Pemurnian Protein

Struktur 3D Protein Protein memiliki struktur 3D yang unik yang menentukan fungsi biologisnya dan sifatnya dalam larutan. Pemurnian protein bergantung pada keunikan struktur ini.

Tujuan pemurnian protein Untuk memisahkan satu protein dari campuran protein-protein lain (seperti ekstrak jaringan), akan tetapi tetap menjaga fungsi biologisnya. Fungsi biologis dari protein dapat dijaga dengan mengontrol pH, suhu dan kekuatan ion (konsentrasi garam).

Pemurnian dapat dianggap sebagai deretan tahap fraksinasi yang dirancang sedemikian rupa sehingga: Protein yang diinginkan terisolasi secara ekslusif pada satu fraksi dan dengan hasil yang baik Sebagain besar kontaminan berada pada fraksi yang lain

Tahap pertama pemurnian protein Tahap pertama di dalam setiap pemurnian protein adalah pengembangan pengujian spesifik dari protein target. Pengujian spesifik dapat didasarkan pada sifat yang karakteristik dari protein target, seperti Aktivitas enzimatik Aktivitas imunologi Karakteristik fisik (misalnya massa molekul, sifat-sifat spektroskopik dan lain-lain) Secara ideal, pengujian haruslah Specific Rapid Sensitive Quantitative

Parameter pengontrol Parameter yang harus dikontrol selama pemurnian:1. Volume sampel total. 2. Protein sampel total (dapat diketahui dari serapan pada = 280 nm. 3. Unit aktivitas dari protein yang diinginkan.

Dari parameter di atas dapat diperoleh informasi tentang:1. % yield untuk setiap tahap pemurnian 2. Aktivitas spesifik dari protein yang diinginkan (unit/mg protein total) 3. Peningkatan kemurnian pada setiap tahap

Kemurnian vs Yield Dalam merancang skema pemurnian harus dipertimbangkan antara kemurnian dengan yield Contoh, mungkin merupakan hal yang mudah untuk mendapatkan kemurnian 90% dengan yield yang bagus. Tetapi, kemungkinan merupakan hal yang sukar untuk meningkatkan kemurnian beberapa persen lagi tapi masih dengan yield bagus. Bila protein akan digunakan untuk menentukan urutan asam amino, kemurnian 90% mungkin masih dapat diterima. Tetapi bila akan digunakan untuk material klinis, maka target kemurnian haruslah 99.99+%.

Diagram Alir Pemurnian ProteinSampel Teknik Pemisahan

Fraksinasi

Ulangi dengan teknik pemisahan lain hingga murniTidak Uji Aktivitas Ada Aktivitas?

Singkirkan

Tidak ada

Ada

Gabungkan Fraksi2

Periksa kemurnian

Murni? Ya

Analisa lanjutan

Tahap I: Penyiapan ekstrak kasarProtein yang terlarut dalam air

Pecah sel, jaringan Atau organ

Sentrifuga

Blender, Homogenizer, Sonication, PressureSel mikroba atau jaringan Pelet dari sel yang masih utuh, organel, mebran, protein membran

Tahap II: PemisahanSifat Kelarutan Ketahanan terhadap stres lingkungan Ukuran Muatan (titik isoelektrik) Metode Pengendapan dengan garam, pelarut organik Denaturasi selektif terhadap temperatur, pH dan pelarut organik

Size-exclusion chromatographyKromatografi penukar ion

Ikatan dengan molekul kecil

Kromatografi afinitas

Prinsip pemisahan berdasarkan kelarutan protein

Kelarutan protein Distribusi residu hidrofilik (polar bermuatan atau tidak) dan hidrofobik (non-polar) pada permukaan molekul protein adalah sifat yang menentukan kelarutan protein dalam berbagai pelarut. Meskipun residu hidrofobik cenderung terkubur di dalam interior dari protein, tetapi sejumlah tertentu residu hidrofobik juga ada pada permukaan dan melakukan kontak langsung dengan pelarut.

