1

EFEK FARMAKOLOGI EKSTRAK ETANOL DAUN SINGAWALANG

(Petiveria alliaceae) PADA MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS

STRAIN H37RV

Nurmawati Fatimah

(Departemen Farmakologi FK Unair)

ABSTRACT

Tuberculosis was known bacterial diseases caused infection acute and or

chronic perform on adult human lung. Singawalang leaves were predicted can be

using as an antibacterial like effect. The research aim was to explored

pharmacologic effect of extract singkawang leaves after extracted by ethanol.

Result research appeared that crude ethanol extract of singkawang leaves was

significantly can be used against to bacterial caused Tuberculosis diseases

(Mycobacterium tuberculosis).

Keywords: Herbal medicine, in vitro test, Mycobacterium tuberculosis, Lung

diseases

PENDAHULUAN

Tuberkulosis merupakan penyakit yang disebabkan oleh infeksi bakteri

Mycobacterium tuberculosis dan menjadi salah satu penyakit menular yang masih

menjadi masalah kesehatan masyarakat di dunia maupun di Indonesia. Angka

prevalensi tuberkulosis pada tahun 2008 di negara-negara ASEAN berkisar antara

27 sampai 680 kasus per 100.000 penduduk.

Indonesia saat ini berada pada ranking kelima dengan beban TB tertinggi

didunia. Estimasi prevalensi TB semua kasus adalah sebesar 660.000 (WHO,

2010b) dan estimasi insidensi berjumlah 430.000 kasus baru per tahun. Jumlah

kematian akibat TB diperkirakan 61.000 kematian per tahunnya (Kementerian

Kesehatan RI, 2011).Tingginya angka kasus baru dan kematian yang terjadi,

menjadikan tuberkulosis sebagai masalah kesehatan yang segera harus diatasi

(WHO,2010a).

Resistensi antibiotik merupakan masalah mendasar yang harus di tangani,

Agen antimikroba dengan mekanisme baru yang berasal dari bahan sintetis atau

alami akan menjadi alternatif lain. Bahan alami memberikan target dapat

menghambat pertumbuhan bakteri dan penyebaran resistensi antibiotik (Rieder et

al., 2010). Salah satu kebijakan WHO adalah mendukung pengembangan tanaman

obat dan jika memungkinkan sampai dapat ditemukan obat baru untuk mengatasi

masalah infeksi tersebut (Gitawati R dkk.,2005).

Berbagai percobaan juga telah dilakukan terhadap Mycobacterium

tuberculosis misalnya daun waru dan pegagan memiliki daya hambat terhadap

bakteri tersebut meskipun belum diketahui pasti mekanismenya (Gitawati R

dkk.,2005;Zulhipri,2005). Singawalang (Petiveria alliaceae) merupakan salah

satu tumbuhan yang telah diteliti memiliki aktivitas sebagai anti fungi dan anti

2

bakteri Staphylococcus aureus sehingga menumbuhkan harapan bahwa tanaman

tersebut juga mampu menghambat pertumbuhan bakteri spesifik seperti

Mycobacterium tuberculosis (Kim et al.,2006).

Ekstrak daun singawalang mengandung senyawa organik benzyl-thiosulfinate

yang mempunyai fungsi menghambat pertumbuhan bakteri Mycobacterium

smegmatis dengan jalan mengganggu pembentukan dinding sel sehingga terjadi

lisis dinding sel (Ayodele et al.,2000). Ekstrak daun singawalang telah dilaporkan

dapat menghambat pertumbuhan kuman Mycobacterium tuberculosis pada media

LJ (Arifa dkk.,2008).

METODE

Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental laboratorik. Rancangan

penelitian adalah post test only control group design. Jumlah perlakuan yang di

gunakan dalam penelitian ini 5 buah termasuk kontrol, yaitu kontrol, perlakuan

dengan DMSO dan perlakuan dengan ekstrak etanol daun singawalang dalam

berbagai dosis (0,25mg/ml; 0,5mg/ml; 1mg/ml; ), pengulangan setiap kelompok

adalah 6 kali. Daun singawalang diperoleh dari Balai Materia Medika Batu,

determinasi bahan dilakukan di Balai Materia Medika. Ekstraksi daun

singawalang dilakukan di laboratorium Farmakognosi dan Fitokimia Fakultas

Farmasi Universitas Airlangga. DMSO di dapatkan dari Lembaga Penyakit Tropik

(LPT) Universitas Airlangga. Bakteri uji yang merupakan sampel pada penelitian

ini adalah Mycobacterium tuberculosis strain H37RV yang di peroleh dari

Lembaga Penyakit Tropis (LPT) Universitas Airlangga di ambil dari koloni pada

media perbenihan secara acak. Kepekaan Mycobacterium tuberculosis strain

H37RV pada setiap level konsentrasi yang di indikasikan dengan jumlah koloni

bakteri uji yang tumbuh pada media middlebrook 7H10. Ekstrak etanol daun

singawalang adalah penyarian daun singawalang dengan menggunakan etanol.

