Phân lập tuyển chọn vi sinh vật sinh enzyme

phytase

Phan Thị Thu Mai

Trường Đại học Khoa học Tự nhiên

Luận văn Thạc sĩ ngành: Vi sinh vật; Mã số: 60 42 40

Người hướng dẫn: TS. Đào Thị Lương

Năm bảo vệ: 2012

Abstract: Tổng quan về axit phytic, phytate, phytase. Trình bày các phương pháp xác

định hoạt tính enzyme phytase; Tuyển chọn chủng; Phương pháp xác định khả năng

sinh trưởng; Phương pháp phân loại; Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy thích hợp cho khả

năng sinh phytase của chủng vi sinh vật nghiên cứu; Thu hồi enzyme; Nghiên cứu

enzyme phytase. Kết quả: Lần đầu tiên ở Việt Nam sử dụng trình tự đa gen (gyrA,

rpoB, purH, polC, groEL và ADNr 16S) để phân loại chính xác đến dưới loài của chi

Bacillus; Là đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu về phytase bền nhiệt ở loài Bacillus

amyloliquefaciens. Chủng vi khuẩn nghiên cứu là chủng an toàn, nên có thể được sử

dụng trực tiếp trong thức ăn chăn nuôi để cung cấp phytase và là nguồn probiotic cho

động vật.

Keywords: Vi sinh vật; Chủng vi khuẩn; Sinh học; Axit

Content

MỞ ĐẦU

Phospho (P) là một nguyên tố thiết yếu cho sự sinh trưởng và phát triển của sinh vật,

phospho chủ yếu được tìm thấy trong các loại đá phốtphat vô cơ và trong các cơ thể sống.

Axit phytic (myo-inositol hexakisphosphate) là dạng dự trữ chủ yếu của phospho trong tự

nhiên, có mặt nhiều trong các loại ngũ cốc, hạt của các cây họ đậu và hạt lấy dầu (axit phytic

chiếm hơn 80% lượng P trong các thực vật này) và đây là nguồn dinh dưỡng quan trọng cho

người và động vật. Axit phytic có khả năng tạo phức chặt chẽ với các ion kim loại tạo nên các

muối (phytate: muối của axit phytic với Na+, phytin: muối của axit phytic với Ca

2+, Mg

2+) và

các hợp chất khác như axit amin, protein, làm ức chế các enzyme tiêu hóa, ngăn cản sự hấp

thu các chất này của các cơ thể sống. Vì thế axit phytic được coi là một yếu tố kháng dinh

dưỡng (an anti-nutrient compound) trong thức ăn và thực phẩm.

Phytase là một enzyme đóng vai trò quan trọng trong công nghiệp chế biến thực phẩm

và thức ăn chăn nuôi. Phytase xúc tác cho phản ứng thủy phân các muối của axit phytic

(phytate, phytin) giải phóng ra orthophosphate và myo-inositol-6-phosphate và các cấp độ

2

thấp hơn của phản ứng phosphoyl hóa. Việc sử dụng phytase không chỉ làm tăng khả năng

hấp thu phospho vô cơ mà còn tăng khả năng hấp thu các nguyên tố khoáng và khả năng tiêu

hóa các hợp chất khác. Do đó dùng phytase để thủy phân, loại bỏ axit phytic trong thành phần

thức ăn là rất cần thiết.

Ở các động vật nhai lại, axit phytic được phân giải bởi các phytase do khu hệ vi sinh vật

kị khí như nấm và vi khuẩn sống trong dạ cỏ sinh ra. Nhưng những động vật dạ dày đơn như

gia cầm và cá không thể sử dụng muối phytate vì trong đường tiêu hóa của chúng thiếu hụt

enzyme quan trọng này. Bởi vậy, người ta thường bổ sung phốt pho vô cơ (Pi) vào trong thức

ăn để đáp ứng nhu cầu P cho cơ thể, nhằm đảm bảo cho động vật sinh trưởng, phát triển bình

thường. Tuy nhiên, bổ sung Pi không làm giảm được hiệu ứng kháng dinh dưỡng của axit

phytic mà còn gây ô nhiễm môi trường do P dư thừa thải qua phân động vật. Đồng thời làm

tăng chi phí khẩu phần thức ăn. Vì vậy, giải pháp tốt nhất thay thế cho việc bổ sung Pi là thêm

phytase vào thức ăn của vật nuôi, nhằm phân giải phytate thực vật sẵn có trong thức ăn, giải

phóng Pi dễ hấp thụ cho vật nuôi cũng như các yếu tố dinh dưỡng và khoáng khác. Ngoài ứng

dụng vào trong thức ăn chăn nuôi, phytase còn được sử dụng cho thực phẩm ở người, trong

điều chế các dẫn xuất myo-inositol phosphate cho ngành dược phẩm, ứng dụng trong công

nghiệp giấy và cải tạo đất trồng. Bởi thế, việc nghiên cứu sản xuất phytase đã và hiện đang là

mối quan tâm của nhiều nhà khoa học.

