pengaruh escalating dose antigen specific …repository.ub.ac.id/8435/1/muhammad hazim bin...

PENGARUH ESCALATING DOSE ANTIGEN SPECIFIC IMMUNOTHERAPY

MENGGUNAKAN SELF-ANTIGEN DOUBLE-STRANDED

DEOXYRIBONUCLEIC ACID (dsDNA) TERHADAP KADAR ANTINUCLEAR

ANTIBODY (ANA) DALAM SERUM PADA MENCIT LUPUS ERITEMATOSUS

SISTEMIK (LES) INDUKSI PRISTANE

TUGAS AKHIR

Untuk Memenuhi Persyaratan

Memperoleh Gelar Sarjana Kedokteran

Oleh:

Muhammad Hazim Bin Zulkurnain

145070108121008

PROGRAM STUDI SARJANA KEDOKTERAN

FAKULTAS KEDOKTERAN

UNIVERSITAS BRAWIJAYA

MALANG

2017

vii

DAFTAR ISI

Judul .................................................................................................................. i

Lembar Pengesahan ......................................................................................... ii

Kata Pengantar .................................................................................................. iii

Abstrak .............................................................................................................. v

Abstract ............................................................................................................. vi

Daftar Isi ............................................................................................................ vii

Daftar Gambar ................................................................................................... x

Daftar Tabel ....................................................................................................... xi

Daftar Lampiran ................................................................................................. xii

Daftar Singkatan ................................................................................................ xiii

BAB 1 PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang ............................................................................ 1

1.2 Rumusan Masalah ....................................................................... 4

1.3 Tujuan Penelitian ......................................................................... 4

1.4 Manfaat Penelitian ...................................................................... 4

BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Lupus Eritematosus Sistemik ....................................................... 6

2.2 Antinuclear Antibody (ANA) ......................................................... 10

2.3 Self-Antigen dsDNA ..................................................................... 12

2.4 Toleransi Sistem Imun ................................................................. 13

2.5 Escalating Dose Antigen-Specific Immunotherapy ....................... 13

viii

2.6 Enzyme-linked Immunosorbent Assaay (ELISA) .......................... 15

BAB 3 KERANGKA KONSEP DAN HIPOTESIS PENELITIAN

3.1 Kerangka Konsep Penelitian ........................................................ 16

3.2 Penjelasan Kerangka Konsep ...................................................... 17

3.3 Hipotesis Penelitian...................................................................... 18

BAB 4 METODE PENELITIAN

4.1 Rancangan Penelitian .................................................................. 19

4.2 Sampel Penelitian ........................................................................ 21

4.3 Variabel Penelitian ....................................................................... 22

4.4 Lokasi dan Waktu Penelitian ........................................................ 22

4.5 Alat dan Bahan Penelitian ............................................................ 23

4.6 Definisi Operasional ..................................................................... 24

4.7 Prosedur Penelitian ...................................................................... 24

4.8 Analisis Data ................................................................................ 27

BAB 5 HASIL PENELITIAN DAN ANALISIS DATA

5.1 Hasil Penelitian ............................................................................ 28

5.2 Analisis Data ................................................................................ 30

BAB 6 PEMBAHASAN .............................................................................. 33

BAB 7 KESIMPULAN DAN SARAN

7.1 Kesimpulan .................................................................................. 38

ix

7.2 Saran ........................................................................................... 38

DAFTAR PUSTAKA ................................................................................... 39

LAMPIRAN ................................................................................................. 44

v

ABSTRAK

Zulkurnain, Muhammad Hazim. 2017. Pengaruh Peningkatan Dosis Antigen

Specific Immunotherapy Menggunakan Self-antigen dsDNA

Terhadap Kadar Antinuclear Antibody (ANA) Dalam Serum Pada

Mencit Lupus Eritematosus Sistemik (LES) Induksi Pristane.

Tugas Akhir, Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya. Dosen

pembimbing: (1) Prof. Dr. dr. Kusworini, M.Kes, Sp.PK, (2) dr. Desy

Wulandari, Sp.A, M. Biomed

Tujuan dari penelitian ini adalah untuk mengetahui pengaruh escalating

dose self-antigen immunotherapy menggunakan self-antigen dsDNA terhadap

regulasi sistem imun dengan mengukur kadar ANA pada mencit lupus induksi

pristane. 20 mencit Balb/C betina berusia 6-8 minggu dibagi menjadi 2 kelompok:

16 mencit mendapat injeksi tunggal pristane intraperitoneal (i.p.) 0,5 cc untuk

induksi lupus dan 4 mencit sebagai kontrol. Dimulai pada 12 minggu setelah

injeksi, 12 mencit yang diinduksi oleh pristane dibagi menjadi tiga kelompok

berdasarkan dosis dsDNA yang diberikan secara i.p. selama tiga minggu:

Kelompok A (0,005 μg, 0,05 μg, 0,5 μg), kelompok B (0,05 μg, 0,5 μg, 5 μg) dan

kelompok C (0,5 μg, 5 μg, 50 μg). Dosisnya ditingkatkan sepuluh kali tiap

minggu. dsDNA dikomplekskan dengan polietilenimin polimer kationik (PEI) 2

sebelum diinjeksikan. Sebanyak 20 mencit Balb/C dianalisis untuk serum kadar

antinuclear antibody (ANA) menggunakan metode enzyme-linked immunosorbent

assay (ELISA). Kadar ANA pada kelompok yang diberikan injeksi dsDNA

mengalami penurunan tetapi tidak ada perbedaan yang signifikan dengan

kelompok kontrol negatif. Kesimpulannya, meskipun hipotesis tidak terbukti

secara statistik, masih terdapat kecenderungan penurunan pada kadar ANA.

Selain itu, beberapa kelemahan pada penelitian ini juga perlu diperbaik seperti

lama durasi induksi lupus serta terapi yang terlalu singkat menyebabkan daya

desensitisasi self-antigen dsDNA yang tidak optimal, dan pemilihan tehnik

sampling yang kurang tepat.

Kata Kunci : LES, self-antigen dsDNA, ANA.

vi

ABSTRACT

Zulkurnain, Muhammad Hazim. 2017. The Effect Of Escalating Dose Antigen

Specific Immunotherapy Using Self-Antigen dsDNA towards

Level of Antinuclear Antibody (ANA) In Pristane Induced

Systemic Lupus Erythematosus (SLE) Mice Model’s Serum. Final

Assignment, Faculty of Medicine, Brawijaya University. Supervisors:

(1) Prof. Dr. dr. Kusworini, M.Kes, Sp.PK, (2) dr. Desy Wulandari,

Sp.A, M. Biomed

The aim of this study was to develop a novel therapeutic method of

escalating dose self-antigen immunotherapy using self-antigen dsDNA against

immune system regulation by measuring ANA levels in pristane-induced lupus

mice model. 20 female Balb/C mice, 6–8 weeks old were divided into 2 groups:

16 mice received a single intraperitoneal (i.p.). injection of 0.5 cc pristane for

lupus induction and 4 mice as healthy controls. Starting at 12 weeks after

injection, 12 pristane-induced lupus mice were divided into three groups based

on doses of dsDNA received intraperitoneally for three weeks: Group A (0,005

µg, 0,05 µg, 0,5 µg), group B (0,05 μg, 0,5 μg, 5 μg) and group C (0,5 μg, 5 μg,

50 μg). The doses would be increased ten times every week. dsDNA were

complexed with the cationic polymer polyethylenimine (PEI)2 before injection. A

total of 20 Balb/C mice were analyzed for level of antinuclear antibody (ANA) in

serum using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Level of ANA in the

serum decreased unsignificantly. In conclusion, although the hypothesis is not

proven statisitically, however level of ANA still shows a decreased trend in this

study. Besides, there are some weaknesses that are need to be fixed in this

study such as the duration of lupus induction and the treatments given that was

too short causing desensitization with self-antigen dsDNA is not optimal, and the

imprecise sampling technique used.

Keywords: SLE, self-antigen dsDNA, ANA.

1

BAB 1

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Lupus Eritematosus Sistemik (LES) atau lebih dikenal dengan Systemic

Lupus Erythematosus (SLE) merupakan penyakit autoimun kronis dan kompleks

(Zhu dan Mohan, 2007). Terdapat banyak bukti bahwa patogenesis LES bersifat

multifaktor yang melibatkan faktor lingkungan, genetik, dan hormonal (Mok dan

Lau, 2003). Penyakit ini terutama menyerang wanita usia reproduktif dengan

rasio wanita dibanding pria adalah 8:1 hingga 9:1 (Mok dan Lau, 2003; Zhu dan

Mohan, 2007). Data terakhir yang ada di Indonesia menunjukkan bahwa

penderita LES di Indonesia mempunyai harapan hidup yang masih rendah yakni

5 tahun 70% dan 10 tahun 50% (Kalim, 2000).

Patogenesis LES masih belum diketahui dengan jelas, namun telah

dibuktikan adanya gangguan toleransi sistem imun. Toleransi imunologis adalah

salah satu mekanisme normal yang dimiliki oleh sistem imun. Secara normal

sistem imun dapat bereaksi terhadap berbagai macam jenis mikroba (non self-

antigen) namun tidak bereaksi melawan antigen yang berasal dari tubuh sendiri

(self-antigen). Hal ini dikarenakan sel limfosit memiliki kemampuan untuk

mengenali self-antigen yang didapatkannya saat proses menuju maturasi.

Mekanisme ini sangat penting dalam menjaga keseimbangan sistem tubuh.

Apabila mekanisme ini gagal, maka akan terjadi suatu autoimunitas, yaitu sistem

imun dari individu dapat menyerang sel dan jaringan dari individu itu sendiri.