Proses penyarian dilakukan sesuai dengan prosedur pada Laboratorium

Farmakognosi dan Fitokimia Fakultas Farmasi Unair. Daya hambat terhadap

Mycobacterium tuberculosis merupakan kepekaan Mycobacterium tuberculosis

strain H37RV yang berasal dari LPT (Lembaga Penyakit Tropis) Universitas

Airlangga. Jumlah koloni bakteri yang ditanam adalah 105. Penilaian daya hambat

ditentukan dengan ada atau tidak adanya pertumbuhan bakteri, di lanjutkan

dengan menghitung jumlah koloni Mycobacterium tuberculosis pada media

middlebrook 7H10 pada setiap dosis ekstrak etanol daun singawalang setelah

inkubasi selama 8 minggu pada suhu 370C di dalam inkubator CO2. Data yang di

perlukan dalam penelitian ini adalah jumlah koloni bakteri yang tumbuh pada

media 7H10 pada berbagai konsentrasi ekstrak etanol daun singawalang. Prosedur

pengumpulan data untuk mengetahui ada tidaknya pertumbuhan koloni bakteri

pada media di lakukan dengan mengacu pada metode dilusi ( Baron et al.,1994).

DISKUSI DAN KESIMPULAN

Data hasil penelitian eksperimental tentang efek bakterisid ekstrak etanol daun

singawalang (Petiveria alliaceae) pada mycobacterium tuberculosis strain H37RV

3

yang di amati selama 8 minggu, kemudian dikumpulkan dan diolah sesuai dengan

tujuan dan hipotesis penelitian yang telah dibuat. Data ini merupakan jumlah

Mycobacterium tuberculosis strain H37 RV yang tumbuh dalam media

middlebrook 7H10 dengan berbagai dosis ekstrak etanol daun singawalang

(Petiveria alliaceae). Penelitian yang dilakukan diawali dengan penanaman

Mycobacterium tuberculosis strain H37 RV dan berbagai dosis ekstrak etanol daun

singawalang pada media cair middlebrook 7H9, selanjutnya diinkubasi dalam

inkubator CO2 selama 3 hari. Mycobacterium tuberculosis strain H37 RV dan

berbagai dosis ekstrak etanol daun singawalang pada media cair 7H9 yang telah di

inkubasi selama 3 hari dalam inkubator CO2, di ambil 10µl, diinokulasikan pada

media padat 7H10 lalu di ratakan dengan ose.

Uji aktivitas ekstrak etanol daun singawalang dilakukan pada media padat

7H10 dengan bakteri uji Mycobacterium tuberculosis strain H37 RV. Hasil uji

kuantitatif di nyatakan dengan jumlah koloni yang dihitung pada minggu ke 8.

Jumlah Mycobacterium tuberculosis strain H37 RV yang tumbuh pada media padat

7H10 ditunjukkan pada Tabel 3.1, gambar pertumbuhan Mycobacterium

tuberculosis strain H37 RV kontrol positif dapat dilihat pada gambar 3.2.

Tabel 3.1 Jumlah pertumbuhan koloni Mycobacterium tuberculosis strain H37 RV.

Jumlah koloni Mycobacterium tuberculosis strain H37RV

Plate ke- I II III IV V VI

Kontrol

positif

6 4 4 4 6 4

Pertumbuhan koloni Mycobacterium tuberculosis strain H37 RV pada kontrol

positif dinyatakan dengan jumlah bakteri yang tumbuh pada media middlebrook

7H10. Pertumbuhan koloni Mycobacterium tuberculosis strain H37 RV pada

perlakuan kontrol negatif dengan DMSO yang juga dinyatakan dengan jumlah

bakteri yang tumbuh pada media middlebrook 7H10 ditunjukkan pada Tabel 3.2,

gambar pertumbuhan Mycobacterium tuberculosis strain H37 RV perlakuan

dengan DMSO dapat dilihat pada gambar 3.2

Tabel 3.2 Jumlah pertumbuhan koloni Mycobacterium tuberculosis strain H37

RV terhadap perlakuan kontrol positif dan kontrol negatif perlakuan dengan

DMSO

Jumlah koloni Mycobacterium tuberculosis strain H37RV

Plate ke- I II III IV V VI

Kontrol

positif

6 4 4 4 6 4

DMSO 4 1 4 4 4 4

4

Gambar 3.1 Pertumbuhan koloni Mycobacterium tuberculosis strain H37 RV

kontrol positif.