Với đặc điểm là một đất nước có khí hậu nhiệt đới gió mùa, có sự đa dạng lớn về địa

hình và hệ sinh thái tạo nên sự đa dạng phong phú của các loài vi sinh vật, cũng như do nhu

cầu và tầm quan trọng của các sản phẩm phytase thương mại, chúng tôi đã tiến hành đề tà i

nghiên cứu “Phân lập tuyển chọn vi sinh vật sinh enzyme phytase” nhằm tìm kiếm các loài

vi sinh vật có khả năng sinh enzyme phytase cao và là các chủng an toàn, đáp ứng nhu cầu

trong công nghiệp chế biến thức ăn chăn nuôi và thực phẩm.

Những đóng góp của đề tài

- Lần đầu tiên ở Việt Nam sử dụng trình tự đa gen (gyrA, rpoB, purH, polC, groEL và

ADNr 16S) để phân loại chính xác đến dưới loài của chi Bacillus.

- Là đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu về phytase bền nhiệt ở loài Bacillus

amyloliquefaciens.

- Chủng vi khuẩn nghiên cứu là chủng an toàn, nên có thể được sử dụng trực tiếp trong

thức ăn chăn nuôi để cung cấp phytase và là nguồn probiotic cho động vật.

3

CHƢƠNG I. TỔNG QUAN

1.1 AXIT PHYTIC VÀ PHYTATE

Axit phytic lần đầu tiên được Hartig tìm thấy năm 1855-1856 ở dạng hạt nhỏ, không

phải là tinh bột trong các hạt của một số loài thực vật. Sau Hartig, cũng đã có nhiều nhà

nghiên cứu tìm thấy phytate dưới dạng ―globoid‖ (dạng cầu) và khẳng định thành phần hóa

học chính của nó là C, P và các ion kim loại. Năm 1897 Winterstein đưa ra tên là axit inositol-

phosphoic và sau đó năm 1968 được duyệt lại là ‗myo-inositol 1, 2, 3, 4, 5, 6 hexakis

(dihydrogen) phosphate (IP6) bởi IUPAC-IUB. Phytate là một hợp chất có mặt ở nhiều loại

thực vật khác nhau, chúng chiếm đến 1-5% khối lượng các cây họ đậu, ngũ cốc, các hạt chứa

dầu và hạnh nhân. IP6 có thể được tìm thấy trong nhân hồng cầu ở các loài chim, cá nước ngọt

và rùa, cũng như được tìm thấy trong các loại đất hữu cơ.

Axit phytic được coi là một hợp chất kháng dinh dưỡng (an anti-nutritional compound)

do khả năng tạo phức chặt chẽ với các ion kim loại và các hợp chất khác như tinh bột, protein

làm giảm khả năng tiêu hóa và hấp thu các chất này.

1.2 PHYTASE

Phytase (myo-inositol hexakisphosphate hydrolases) là một nhóm enzyme đặc biệt trong

số các enzyme phosphatase, có khả năng xúc tác cho phản ứng thủy phân từng bước axit

phytic thành myo-inositol, các nhóm phosphate (Pi) và các myo-inositol phosphate trung gian

(IP5, IP4, IP3, IP2, IP1). Khối lượng phân tử phytase của vi khuẩn biến thiên từ 35-50 kDa trừ

phytase từ Klebsiella aerogenes có 2 dạng phân tử cảm ứng. Phytase từ eukaryote như nấm

men, nấm sợi, thực vật và động vật thường được glycosyl hóa và có khối lượng phân tử cao

hơn, nằm trong khoảng từ 85-150 kDa đối với nấm, khoảng 500 kDa đối với phytase của nấm

men và từ 50-150 kDa đối với phytase của thực vật và động vật. Phytase được phân bố rộng

rãi trong tự nhiên bao gồm ở thực vật, động vật và các loài vi sinh vật. Phytase có mặt ở nhiều

loài vi sinh vật bao gồm cả vi khuẩn, nấm, nấm men và động vật nguyên sinh.