Penelitian mengenai induced tolerance telah banyak dilakukan untuk

menemukan cara yang aman mentoleransi pasien autoimun terhadap self-

2

antigen mereka. Hal ini biasanya terlibat memberikan serangkaian panjang

suntikan formulasi khusus alergen atau self-antigen untuk mengembalikan

regulasi imun (Abbas et al., 2014).

Abnormalitas toleransi sistem imun ini disebabkan adanya antinuclear

antibody (ANA) yang berlebihan di tubuh. ANA adalah antibodi yang malfungsi

mengenali protein normal sebagai antigen. Kebanyakan ANA menyerang asam

nukleat atau protein yang terkait dengan asam nukleat. Pada LES, antigen yang

paling dominan adalah nukleosom khususnya dsDNA. Fungsi nukleosom adalah

untuk menghasilkan struktur kromatin dan penting dalam fungsi pemadatan

deoxyribonucleic acid (DNA) dalam sel inti (Sangha, 2000).

Terapi standar untuk LES pada saat ini dengan menggunakan obat-

obatan imunosupresan dan steroid ternyata masih belum menunjukkan hasil

yang memuaskan karena pemberian steroid yang panjang dapat menimbulkan

banyak komplikasi terhadap pasien LES (Guiducci et al., 2010). Pengobatan

terbaru saat ini yang masih dikembangkan adalah dengan menggunakan agen

biologis yang telah menunjukkan hasil lebih baik. Tetapi, obat ini masih tidak

terjangkau oleh sebagian besar pasien LES di Indonesia. Oleh karena itu,

diperlukan suatu metode pengobatan maupun pencegahan baru yang dapat

menginduksi dan memperbaiki regulasi sistem imun terhadap self-antigen yang

boleh meminimalkan efek samping dan komplikasi pengobatan konvensional

serta memperbaiki kondisi klinis pasien LES secara maksimal (Handono et al.,

2013).

Penelitian terdahulu dalam pengembangan metode terapi escalating

dose specific antigen immunotherapy pada tikus model autoimun multiple

sclerosis dengan pemberian self-antigen sel schwan sendiri yaitu myelin basic

3

protein (MBP) secara bertahap menunjukkan penurunan sitokin proinflamasi

yang bermakna dan menunjukkan kembali mekanisme toleransi (Boggs et al.,

2011). Oleh karena itu, telah timbul pertanyaan apakah self-antigen dsDNA dapat

digunakan sebagai imunoterapi pada penyakit autoimun LES. Self-antigen

dsDNA yang menjadi penyusun kompleks imun dapat memicu aktivasi sel

plasmasitoid dendritik pada pasien LES sehingga terbentuk autoantibodi dsDNA.

Normalnya, self-antigen dsDNA bersifat non-immunogenic dan didegradasi ketika

berada pada lingkungan ekstraselular. Namun, ketika self-dsDNA tergabung

dalam kompleks yang terdiri dari human neutrophil peptide (HNP) dan human

cathelicidin (LL37), self-antigen dsDNA ini memiliki kemampuan untuk

mengakses kompartemen intraselular dari plasmasitoid sel dendritik dan memicu

aktivasi toll-like receptor (TLR7) dan (TLR9) serta membuat sel B autoreaktif

membentuk autantibodi. Meskipun mekanisme ini masih belum bisa dijelaskan

secara tepat (Lande et al., 2011).

Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui pengaruh escalating dose

self-antigen immunotherapy menggunakan self-antigen dsDNA terhadap regulasi

sistem imun dengan mengukur kadar ANA pada mencit lupus induksi pristane.

4

1.2 Rumusan Masalah

Bagaimana pengaruh escalating dose self-antigen immunotherapy

menggunakan self-antigen dsDNA terhadap mencit lupus induksi pristane?

1.3 Tujuan Penelitian

1.3.1 Tujuan Umum

Mengetahui pengaruh escalating dose self-antigen

immunotherapy menggunakan self-antigen dsDNA terhadap regulasi

sistem imun pada mencit lupus induksi pristane.

1.3.2 Tujuan Khusus

Mengetahui pengaruh escalating dose self-antigen

immunotherapy menggunakan self-antigen dsDNA terhadap kadar ANA

pada mencit lupus induksi pristane.

1.4 Manfaat Penelitian

1.4.1 Manfaat Akademik

1. Dapat menambah pengetahuan tentang patogenesis penyakit

LES terhadap pemberian self-antigen dsDNA.

2. Mengetahui pengembangan metode terapi escalating dose

specific antigen immunotherapy sebagai metode pengobatan

maupun pencegahan baru.

3. Memberi kontribusi dalam ilmu kedokteran tentang terapi self-

antigen dsDNA terhadap penyakit LES.

5

1.4.2 Manfaat Praktis

1. Mewujudkan kesadaran pada masyarakat bahwa harapan

hidup penderita LES di Indonesia masih rendah.

2. Mengembangkan dan menemukan metode pengobatan

maupun pencegahan baru untuk penyakit LES dengan

menggunakan self-antigen dsDNA.

3. Menemukan metode pengobatan maupun pencegahan baru

untuk penyakit LES dengan harga yang lebih terjangkau.

6

BAB 2

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Lupus Eritematosus Sistemik

2.1.1 Definisi

Lupus eritematosus sistemik (LES) atau lebih dikenal dengan

systemic lupus erythematosus (SLE) merupakan penyakit inflamasi

autoimun kronis dengan etiologi yang belum diketahui serta manifestasi

klinis dan perjalanan penyakit serta dengan prognosis yang sangat

beragam (Cervera et al., 2003). Faktor lingkungan, genetik, dan hormonal

diduga berperan penting dalam patofisiologi LES (Tassiulas dan

Boumpas, 2009). Penyakit ini terutama menyerang wanita usia reproduktif

dengan rasio wanita dibanding pria adalah 8:1 hingga 9:1 dengan angka

kematian yang cukup tinggi (Mok dan Lau, 2003; Zhu dan Mohan, 2007).

Prevalensi LES juga bervariasi antara 12,5 hingga 39 per 100.000

populasi. Begitu insidennya bervariasi antara 1,8 sampai 7,6 kasus per

100.000 orang per tahun. Secara keseluruhan, prevalensi dan insiden

lebih tinggi pada wanita dibanding pria (Rus et al., 2007). Pada tahun

2002 di RSUP Cipto Mangunkusumo (RSCM) Jakarta, didapatkan 1.4%

kasus LES dari total kunjungan pasien di poliklinik Reumatologi Penyakit

Dalam, sementara di Rumah Sakit Hasan Sadikin Bandung terdapat 291

pasien LES atau 10.5% dari total pasien yang berobat ke poliklinik

reumatologi selama tahun 2010 (Kasjmir et al., 2011). Selain itu, dari

penelitian sebelum ini telah menunjukkan bahwa penderita LES di

7

Indonesia mempunyai harapan hidup yang masih rendah yakni 5 tahun

70% dan 10 tahun 50% (Kalim, 2000).

2.1.2 Patofisiologi dan Aktivitas Respon Imun pada Pasien LES

Meskipun penyebab LES masih belum dipahami dengan jelas,

akan tetapi beberapa ahli menyatakan bahwa terdapat beberapa faktor

yang dapat mempengaruhi terjadinya penyakit ini, meliputi paparan

eksternal yang berasal dari sinar ultraviolet, obat, dan lingkungan, serta

internal yang dikarenakan oleh genetik dan hormonal. (Mok dan Lau,

2003).

Patogenesis penyakit ini juga masih belum jelas namun terdapat

bukti kelainan imunologis sabagai dasar utama dengan adanya produksi

autoantibodi. Autoantibodi pada LES dapat menyerang self-molecule atau

self-antigen yang ada di dalam tubuh. Berbagai macam autoantibodi saat

ini yang sudah ditemukan pada pasien LES, antaranya adalah antinuclear

antibody (ANA) yang sangat sering ditemukan pada autoantibodi pasien

LES. Autoantibodi lain yang juga di temukan adalah anti-dsDNA, anti-

Smith, anti-Ro, anti-La dan anti-nukleosom (Wallace, 2007).

Autoantibodi yang terbentuk akan menyerang self-antigen yang

terpapar ke ekstraseluler. Penyebab terpaparnya antigen-antigen ke

ekstraseluler disebabkan oleh terjadinya gangguan proses pembersihan

dari apoptosis. Sel yang secara normal mengalami apoptosis akan

dieliminasi dengan cepat oleh sistem imun sehingga tidak menginduksi

terjadinya respon imun atau inflamasi. Pada LES, ditemukan gangguan

proses pembersihan dari sel yang mengalami apoptosis sehingga bagian

8

dari sel terapoptosis yang disebut apoptotic bodies banyak ditemukan

pada jaringan tubuh pasien LES (Shao dan Cohen, 2011).

Apoptotic bodies ini mengandung berbagai macam self-antigen

dan diketahui dapat menginduksi sistem imun dan autoantibodi sehingga

dapat membentuk kompleks imun. Kompleks imun yang terbentuk diduga

merupakan inti dari imunopatologis pada LES. Pembersihan kompleks

imun oleh sistem fagosit-makrofag juga mengalami gangguan sehingga

dapat menghambat proses eliminasi kompleks imun dari sirkulasi maupun

jaringan, hal ini mengakibatkan terjadinya penumpukan kompleks imun

pada jaringan ginjal, kulit, pleksus koroid di otak dan jaringan lainnya

yang dapat mengakibatkan terjadinya kerusakan jaringan secara sistemik.

Sel yang terapoptosis akan terakumulasi di dalam tubuh sehingga dapat

menginduksi sel T autoreaktif (Wallace, 2007).

