7/22/2019 PCR& RFLP (A1)

1/22

PCR

(Polymerase Chain Reaction)

Kelompok A1

7/22/2019 PCR& RFLP (A1)

2/22

Polymerase Chain Reaction (PCR) satucara untuk amplifying (menciptakanbeberapa salinan dari) DNA tanpa

menggunakan suatu organisma hidup,seperti E. coliatau ragi .

PCR biasanya terpakai di laboratoriumpenelitian medis dan biologi untuk berbagaitugas, seperti pelacakan dari penyakitketurunan, identifikasi dari sidik jari genetik ,menggandakan gen , dan test garis ayah

Latar Belakang

7/22/2019 PCR& RFLP (A1)

3/22

SEJARAH

PCR ditemukan 1980s oleh Kary B. Mullis

Mullis mendapat hadiah nobel di Ilmu Kimiapada Oktober 1993 & menyelesaikan program

PCR selama tujuh tahun, setelah diamempublikasikan idenya

Mullis mempunyai ide untuk

mengembangkan satu proses dimana DNAdapat diperbanyak (Replikasi) melalui siklusyang diulangi dari duplikasi yang dibantu olehenzim yaitu DNA Polymerase

7/22/2019 PCR& RFLP (A1)

4/22

DNA-Polymerase terjadi secara alami di

organisma hidup, yang berfungsi menyalin

DNA ketika sel membelah. Proses ini

mengikat DNA tunggal dan menciptakan

ujung komplementer.

Pada proses PCR original mullin Enzim

in vitro di dalam suatu lingkungan yang

terkontrol tetapi berada diluar suatuorganisme.

7/22/2019 PCR& RFLP (A1)

5/22

Ganda tepi DNA dipisahkan ke dalam dua

tepi tunggal dengan pemanasan 96C.

Di suhu ini, bagaimanapun, DNA Polymerase

dihancurkan lalu enzim harus diisi setelah

langkah pemanas dari masing-masing siklus.

Mullis asli proses PCR sangat tidak efisien

karena diperlukannya banyak waktu, jumlah

luas dari DNA Polymerase, dan perhatianberkesinambungan sepanjang PCR berjalan.

7/22/2019 PCR& RFLP (A1)

6/22

Kemudian, proses PCR orisinil ditingkatkan olehpenggunaan dari DNA Polymerase mengambil darithermophilic (heat-loving) bakteri yang tumbuh diair panas pada suhu lebih dari 110C.

DNA Polymerase Yang diambil dari organisma ini

adalah thermostable (stabil di temperatur tinggi)dan, ketika dipergunakan di PCR, tidak memecahketika campuran dipanaskan untuk memisahkanDNA tepi.

Sejak saat itu tidak ada lagi suatu proses untukmenambahkan DNA Polymerase untuk masing-masing siklus, proses dari penyalinan satu tepiDNA tertentu dapat menjadi sederhana dan

otomoatis.

7/22/2019 PCR& RFLP (A1)

7/22

Salah satu thermostable DNA Polymerases yangpertama diperoleh dari Thermus aquaticus dandipanggil Taq.

Taq polymerase secara luas terpakai di arus PCR.

Satu kerugian dari Taq terkadang bisa berbuatsalah ketika menyalin DNA, cenderung mengarahke mutasi.

Polymerases seperti Pwo atau Pfu, diperoleh dari

Archea, punya proofreading mechanisms(mekanisme pengecekan untuk kesalahan) dandapat berpengaruh significant mengurangi angkadari mutasi yang terjadi pada urutan DNA .

7/22/2019 PCR& RFLP (A1)

8/22

Komponen dasar PCR

DNA temp late, memerlukan tempat DNA yangbesar.

Dua pr imers, menentukan awal dan akhir dari

suatu reaksi DNA.

Nucleot ides, dimana DNA polymerasemembentuk DNA yang baru.

Buffer , lingkungan kimia yang cocok denganDNA polymerase.

7/22/2019 PCR& RFLP (A1)

9/22

Reaksi PCR diselesaikan pada satu

thermocycler.

Thermocycler adalah alat yang dapat

menyejukkan tabung reaksi atau

memanaskan tabung reaksi.