Theo hiệp hội hóa sinh quốc tế (The International Union of Biochemists) hiện nay

phytase được chia ra làm 2 loại chính là 3-phytase (EC 3.1.3.8) và 6-phytase (EC 3.1.3.26),

dựa trên vị trí cắt nhóm phosphate đầu tiên của vòng inositol. Dựa trên pH hoạt động tối ưu,

phytase được chia thành 3 loại: phytase ưa axit, ưa kiềm và trung tính. Ngoài ra, dựa vào cấu

hình trung tâm hoạt động và cơ chế xúc tác, phytase được phân thành 3 loại khác nhau là:

histidine axit phosphatase (HAP) phytases, ß-propeller phytase (BPP) và purple axit

phosphatase (PAP) phytase.

4

Dựa trên những đặc tính hóa lý và chức năng, phytase có rất nhiều ứng dụng khác nhau

tập trung chính vào 2 lĩnh vực sau: sản xuất thực phẩm và thức ăn động vật trên quy mô công

nghiệp, là công cụ trong các nghiên cứu hóa sinh. Ngoài ra phytase còn được sử dụng nhiều

trong việc phục hồi đất và bán tổng hợp peroxydase.

1.3 LÊN MEN XỐP

Lên men xốp (Solid-state fermentation) là quá trình lên men của vi sinh vật trên cơ chất

không tan ở độ ẩm nhất định, cơ chất này vừa đóng vai trò là chất hỗ trợ cơ học (giá thể) và

vừa là nguồn dinh dưỡng cho vi sinh vật. Với đặc điểm độ ẩm thấp, lên men xốp chỉ thích hợp

với một lượng giới hạn các loại vi sinh vật, chủ yếu là nấm, nấm men và một số vi khuẩn.

Lên men xốp có 2 lĩnh vực ứng dụng rất quan trọng, đầu tiên đó là ứng dụng trong quá

trình xử lý sinh học môi trường như phân hủy sinh học các hợp chất nguy hại, các hợp chất

độc từ chất thải của công nghiệp chế biến, sản xuất phân bón, thức ăn động vật từ các chất

thải rắn…Một ứng dụng khác của lên men xốp đó là sản xuất các hợp chất làm phụ gia rất có

giá trị như enzyme, nấm, aminoaxit, thuốc trừ sâu sinh học, nhiên liệu sinh học, chất hoạt

động bề mặt sinh học, hương liệu, chất tạo màu, tạo mùi, chất chuyển hóa thứ sinh có hoạt

tính sinh học, và các loại cơ chất khác cần thiết cho công nghiệp thực phẩm.

1.4 CHI BACILLUS VÀ PHÂN LOẠI TRONG CHI BACILLUS

Bacillus là một chi lớn với gần 200 loài vi khuẩn hiếu khí, hình que thuộc ngành

Firmicutes, có khả năng sinh nội bào tử với nhiều hình dạng khác nhau như bầu dục, tròn hay

cầu hoặc khúc xạ trụ bên trong tế bào, để chống chịu các điều kiện bất thường của môi trường

sống, đa số các loài vi khuẩn Bacillus là không gây bệnh, tuy nhiên có một số loài được biết

đến bởi khả năng gây bệnh cho vật nuôi (như Bacillus anthracis và Bacillus cereus) và gây

bệnh cho côn trùng (như Bacillus thuringiensis). Nhiều loài vi khuẩn Bacillus, đặc biệt là

nhóm B. subtilis, có tiềm năng sản xuất các sản phẩm thương mại ứng dụng trong y học, trong

nông nghiệp và trong công nghiệp thực phẩm.

Hệ thống phân loại Bacillus dựa trên phân tích trình tự đoạn gen 16S rRNA bắt đầu từ

những năm 1990. Phương pháp phân loại truyền thống dựa trên hình thái tế bào, bào tử cũng

như các đặc tính sinh hóa không có khả năng phân tách các loài thuộc nhóm Bacillus. Gần

đây, xây dựng cây phát sinh chủng loại trên trình tự đa gen (gyrA, rpoB, purH, polC, groEL

và ADNr 16S) đã được ứng dụng trong phân loại các loài hoặc dưới loài B. subtilis.