2.1.3 Manifestasi Klinis

LES merupakan penyakit autoimun yang tidak mudah terdiagnosis

karena tingkat kompleksitas yang tergolong tinggi, memiliki banyak gejala

dan gejala tersebut timbul secara perlahan. Penderita LES seringkali

memiliki gejala yang tidak spesifik seperti demam, keletihan dan

kerontokan pada rambut. Penderita juga dapat mengalami rasa panas di

dada dan nyeri perut (Duarte et al., 2011).

Manifestasi klinis pada setiap pasien LES juga bervariasi dan

sering mengalami overlap dengan gejala penyakit lain seperti

skleroderma serta artritis reumatoid. Manifestasi klinis LES juga dapat

digolongkan menjadi beberapa golongan, yaitu gejala mucocutaneous:

acute cutaneous lupus, chronic atau discoid lupus, lupus panniculitus,

9

lupus pernio, subacute cutaneous lupus, dan tumid lupus. Gejala

musculoskeletal: artritis, myositis dan avascular bone necrosis. Masalah

ginjal yang melibatkan 40 – 70% pada pasien LES. Gejala kardiovaskular:

demam, dispnea, takikardia dan gagal jantung yang dapat ditemui >80%

pada pasien LES. Gejala hematologi: anemia, leukopenia,

trombositopenia, dan sindroma antifosfolipid.

2.1.4 Diagnosis

Diagnosis LES dapat ditegakkan berdasarkan gambaran klinik dan

laboratorium. American College of Rheumatology (ACR) pada tahun

1982, mengajukan 11 kriteria untuk klasifikasi LES, dimana diagnosis

dapat ditegakkan apabila minimal 4 kriteria diagnosis. Kriteria tersebut

adalah:

Tabel 2.1. Kriteria Diagnosis LES Berdasarkan ACR (Tsokos, 2011)

KRITERIA DEFINISI

Malar rash Ruam pada pipi dan hidung, sering berbentuk kupu-kupu

Discoid rash Ruam yang tampak kemerahan, timbul, plak bulat

Fotosensitivitas Reaksi terhadap matahari yang menyebabkan ruam timbul atau memburuk

Ulkus oral Luka pada mulut

Arthritis Nyeri sendi dan bengkak pada 2 atau lebih sendi

Serositis Pleuritis atau perikarditis

Kelainan ginjal Proteinuria >0.5g per hari atau cellular cast yang menetap pada urin

Kelainan neurologik

Kejang atau psikosis

Kelainan darah Anemia dengan retikulositosis, leukopenia, limfopenia, atau trombositopenia

Kelainan imunologik

Positif pada anti dsDNA, antigen Smith (anti Sm) atau antibodi antifosfolipid

Antibodi antinuclear

Positif pada immunoflurescence

10

2.2 Antinuclear Antibody (ANA)

2.2.1 Peran ANA dalam Regulasi Respon Imun dan Patogenesis

LES

Deteksi ANA dengan indirect immune-fluorescence (IIF) staining

telah digunakan lebih dari 60 tahun untuk menegakkan diagnosis

autoimun. Prevelensi ANA pada LES sangat tinggi, walaupun ANA juga

dapat terdeteksi pada pasien dengan penyakit autoimun lain, malignancy,

infeksi dan juga pada kontrol sehat (Dema dan Charles, 2016).

Beberapa ANA yang dapat menembus sel dan mengikat di sel ini

bukanlah mekanisme utama yang menjelaskan patologi yang diamati

pada lupus nefritis. Begitu antibodi reaktif kembali menemukan jalan ke

glomerulus, terdapat 2 jalur efektor utama yang dapat menyebabkan

kerusakan: 1. Melalui aktivasi komplemen, 2. Melalui kemampuan antibodi

IgG untuk mengikat reseptor Fc, sehingga merekrut mekanisme efektor

seluler yang lain (Ehrenstein, 1999).

LES juga ditandai penyimpangan sistem kekebalan yang

melibatkan sel B, sel T, dan sel monosit lainnya, yang mengaktivasi sel B

poliklonal sehingga terjadi peningkatan jumlah sel yang dapat

menghasilkan antibodi serta pembentukan autoantibodi dan kompleks

imun. Antigen lingkungan dan self-antigen akan berikatan dengan antigen

presenting cells (APCs) serta permukaan sel B. Baik APCs dan sel B akan

mengubah antigen menjadi peptida, kemudian mempresentasikannya

kepada molekul HLA pada pemukaan sel T. Sel T yang diaktifkan akan

merangsang sel B untuk menghasilkan autoantibodi patogen. (Mok dan

Lau, 2003).

11

Gambar 2.1 Patogenesis LES (Crampton et al., 2014)

Produksi autoantibodi dari sel plasma dapat memicu respon imun yang lain sehingga terjadi kerusakan jarigan pada organ target yang merupakan salah satu manifestasi daripada penyakit LES.

Presentasi antigen asing oleh molekul major histocompatibility complex

(MHC) mengaktifkan sel T. Sel ini kemudian membantu sel B mengalami

autoreaktif, maturasi dan diferensiasi menjadi sel plasma yang akan

memproduksi kadar autoantibodi yang tinggi. Autoantibodi ini akan membentuk

kompleks imun dengan mengikat self-antigen yang melibatkan reseptor Fc.

Pengikatan ini mengakibatkan peradangan dan kerusakan melalui rekruitmen sel

inflamasi ke jaringan. Sel apoptosis yang tidak dibersihkan dengan sempurna

akan mempresentasikan self-antigen yang baru dan memicu autoreaktif yang

lebih lanjut. Selain itu, faktor lingkungan seperti sinar UV dan infeksi virus juga

berkontribusi pada proses yang menginduksi sekresi IFN-I dan sitokin lain

melewati TLR pada permukaan sel. Hal ini juga dapat mendukung kerusakan

jaringan lebih lanjut.

12

2.3 Self-antigen dsDNA

Penelitian terdahulu yang dilakukan Christense et al. menunjukkan bahwa

self-antigen dsDNA yang menjadi penyusun kompleks imun dapat memicu

aktivasi plasmacytoid sel dendritik pada pasien LES sehingga terbentuk

autoantibodi dsDNA. Normalnya, self-antigen dsDNA bersifat non-immunogenic

dan didegradasi ketika berada pada lingkungan ekstraselular. Namun, ketika self-

dsDNA tergabung dalam kompleks imun yang terdiri dari HNP (Human

Neutrophil Peptides) dan LL37 (Human Cathelicidin), self-antigen dsDNA ini

memiliki kemampuan untuk mengakses kompartemen intraselular dari

plasmasitoid sel dendritik dan memicu aktivasi Toll-like receptor seperti TLR7

dan TLR9 serta menyebabkan sel B autoreaktif dan membentuk autantibodi.

Meskipun mekanisme ini masih belum bisa dijelaskan secara tepat (Lande et al.,

2011). Self-dsDNA menjadi imunogenik dan memicu TLR9 di pDCs (plasmacyoid

dendritic cells) dengan cara membentuk kompleks dengan HNP dan peptida

LL37 antimikroba (Zanetti, 2004). DsDNA, HNP dan LL37 dirilis oleh neutrofil

yang mengalami NETosis dan melepaskannya dalam jumlah yang banyak pada

ruang ekstraselular dalam bentuk seperti jaring yang disebut dengan NET

(Neutrofil Extracellular Trap) dan terekspresi tinggi dalam darah pasien SLE

(Bennett et al., 2003). HNP dan LL37 adalah peptida yang diperlukan self-dsDNA

untuk terlindungi dari degradasi ekstraseluler (Lande et al., 2007). NET yang

dirilis oleh neutrofil dalam jumlah yang banyak pada pasien LES tersebut

langsung mengaktifkan pDC untuk menghasilkan IFN-α (interferons alpha) dan

menginduksi terbentuknya autoantibodi (Brinkmann dan Zychlinsky, 2007).

13

2.4 Toleransi Sistem Imun

Toleransi imunologis adalah salah satu mekanisme normal yang dimiliki

oleh sistem imun. Secara normal sistem imun dapat bereaksi terhadap berbagai

macam jenis mikroba (non self-antigen) namun tidak bereaksi melawan antigen

yang berasal dari tubuh sendiri (self-antigen). Hal ini dikarenakan sel limfosit

memiliki kemampuan untuk mengenali self-antigen yang didapatkannya saat

proses menuju maturasi. Mekanisme ini sangat penting dalam menjaga

keseimbangan sistem tubuh. Apabila mekanisme ini gagal, maka akan terjadi

suatu autoimunitas, yaitu sistem imun dari individu dapat menyerang sel dan

jaringan dari individu itu sendiri. Penelitian tentang induced toleransi dewasa ini

banyak dilakukan untuk menemukan cara yang aman untuk mentoleransi pasien

autoimun terhadap self-antigen mereka. Hal ini biasanya terlibat memberikan

serangkaian panjang suntikan formulasi khusus alergen atau self-antigen untuk

mengembalikan regulasi imun (Abbas et al., 2014).

2.5 Escalating Dose Antigen-Specific Immunotherapy

Escalating dose antigen-specific immunotherapy adalah metode terapi

untuk mensupresi respon imun melalui mekanisme toleransi dengan cara

menginjeksikan self-antigen yang menstimulus pembentukan autoantibodi

dengan dosis yang bertahap hingga memunculkan efek toleransi. Efek-efek yang

merugikan dari yang paling ringan seperti gatal-gatal sampai yang paling berat,

syok anafilaksis dapat dihindari dengan pemberian dosis yang bertahap dan

meningkat (Lee et al., 2008).

