pcr y electroforesis biociencias 2011
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REACCION EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) YELECTROFORESIS
ADRIANA MARIA GIL ZAPATAMscMsc. CIENCIAS BASICAS BIOMEDICAS. CIENCIAS BASICAS BIOMEDICAS
BIOCIENCIAS II
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ELEMENTOS QUE SE REQUIEREN EN LA SINTESIS DEL DNA POR PCR
•••• Hebra Templado
• Iniciador (cebador, primer) : secuencia corta denucleótidos complementaria a la hebra templado. La enzima DNA polimerasa sólo puede iniciar la síntesisde una cadena de DNA a partir de un 3’OH libre.
•••• dNTPs : desoxirribonucleótidos tri-fosfatados
•••• DNA Polimerasa
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PCRMelting
94 oC
Tem
peratura
100
0
50
Tiempo
5’3’
3’5’DNA de cadena doble
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PCRMelting
94 oC
Tem
peratura
100
0
50
Tiempo
3’5’
5’3’
CalorDNA de cadena simple
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PCRMelting
94 oCAnnealing
Primers
50 oC
Extension
72 oC
Tem
peratura
100
0
50
Tiempo
3’5’
5’3’
5’
5’
Melting
94 oC
Hibridaciónde primers
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PCRMelting
94 oC
Melting
94 oCAnnealing
Primers
50 oC
Extension
72 oC
Tem
peratura
100
0
50
Tiempo
30 ciclos
3’5’
5’3’
Calor
Calor
5’
5’
5’
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PCRMelting
94 oC
Melting
94 oCAnnealing
Primers
50 oC
Extension
72 oC
Tem
peratura
100
0
50
Tiempo
30ciclos
3’5’
5’3’5’
5’
5’
5’
5’
5’
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PCRMelting
94 oC
Melting
94 oCAnnealing
Primers
50 oC
Extension
72 oC
Tem
peratura
100
0
50
Tiempo
30ciclos
3’5’
5’3’5’
5’
5’
5’
5’
5’
Calor
Calor
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PCRMelting
94 oC
Melting
94 oCAnnealing
Primers
50 oC
Extension
72 oC
Tem
peratura
100
0
50
Tiempo
30ciclos
3’5’
5’3’5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
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Fragmentos de
tamaño definido
PCRMelting
94 oC
Melting
94 oCAnnealing
Primers
50 oC
Extension
72 oC
Tem
peratura
100
0
50
Tiempo
30ciclos
3’5’
5’3’5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
5’
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El numero de copias del DNA delimitado por los primers se duplica en cada ciclo de PCR.
0
# ciclos
Numero de copias
1
3
8
2
4
1
2
4
16
5
32
6
64
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VENTAJAS DE PCR SOBRE
OTRAS TECNICAS
���� ALTA SENSIBILIDAD
���� ALTA ESPECIFICIDAD
���� RAPIDEZ
DESVENTAJA:
PROBLEMAS DE CONTAMINACION (a partir de trazas de DNA
templado específico o productos amplificados previamente)
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PCRProceso que semeja “in vitro” la replicación del ADN y que permite obtener millones de copias iguales de un fragmento de ADN, después de realizar 30 o más ciclos.
REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA
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REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA
CICLO
1. DENATURACIÓN90 a 95 ° c
2. ANILLAMIENTO55 a 65 ° c
3. EXTENSIÓN72 ° c
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DENATURACION
• El ADN sirve de molde para ser copiado.
• Un aumento de la temperatura o un pH
alcalino permite que la cadena se separe.
• Es reversible
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HIBRIDACION
• Los primers se unen a los extremos 3 prima
de la cadena.
• La nueva hebra tiene la direccion de 5 a 3
prima.
• Le dan la especificidad a la PCR.
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EXTENSION
• Actua la Taq (Termophilus aquaticus)
polimerasa.
• Polimerisa los dNTP‘s.