5

Bacillus amyloliquefaciens là một vi sinh vật an toàn (GRAS) do đó B.

amyloliquefaciens được biết đến với nhiều ứng dụng trong sản xuất các sản phẩm thương mại

như sản xuất enzyme công nghiệp. Enzyme từ Bacillus như amylase, cellulose, protease và

lipase có nhiều đặc tính quý như khả năng hoạt động tốt trong dải pH rộng và bền nhiệt. Do

đó, enzyme từ Bacillus đã được ứng dụng nhiều trong công nghiệp chế biến thực phẩm, công

nghiệp dệt may, công nghiệp giấy và công nghiệp sản xuất chất tẩy rửa. B. amyloliquefaciens

là những vi sinh vật an toàn (GRAS) và có thể dùng như probiotics để bổ sung vào thức ăn

hoăc nươc uông nhằm cân băng hê vi sinh đương ruôt . Phytase của các chủng thuộc loài

Bacillus amyloliquefaciens là β propeller phytase với trung tâm hoạt động có vị trí ái lực cao

với Ca2+

. Đây là loại phytase khá bền nhiệt, có tính đặc hiệu cơ chất rất cao với phytate nhưng

lại biểu hiện rất ít hoặc không có hoạt tính đối với các loại cơ chất esters phosphate khác. Sự

có mặt của Ca2+

cũng làm tăng tính bền nhiệt của phytase loại này.

1.5 THU HỒI ENZYME

Trong quá trình sản xuất enzyme bằng lên men chìm hay lên men pha rắn sinh ra hàng

trăm loại enzyme khác nhau, đặc biệt là lên men pha rắn lượng tạp chất trong enzyme còn lớn

hơn rất nhiều và enzyme gắn bám vào các cơ chất xốp gây khó khăn cho việc nghiên cứu.

Quá trình thu hồi enzyme nhằm chiết rút được những enzyme nhất định, giữ lại được tối đa

hoạt tính enzyme và loại bỏ các hợp chất không tan, cô đặc enzyme nhằm phục vụ cho quá

trình tinh sạch enzyme hoặc sản xuất các chế phẩm enzyme. Đặc tính tự nhiên của enzyme,

nguồn gốc enzyme (từ nấm sợi hay vi khuẩn) và loại cơ chất sử dụng là 3 yếu tố chính ban

đầu đóng vai trò quan trọng trong việc chiết xuất enzyme từ cơ chất rắn (cách lựa chọn dung

dịch chiết và phương pháp chiết rút), ngoài ra quá trình chiết xuất thu hồi enzyme trong lên

men xốp còn phụ thuộc vào yếu tố như thời gian ngâm chiết, dung dịch chiết, nhiệt độ ngâm

chiết và tốc độ khuấy.

6

CHƢƠNG II. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP

2.1 CHỦNG VI SINH VẬT, MÔI TRƢỜNG NGHIÊN CỨU

- Các chủng vi sinh vật được nghiên cứu là các chủng thuộc 3 bộ giống phân lập được từ

Sapa (đất rừng Hòang Liên và đất canh tác nông nghiệp xung quanh rừng thuộc Sapa), tỉnh

Lào Cai (274 chủng), từ đất nông nghiệp Ba Vì (34 chủng) và từ Phú Quốc (38 chủng), hiện

đang được lưu giữ tại Bảo tàng giống chuẩn Viện vi sinh vật và Công nghệ sinh học- Đại học

quốc gia Hà Nội.

- Môi trường sàng lọc chủng ưa nhiệt: môi trường thạch dinh dưỡng NA (g/l): cao thịt- 3;

peptone-5; agar-16; pH 6,8± 0,2; khử trùng 121oC trong 15 phút.

- Môi trường dịch thể: môi trường NA (g/l): cao thịt-3; pepton-10; NaCl- 5; pH 6,8± 0,2, môi

trường thạch thường (g/l): cao thịt- 3; pepton- 5, môi trường thạch thường cải tiến (g/l):

pepton- 10g; nước mắm đạm trên 40%- 10ml, môi trường Trypticase soy (hãng BBL), môi

trường Jorquera (2008) (g/l): Glucose- 10; Na-phytate- 2; CaCl2- 2; NH4NO3- 5; KCl- 0,5;

MgSO4.7H2O- 0,5; FeSO4- 0,01; MnSO4- 0,01; khử trùng 2 lần cách nhau 24h, mỗi lần

100oC 15 phút.

- Môi trường sàng lọc chủng sinh phytase (PSM – phytase screening media) (g/l): Glucose-

10; Na-phytate- 4; CaCl2- 2; NH4NO3- 5; KCl- 0,5; MgSO4.7H2O- 0,5; FeSO4- 0,01; MnSO4-

0,01; agar- 16, khử trùng 2 lần cách nhau 24h, mỗi lần 100oC/15 phút.

- Môi trường dịch thể kích thích sinh phytase: các môi trường dịch thể sàng lọc vi sinh vật

sinh phytase được ký hiệu lần lượt là: K1, K2, G, J, H có công thức lần lượt:

+ Môi trường K (g/l): cám gạo-50; (NH4)2SO4- 0,4; MgSO4.7H2O- 0,2; CaCl2 – 2,2; pH 6;

khử trùng 121oC/15 phút.