Terapi penyakit autoimun adalah untuk membatasi respon imun terhadap

self-antigen tanpa menurunkan kemampuan sel imun untuk mengeliminasi

antigen asing (non-self). Sel regulator pada respon imun yaitu Treg yang

14

mensupresi sel T yang autoreaktif dapat diinduksi dengan injeksi self-antigen

dengan dosis yang bertahap (Sakaguchi, 2000).

Metode yang berpeluang besar untuk terapi penyembuhan penyakit

autoimun dan meskipun metode ini masih sedikit dilakukan penelitian yaitu

dengan menggunakan metode escalating dose antigen-specific immunotherapy.

Pengobatan autoimun hanya bersifat mengontrol manifestasi klinis sehingga

membuat banyak peneliti bidang imunologi yang mengembangkan metode ini.

Penelitian yang dilakukan Seddon dan Mason pada penyakit autoimun thyroiditis

dengan menginjeksi self-antigen thyroid ternyata mampu menginduksi Treg.

Penelitian lain yang dilakukan oleh Thorstenson menunjukkan bahwa baik

pemberian oral dan injeksi antigen ovalbumin mampu menginduksi Treg

(Sakaguchi, 2000).

Escalating dose antigen-specific immunotherapy lain yang telah

dikembangkan adalah terhadap autoimmune multiple sclerosis. Injeksi subkutan

myelin basic protein mampu menginduksi aktivasi Treg untuk sekresi sitokin IL-

10 dan TGF-β (transforming growth factor beta) yang bekerja mensupresi sel

imun autoreaktif. Penggunaan metode terapi ini terhadap penurunan progesivitas

penyakit LES belum pernah dilakukan. Mengingat banyaknya sitokin yang

mengalami kelainan dan banyak berperan dalam patogenesis LES, maka perlu

dieksplorasi lebih lanjut lagi mengenai penggunaan metode escalating dose

antigen-spesific immunotherapy menggunakan self-antigen dsDNA dalam

menurunkan progresivitas dari penyakit LES (Rifa’I et al., 2004).

15

2.6 Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA)

Tes ANA adalah untuk mengidentifikasi antibodi yang terpresentasi di

dalam serum yang bergabung dengan self-antigen di dalam sel inti. Kebanyakan

antibodi ini adalah IgG, akan tetapi IgM dan IgA juga dapat terdeteksi. Metode

ELISA melibatkan interaksi antara antibodi yang dipresentasi di dalam serum

serta antigen yang dipaparkan (Al-Zoughi, 2014).

ELISA merupakan tes skrining yang ideal karena sensitivitas yang dapat

mencapai 95% serta kesederhanaan prosedur pengujian. Hasil negatif pada

tahun sebelumnya biasanya berhubungan dengan adanya autoantibodi lain

seperti anti SSA (anti-Sjogren’s Syndrome A) dan anti-ribosomal P protein.

Walaupun, spesifisitas ELISA adalah rendah karena ANA juga dapat ditemukan

positif pada kondisi patologis lain seperti skleroderma, polimiositis, artritis

reumatoid serta di orang sehat. Namun, pada kondisi patologis lain dan orang

sehat cenderung nilainya lebih rendah (

16

BAB 3

KERANGKA KONSEP PENELITIAN

3.1 Kerangka Konsep Penelitian

Gambar 3.1 Kerangka Konsep Penelitian

Keterangan

Variabel yang diukur

Variabel yang tidak diukur

Menginduksi

Menghambat

Menginduksi bertingkat

Sel B

Aktivitas Sel Dendritik

Sel Treg ↑

Lingkungan

Defek klirens kompleks imun

Kerusakan Jaringan & Inflamasi

Inflamasi Organ

SLE

Escalating Dose Immunotherapy

ANA

Sel Plasma

Hormonal Genetik

17

3.2 Penjelasan Kerangka Konsep

Defek pada klirens imun komplek akan mengakibatkan sel-sel imun tidak

bisa membersihkan serpihan-sepihan antigen secara optimal. Ditambah lagi

dengan kondisi lingkungan yang mendukung terjadi nya proses keradangan

(defek genetik) sehingga memperparah kerusakan jaringan dan inflamasi

(Tsokos et al., 2016).

Pada mencit LES terjadi pembentukan autoantibodi yang berlebihan.

Autoantibodi ini menyerang self-antigen yang dapat ditemui pada inti sel,

sitoplasma, dan permukaan sel, serta terdapat molekul yang larut seperti IgG

(immunoglobulin G) dan faktor koagulasi. Anti Sm (antigen Smith) merupakan

small nuclear ribonucleoprotein (snRNP) dan kaya dengan molekul uridine RNA

yang bereaksi dengan kelompok core protein pada snRNP lain. Selain anti Sm,

terdapat anti DNA yang berikatan dengan asam nukleat yang didapatkan pada

molekul DNA. Dengan adanya anti DNA, antibodi ini dapat berikatan dengan: 1)

beberapa potongan DNA yang ada pada membran inti epitel yang terletak pada

basal glomerulus, 2) histon, 3) antigen glomerulus seperti C1q (komplemen),

nukleosom, sulfat heparin dan laminin. Ikatan anti DNA dengan antigen diatas

dapat menginduksi peradangan lokal oleh pengaktifan komplemen (Mok dan Lau,

2003). Selain anti DNA, terdapat patogenik autoantibodi anti dsDNA berasal dari

sel B autoreaktif naif yang terbentuk oleh aktivasi sel poliklonal B dan anti dsDNA

ini selanjutnya sebagai antigen independen. Selain itu, pada pasien LES juga

terjadi kelainan di toleransi sel B yang disebabkan oleh akumulasi sel B

autoreaktif naif pada fase sel B matur. Sel B naif dapat berkembang menjadi IgM

memory B cells melalui mekanisme antigen dependen dan IgG expressing cells

melalui mekanisme antigen independen. Meskipun pada pasien LES terjadi

18

penurunan IgM memory B cells, ternyata terdapat peningkatan kadar BAFF (B

cell activating factor), sitokin interleukin 10 (IL-10) dan interleukin 21 (IL-21)

(Zhang et al., 2008).

Proses desensitasi adalah dengan cara memaparkan antigen dari dosis

yang paling kecil hingga dosis yang paling besar dengan harapan akan terjadi

toleransi. Kadar dsDNA antibodi pada pasien lupus sangat tinggi, hal ini menjadi

landasan bahwa self-antigen yang diserang adalah self-antigen dsDNA. Self-

antigen dsDNA menjadi penyebab reaksi inflamasi pasien lupus terjadi secara

sistemik karena setiap bagian tubuh tesusun oleh DNA. Saat self-antigen dsDNA

diinjeksikan secara berulang dan bertahap dengan dosis yang bertingkat maka

akan ada perubahan dari sel dendritik. Sel dendritik akan mengaktikan IDO

(Indoleamin 2,3 dioxygenase). Aktivasi IDO menyebabkan meningkatnya

metabolisme triptofan pada APC (antigen presenting cell). Meningkatnya IDO

tersebut mengakibatkan kurangnya ketersediaan triptofan sehingga sel T CD4

mengalami starvasi. Karena triptofan sangat penting untuk aktivasi sel T CD4

dan menjaga survival sel T efektor maka kekurangan ketersediaan triptofan

dapat memicu timbulnya apoptosis sel T efektor. Ketika sel T mengalami

apoptosis maka tidak akan ada rangsangan pada sel B untuk diferensiasi

menjadi sel plasma dan akibatnya pembentukan ANA menurun sehingga tidak

terjadi reaksi imun. (Burton et al., 2014)

3.3 Hipotesis Penelitian

Dengan pemberian escalating dose self-antigen immunotherapy

menggunakan self-antigen dsDNA dapat memperbaiki regulasi sistem imun

dengan menurunkan kadar ANA pada mencit lupus induksi pristane.

19

BAB 4

METODE PENELITIAN

4.1 Rancangan Penelitian

Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental murni (true

experimental) laboratorik dengan menggunakan desain post-test only controlled

group design. Penelitian ini dilakukan secara in vivo dengan menggunakan

mencit Balb/C sebagai subjek penelitian yang sebelumnya diinjeksikan pristane

untuk induksi LES dan kemudian diinjeksikan self-antigen dsDNA dalam berbagai

dosis secara berurutan dan bertahap.

Pengelompokan dan perlakuan hewan coba dilakukan secara acak

dengan metode simple random sampling dan pembagian kelompok didasarkan

atas pembagian pemberian perlakuan self-antigen dsDNA. Berikut ini merupakan

pembagian kelompok perlakuan :

Kelompok K- : kelompok kontrol negatif (mencit tanpa injeksi pristane

dan tanpa injeksi self-antigen dsDNA).

Kelompok K+: Kelompok kontrol positif (mencit yang diinjeksi pristane

0.5 cc dan tanpa injeksi self-antigen dsDNA).

Kelompok A : Mencit yang diinjeksi pristane 0.5 cc dan self-antigen

dsDNA konsentrasi I (0,005 μg, 0,05 μg, 0,5 μg)

selang 1 minggu.

Kelompok B : mencit yang diinjeksi pristane 0.5 cc dan self-antigen

dsDNA konsentrasi II (0,05 μg, 0,5 μg, 5 μg) selang 1

minggu.

20

Kelompok C : mencit yang diinjeksi pristane 0.5 cc dan self-antigen

dsDNA konsentrasi III (0,5 μg, 5 μg, 50 μg) selang 1

minggu.