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PCR MIX• Buffer • Primers •ADN molde
• dNTP’s (dATP, dGTP, dTTP y dCTP)
•ADN Polimerasa (Taq polimerasa)
• Cloruro de Magnesio (MgCl2) cofactor de la Taq.
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Usos de la PCR
• Pruebas de identificación (STRs)• Detección de enfermedades hereditarias
• Detección de enfermedad viral• Clonación de genes• Mutagénesis dirigida• Genotipificación de mutaciones especificas (SNPs)
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CLASES DE PCR
• PCR MISMATCH• RT PCR• PCR TIEMPO REAL• PCR MULTIPLEX• PCR NESTED
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mRNA
cDNA (simple cadena)
cDNA (doble cadena)
PCR
RT-PCR
Consiste en dos pasos:
• Transcripción reversa
• PCR
OBJETIVO:
Detección de la expresión de un gen – por presencia de mRNA
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Transcripción Reversa1. Purificación de RNA mensajero
2. Transcripción reversa a cDNA (DNA copia)
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REAL TIME PCR - PCR EN TIEMPO REAL
•Cuantificación del número de copias de DNA presentesen la muestra (diagnóstico, monitoreo de carga viral, comparación entre número de copias en diferentessubespecies, etc.)
•Cuantificación del mRNA por RT-PCR en tiempo real (análisis de la expresión de genes en diferentes tejidos o en diferentes condiciones normales vs patológicas, efecto de drogas, etc)
•Análisis de la cinética de la reacción
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PCR en tiempo real
• Detección y cuantificación de reporteros fluorescentes.
• La fluorescencia emitida es proporcional a la cantidad de
producto formado en cada ciclo de PCR.
• Reporteros fluorescentes: TaqMan, Beacons moleculares,
SYBR Green
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TaqMan PCRSonda específica
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CYCLE NUMBER DNA copy number0 11 22 43 84 165 326 647 1288 2569 512
10 1,02411 2,04812 4,09613 8,19214 16,38415 32,76816 65,53617 131,07218 262,14419 524,28820 1,048,57621 2,097,15222 4,194,30423 8,388,60824 16,777,21625 33,554,43226 67,108,86427 134,217,72828 268,435,45629 536,870,91230 1,073,741,82431 1,400,000,00032 1,500,000,00033 1,550,000,00034 1,580,000,000
PCR reagent is the limiting factor!!
Copies of DNA=2N
0.0E+00
2.0E+08
4.0E+08
6.0E+08
8.0E+08
1.0E+09
1.2E+09
1.4E+09
1.6E+09
1.8E+09
0 5 10 15 20 25 30 35
PCR cycle
DN
A c
opy
num
ber
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
0 5 10 15 20 25 30 35
PCR cycle
DN
A c
opy
num
ber
(log)
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CANTIDAD DE DNA (escala logaritmica) vs NUMERO DE CICLOS
Se observa diferencias en los ciclos iniciales. Relación como línea recta al utilizar logaritmos, porque la amplificación por PCR es una reacción logarítmica.
![Page 28: Pcr y Electroforesis Biociencias 2011](https://reader034.vdocuments.net/reader034/viewer/2022052307/5571fb5b497959916994a83c/html5/thumbnails/28.jpg)
Real Time PCR
![Page 29: Pcr y Electroforesis Biociencias 2011](https://reader034.vdocuments.net/reader034/viewer/2022052307/5571fb5b497959916994a83c/html5/thumbnails/29.jpg)
ARTEFACTOS - PRODUCTOS NO ESPECIFICOS:
• Unión inespecífica de primers (mispriming): por unión de los
primers a secuencias parcialmente complementarias presentes en
el DNA o cDNAs de la muestra
• Dímeros : los primers pueden hibridarse entre ellos creando
productos pequeños
PROBLEMAS
PRODUCTOS NO ESPECIFICOS (artefactos) : que
pueden incrementar el valor de fluorescencia obtenida
durante la reacción. Esto es mas frecuente cuando se utiliza
SYBR-green.
