Anniling” (hibridizacija prajmera i matrice) (55°
C)3. Elongacija (72° C) Prajmeri: 15-30 nukleotida Broj ciklusa: 25-40Eksponencijalno umnožavanje target sekvence
![Page 8: PCR Reakcija](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022081501/563dba54550346aa9aa4a8a9/html5/thumbnails/8.jpg)
![Page 9: PCR Reakcija](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022081501/563dba54550346aa9aa4a8a9/html5/thumbnails/9.jpg)
Aparatura
![Page 10: PCR Reakcija](https://reader035.vdocuments.net/reader035/viewer/2022081501/563dba54550346aa9aa4a8a9/html5/thumbnails/10.jpg)
Utvrdjivanje veličine dobijenih produkata:Agarozna elektoforeza
Primena molekulskih markeraBojenje etidijum bromidom-
interkalacija u dvostruku spiralu DNK (π-π interakcije)
Pod UV svetlošću-mesta na kojima se EtBr vezao za molekul DNK, uočavaju se kao obojene trake na neobojenoj pozadini