+ Môi trường K2 (g/l): cám gạo-50; (NH4)2SO4-0,4; MgSO4.7H2O-0,2; CaCl2-2,2; cao men-

7,5; methanol-7,5; pH 6, khử trùng 121oC/15 phút.

+ Môi trường G (g/l): bột đậu tương- 5; sucrose-1; Asparagin-0,5; KCl-0,5; FeSO4- 0,01;

MnSO4- 0,01; pH 5, khử trùng 121oC/15 phút.

7

+ Môi trường J (g/l): Glucose-10; CaCl2- 2; NH4NO3- 5; KCl- 0,5; MgSO4.7H2O- 0,5; FeSO4-

0,01; MnSO4- 0,01; Na-phytate- 0,2%; khử trùng 2 lần cách nhau 24h, mỗi lần 100oC/15

phút.

+ Môi trường H (g/l): Glucose- 3; tryptone- 1; CaCl2- 0,3; MgSO4.7H2O- 0,5; MnCl2.4H2O-

0,04; FeSO4.7H2O- 0,0025; Na-phytate- 1; khử trùng 2 lần cách nhau 24h, mỗi lần 100oC/15

phút.

- Môi trường nuôi xốp với cơ chất là ngô vỡ, gạo lức, bột đỗ tương, cám, dung dịch làm ẩm là

môi trường dịch thể Jorquera không bổ sung cơ chất Na- phytate).

2.2 CÁC PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

- Phương pháp xác định hoạt tính enzyme phytase theo phương pháp của Shimizu và cộng sự,

1992

- Tuyển chọn chủng

+ Sàng lọc các chủng ưa nhiệt: cấy chấm các chủng vi khuẩn trong 3 bộ giống lên đĩa thạch

NA và nuôi trong tủ ấm ở 40oC trong 48 - 72h.

+ Sàng lọc các chủng có sinh tổng hợp phytase

Định tính: Cấy zic zắc các chủng vi khuẩn ưa nhiệt lên môi trường sàng lọc phytase (môi

trường PSM) và nuôi ở tủ ấm 37oC trong 5 ngày, sau khi các khuẩn lạc xuất hiện, tiến hành

lấy các khuẩn lạc xuất hiện vòng trong xung quanh. Đây là các khuẩn lạc vi khuẩn sinh

enzyme phân giải Na-phytate.

Định lượng:

+ Chủng nghiên cứu được nuôi lắc trong các môi trường dịch thể có bổ sung Na-phytate kích

thích sinh phytase là G, H, J, K1, K2 ở 40oC, 200 vòng/phút, sau 3 ngày dịch nuôi cấy được ly

tâm loại bỏ sinh khối và phần dịch trong được dùng để xác định hoạt tính phytase

+ Tiến hành nuôi xốp các chủng vi khuẩn có sinh enzyme phytase trên môi trường gạo lức +

dung dịch làm ẩm, sau đó tách chiết dịch enzyme và xác định hoạt độ enzyme để lựa chọn

chủng có hoạt độ phytase cao nhất.

- Phương pháp xác định khả năng sinh trưởng: khả năng sinh trưởng của các chủng vi khuẩn

được xác định bằng số lượng tế bào trên ml(g).

+ Phương pháp phân loại dựa vào đọc trình tự ADN r16S và 5 gen chức năng gyrA, rpoB,

purH, polC, groEL.

8

- Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy giống thích hợp cho khả năng sinh trưởng ở chủng nghiên

cứu: lựa chọn môi trường nuôi cấy, lựa chọn nhiệt độ nuôi cấy, pH thích hợp, lựa chọn thời

gian nuôi cấy, lựa chọn chế độ thông khí

- Nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy xốp thích hợp cho khả năng tổng hợp phytase ở chủng

nghiên cứu: lựa chọn cơ chất, lựa chọn thời gian nuôi cấy, lựa chọn độ ẩm, lựa chọn tỷ lệ cấy

giống, lựa chọn nguồn cacbon bổ sung, lựa chọn nguồn nitơ bổ sung, lựa chọn các ion kim

loại bổ sung, ảnh hưởng của Ca2+

ở các nồng độ khác nhau.

- Thu hồi enzyme: chiết xuất enzyme sử dụng các loại dung dịch chiết khác nhau: Triton

X100 1%, NaCl 50mM, SDS 1%, Tween 20 1%, Tris HCl pH 7, nước cất, nước máy. Tủa

enzyme bằng amoniumsulphate và dung môi hữu cơ (cồn, acetone).