Pertumbuhan koloni Mycobacterium tuberculosis strain H37 RV pada

kontrol positif dinyatakan dengan jumlah bakteri yang tumbuh pada media

middlebrook 7H10 dan pertumbuhan koloni Mycobacterium tuberculosis strain

H37 RV pada perlakuan dengan ekstrak etanol daun singawalang dalam berbagai

dosis (0,25 mg/ml; 0,5 mg/ml; 1 mg/ml) yang dinyatakan dalam jumlah bakteri

5

yang tumbuh pada media middlebrook 7H10 ditunjukkan pada Tabel 3.3, dan

gambar pertumbuhan koloni Mycobacterium tuberculosis strain H37 RV perlakuan

dengan ekstrak etanol daun singawalang dalam berbagai dosis (0,25 mg/ml; 0,5

mg/ml; 1 mg/ml) dapa dilihat pada gambar 3.3 sampai gambar 3.5, pertumbuhan

koloni Mycobacterium tuberculosis strain H37 RV didapatkan pada minggu ke-8

masa inkubasi dalam inkubator CO2.

Gambar 3.2 Pertumbuhan koloni Mycobacterium tuberculosis strain H37 RV pada

perlakuan kontrol negatif dengan DMSO.

6

Tabel 3.3 Jumlah koloni Mycobacterium tuberculosis strain H37 RV terhadap

perlakuan kontrol positif, kontrol negatif dan perlakuan dengan

ekstrak etanol daun singawalang dalam berbagai dosis.

Jumlah koloni Mycobacterium tuberculosis strain H37RV

plate ke- I II III IV V VI

Kontrol positif 6 4 4 4 6 4

DMSO 4 1 4 4 4 4

ekstrak etanol daun

singawalang

0,25mg/ml

2 3 1 3 3 3

ekstrak etanol daun

singawalang

0,5mg/ml

3 1 1 1 1 1

ekstrak etanol daun

singawalang 1mg/ml

1 1 1 1 1 1

ditunjukkan dengan pertumbuhan jumlah pertumbuhan koloni bakteri uji. Pada

kelompok kontrol positif jumlah pertumbuhan koloni Mycobacterium tuberculosis

strain H37 RV lebih banyak dibandingkan dengan kelompok perlakuan dengan

pemberian ekstrak etanol daun singawalang dalam berbagai dosis (0,25 mg/ml;

0,5 mg/ml; 1 mg/ml). Kelompok perlakuan dengan pemberian ekstrak etanol daun

singawalang dalam dosis 0,25 mg/ml jumlah pertumbuhan koloni Mycobacterium

tuberculosis strain H37 RV pada keenam plate media middlebrook 7H10

menunjukkan jumlah yang lebih sedikit dibandingkan dengan kelompok kontrol.

Kelompok perlakuan dengan pemberian ekstrak etanol daun singawalang

dalam dosis 0,5 mg/ml jumlah pertumbuhan koloni Mycobacterium tuberculosis

strain H37 RV pada keenam plate media middlebrook 7H10 menunjukkan jumlah

yang lebih sedikit dibandingkan dengan kelompok kontrol. Kelompok perlakuan

dengan pemberian ekstrak etanol daun singawalang dalam dosis 1 mg/ml jumlah

pertumbuhan koloni Mycobacterium tuberculosis strain H37 RV pada keenam

plate media middlebrook 7H10 menunjukkan jumlah yang lebih sedikit

dibandingkan dengan kelompok kontrol. Jumlah pertumbuhan koloni

Mycobacterium tuberculosis strain H37 RV pada kelompok dengan pemberian

DMSO lebih banyak dibandingkan dengan kelompok perlakuan dengan

pemberian ekstrak etanol daun singawalang dalam berbagai dosis (0,25 mg/ml;

0,5 mg/ml; 1 mg/ml

7

Gambar

3.3 Pertumbuhan koloni Mycobacterium tuberculosis strain H37 RV pada

perlakuan dengan ekstrak etanol daun singawalang dalam dosis 0,25 mg/ml.