Gambar 4.1 Rancangan Penelitian

Mencit Balb/C Betina, usia 6-8 minggu

Kelompok Kontrol (-)

Kelompok Kontrol (+)

Kelompok A Perlakuan 1

Kelompok B Perlakuan 2

Kelompok C Perlakuan 3

Injeksi Pristane 0,5 cc secara intraperitoneal, ditunggu 12 minggu

Pembedahan dan pengambilan serum pada minggu ke-17

Perlakuan 1 Pemberian

dsDNA dengan konsentrasi I

(0.005 μg, 0.05 μg, 0.5 μg )

Selang 1 minggu


dsDNA dengan konsentrasi II

(0.05 μg, 0.5 μg, 5 μg)

Selang 1 minggu


dsDNA dengan konsentrasi III (0.5 μg, 5 μg,

50 μg) Selang 1 minggu

Pengukuran kadar ANA dalam serum menggunakan metode

ELISA

21

4.2 Sampel Penelitian

Sampel penelitan ini adalah mencit strain Balb/C diperoleh dari

LPPT Universitas Gadjah Mada Yogyakarta yang telah bersertifikasi. Mencit

diinjeksikan vaksin self-antigen dsDNA lalu dibedah pada akhir perlakuan untuk

dinilai kadar ANA. Penelitian akan dilakukan setelah mendapatkan persetujuan

dari Komisi Etik Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya.

Berikut ini merupakan kriteria inklusi mencit subjek penelitian ini :

1. Mencit strain Balb/C betina.

2. Mencit bewarna bulu putih mengkilat, sehat, bergerak aktif, dan tingkah laku

normal.

3. Umur 6-8 minggu.

4. Berat badan rata-rata 25-30 gram.

Berikut ini adalah kriteria eksklusi subjek penelitian :

1. Mencit yang selama penelitian tidak mau makan.

2. Mencit yang kondisinya menurun atau mati selama penelitian berlangsung.

Jumlah sampel mencit yang digunakan dalam penelitian ini dihitung

menggunakan rumus oleh Andriani (2008) :

n (p – 1) ≥ 15 n : jumlah ulangan p : jumlah perlakuan

Penelitian ini terdapat lima perlakuan sebagaimana yang telah disebutkan

sebelumnya. Oleh karena itu didapatkan jumlah sampel sebagai berikut:

n (5– 1) ≥ 15 n ≥ 3, 75 dibulatkan menjadi 4 ekor

Untuk lima perlakuan, diperlukan pengulangan paling sedikit sebanyak 4

ekor untuk tiap perlakuan sehingga sampel mencit total yang diperlukan dalam

penelitian ini adalah minimal 20 ekor mencit Balb/C betina.

22

4.3 Variabel Penelitian

4.3.1 Variabel Bebas

Variabel bebas dalam penelitian ini adalah pemberian self-antigen dsDNA

dalam berbagai macam dosis secara intraperitoneal bertahap kepada

mencit Balb/C model Lupus.

4.3.2 Variabel Terikat

Kadar ANA dalam serum.

4.4 Lokasi dan Waktu Penelitian

4.4.1 Lokasi Penelitian

1. In vivo-jetPEI dilakukan di Laboratorium Biomedik FKUB.

2. Isolasi DNA dilakukan di Laboratorium Parasitologi FKUB.

3. Penjagaan dan pembedahan mencit di Laboratorium Farmakologi

FKUB.

4. Pengukuran kadar ANA dalam serum mengggunakan ELISA di

Laboratorium Kawi 31, Jalan Kawi 31, Malang.

4.4.2 Waktu Penelitian

Penelitian ini dilakukan selama 4 bulan dengan rincian:

1. Adaptasi tikus di minggu pertama.

2. Injeksi pristane pada tikus di minggu ke-2.

3. Isolasi DNA di minggu ke-3.

4. Melakukan in vivo-jetPEI dan injeksi self-antigen dsDNA pada tikus di

minggu ke-14, 15 serta 16.

5. Pembedahan dan pengerjaan ELISA pada minggu ke-17.

23

4.5 Alat dan Bahan Penelitian

Alat yang digunakan untuk melakukan pembedahan mencit:

1. Gunting bedah.

2. Pinset.

3. Jarum pentul.

4. Sterofoam atau papan fiksasi.

5. Kapas.

Bahan yang digunakan untuk pembedahan mencit:

1. Chloroform atau eter.

2. Formalin 10%.

3. Alcohol.

4. Vacutainer.

5. Spuit 5cc.

Alat dan Bahan untuk mengukur variabel:

1. Induksi mencit Balb/C model LES: Pristane.

2. Alat yang digunakan untuk mengetahui kadar ANA: ELISA .

24

4.6 Definisi Operasional

Tabel 4.1 Definisi Operasional

NAMA DEFINISI OPERASIONAL CARA

PENGUKURAN HASIL UKUR SKALA

Mencit Lupus

Hewan coba model Lupus adalah mencit Balb/C betina, yang telah menunjukkan tanda lupus karena injeksi pristane.

Klinis dan laboratorium.

Rambut rontok, penurunan berat badan, tanda-tanda artritis, kadar ANA

Bulu rontok Tanda yang dapat dilihat jika terjadinya lupus

Klinis Bulu rontok

Pristane Pristane (tetramethylpentadecane) merupakan alkana isoprenoid yang digunakan untuk menginduksi lupus pada mencit. Pristane didapatkan dari Sigma Aldrich.

cc

Self-Antigen dsDNA

Self-antigen dsDNA merupakan antigen yang digunakan dengan metode escalating dose dengan optimasi pada penentuan dosis antigen ini diisolasi dari darah mencit yang telah diinduksi lupus.

µg

Kadar ANA Kadar ANA diukur dalam serum menggunakan metode ELISA.

µL/mL

4.7 Prosedur Penelitian

4.7.1 Persiapan Hewan Coba

Hewan coba yang digunakan dalam penelitian ini adalah mencit

strain Balb/C yang dipilih berdasarkan kriteria inklusi dan eksklusi. Mencit

Balb/C dipilih karena penelitian terdahulu yang menunjukkan bahwa

mencit Balb/C dapat memberikan gambaran imunologis seperti yang

terjadi pada manusia (Rottman dan Willis, 2010). Mencit diberikan

makanan standar dan ditempatkan di dalam kandang. Penelitian ini

25

dilakukan setelah mendapat persetujuan etik dari komisi etik Fakultas

Kedokteran Universitas Brawijaya.

4.7.2 Isolasi dsDNA

dsDNA diisolasi dari serum darah mencit yang sehat. Serum yang

diambil dimasukkan pada larutan sel lisis untuk melisiskan sel darah

merah. Sentrifugasi dilakukan selama 2 menit dan supernatan dibuang

lalu divortex. Setelah itu ditambahkan 300µL larutan nuklei lisis. Larutan

“protein precipitation” ditambahkan dan divortex lalu sentrifugasi selama 3

menit dan terlihat pellet berwarna coklat tua. Kemudian supernatan

dipindahkan pada tabung berisi isopropanol 300µL. Tabung dibalikkan

untuk mencampur lalu disentrifugasi selama 1 menit. Supernatan dibuang

dan ditambahkan 300µL etanol 70% lalu dibolak balikkan tabung perlahan

dan disentrifugasi kembali pada 13.500rpm selama 1 menit. Etanol

diambil perlahan tanpa mengganggu pellet dan tabung dibalik untuk

dikeringkan lalu ditambahkan larutan hidrasi DNA.

4.7.3 Preparasi dan Injeksi dsDNA

Reagen invivo-jetPEI dilarutkan dalam setengah volume injeksi

pada glukosa 5% dengan pelarut sterile water. Vortex perlahan dan

lakukan spin down. Ditambahkan larutan tersebut seluruhnya ke dalam

larutan ds-DNA. Vortex perlahan dan lakukan spin down. Dilakukan

Inkubasi selama 15 menit pada suhu ruang hingga larutan menjadi stabil.

dsDNA diinjeksikan secara intraperitoneal sesuai dosis masing-masing

kelompok perlakuan.

26

4.7.4 Pengukuran kadar antibodi terhadap self-antigen dsDNA

Prosedur pengukuran dengan meng-coating antigen 1:20 dalam

tabung ELISA, inkubasi semalam pada suhu 40oC, kemudian dicuci

dengan PBS-T (phosphate buffered saline tween). Kemudian blocking

dengan BSA (bovine serum albumin) 1%. Dicuci kembali dengan PBS-T.

Antibodi primer (serum) diencerkan 1:500 dalam PBS, ditambahkan 100

ul dalam tabung di inkubasi selama 1 jam. Tabung dicuci kembali dengan

300 ul PBS-T 0,2 % selama 3 kali. Antibodi sekunder berlabel enzim (anti

mouse IgG) 1:1000 ditambahkan pada tabung dengan inkubasi 1 jam.

Cuci dengan PBS-T 0,2 %. Ditambahkan SA-HRP (streptavidin

horseradish peroxidase) 1:1000 diinkubasi selama 1 jam. Sel dicuci

dengan PBS-T 0,2 %. Kemudian dilakukan penambahan substrat

(sureblue) TMB (tetramethylbenzidine) dan diinkubasi 30 menit. Tanpa

membuang Sureblue TMB, reaksi di stop dengan HCl (hydrochloric) 1N,

inkubasi 15 menit. Kemudian dibaca ELISA reader (λ=450nm). Kadar anti

dsDNA ditunjukkan dalam ul/mL.

4.7.5 Pengukuran Kadar ANA dalam Serum Menggunakan ELISA

Dengan menggunakan Serum Separator Tube (SST) dan

membiarkan sampel untuk membentuk klot selama 30 menit sebelum di

sentrifugasi selama 15 menit pada 3000 rpm. Kemudian segera

memindahkan serum dan assay serta simpan sampel di tempat dengan

suhu -20oC atau -80oC.

Tambahkan 100 μl sampel per plate dan ditutup dengan sealer.