- Nghiên cứu enzyme phytase

+ Giải trình tự gen mã hóa phytase và so sánh mức độ tương đồng của gen mã hóa phytase

chủng SP1901 với gen mã hóa phytase của các loài khác trên genbank sử dụng chương trình

Blast và xây dựng cây phát sinh chủng loại dựa trên trình tự gen mã hóa phytase.

+ Các đặc tính của enzyme: khả năng bền nhiệt của enzyme, pH thích hợp cho hoạt động của

enzyme, nhiệt độ thích hợp cho hoạt động của enzyme, ảnh hưởng của các ion kim loại đến

hoạt độ của enzyme, sự ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của enzyme trên cơ chất sấy

khô, ảnh hưởng của enyme tiêu hóa đến hoạt độ của enzyme.

CHƢƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 KẾT QUẢ TUYỂN CHỌN

3.1.1 Lựa chọn chủng ƣa nhiệt

Từ tổng số 346 chủng vi sinh vật thuộc 3 bộ giống đã chọn được 91 chủng- trong đó bộ

giống từ Sa Pa có 46/274 chủng, bộ giống từ Ba Vì có 29/34 chủng và bộ giống từ Phú Quốc

có 16/38 chủng có khả năng sinh trưởng được ở 40oC.

3.1.2 Lựa chọn chủng có hoạt tính phytase cao

Định tính: Từ 91 chủng ưa nhiệt được nuôi trên đĩa thạch sàng lọc phytase (PSM) sau 5

ngày, lựa chọn được 2 chủng xuất hiện vùng phân giải trong là SP1901 và D15 (hình 1).

9

Hìn

h 1.

Sinh

trƣởng và vùng phân giải của phytase chủng SP1901 (trái) và D15 (phải) trên PSM

Định lượng trên môi trường lên dịch thể và lên men xốp: chúng tôi đã tiến hành lên men

dịch thể chủng SP1901, D15 để sản xuất phytase trên 5 loại môi trường khác nhau, sau 3 ngày

xác định hoạt tính phytase và lên men xốp trên môi trường chứa gạo lức và bột đỗ tương, sau

3,5 ngày mẫu được chiết xuất để xác định hoạt tính phytase.

Bảng 1. Hoạt tính phytase của 2 chủng SP1901 và D15 trong lên dịch thể và lên

men xốp

Chủng

Hoạt tính phytase

Môi trường lên men dịch thể

(U/ml) Môi trường lên

men xốp (U/g) G H J K1 K2

SP1901 0 0 0,63 0,35 0,26 3,9

D15 0 0 0,5 0,34 0,19 3,1

Với các kết quả thu được ở bảng 5 môi trường J cho hoạt tính phytase cao nhất ở cả 2

chủng, tuy nhiên lại thấp hơn nhiều khi so sánh với hoạt tính phytase được sinh ra trên môi

trường lên men xốp. Mặt khác, môi trường J bổ sung cơ chất Na-phytate tinh khiết rất đắt

tiền, trong khi đó môi trường lên men xốp sử dụng các cơ chất tự nhiên, dễ kiếm, rẻ tiền do đó

chúng tôi quyết định sử dụng lên men xốp cho các nghiên cứu tiếp theo.

Như vậy từ 91 chủng vi sinh vật ưa nhiệt, chúng tôi đã chọn ra 2 chủng vi khuẩn là:

SP1901 và D15 có sinh tổng hợp phytase trên môi trường lên men xốp. Dịch enzyme của 2

chủng này được dùng để xác định khả năng bền nhiệt.

10

3.1.3 Lựa chọn chủng sinh tổng hợp phytase bền nhiệt

Dịch chiết enzyme thô của 2 chủng vi khuẩn SP1901 và D15 được xử lý ở 60oC trong

các khoảng thời gian 10 phút, 20 phút, 30 phút. Sau đó, tiến hành xác định hoạt tính phytase

bằng định lượng, thu được kết quả như sau:

Bảng 2. Độ bền nhiệt của 2 chủng SP1901 và D15 ở 60oC

STT Chủng Nhiệt độ Thời gian xử lý (phút) Hoạt độ tƣơng đối (%)

1 SP1901 60oC

Đối chứng (0) 100

10 95,3

20 93,95

30 90

2 D15 60oC

Đối chứng (0) 100

10 71,3

20 45,7

30 18,8

Như vậy, chủng SP1901 bền ở 60oC sau 30 phút xử lý, hoạt tính còn 90%, trong khi đó

chủng D15 hoạt tính chỉ còn 45,7%. Vì thế chúng tôi lựa chọn chủng SP1901 cho các nghiên

cứu tiếp theo.