Polar nonpolar

+

Gaya elektrostatik antar molekul protein Kelarutan adalah hasil dari interaksi polar dengan pelarut, interaksi ionik dengan garam, dan beberapa sebagai hasil gaya tolakmenolak antar molekul dengan muatan yang sama. Prinsipnya protein akan mengendap bila gaya tolakmenolak antar protein tidak cukup besar untuk mencegah terjadinya penggabungan. Misalnya pada kondisi: Kekuatan ion rendah Banyaknya residu hidrofobik di permukaan Pada titik mendekati isoelektrik pH > I.E.P pH I.E.P

pH < I.E.P

++ + + ++Kelarutan

+

+

+ ++

I.E.P

pH

Efek kekuatan ion pada kelarutan protein Dalam rentang kekuatan ion antara 0-0,5 M, bertambah-nya kelarutan (pada pH dan suhu tertentu) dengan bertambahnya konsentrasi garam dikenal dengan sebutan salting in. Pada konsentrasi garam tinggi kelarutan protein akan menurun kembali akibat terjadinya peristiwa salting out. Salting out sangat bergantung pada hidrofobisitas dari protein , sedangkan salting in sangat bergantung pada distribusi muatan dan interaksi polar dengan pelarut.pH mendekati I.E.P

Kelarutan

pH = I.E.P

Konsentrasi garam

Termodinamika salting in dan salting out Misalkan proses pelarutan protein dalam air dituliskan sbb: P + nH2O P.nH2O dimana nH2O adalah jumlah molekul air yang tersusun secara teratur disekitar residu hidrofob. Dalam kasus ini S < 0. Karena proses terjadi secara alamiah, maka G < 0, sehingga H < 0 dan nilai |H| > |T S|. Bila dua protein bergabung dan berinteraksi melalui residu hidrofob, dan melepaskan air: P.nH2O + P.mH2O P-P + (n + m)H2O pelepasan air mnyebabkan S > 0; H > 0. Nilai G bergantung pada besarnya H dan S.Pada konsentrasi garam rendah, G > 0 proses ini tidak dapat terjadi Pada konsentrasi garam tinggi, G < 0 proses ini dapat terjadi. Pada kondisi ini, molekul air yang dilepaskan dijebak oleh ion garam, melalui proses hidrasi. AB (garam) + (n1 + n2)H2O A+.n1H2O + B-. n2H2O sekali sejumlah molekul air terambil dari protein, maka agregasi dapat terjadi.

Daerah Hidrofob protein Molekul air

Garam salting out Garam yang efektif menyebabkan salting out pada konsentrasi tinggi adalah garam dengan anion multicharge, seperti ion sulfat, fosfat, sitrat. Urutan kefektifan anion: SCN- < CLO4- < NO3- < Br- < Cl- < asetat- < SO42- < PO43 Kation yang efektif: NH4+ > K+ > Na+ Garam yang potensial: amonium, kalium dan natrium silfat, fosfat, dan sitrat. Pertimbangan dalam pemilihan garam : Harga per kilogram Kelarutan Kalor larutan Kerapatan larutan

Kelebihan amonium sulfat: Kelarutannya bervariasi sedikit pada temperatur 0-30 oC Konsentrasi jenuhnya ~4 M Kerapatan jenuh = 1,235 g cm-3

Pengendapan dengan ammonium sulfat Kelarutan ammonium sulfat pada 20oC adalah 533 g/L. Untuk membuat larutan stok amonium sulfat jenuh (1,425 L; 4,05 M), 761 g harus ditambahkan ke dalam 1 L air. Kerapatan jenuhnya adalah 1761/1425 = 1,235 g cm-3. Larutan lain dapat dibuat dengan rumus berikut: (a) Bila ingin membuat Larutan M2 dari larutan M1 g = 533(M2 M1) / (4.05 0.3M2) (b) Bila ingin membuat larutan dengan %S2 dari %S1: g = 533(S2 S1) / (100 0,3S2) Asumsi bahwa 100% jenuh adalah 4,05 M. Ammonium sulfat memiliki sedikit sifat asam, sehingga 50 mM buffer (misalkan fosfat) harus ditambahkan. Keuntungan yang paling penting dari fraksinasi amonium sulfat dibanding teknik lain adalah menawarkan kestabilan yang tinggi dari protein yang diendapkan. Juga dapat menghambat aktivitas protease.