8

Gambar 3.4 Pertumbuhan koloni Mycobacterium tuberculosis strain H37 RV pada

perlakuan dengan ekstrak etanol daun singawalang dalam dosis 0,5 mg/ml.

9

Gambar 3.5 Pertumbuhan koloni Mycobacterium tuberculosis strain H37 RV pada

perlakuan dengan ekstrak etanol daun singawalang dalam dosis 1 mg/ml.

Hasil uji daya hambat ekstrak etanol daun singawalang terhadap bakteri

Mycobacterium tuberculosis yang telah dilakukan menunjukkan bahwa tumbuhan

tersebut mempunyai khasiat menghambat pertumbuhan Mycobacterium

tuberculosis. Hal ini dapat diketahui dari berkurangnya jumlah koloni bakteri

yang tumbuh dari dosis terendah 0,25mg/ml sampai 1mg/ml media. Pada dosis

ekstrak etanol daun singawalang 0,25 mg/ml media; 0,5 mg/ml media dan dosis 1

mg/ml media didapatkan pertumbuhan Mycobacterium tuberculosis masing

masing plate 1 koloni adaya hambatan pertumbuhan bakteri Mycobacterium

10

tuberculosis juga tampak pada kontrol dan perlakuan dengan pemberian DMSO,

pertumbuhan bakteri Mycobacterium tuberculosis di mulai pada minggu ke-4 dan

bertambah banyak pada minggu ke-8. Hal ini menunjukkan bahwa hambatan

pertumbuhan kuman pada media oleh ekstrak etanol daun singawalang merupakan

efek dari bahan aktif yang terkandung didalamnya bukan karena kesalahan

prosedur atau kuman yang tidak virulent. Senyawa benzil thiosulfinates relatif

paling kuat aktivitas antibakterinya, senyawa ini di laporkan memiliki aktivitas

mengurangi fluiditas dari membran, juga dilaporkan memiliki aktivitas inhibisi

terhadap sintesis makromolekul antara lain DNA, RNA, dinding sel dan protein

(Kim et al,2006;Benevides et al.,2001; Musser,1995). Petiveria alliaceae

mengandung senyawa benzyl-thiosulfinate yang mempunyai fungsi menghambat

pertumbuhan bakteri Mycobacterium smegmatis dengan jalan mengganggu

pembentukan dinding sel sehingga terjadi lisis dinding sel (Ayodele et al,2000).

Berbagai macam zat tersebut yang diduga kuat mempunyai khasiat sebagai

antibakteri adalah senyawa yang mengandung gugus sulfur seperti: benzyl

thiosulfinat, benzyl trislfid dan benzyl sulfinic acid (Kim S et al,2005). Secara