Plate terisi sampel tadi diinkubasi selama 2 jam pada suhu 37oC. Buang

sampel dari plate tanpa dicuci dengan air, kemudian tambahkan 100 μl

27

Detection Reagent A pada plate dan ditutup dengan menggunakan

sealer. Plate tersebut diinkubasi lagi selama 1 jam pada suhu 37oC.

Larutan akan kelihatan keruh seperti berawan. Hangatkan pada suhu

kamar dan aduk sehingga merata. Aspirasi dan cuci plate dengan

menggunakan Wash Buffer sekitar 400μl dengan menggunakan pipet

serta pencucian diulang sebanyak 3 kali. Setelah pencucian terakhir,

membalikkan plate tersebut pada kertas handuk yang bersih. Setelah itu,

tambahkan 100μl Detection Reagent B dan tutup dengan menggunakan

sealer. Plate tersebut diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37oC dan ulangi

aspirasi serta pencucian seperti tadi. Kemudian tambahkan 90μl

Substrate Solution pada plate dan ditutup menggunakan sealer serta

diinkubasi selama 30 menit pada suhu 37oC. Dipastikan sampel tidak

terkena pada sinar matahari. Tambahkan 50μl Stop Solution pada plate

dan melihat perubahan warna. Terakhir, gunakan microplate reader yang

di set pada 450nm untuk menentukan optical density pada plate.

4.8 Analisis Data

4.8.1 Prosedur Pengumpulan dan Analisis Data

Hasil pengukuran parameter tikus kontrol dan perlakuan dianalisis

secara statistik dengan menggunakan program statistik IBM SPSS

(International Business Machines Statistical Package for the Social

Science) 20 dengan tingkat signifikansi 0,05 (p = 0,05) dan taraf

kepercayaan 95% (α = 0,05). Langkah-langkah uji hipotesis komparatif

dan korelatif adalah uji normalitas data, uji homogenitas varian, uji One-

way ANOVA, Post hoc test, dan uji korelasi Pearson dan uji Regresi.

28

BAB 5

HASIL PENELITIAN DAN ANALISIS DATA

5.1 Hasil Penelitian

5.1.1 Identifikasi Karakteristik Hewan Model LES

Penelitian ini telah dilakukan selama 17 minggu melibatkan 16

mencit LES dan 4 kontrol sehat. Penentuan hewan coba LES ditandai

dengan adanya hasil dari laboratorium yaitu pengukuran kadar ANA dan

manifestasi klinis. Manifestasi klinis yang muncul pada hewan coba

antara lain adalah perbandingan penurunan berat badan. Oleh karena

dalam penelitian ini menggunakan mencit berumur 2 minggu, berat badan

dapat dilihat dengan perbandingan rata-rata peningkatan berat badan

antara mencit LES dan mencit sehat, dan adanya bulu rontok pada

mencit LES.

5.1.2 Pengukuran Berat Badan pada Kelompok Kontrol dan

Perlakuan Pemberian Self-antigen dsDNA

Rata-rata berat badan mencit yang diinduksi pristane dan diinjeksi

self-antigen dsDNA secara bertahap diperoleh pada akhir penelitian untuk

mengetahui rata-rata berat badan mencit di setiap kelompok pada setiap

bulan. Hasil pengukuran yang diiukur dalam satuan gram. Pada tabel 5.1

menunjukkan rata-rata berat badan mencit yang tidak menunjukkan

perubahan yang signifikan:

29

Tabel 5.1 Rata-rata Berat Badan Mencit yang Diinduksi Pristane dan Diinjeksi Self-antigen dsDNA Secara Bertahap

KELOMPOK RATA-RATA BERAT BADAN MENCIT (g)

MINGGU PERTAMA MINGGU TERAKHIR

K- 21.00 31.33

K+ 19.83 28.50

A 21.50 38.83

B 19.67 25.67

C 21.17 33.16

K- (kelompok kontrol negatif tanpa injeksi pristane dan tanpa pemberian dsDNA) K+ (kelompok kontrol positif diinjeksi pristane dan tanpa pemberian dsDNA) A (kelompok perlakuan diinjeksi pristane dan pemberian dsDNA dosis 0.005 μg, 0.05μg, 0.5μg) B (kelompok perlakuan diinjeksi pristane dan pemberian dsDNA dosis 0.05 μg, 0.5μg, 5μg) C (kelompok perlakuan diinjeksi pristane dan pemberian dsDNA dosis 0.5μg, 5 μg, 50 μg)

5.1.3 Pengukuran Kadar ANA

Rata-rata kadar ANA diperoleh dari kontrol negatif, kontrol positif,

mencit perlakuan A, B dan C. Diambil rata-rata kadar ANA pada sampel

darah mencit di akhir penelitian. Pengukuran kadar ANA dilakukan

dengan metode ELISA untuk membuktikan hasilnya pada setiap

kelompok.

Hipotesis dalam penelitian mengatakan bahwa desensitisasi

dengan pemberian self-antigen dsDNA dapat menurunkan kadar ANA.

Berikut merupakan tabel yang menunjukkan kadar ANA.

30

Tabel 5.2 Rata-rata Kadar ANA pada Mencit yang Diinduksi Pristane dan Diinjeksi Self-antigen dsDNA Secara Bertahap Setelah 6 Bulan

KELOMPOK RATA-RATA (µL/mL) STANDAR DEVIASI

K- 26.6000 2.8029

K+ 30.4000 0.5462

A 24.6000 3.4954

B 21.6500 2.2555

C 22.9750 2.2484


Sehingga dapat disimpulkan kadar ANA meningkat pada mencit

LES. Hal itu menunjukkan bahwa mencit K+ telah menderita LES.

(Rottman dan Willis, 2010).

5.2 Analisis Data

Analisis data dilakukan dengan menggunakan uji statistik yang diperoleh

berdasarkan hasil pengukuran kadar ANA pada serum dalam darah jantung

mencit LES. Uji statistik yang digunakan yaitu uji statistik Kruskal-Wallis, dan uji

Mann-Whitney.

5.2.1 Hasil Pengujian Normalitas Data dan Homogenitas Varian pada Kadar ANA

Untuk menguji apakah sampel penelitian merupakan jenis sampel

dengan distribusi normal maka digunakan pengujian Shapiro-Wilk.

31

Tabel 5.3 Hasil Uji Shapiro-Wilk Kadar ANA pada Mencit LES

KELOMPOK RATA-RATA

(Hasil Uji Spahiro-Wilk kadar ANA)

SIGNIFIKANSI (P)

K- 0.912 0.494

K+ 0.773 0.062

A 0.911 0.485

B 0.953 0.735

C 0.919 0.529


Tabel 5.3 menunjukkan bahwa kadar ANA signifikansi pada setiap

kelompok (P > 0.05), sehingga dapat disimpulkan bahwa data rata-rata

kadar ANA berdistribusi normal. Setelah uji Shapiro-Wilk, dilakukan uji

homogenitas varians data untuk mendeteksi apakah sampel dalam

penelitian merupakan sampel yang homogen.

Tabel 5.4 Hasil Uji Levene Kadar ANA pada Mencit LES

RATA-RATA (Hasil Uji Levene kadar

ANA) SIGNIFIKANSI (P)

4.350 0.016

Tabel 5.4 menunjukkan bahwa nilai signifikansi adalah 0.016 (P <

0.05), sehingga dapat disimpulkan bahwa ragam data rata-rata kadar

ANA pada mencit LES tidak homogen.

32

5.2.2 Hasil Uji Kruskal-Wallis Kadar ANA pada Mencit LES

Oleh karena data tidak homogen, uji statistik dilanjutkan dengan

uji Kruskal-Wallis untuk mengetahui perbedaan pemberian berbagai

kelompok dosis desensitisasi dengan self-antigen dsDNA terhadap kadar

ANA.

Tabel 5.5 Hasil Uji Kruskal-Wallis Kadar ANA

KELOMPOK RATA-RATA

(Hasil Uji Kruskal-Wallis kadar ANA)

SIGNIFIKANSI (P)

K- 12.75

K+ 15.75

A 10.00 0.157

B 6.50

C 7.50


Tabel 5.5 menunjukkan bahwa nilai signifikansi adalah 0.157 (P >

0.05), sehingga dapat disimpulkan bahwa tidak terdapat perbedaan yang

signifikan antar kelompok. Oleh karena itu, tidak dapat dilanjutkan ke uji

Post Hoc untuk melihat perbedaan antara kelompok.

33

BAB 6

PEMBAHASAN

LES merupakan penyakit autoimun kronis dan kompleks (Zhu dan

Mohan, 2007). Etiologi dan patofisiologi penyakit ini juga masih belum jelas tetapi

banyak penelitian sebelum ini membuktikan bahwa LES bersifat multifaktor yang

melibatkan lingkungan, hormonal dan genetik (Mok dan Lau, 2003). Pada LES

terdapat gangguan pada fungsi imun dan produksi autoantibodi oleh karena

kehilangan self-tolerance yang boleh mengakibatkan terbentuknya kompleks

imun yang mengganggu kesehatan (Maidhof dan Hilas, 2012).

Manifestasi imunologis dan klinis LES yang umum pada mencit strain

Balb/C model lupus yang diinjeksi pristane secara intraperitoneal dapat timbul

gejala sindroma lupus seperti bulu rontok, glomerulonefritis, artritis, anemia dan

perdarahan pada alveolar. Hal ini terjadi karena hiperaktivitas sel B dan T yang

berinteraksi antara satu sama lain, peningkatan penghasilan autoantibodi yang

diarahkan terhadap antigen inti dan pembersihan kompleks yang kurang baik

(Zhuang et al., 2015).