% of protein precipitating

Soluble at 100% saturation

% of saturation of (NH4)2SO4

Fraksinasi dengan amonium sulfatPercent saturation range First trial 0-40 40-60 60-80 80 Percent enzyme precipitated 4 62 32 2 Percent protein precipitated 25 22 32 21 Purification factor

2.8 1.0

Kesimpulan: enzim banyak mengendap pada konsentrasi 40-60%, coba 45-70%

Second Trial

0-45 45-70 70

6 90 4

32 38 30

2.4

Kesimpulan: Good recovery, tetapi faktor kemurnian tidak bagus seperti pada percobaan pertama, Bila kemurnian dianggap penting coba 48-65% Third trial 0-48 48-65 65 10 75 15 35 25 40

3.0

Faktor kemurnian = aktivitas spesifik dari fraksi dibagi dengan aktivitas spesifik sampel awal.

Pengendapan dengan pelarut organik Efek penambahan pelarut organik adalah menurunkan aktivitas air. Tetapan dielektrik pelarut turun. Imobilisasi air akibat hidrasi pelarut organik. Struktur teratur dari air sekitar daerah hidrofobik protein digantikan oleh molekul pelarut organik.

Prinsip agregasi protein oleh pelarut organik adalah elektrostatik dan gaya dipolar. Syarat pelarut: Pelarut yang digunakan harus larut dengan baik dalam air. Tidak bereaksi dengan protein. Memiliki efek pengendapan yang baik. Contoh: etanol dan aseton

Keuntungan fraksinasi dengan pelarut organik adalah pengendapan dapat dilakukan pada suhu di bawah 0 oC.

Pengendapan dengan pelarut organik Saat melakukan fraksinasi dengan pelarut organik, temperatur harus dijaga. Pada suhu rendah, fleksibilitas struktur protein sangat rendah, sehingga sangat sukar untuk terjadinya penetrasi molekul organik kedalam struktur internal protein. Pada suhu sekitar 10oC denaturasi dapat terjadi. Molekul organik yang kecil dapat masuk ke dalam crack pada permukaan yang terbentuk secara spontan akibat lentiran alamiah, dan melekatkan diri pada residu internal melalui interaksi hidrofobik.

Prinsip pemisahan berdasarkan denaturasi selektif

Denaturasi selektif Tujuan denaturasi selektif adalah untuk menciptakan kondisi dimana protein target tidak terdenaturasi, tetapi komponen lain akan terdenaturasi dan mengendap. Stres yang diberikan: Temperatur pH Pelarut organik

Denaturasi pHPerubahan pH dapat menyebabkan denaturasi protein, karena daerah sensitif dari protein jadi memiliki lebih banyak muatan yang sama, sehingga menyebabkan tolakmenolak internal, atau perubahan pH menyebabkan kehilangan muatan yang sebelumnya digunakan dalam interaksi tarik-menarik untuk mempertahankan struktur.

Yang menyebabkan denaturasi bukan protonasi residu bermuatan, tetapi tahap pembukaan strukturlah yang menentukan laju proses denaturasi. Temperatur ikut berperan dalam mempercepat proses pembukaan struktur ini.

Denaturasi oleh pelarut organik Kondisi denaturasi% activity remaining Temperatur biasanya dijaga antara 20-30oC atau lebih tinggi. Konsentrasi pelarut organik biasanya lebih rendah dibanding yang diperlukan untuk presipitasi. (o) metanol; () etanol; () propanol; () butanol; () pentanol; (+) propan-2-ol.