umum didalam tumbuhan singawalang juga mengandung berbagai senyawa

organik yang mengandung belerang. Banyak diantaranya berupa senyawa atsiri

berasa tajam atau berbau tidak enak sehingga adanya senyawa tersebut mudah

diketahui ketika ekstraksi dan isolasi. Golongan dari senyawa tersebut yang

penting adalah pertama golongan glukosinolat dari Cruciferae, kedua disulfida

organik dari allium dan golongan ketiga adalah tiofen asetilenik. Senyawa

golongan glukosinolat pada berberapa tumbuhan diketahui berfungsi sebagai

antibakteri (Yan ping et al,2002). Senyawa lain yang diduga berkhasiat sebagai

antibakteri adalah senyawa golongan fenol. Pada beberapa tumbuhan senyawa

fenol dan derivatnya berfungsi sebagai antibakteri dengan cara menurunkan

tegangan permukaan sel dan denaturasi protein walaupun demikian khasiat

senyawa fenol pada tumbuhan lain bisa berbagai macam, misalnya sebagai

antioksidan (Manna C,1997). Daun singawalang mengandung berbagai senyawa

dari golongan polifenol yang juga ternasuk dalam golongan senyawa fenol. Jenis

dan jumlah senyawa tersebut di dalam ekstrak etanol daun singawalang belum

diketahui dengan pasti demikian juga dengan fungsi dan khasiatnya. Daun

singawalang juga mengandung senyawa golongan triterpenoid. Pada beberapa

tumbuhan senyawa golongan ini berfungsi sebagai antibakteri dengan

melunakkan sel membran bakteri yang mengakibatkan hancurnya dinding sel

seperti pada triterpene asiaticoside ( Gitawati,2005). Tetapi perlu diingat juga

bahwa senyawa golongan triterpenoid juga bisa memiliki berbagai khasiat

seperti Phylanthus niruri merupakan salah satu tumbuhan yang mengandung

senyawa golongan terpenoid dan berkhasiat sebagai antibakteri (Manna et

al,1997). Senyawa golongan ini juga ditemukan pada tumbuhan Eunicea

pinta yang berkhasiat sebagai antikanker dan antimikroba (Yan ping et

al,2002). Khasiat antikanker senyawa golongan terpenoid juga berhasil

diidentifikasi pada tumbuhan Emilia Soncheifolia (Shylish,2005). Khusus

senyawa triterpenoid baik jenis, jumlah maupun kahsiatnya masih perlu penelitian

lebih lanjut.

11

Melihat banyaknya kandungan senyawa kimia tumbuhan singawalang, maka

daya hambat ekstrak etanol daun singawalang terhadap bakteri Mycobacterium

tuberculosis pada penelitian ini diduga merupakan hasil kerja kombinasi dari

berbagai macam senyawa yang terkandung didalam daun tersebut, seperti yang

terjadi pada terapi tuberkulosis saat ini. Manajemen terapi tuberkulosis yang

digunakan saat ini tidak menggunakan monoterapi tetapi merupakan kombinasi

dari berbagai macam obat dengan mekanisme kerja yang berbeda. Tujuan dari

kombinasi ini adalah untuk memperpendek lama terapi, meningkatkan potensi,

menurunkan efek samping dan mencegah terjadinya resistensi. Antituberkulosis

yang digunakan antara lain isoniazid mempunyai cara kerja dengan menghambat

sintesa asam mikolat sehingga pembentukan dinding sel bakteri terganggu,

rifampisin dengan menghambat transkripsi gen , pirazinamid menyebabkan

rusaknya membran plasma dan etambutol menghambat pembentukan dinding sel,

kemungkinan ekstrak etanol daun singawalang mengandung lebih dari satu

macam antibakteri dengan mekanisme kerja yang berbeda. Tetapi tidak menutup

kemungkinan bahwa senyawa antibakteri hanya tunggal sedangkan senyawa

lainnya merupakan bahan untuk meningkatkan aktifitas senyawa antibakteri. Pada

penelitian ini belum dapat diidentifikasi senyawa yang mempunyai khasiat

sebagai anti bakteri. Sehingga perlu dilakukan penelitian untuk identifikasi

senyawa dan isolasi. Dari berbagai isolat tersebut dilakukan uji aktivitas terhadap

bakteri tuberkulosis. Hasil penelitian ini dapat digunakan sebagai dasar untuk

menemukan antibiotika baru terutama antibiotika terhadap M. Tuberculosis yang

sudah resisten terhadap antibiotika yang sudah ada. Hasil penelitian yang didapat

menunjukkan bahwa terjadi penurunan jumlah pertumbuhan koloni

Mycobacterium tuberculosis strain H37RV pada perlakuan dengan ekstrak etanol

daun singawalang berbagai dosis dibandingkan dengan perlakuan dengan DMSO.

Pada penelitian analisis kimia yang telah dilakukan dalam proyek penelitian yang

melibatkan berbagai disiplin ilmu di Haiti, Republik Dominika diketahui bahwa

tanaman singawalang mengandung senyawa triterpenes jenis isoarbinol, asetat,

cinnamate isoarbinol, dan coumarin. Akar dan daunnya mengandung bahan jadian

sulfur, benzthydroxyethyltrisulfide, tritiolaniacine, benzenic, bensaldehide, dan

benzoid acid, yang mempunyai khasiat anti bakteri (Benevides et al,2001).

Diketahui bahwa senyawa benzil thiosulfinates relatif paling kuat aktivitas

antibakterinya, senyawa ini di laporkan memiliki aktivitas mengurangi fluiditas

dari membran, juga dilaporkan memiliki aktivitas inhibisi terhadap sintesis

makromolekul antara lain DNA, RNA, dinding sel dan protein (Kim et

al,2006;Benevides et al.,2001; Musser,1995).

Berdasarkan hasil analisis dan pembahasan dapat disimpulkan sebagai berikut.