LES dapat terjadi apabila sel T berinteraksi dengan antigen presenting

cell (APC). Hasil interaksi antara kedua sel tersebut menginduksi pelepasan

sitokin, stimulasi sel B dan inflamasi (Rahman dan Isenberg, 2008). Autoantibodi

imunoglobulin G (IgG) yang disekresi daripada stimulasi sel B dapat merusak

jaringan pada LES (Rahman, 2004). Selain itu, interaksi antara sel T dan sel B

dapat berinteraksi dan menghasilkan autoantibodi inflamasi (Valencia et al.,

2007).

34

Banyak autoantibodi yang dapat dikenali pada LES seperti antinuclear

antibody (ANA). Deteksi atau pengukuran kadar ANA juga telah sering digunakan

sebagai pemeriksaan diagnostik pada LES. Mekanisme utama ANA pada LES

adalah dengan menembusi sel sehingga dapat menyerang sel inti serta

memodulasi proses apoptosis yang memberi impak keradangan pada jaringan.

Selain itu, ANA juga dapat menginduksi aktivasi komplemen dengan bantuan IgG

(Ehrenstein, 1999).

Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental murni (true

experimental) laboratorik in vivo dengan menggunakan mencit Balb/C sebagai

subjek penelitian yang sebelumnya diinjeksikan pristane untuk induksi LES dan

kemudian diinjeksikan self-antigen dsDNA dalam berbagai dosis secara

berurutan dan bertahap satu kali per minggu selama tiga minggu. Studi bertujuan

untuk meneliti pengaruh induksi pristane terhadap presentase sel dendritik pada

darah mencit Balb/C model LES. Menurut Zhou et al., (2010) induksi pristane

0.5cc menyebabkan mencit Balb/C menjadi model LES pada minggu ke empat

setelah di induksi. Oleh karena itu, dilakukan pengamatan terhadap beberapa

marker yang menunjukkan manifestasi LES pada mencit akibat induksi pristane.

Berdasarkan penilaian statistik dan non deskriptif terhadap kadar ANA

yang diambil dari serum pada darah di jantung, maka dapat disimpulkan bahwa

tidak ada perbedaan yang signifikan secara statikstik dengan pemberian self-

antigen dsDNA terhadap respon imun terhadap ANA dibandingkan dengan

kelompok kontrol.

Pada analisis data uji normalitas Shapiro-Wilk dan homogenitas Levene

menunjukkan bahwa sampel distribusi normal tetapi tidak homogen, sehingga

dilanjutkan dengan uji analisis non parametric menggunakan uji Kruskal-Wallis.

35

Berdasarkan hasil uji statistik Kruskal-Wallis didapatkan nilai yang tidak signifikan

(P = 0.157, P > 0.05).

Proses desensitisasi adalah dengan cara memaparkan antigen dari dosis

yang paling kecil hingga dosis yang paling besar dengan harapan akan terjadi

toleransi. Kadar dsDNA antibodi pada pasien lupus sangatlah tinggi, hal inilah

yang menjadi landasan bahwa self-antigen yang diserang adalah self-antigen

dsDNA. Hal ini juga yang menjadi alasan kenapa reaksi inflamasi pasien lupus

terjadi secara sistemik karena setiap bagian tubuh terusun oleh DNA. Saat self-

antigen dsDNA diinjeksikan secara berulang dan bertahap dengan dosis yang

bertingkat maka akan ada perubahan dari sel dendritik. Sel dendritik akan

mengaktikan IDO (Indoleamin 2,3 dioxygenase). Aktivasi IDO menyebabkan

meningkatnya metabolisme triptofan kepada kinurenin di dalam sel dendritik.

Meningkatnya IDO di dalam sel dendritik tersebut mengakibatkan kurangnya

ketersediaan triptofan sehingga sel T CD4 mengalami starvasi. Karena triptofan

sangat penting untuk aktivasi sel T CD4 dan menjaga survival sel T efektor maka

kekurangan ketersediaan triptofan dapat memicu timbulnya apoptosis sel T

efektor. Ketika sel T apoptosis maka tidak akan ada rangsangan pada sel B

untuk diferensiasi menjadi sel plasma dan menghasilkan ANA sehingga tidak

terjadi reaksi imun (Burton et al., 2014). Selain tidak akan ada rangsangan pada

sel B untuk diferensiasi oleh sel T, hasil metabolisme kinurenin akan

mengaktivasi sel Treg. Sel Treg akan menghambat maturasi sel dendritik

immatur kepada sel dentritik matur (Campbell dan Koch, 2012).

Dibandingkan dengan penelitian yang terdahulu, penelitian ini berusaha

mendesensitisasi pembentukan autoantibodi melalui pemberian self-antigen

dsDNA. Mekanisme yang mungkin menyebabkan fenomena ini adalah dengan

36

peningkatan aktivitas sel Treg yang akan mensupresi aktivitas sel dendritik

matur. Presentasi self-antigen dsDNA akan menurun dengan penurunan aktivasi

sel dendritik matur sehingga aktivasi sel T dan sel B juga akan menurun.

Penurunan tersebut akan menurunkan produksi autoantibodi seperti ANA

sehingga menurunkan juga kerusakan target organ serta manifestasi klinis pada

LES.

Meskipun hipotesis tidak terbukti secara statistik, masih terdapat

kecenderungan yang menurun pada kadar ANA. Selain itu, terdapat juga

beberapa kelemahan yang mempengaruhi penelitian ini seperti lama durasi

induksi lupus serta terapi yang terlalu singkat menyebabkan daya desensitisasi

self-antigen dsDNA yang tidak optimal. Selain itu, penurunan yang tidak

bermakna pada penelitian ini juga dikarenakan oleh jumlah mencit yang

digunakan terlalu sedikit, yaitu 20 ekor menyebabkan hasil rata-rata kurang

meluas.

Pada penelitian Cui et al., (2006), dinyatakan kadar ANA pada mencit

Balb/C model lupus muncul 3 hingga 4 bulan setelah injeksi pristane 0.5cc

secara intraperitoneal, dan mencapai 87.5% setelah 8 bulan injeksi pristane.

American College of Allergy, Asthma and Immunology (1997)

Menyatakan juga desensitisasi dimulai dengan pemberian alergen pada dosis

yang rendah, kemudian ditingkatkan secara bertahap sehingga mencapai dosis

maksimal. Hal ini dapat mengurangi efek samping yang tidak diinginkan.

Perbaikan dapat dilihat mulai bulan ke 3 hingga 6, dan perbaikan maksimal

hanya boleh tercapai sekitar bulan ke 12 hingga 24.

Selain itu, tehnik sampling yang kurang tepat juga akan menyebabkan

hasil rata-rata yang kurang meluas untuk penelitian ini. Untuk penelitian

37

eksperimental, belum banyak rumus yang dikembangkan untuk menentukan

besar sampel yang diperlukan. Menurut Frederer (1967), untuk menentukan

besar sampel yang diperlukan boleh menggunakan rumus:

(t – 1)(n – 1) ≥ 15

Dimana t merupakan jumlah kelompok percobaan dan n merupakan

jumlah pengulangan atau jumlah sampel tiap kelompok. Penelitian ini

menggunakan 5 kelompok sehingga perhitungan sampel menjadi:

(5 – 1)(n – 1) ≥ 15

4n – 4 ≥ 15

4n ≥ 19

n ≥ 4,75

Jadi, sampel yang digunakan tiap kelompok percobaan sebanyak 5 ekor

(n ≥ 4,75) dan jumlah kelompok yang digunakan adalah 5 kelompok sehingga

penelitian ini seharusnya menggunakan 25 ekor tikus putih Balb/C betina.

38

BAB 7

KESIMPULAN DAN SARAN

7.1 Kesimpulan

Kesimpulan yang didapatkan dari penelitian ini adalah:

1. Induksi lupus oleh pristane 0.5 cc secara intraperitoneal dengan

dosis tunggal mampu meningkatkan kadar ANA.

2. Meskipun escalating dose self-antigen immunotherapy

menggunakan self-antigen dsDNA terhadap kadar ANA pada

mencit lupus induksi pristane tidak terbukti secara statistik, masih

terdapat kecenderungan yang menurun pada kadar ANA.

7.2 Saran

Saran yang dapat diberikan untuk memperbaiki beberapa kekurangan

yang ada dalam penelitian ini antara lain:

1. Perlu penelitian lebih lanjut pada tahun kedua untuk menilai

ketahanan organ-organ dengan pemberian terapi dsDNA dengan

peningkatan dosis bertahap pada hewan coba model lupus

eritematosus sistemik.

2. Perlu penelitian lebih lanjut pada tahun kedua untuk menilai akibat

pemberian self-antigen dsDNA dengan peningkatan dosis

bertahap pada hewan coba model lupus eritematosus sistemik.

39

DAFTAR PUSTAKA

Abbas A.K., Lichtman A.H., Pillai S., 2014. Immunologic Tolerance and

Autoimmunity. Cellular and Molecular Immunology, 8th Ed., Edited by

Malley J., Elsevier Saunders, Philadelphia, p. 315-336.

Al-Zoughi A., 2014. Drugs & Disease: Laboratory Medicine. Antinuclear Antibody,

(Online), (https://emedicine.medscape.com/article/2086616-overview#a1,

diakses 5 Desember 2016).

Anonymous, 1997. General Information About Allergy Injections, (Online),

(http://college.acaai.org/sites/default/files/ACAAI%20Immunotherapy.pdf,

diakses 1 Januari 2018).

Bennett L., Palucka A.K., Arce E., Cantrell V., Borvak J., Banchereau J., et al.,

Interferon and Granulopoiesis Signatures in Systemic Lupus

Erythematosus Blood. Journal of Experimental Medicine, 2003, 197: 711-

723.