Prinsip pemisahan: Protein yang berbeda akan memiliki sensitivitas yang berbeda pula pada kedua kondisi di atas. Efek alkohol: semakin panjang rantai alifatik, semakin kuat sifat mendenaturasinya. Efek aseton: sama dengan etanol.

%etanol (vol/vol) Denaturasi yeast gliseraldehid fosfat dehidrogenase oleh alkohol. 2mg/ml enzim diinkubasi pada suhu 30oC selama 30 menit, didinginkan dan endapan dikeluarkan dengan sentrifugasi. Supernatan diuji aktivitasnya.

Prinsip pemisahan dengan teknik kromatografi

Kromatografi Molekul campuran dalam suatu larutan ditempatkan dalam suatu fasa gerak dan dilewatkan pada bahan adsorbent tertentu (fasa diam). Molekul-molekul akan memiliki afinitas tertentu terhadap adsorbent, sehingga terjadi pemisahan. Untuk setiap protein akan memiliki waktu retensi tertentu. Pada saat pemisahan molekul yang sama akan bermigrasi bersama-sama, tetapi karena adanya proses difusi dan disain peralatan (pemipaan), maka molekul yang sama cenderung terpisah dengan pita lebar.

Teknik pemisahan protein dengan metode kromatografi Ekstrak kasar atau fraksi hasil pengendapan dengan garam/ pelarut organik ditempatkan di atas matrix padat. Dalam hal ini dimisalkan dalam ektrak terdapat empat protein yang berbeda dimana setiap protein diwakili dengan warna. Protein-protein ini akan bergerak dengan laju berbeda melewati matrix bergantung pada sifat dari protein tersebut dan jenis matrix yang digunakan.

Protein

Fraksinasi Saat terjadi pemisahan, efluen ditampung ke dalam beberapa tabung fraksi yang berbegak dengan kecepatan tertentu. Fraction collector di lab dapat menampung 75 hingga 200 tabung.

Protein arent color codedPada kenyataannya protein berwarna, sehingga setidaknya ada tiga pertanyaan yang harus dijawab setelah fraksinasi: 1. Fraksi mana yang mengandung protein? 2. Dari fraksi-fraksi yang mengandung protein, fraksi mankah yang mengandung protein yang diinginkan? 3. Bagaimana menguji kemurniannya?

???

Fraksi mana yang mengandung protein? Protein total dpat diperkirakan dengan mengambil absorbansi pada 280 nm dengan spektrofotometer UV. Asam amino aromatik (Tyr, Trp) menyerap pada panjang gelombang ini. Nilai absorbansi dapat diplot terhadap nomor fraksi Profil elusi. Aktivitas enzim dapat diukur pada fraksi yang mengandung protein.

Fraction #

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

A280EnzAssay

00025200025852002520

Results

A280

Nomor fraksi # Buang fraksi yang tidak mengandung protein

Gabung fraksi yang memiliki aktivitas enzimMerupakan hal yang penting untuk mempertimbangkan lebih dari sekedar aktivitas fraksi. Aktivitas spesifik adalah suatu ukuran dari aktivitas enzim per jumlah protein (unit/mg). Semakin besar aktivitas specifiknya, makin tinggi kemurniannya.Fraction 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 #

Apakah fraksi gabungan sudah murni?1. Perhatikan pita pada gel. Bila hanya ada satu pita, kemungkinan murni baik sebagai monomer, homodimmer atau multimer.Bila tidak satu pita, kemungkinan tidak murni atau sub unit dari enzim. 2. Hitung aktivitas spesifiknya.ProsedurEkstrak kasar Pemisahan metode 1

Fraksi gabunganAktivitas spesifik (Unit/mg) 10 200 15000

standar

Ekstrak kasar

Frkasi vol (ml) 1400 90 8

Total Prot (mg) 10000 400 4

Aktivitas (unit) 100000 80000 60000

Pemisahan metode 2

Fraksi murni