permissivitÀ l f verso caprine arthritis encephalitis ... · permissivitÀ di linee fibroblastiche...
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PERMISSIVITÀ DI LINEE FIBROBLASTICHE VERSO CAPRINE ARTHRITIS ENCEPHALITIS VIRUS (CAEV)
DERIVANTI DA ANIMALI CON ALTA E BASSA CARICA VIRALE
Rosati S. Dipartimento di Scienze Veterinarie, Università di Torino.
introduzione
• SRLV e CAEV
• Il virus dell’Artrite Encefalite Caprina (CAEV) è rappresentato dal sottotipo B1 dei lentivirus dei piccoli ruminanti (SRLV)
• Causa sintomi clinici negli animali adulti (artrite, mastite, polmonite)
introduzione
• SRLV e CAEV
• Il virus dell’Artrite Encefalite Caprina (CAEV) è rappresentato dal sottotipo B1 dei lentivirus dei piccoli ruminanti (SRLV)
• Causa sintomi clinici negli animali adulti (artrite, mastite, polmonite)
SRLV
CAEV
CAEV: sottotipo B1
patogenesi
• Via: orale/respiratoria/mammaria scendente
• Target: monocita/macrofago
• Siti di persistenza
• Viremia (n°copie/µg)
• Localizzazioni secondarie
• Lesioni immunomediate
Frequenza delle forme cliniche
• Artrite
• Mastite induritiva
• Long-term non progressors
Meccanismi di resistenza
• Immunità innata verso i retrovirus
– receptor/co-receptor (difetti di entrata)
– Trim5α (degradazione via proteasoma del capside)
– APOBEC3 (citidina deaminasi: accumulo ipermutazioni)
– Tetherin (inibizione della fase di rilascio)
• Immunità adattativa
– MHC I e II
– Superinfezioni
Immunità adattativa GAG-PEPTIDEGAG-PEPTIDE
ANTIBODY ELISAANTIBODY ELISA
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
4
4.5
#1 #2 #3 #4 #5 #6 #7 #8 #9 #10 #11 #12
goat #
OD
-6 dpi
22 dpi
27 dpi
43 dpi
83 dpi
cutoff
BE 10/D2BE 10/D2 BE 1/D5BE 1/D5
D5
MHC I (BE) MHC II (D)
Immunità adattativa
• Il ruolo delle superinfezioni
Two Sample t-test
p-value = 0.04
mean of x mean of y
1.601115 1.532695
B1 vs E
l’infezione da genotipo E riduce la carica provirale di CAEV potenziando l’attività citotossica
Vertebrati e retrovirus: una lunga storia
• 8% del genoma umano è costituito da sequenze retrovirali endogene
• Proteine di fusione espresse a livello placentare
• Milioni di anni di co-evoluzione
• Negli ovi-caprini? 27 eventi di integrazione
• Alcune sequenze sono identiche in pecore e capre – Evento precedente alla speciazione
• Meccanismi di difesa ed evasione – Es: Apobec e VIF
il ruolo dell’immunità innata
• Selezione allevamenti CAEV+
• Caratterizzazione del ceppo virale infettante (sierologica e biomolecolare)
• Sviluppo di una PCR real time ‘allevamento-specifica’
• Classificazione soggetti in base alla carica virale
introduzione
• In un allevamento in particolare (100% sieropositivi) è stata registrata una certa variabilità nella carica provirale
pvl (N/50ng)
Fre
qu
ency
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500
02
46
81
012
Low viral load
High viral load
obiettivi…
• Quali sono i fattori responsabili delle differenze nella carica provirale
– Caratteristiche del virus (origine clonale)
– Caratteristiche dell’ospite
obiettivi…
• Quali sono i fattori responsabili delle differenze nella carica provirale
– Caratteristiche del virus
– Caratteristiche dell’ospite
metodi…
Uncoating & RT
Receptors &
Coreceptors
Integration
Transcription &
proteins
Ciclo replicativo
metodi…
Uncoating e RT
Uncoating & RT
Receptors &
Coreceptors
Integration
Transcription &
proteins
materiali…
• Isolamento virale da BDM
– solo da animali ad alta carica (HpVL)
– nessun isolamento da animali a bassa carica (LpVL)
– Verifica del ceppo virale classificato come B1 (CAEV)
• Biopsie cutanee
– linee cellulari fibroblastiche da entrambe le classi di animali
metodi…
• Linee fibroblastiche HpVL e LpVL
• Valutazione dell’entrata
– Entry Assay
• Presenza delle proteine virali
– Immunocitochimica
• Presenza di progenie virale
– RT Assay
metodi…
Entry Assay
• Co-trasfezione di HEK293T –pCAEV AP –pCMV-env (CAEV B1)
• Infezione dei fibroblasti cutanei con
pseudovirus
• Conta dei foci
1
2210
4419
6628
8837
11046
pCAEV-AP
13256 bp
CMV
RU5 gag pol vif
CMV
HPAP
vpr RU5
amp1
1
1036
2071
3106
4141
5176
5818
pCMVlcn
6212 bp
CMV
MCS
amp
ori
Fosfatasi alcalina termostabile
SU-TM (env)
Trascrittasi inversa
Antigene capsidico
matrice
Entry assay
Cellula permissiva Cellula non permissiva
infection
AP stain
24h
metodi…
Immunocitochimica
• Ab policlonale anti-p25 • Fibroblasti infetti con il ceppo virale
isolato dall’allevamento e CAEV Cork
RT Assay
• Valutazione dell’attività della retrotrascrittasi fino a 14 dpi
risultati…
Carica provirale
• Elevata differenza tra HpLV e LpVL – HpVL: 1571.88 copie/50ngDNA – LpVL: 54.37 copie / 50ngDNA
pvl (N/50ng)
Fre
qu
ency
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500
02
46
81
012
risultati…
Entry Assay
• Lieve differenza tra HpLV e LpVL – HpVL: 1.2 x 103 FFU/ml – LpVL: 0.5 x 103 FFU/ml
risultati…
Immunocitochimica • Assenza di segnale in LpLV, anche in
presenza di fusione cellulare e rari sincizi
HpVL LpLV
risultati… S
IDiL
V
2012
RT Assay (detection limit 103 TCID50) • Assenza di segnale in LpVL
HpVL
LpVL
discussione… S
IDiL
V
2012
La linea LpVL sembra in grado di restringere l’infezione da CAEV rispetto a HpVL
• Minore entrata (CCR5)
• Assenza di proteine del capside (trim5)
• Assenza di attività RT nel sovranatante (budding)
discussione…
L’immunità innata gioca un ruolo fondamentale nella restrizione dell’infezione:
• Polimorfismi nei recettori e corecettori
– CCR5, MR…
• Meccanismi di restrizione post-entry
– TRIM5a, …
• Meccanismi di late restriction
– TRIM5a, tetherin
Conclusioni
• marker genetici per l’identificazione di individui resistenti a CAEV
• Nuove prospettive per misure alternative di controllo verso i genotipi virulenti
• Bertolotti L.1, Profiti M.1
• Colussi S.2, Modesto P.2, Peletto S.2, Acutis2
• Quasso A.3
• Reina R.4
• 1 Dipartimento di Scienze Veterinarie, Università di Torino.
• 2 IZS del Piemonte, Liguria e Valle D’ Aosta, sezione di Torino.
• 3 Dipartimento di Prevenzione - Servizi Veterinari - Area Sanità Animale – ASL n. 19 ~ Asti
• 4 Instituto de Agrobiotecnologia, CSIC-UPNA-Gobierno de Navarra ~ Navarra - Spain
Ringraziamenti