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Ventajas del PCR en tiempo real• Simple y rápida (semi-automatizada).
• No hay manipulación post-PCR.
• Eliminación de contaminación por amplicones.
• Cuantificación del DNA o RNA molde inicial.
• Muy sensible.
• Detección de productos inespecíficos con la opción “curva de desnaturalización” (Melt-Curve).
• Detección de más de un producto específico en una misma reacción.
• Extraordinariamente específico.
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SHORT TANDEM REPEATSSHORT TANDEM REPEATS
STRsSTRs LocalizaciLocalizacióón Secuencia Taman Secuencia Tamaññoocromoscromosóómica ( mica ( pbpb ))
D3S1358 3p (D3S1358 3p (TCTA)nTCTA)n 114 114 -- 142142
vWAvWA 12p (TCTG)n 152 12p (TCTG)n 152 -- 197197
FGA 4p (CTTT)n 219 FGA 4p (CTTT)n 219 -- 167167
DYS 391 Y (GCGT)n 210 DYS 391 Y (GCGT)n 210 -- 264264
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METODOLOGIA DE ANÁLISIS DEL ADN
ELECTROFORESIS CAPILAR:
Cromosoma Y: DYS19, DYS385, DYS389 I, DYS389 II, DYS390, DYS391, DYS392, DYS393.
ABI PRISM 310
PCRSTR’s
EXTRACCION DE ADN: Salting Out, Chelex
Autosómicos: D3S1358, VWA, FGA,THO1, TPOX, CSF1PO, D5S818, D13S317,D7S820, D8S1179, D21S11, D18S51,D16S539.
Cromosoma X: DXS8378, DXS9898,DXS8377DXS8378, DXS9898,DXS8377HPRTBHPRTB
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TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA Alelo 4Alelo 4
TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA Alelo 5Alelo 5
TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA Alelo 6Alelo 6
TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA TATA TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA TCTA TATA …… n n Alelo nAlelo n
POLIMORFISMO:POLIMORFISMO: MMúúltiples alelos posibles en la poblaciltiples alelos posibles en la poblacióónn
D3S1358
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![Page 35: Pcr y Electroforesis Biociencias 2011](https://reader034.vdocuments.net/reader034/viewer/2022052307/5571fb5b497959916994a83c/html5/thumbnails/35.jpg)
KIT COFILER
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![Page 42: Pcr y Electroforesis Biociencias 2011](https://reader034.vdocuments.net/reader034/viewer/2022052307/5571fb5b497959916994a83c/html5/thumbnails/42.jpg)
ELECTROFORESIS
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METODOLOGIA DE ANÁLISIS DEL ADN
ELECTROFORESIS CAPILAR
EQUIPO ABI PRISM 310
ELECTROFORESIS
ELECTROFORESIS CONVENCIONAL
CAMARA DE ELECTROFORESISGEL DE AGAROSA
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ELECTROFORESIS
Técnica en la cual una partícula cargada se hace desplazar a través de un medio aplicando un campo eléctrico.
La velocidad de migración es función de la densidad de carga y ésta a su vez es función de una serie de parámetros que marcan las condiciones experimentales como: pH, fuerza iónica, voltaje, interacciones con el soporte.
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MOVIMIENTO DE LA PARTICULA EN EL CAMPO ELECTRICO
Catión ( carga + ) Migra al polo negativo. CATODOAnión ( carga - ) Migra al polo positivo. ANODO
La fuerza que ejerce el campo eléctrico sobre la partícula cargada, es proporcional a la carga de la partícula y al voltaje del campo eléctrico aplicado.
F = Q X V
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MOVIMIENTO DE LA PARTICULA EN EL CAMPO ELECTRICO
Otra fuerza se opone al movimiento de la partícula y es proporcional al tamaño y la forma de ella y a la viscosidad del buffer.
Fr = F X VEstas dos fuerzas se equilibran cuando la partícula empieza a migrar y hace que alcance una velocidad constante.