Profil pertumbuhan koloni Mycobacterium tuberculosis strain H37 RV pada

perlakuan kontrol , perlakuan dengan DMSO dan perlakuan dengan ekstrak

etanol daun singawalang dalam berbagai dosis (0,25 mg/ml; 0,5 mg/ml; 1 mg/ml)

berbeda dalam jumlah koloni bakteri yang tumbuh. Jumlah pertumbuhan koloni

Mycobacterium tuberculosis strain H37 RV terbanyak terdapat pada perlakuan

kontrol dan berkurang jumlah koloni kuman pada perlakuan dengan ekstrak etanol

daun singawalang dalam dosis 0,25 mg/ml keatas. Tidak terdapat pengaruh antara

dosis ekstrak etanol daun singawalang dengan pertumbuhan koloni

12

Mycobacterium tuberculosis strain H37 RV, Masih belum di peroleh dosis yang

bersifat bakterisid. Saran dari hasil penelitian adalah perlu dilakukan penelitian

lanjutan tentang kandungan bahan aktif serta kadar selanjutnya dapat dilakukan

isolasi. Dari hasil isolasi perlu dilakukan uji ulang daya hambat terhadap berbagai

bakteri

DAFTAR PUSTAKA

Aditama TY, 2006. XDR-TB. Jurnal Tuberkulosis Indonesia Vol. 3 (2). 20-23.

Anekaplantasia, 2008. Singawalang. Si tangguh melawan TBC. http:// aneka

planta. Wordpress.com, dilihat 15 Januari 2012.

Arifa,M.,Roostantia,I.,Nurmawati,F.,2008.Laporan Penelitian Unit Penelitian dan

Pengabdian Masyarakat (UPPM),FK Unair. Daya hambat Ekstrak

singawalang terhadap Mycobacterium tuberculosis.Surabaya.hal.33.

Ayodele, E.T., Hudson, H.R., Ojo, I.A.O., Pianka, M., 2000. Organosulfur

compounds as potential fungicides: the preparation and properties of some

substituted benzyl 2-hydroxyethyl oligosulfides. Phosphorus Sulfur Silicon

and Related Elements 159, 123–142.

Departemen Kesehatan Republik Indonesia, 2007a. Pedoman Nasional

Penanggulangan Tuberkulosis. Diakses dari:

http://www.tbindonesia.or.id/pdf/BPN_2007.pdf.Tanggal 22 Januari 2012.

Gitawati R, Astuti Y, Winarno W, 2005. Herba pegagan (Centella asiatica L.):

Studi pendahuluan efek anti mikobakterium secara invitro. Jurnal bahan

Alam Indonesia vol.4 (2). 286-91.

Katzung BG, 2009. Basic and Clinical Pharmacology, 11th

Ed. The McGraw-Hill

companies, Inc. The United States of America.

Kementerian Kesehatan, 2011.Strategi Nasional Pengendalian TB di Indonesia:

2011- 2014. , Kementerian Kesehatan: Jakarta, Indonesia.

Kim S, Kubec R, Musah RA, 2006.Antibacterial and anti fungal activity of sulfur

containing compound from petiveria alliaceae.J. Ethnopharmacology 104 (1-

2): 188-92.

Kritszki A, 2007.Tuberkulosis in Adult in Tuberculosis 2007, 1st Ed. Editor

Palomino JI,Leaeo SC, Ritacco V. 487-500.

Kubec, R., Kim, S., Musah, R.A., 2003. The lachrymatory principle of Petiveria

alliaceae. Phytochemistry 63, 37–40.

13

Macek K, 2005. Pharmaceutical application of thin layer and paper

chromatograph.3rd ed. New York: Elsivier Publishing Co.p.505-7.

Pramono E,2002. The commercial use of traditional knowledge and medicinal

plants Indonesia. Submitted for multi-stakeholder dialogue on trade,

intellectual property and biological resources in Asia.

Salman MT, Khan RA, Sukha, I, 2008. Invitro anti microbial sensitivity of

Nigella sativa oil against multi drug resistant bactery. http:// openmed.

Nic.in/2916/01/unimed_oil.pdf ( 5 Juli 2011).

Setiawati, W.Murtiningsih,R. Gunaeni,N. dan Rubiati, T.2008.Tumbuhan Bahan

Pestisida Nabati dan Cara Pembuatannya untuk Pengendalian Organisme

Pengganggu Tumbuhan (OPT), Balai Penelitian Tanaman Sayuran.

WHO,2010b. The global plan to stop TB 2011-2015: transforming the fight

towards elimination of tuberculosis.Geneva,Switzerland.

WHO, 2009. Global Tuberculosis Control. Geneva, Switzerland.