11

3.2 PHÂN LOẠI

Hình 2. Cây phát sinh chủng loại của chủng vi khuẩn SP1901 và các loài Bacillus có

quan hệ họ hàng gần dựa vào trình tự gen 16S rRNA

Quan sát trên cây phân loại cho thấy: chủng nghiên cứu nằm cùng vị trí với Bacillus

amyloliquefaciens_NR041455 (giá trị lặp lại 77%) với mức độ tương đồng ở trình tự ADNr

16S là 99,9%.

Để phân loại chính xác đến dưới loài của chủng SP1901, chúng tôi đã thực hiện phản

ứng khuếch đại và giải trình tự 6 đoạn gen: gyrase subunit A (gyrA), RNA polymerase

subunit B (rpoB), phosphoibosylaminoimidazolecarbox-amide formyltransferase (purH),

DNA polymerase III subunit alpha (polC), 60 kDa heat-shock protein groEL (groEL) và 16S

rRNA, sử dụng các cặp mồi theo mô tả của Rooney và cộng sự, (2009).

Staphylococcus aureus_X68417

Bacillus cibi_AY550276

Bacillus indicus_AJ583158

Bacillus idriensis_AY904033

100

Bacillus isabeliae_AM503357

100

Bacillus aerophilus_AJ831844

Bacillus stratosphericus_AJ831841

Bacillus altitudinis_AJ831842

100

Bacillus safensis_AF234854

Bacillus pumilus_AY876289

100

99

Bacillus aerius_AJ831843

Bacillus licheniformis_X68416

Bacillus sonorensis_AF302118

89

Bacillus atrophaeus_AB021181

Bacillus axarquiensis_AY603657

Bacillus mojavensis_AB021191

Bacillus malacitensis_AY603656

69

Bacillus subtilis_AB042061

54

Bacillus vallismortis_AB021198

66

SP 1901

Bacillus methylotrophicus_EU194897

Bacillus amyloliquefaciens_NR041455

77

Bacillus nematotocita_AY820954

65

77

71

81

100

99

100

97

54

94

0.01

12

Hình 3. Cây phát sinh chủng loại của chủng vi khuẩn SP1901 và các loài thuộc nhóm

Bacillus subtilis dựa vào trình tự kết nối 6 gen gyrA, rpoB, purH, polC, groEL và 16S

rRNA

Quan sát trên cây phân loại cho thấy: chủng nghiên cứu nằm cùng vị trí với Bacillus

amyloliquefaciens subsp. plantarum; trong đó SP1901 sai khác 54 bp với Bacillus

amyloliquefaciens subsp. plantarum FZB42 (tương đương 99%) và sai khác 162 bp với

Bacillus amyloliquefaciens subsp. amyloliquefaciens DSM7 (tương đương 97%). Kết quả

phân tích cho thấy chủng nghiên cứu được xếp vào nhóm loài B. amyloliquefaciens subsp.

plantarum và phân tách rõ ràng với nhóm loài B. amyloliquefaciens subsp. amyloliquefaciens

cũng như những loài khác trong nhóm B. subtilis.

Đặc điểm hình thái

Hình 4. Hình thái tế bào (trái) và khuẩn lạc (phải) của chủng SP1901

Bacillus cereus ATCC 14579

Bacillus pumilus NRRL NRS-272

Bacillus sonorensis NRRL-B-23154

Bacillus licheniformis DMS 13 SP

1901

Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum FZB42

Bacillus amyloliquefaciens subsp. amyloliquefaciens DSM7

100

Bacillus atrophaeus NRRL NRS-213

Bacillus mojavensis NRRL B-14698

Bacillus vallismortis NRRL B-14890

Bacillus tequilensis NRRL B-41771

Bacillus subtilis subsp. spizizenii NRRL B-23049

Bacillus subtilis subsp. inaquosorum NRRL B-23052

Bacillus subtilis subsp. subtilis NRRL NRS-744

96

80

73

100

100

100

98

100

100

100

0.02

13

3.3 NGHIÊN CỨU ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY

3.3.1 Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy giống

Hình 5. Môi trƣờng nhân giống thích hợp

chủng SP1901

Hình 6. pH thích hợp cho sinh trƣởng

chủng SP1901

Hình 9. Chế độ thông khí thích hợp cho sinh trƣởng chủng SP1901

Giống khởi động được dùng để cấy vào các môi trường lên men xốp, đóng vai trò rất

quan trọng đối với quá trình lên men xốp sau đó đặc biệt là lượng sinh khối và chất lượng

giống. Các yếu tố này được quyết định bởi các điều kiện nhân giống như môi trường, pH,

nhiệt chế độ thông khí và thời gian (quyết định tuổi của giống) tạo điều kiện tối đa cho sự

phát triển sinh khối. Với các kết quả thu được, chúng tôi nhận thấy điều kiện nhân giống thích