Boggs J.M., Rangaraj G., Heng Y.M., Liu Y., Harauz G., Myelin Basic Protein

Binds Microtubules to a Membrane Surface and to Actin Filament in Vitro:

Effect of Phosphorylation and Deimination. Biochimica et Biophysica Acta

(BBA) – Biomembranes, 2011: 761-773.

Brinkmann V., Zychlinsky A., Beneficial Suicide: Why Neutrophils Die to Make

NETs. Nature Review Microbiology, 2007, 5: 577-582.

Burton B.R., Britton G.J., Fang H., Verhagen J., Smithers B., Peyton C.A.S., et

al., Sequential Transcriptional Changes Dictate Safe and Effective

Antigen-Specific Immunotherapy. Nature Communications, 2014, 5: 4741.

Campbell D.J., dan Koch M.A., Phenotypic and Functional Specialization of

FOXP3+ Regulatory T Cells. Nature Review Immunology, 2012, 11(2):

119-130.

https://emedicine.medscape.com/article/2086616-overview#a1http://college.acaai.org/sites/default/files/ACAAI%20Immunotherapy.pdf

40

Cervera R., Khamashta M.A., Font J., Sebastiani G.D., Gil A., Lavilla P., et al..

Morbidity and Mortality in Systemic Lupus Erythematosus During a 10

Years Period: A Comparison of Early and Late Manifestation in Cohort of

1000 Patients. Medicine (Baltimore), 2003, 82: 299-308.

Crampton P.S., Morawski P.A., Bolland S.. Linking Susceptibility Genes and

Pathogenesis Mechanisms Using Mouse Model of Systemic Lupus

Erythematosus. The Company of Biologists: Disease Models &

Mechanisms, 2014, 7(9): 1033-1046.

Cui G.M., Liu G., Liu W., Kan B., Mao Y.Q., Wei T.Q., 2006. Experimental Study

of Pristane-Induced Murine Lupus Model. (Abstract). Journal of Sichuan

University, 37(2): 309-12.

Dema B. dan Charles N.. Autoantibodies in SLE: Specificities, Isotypes and

Receptors. MDPI: Antibodies, 2016, 5(2): 1-30.

Duarte C., Couto M., Ines L., Liang M.H., 2011. Epidemiology of Systemic Lupus

Erythematosus. Systemic Lupus Erythematosus, 5th Ed., Edited by Lahita

R.G., Academic Press, Elsevier, London, p. 673–696.

Ehrenstein M.R.. Antinuclear Antibodies and Lupus: Causes and Consequences.

Rheumatology, 1999, 38: 691-696.

Guiducci C., Gong M., Gill M., Chaussabel D., Meeker T., Chan J.H., et al.. TLR

Recognition of Self Nucleic Acids Hampers Glucocorticoid Activity in

Lupus. Nature, 2010, 465: 937-41.

Handono K., Hasanah D., Kalim H.. Low Serum Level of Vitamin D is Associated

with Increased Number of Low-Density Granulocytes (LDGs) and

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Formation in Patients with Systemic

Lupus Erythematosus. Global Journal of Biology, Agriculture & Health

Sciences, 2013, 2: 90-95.

Kalim H., 2000. HLA Kelas II Dan Kerentanan Genetik Terhadap Lupus

Eritematosus Sistemik Di Indonesia. Acta Medica Indonesiana XXXII,

Indonesia, p. 11-15.

41

Kasjmir Y.I., Handono K., Wijaya L.K., 2011. Diagnosis dan Pengelolaan Lupus

Eritematosus Sistemik. Perhimpunan Reumatologi Indonesia, Indonesia,

p. 1-42.

Lande R., Gregorio J., Facchinetti V., Chatterjee B., Wang Y.H., Homey B., et al..

Plasmacytoid Dendritic Cells Sense Self-DNA Coupled with Antimicrobial

Peptide. Nature, 2007, 449: 564-569.

Lande R., Ganguly D., Facchinetti V., Frasca L., Conrad C., Gregoria J., et al..

Netrophils Activate Plasmacytoid Dendritic Cells by Releasing Seld-DNA-

Peptide Complexes in Systemic Lupus Erythematosus. Research Article:

Autoimmune Disease, 2011, 3(73): 1-10.

Lee Y., Rifa’i M., Shi Z., Isobe K., Suzuki H.. Essential Role of CD8CD122

Regulatory T Cells in the Recovery From Experimental Autoimmune

Encephalomyelitis. Journal of immunology (Baltimore), 2008, 180(2): 25-

321.

Maidhof W. dan Hilas O.. Lupus: An Overview of Disease and Management

Options. Pharmacy & Therapeutics, 2012, 37(4): 240-246, 249.

Mok C.C. dan Lau C.S.. Pathogenesis of Systemic Lupus Erythematosus.

Journal of Clinical Pathology, 2003, 56: 481-490.

Rahman A.. Autoantibodies, Lupus and the Science of Sabotage. Rheumatology

(Oxford), 2004, 43: 1326–1336.

Rahman A. dan Isenberg D.. Systemic Lupus Erythematosus. The New England

Journal of Medicine, 2008, 358: 929–939

Rifa’i M., Kawamoto I., Nakashima I., Suzuki H.. Essential Roles of CD8CD122

Regulatory T cells in the Maintenance of T Cell Homeostasis. Journal of

Experimental Medicine, 2004, 200(9): 1123-34.

Rottman J.B. dan Willis C.R.. Mouse models of systemic lupus erythematosus

reveal a complex pathogenesis. Veterinary Pathology, 2010, 47(4): 4664-

4676

42

Rus V., Maury E.E., Hochberg M.C., 2007. The Epidemiology of Systemic Lupus

Erythematosus. Dubois’ Lupus Erythematosus, 7th Ed., Edited by Wallace

D.J. dan Hahn B.H., Lippincott Williams & Walkins, California, p. 34-42.

Sakaguchi S.. Regulatory T Cells: Key Controllrs of Immunologic Self-Tolerance.

Cell, 2000, 101: 455-458.

Sangha O.. Epidemiology of Rheumatic Disease. British Society for

Rheumatology, 2000, 39(2): 3-12.

Shao W.H. dan Cohen P.L.. Dusturbance of Apoptic Cell Clearance in Systemic

Lupus Erythematosus. Arthritis Research and Therapy, 2011, 13(1): 202.

Tsokos G.C.. Systemic Lupus Erythematosus. The New England Journal of

Medicine, 2011, 365: 2110-21.

Tsokos G.C., Lo M.S., Costa R.P., Sullivan K.E., 2016. New Insight Into the

Immunopathogenesis of Systemic Lupus Erythematosus. (Abstract).

Nature Review Rheumatology, 12(12): 716-730.

Tassiulas I.O. dan Boumpas D.T., 2009. Clinical Features and Treatment of SLE.

Kelley’s Textbook of Rheumatology, 8th Ed, Edited by Firestein G.S.,

Budd R.C., Harris E.D., McIannes I.B., Ruddy S., Sergent J.S., WB

Saunders Elsevier, Philadelphia, p.1263-1300.

Valencia X., Yarboro C., Illei G., Lipsky P.E.. Deficient CD4 + CD25 (high) T

Regulatory Cell Function in Patients with Active Systemic Lupus

Erythematosus. The Journal of Immunology, 2007, 178: 2579-2588.

Wallace D.J.. 2007. The Clinical Presentation of Systemic Lupus Erythematosus;

Differential Diagnosis and Disease Association. Dubois’ Lupus

Erythematosus, 7th Ed., Edited by Wallace D.J. dan Hahn B.H., Lippincott

Williams & Walkins, California, p. 956-966.

43

Weselman K., 2017. American College of Rheumatology. Antinuclear Antibody,

(Online),(https://www.rheumatology.org/I-Am-A/Patient-Caregiver/Disease

s-Conditions/Antinuclear-Antibodies-ANA, diakses 15 Juni 2017).

Zanetti M.C.. Multifunctional Peptides of the Innate Immunity. Journal of

Leukocyte Biology, 2004, 75: 39-48.

Zhang J., Jacobi A.M., Wang T., Diamond B.. Pathogenic Autoantibodies in

Systemic Lupus Erythematosus Are Derived from Both Self-Reactive and

Non-Self–Reactive B Cells. Molecular Medicine, 2008, 14: 675-681.

Zhu J. dan Mohan C., 2007. Genetic Dissection of Lupus. Immune Mediated

Disease – From Theory to Therapy. Edited by Shurin M.R., Smolkin Y.R.,

Springer, New York, p. 86.

Zhuang H., Szeto C., Han S., Yang L., Reeves W.H.. Animal Models of Interferon

Signature Positive Lupus. Frontiers in Immunology, 2015, 6: 291.

Zhou L.L., Wei W., Si J.F., Yuan D.P.. Regulatory Effect of Melatonin on Cytokine

Disturbance in Pristane-Induced Lupus Mice. Mediators of Inflammations.

2010, 951210: 1-7.

https://www.rheumatology.org/I-Am-A/Patient-Caregiver/Disease%20s-Conditions/Antinuclear-Antibodies-ANAhttps://www.rheumatology.org/I-Am-A/Patient-Caregiver/Disease%20s-Conditions/Antinuclear-Antibodies-ANA

BAGIAN DEPAN.pdf1. Cover + Daftar Isi.pdf2. Lembar pengesahan.pdf3. Abstrak Indonesia + Inggris.pdf

4. BAB 1.pdf5. BAB 2.pdf6. BAB 3.pdf7. BAB 4.pdf8. BAB 5.pdf9. BAB 6.pdf10. BAB 7.pdf11. Daftar Pustaka.pdf

pengaruh escalating dose antigen specific …repository.ub.ac.id/8435/1/muhammad hazim bin...

Documents