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FACTORES QUE AFECTAN LA MIGRACION DE LAS PARTICULAS
Carga neta de la partícula: Efecto del pH del tampón.Cuando las partículas se colocan en un campo eléctrico, estas migrarán hacia el ánodo o el cátodo en función de la carga neta que posean y ésta depende del pH de la solución en que se encuentran.
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FACTORES QUE AFECTAN LA MIGRACION DE LAS PARTICULAS
Tamaño y Forma de la partícula:Según el tipo de electroforesis, el tamaño y la forma de la partícula pueden tener mayor o menor importancia.Cuando se emplean soportes que permiten el paso selectivo de moléculas, según el tamaño, retienen las grandes y dejan pasar las más pequeñas.
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FACTORES QUE AFECTAN LA MIGRACION DE LAS PARTICULAS
Fuerza iónica del tampón:En la electroforesis, la corriente es llevada por los iones presentes, tanto del tampón como de las partículas en solución, por tanto cuanto más concentrado es el tampón, mayor la proporción de corriente que transportan, menor la migración de las partículas y peor la separación.
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FACTORES QUE AFECTAN LA MIGRACION DE LAS PARTICULAS
Potencial del campo eléctrico:A mayor potencial del campo eléctrico mayor velocidad de la partícula.Según el método electroforético se elige trabajar manteniendo constante el V o A.Si aumenta el voltaje, aumenta velocidad de separación, pero también la temperatura aparecen efectos indeseables como:desnaturalización de pr, evaporación del buffer, aumento de la fuerza iónica.
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TIPOS DE SOPORTES
El procedimiento electroforético se lleva a cabo sobre dos soportes::
1. Soportes No Restrictivos:Las partículas colocadas sobre ellos, se separan únicamente en función de su carga eléctrica. Los principales soportes son:Papel – Acetato de Celulosa – Agarosa
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TIPOS DE SOPORTES
2. Soportes Restrictivos:El soporte ejerce algún tipo de resistencia al desplazamiento de las moléculas de la muestra. La resistencia estará dada por el tamaño del poro del soporte y por el tamaño y características de las moléculas que deben desplazarse sobre el soporte. Los principales tipos de soportes son:Geles de Almidón – Geles de Poliacrilamida
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ELECTROFORESIS CONVENCIONAL
AGAROSA:Es uno de los componentes del agar. Se prepara como un gel de concentración entre 0.5 – 2 gr %. El tamaño del poro es grande y permite el paso de moléculas de peso molecular relativamente alto, por lo cual migran tan solo en función de su carga. Su aspecto claro y transparente facilita la cuantificación por densitometría.
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ELECTROFORESIS CONVENCIONAL
POLIACRILAMIDASe forman por polimerización de la acrilamida con un agente enlazante. El tamaño del poro varía, según la concentración de la acrilamida y las moléculas puedan ser separadas por diferencias en sus cargas y tamaños. Soporte ideal para obtener mayor y mejor número de separaciones electroforéticas. Se puede leer por densitometría.Permite introducir al gel: SDS, urea y etc.
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ELECTROFORESIS CONVENCIONAL
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ELECTROFORESIS CAPILAR
POLIMERO POP 4Soporte restrictivo que permite la separación de moléculas de ADN desde un par de bases en adelante.Se deposita en un capilar de 1 mm de diámetro y este se introduce en un equipo automatizado que posee una placa de calentamiento y un laser que detecta la señal de los fluorocromos.
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ABI PRISM 310
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ABI PRISM 310
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FLUOROCROMOS
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REALIZACION DE LA ELECTROFORESIS
Obtención de la Montaje de laMuestra jeringa
Montaje de la muestra
Electroforesis capilar
Detección por el laser
Lectura de electroferogramas
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ELECTROFEROGRAMA
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MARCADOR DE PESO MOLECULAR
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LADDER ALÉLICO
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PERFIL GENÉTICO
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