7/22/2019 PCR& RFLP (A1)

10/22

7/22/2019 PCR& RFLP (A1)

11/22

PCR prinsipal & procedur

PCR biasanya memperkuat besaran daerahspesifik dari satu benang DNA.

Ini gen tunggal, satu bagian dari suatu

gen, atau rangkaian yang tidak terkode.PCR secara khas memperkuat besaran

fragmen DNA dari sampai 10 kilo mendasaripasangan (kb), walau beberapa ilmu

pengetahuan tentang teknikmempertimbangkan pembesaran darifragmen sampai 40 kb pada ukuran

7/22/2019 PCR& RFLP (A1)

12/22

Komponen dan Bahan Reaksi PCR :

DNA template yang berisi daerah DNA untuk diperbesar.

Satu atau lebih primers, yaitu komplementer ke daerahDNA pada 5 ' (lima utama) dan 3 ' (tiga utama)berakhir dari daerah DNA.

satu DNA polymerase seperti Taq polymerase atau DNAPolymerase lain dengan suatu jumlah maksimum padasuhu sekitar 70C.

Deoxynucleotide triphosphates (dNTPs).

Buffer solution, menyediakan satu lingkungan kimiapantas untuk aktivitas optimum dan kemantapan dariDNA Polymerase.

Divalent cations, magnesium atau batu kawi ion;umumnya Mg 2 + adalah terpakai, cuma Mn 2 + dapatdimanfaatkan untuk PCR menengahi DNA Mutagenesis.

7/22/2019 PCR& RFLP (A1)

13/22

PCR biasanya diselesaikan pada satu volumereaksi dari 15 - 100 l di tabung reaksi kecil (0. 2- MEMASUKI. 5 volume ml) pada satu cyclertermal .

termal cycler mengijinkan pemanasan danpendinginan dari tabung reaksi untuk

mengontrol suhu yang diperlukan di masing-masing tahap reaksi.

termal cyclers mempunyai penutup terpanasi

untuk mencegah kondensasi padamenyempurnakan tabung reaksi.

memerlukan satu lapisan minyak di dalammenyempurnakan campuran reaksi.

7/22/2019 PCR& RFLP (A1)

14/22

7/22/2019 PCR& RFLP (A1)

15/22

7/22/2019 PCR& RFLP (A1)

16/22

7/22/2019 PCR& RFLP (A1)

17/22

RFLP

RFLP merupakan penanda molekul yang

pertama kali ditemukan dan

penggunaannya diperkirakan semenjak

orang menemukan enzim endonekluaserestriksi (RE)

7/22/2019 PCR& RFLP (A1)

18/22

RFLP

RFLP bersifat kodomain dan cukup berlimpahserta polimorfik. Proses ini juga mudahdipetakan dalam peta genetik dan bersifat

stabil. Proses penandaan pada saatpemetaan memerlukan DNA dalam jumlahbesar, lama pemetaan 3 hari, sertamelibatkan penggunaan radio aktif. Tetapi

saat ini pengguaan radio aktif sudah tidakditerapkan

7/22/2019 PCR& RFLP (A1)

19/22

RFLP

RFLP (mendeteksi keberadaan suatu genpada DNA)

Fungsi :

1. Diagnosis suatu penyakit2. Konseling penyakit3. Terapi gen

4. Kultur sel jaringan5. Menumbuhkan tanaman/ jaringan

7/22/2019 PCR& RFLP (A1)

20/22

RFLP didasarkan pada polimerase yang munculkarena adanya basa yg mengalami mutasi

- Subtitusi

- Inversi Pada genom

- Delesi DNA

- Translokasi

7/22/2019 PCR& RFLP (A1)

21/22

Probe molekul yang digunakan untuk RFLP, anta

lain :

- Probe molekul DNA ( yg diturunkan dr genome

DNA)

- Probe C DNA ( yg diturunkan dr mRNA )

7/22/2019 PCR& RFLP (A1)

22/22

Kelebihan dari RFLP

Dpt mendeteksi Co-dominan, artinya dapat

membedakan antara homozigot dan heterozigot

Mendapatkan homologi polimorf