Hình 7. Nhiệt độ thích hợp cho sinh

trƣởng chủng SP1901

Hình 8. Thời gian thích hợp cho sinh

trƣởng chủng SP1901

14

hợp nhất cho chủng SP1901 là nhân giống trên môi trường dịch thể NA ở 40oC, pH 6 và nuôi

trong điều kiện lắc 200 vòng/ phút. Số lượng tế bào đạt được cao nhất sau 16-24 h nuôi cấy.

3.3.2 Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy xốp

Hình 10. Cơ chất thích hợp cho lên men xốp của chủng SP1901

Hình 11. Độ ẩm thích hợp cho lên men

xốp của chủng SP1901

Hình 12. Tỷ lệ cấy giống thích hợp cho

lên men xốp của chủng SP1901

Hình 13. Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy lên sinh khối và hoạt tính phytase của

chủng SP1901

15

Hình 14. Nguồn các bon thích hợp cho lên

men xốp của chủng SP1901

Hình 15. Nguồn nitơ thích hợp cho lên

men xốp của chủng SP1901

Hình 16. Ảnh hƣởng của các ion kim loại đến

khả năng sinh tổng hợp phytase của chủng

SP1901

Hình 17. Ảnh hƣởng của hàm lƣợng

Ca2+

đến khả năng sinh tổng hợp

phytase của chủng SP1901

Với những kết quả thu được khi tối ưu hóa các điều kiện lên men xốp của chủng

SP1901, ngô vỡ là cơ chất thích hợp nhất cho quá trình sản xuất phytase, độ ẩm 50% và tỷ lệ

cấy giống từ 10-20% tạo điều kiện thuận lợi cho sự sinh trưởng và sinh tổng hợp phytase và

hoạt tính phytase đạt được cao nhất sau 84 h nuôi cấy. Chủng SP1901 có thể sử dụng nguồn

cacbon và nitơ sẵn có trong cơ chất tuy nhiên khi có mặt lactose, glycerol, ure và NH4NO3

cũng làm tăng nhẹ hoạt tính phytase thu được. Ion Ca2+

có vai trò quyết định đối với quá trình

sản sinh phytase ở nồng độ thích hợp từ 0,1-1%, các môi trường không có mặt Ca2+

đều

không có sự sinh tổng hợp phytase của chủng SP1901.

16

3.4 THU HỒI ENZYME

3.4.1 Thu hồi enzyme bằng các dung dịch chiết khác nhau

Hình 18. Chiết xuất enzyme bằng

các dung môi khác nhau

Hình 19. Tủa enzyme bằng cồn và

acetone

3.4.2 Tủa enzyme bằng các dung môi khác nhau

Khi tủa enzyme bằng các phân đoạn khác nhau với muối (NH4)2SO4, hoạt tính phytase

mất hoàn toàn ở tất cả các phân đoạn. Do đó không thể sử dụng muối (NH4)2SO4 khi tủa

phytase trong trường hợp này. Khi tủa bằng cồn và acetone (hình 19) phytase tủa nhiều nhất ở

nồng độ cồn và acetone 70%.

3.5 NGHIÊN CỨU ENZYME PHYTASE CỦA CHỦNG SP1901

3.5.1 Phân tích trình tự gen phytase và so sánh với các loài có quan hệ gần gũi

Trình tự gen phytase chủng SP1901 gồm 1175 bp, được so sánh độ tương đồng với các

chủng thuộc nhóm Bacillus substilis khác đã được công bố trên Genbank. Cây phân loại được

xây dựng dựa vào trình tự của gen phytase của chủng SP1901 và 33 chủng khác thuộc nhóm

Bacillus substilis được thể hiện trong hình 28.

Kết quả ở hình 20 cho thấy chủng SP1901 có độ tương đồng 97% với trình tự gen

phytase của chủng Bacillus amyloliquefaciens FZB42, 97% với trình tự gen phytase của

chủng Bacillus sp. B13, 96% với trình tự gen phytase của chủng Bacillus sp. DS11, 90% với

trình tự gen phytase của Bacillus amyloliquefaciens DSM7. Trong cây phát sinh được xây

dựng dựa trên trình tự gen phytase, các loài Bacillus amyloliquefaciens và Bacillus subtilis

nằm xen kẽ lẫn nhau. Khi so sánh vị trí của chủng SP1901 trong 2 cây phát sinh chủng loại

17

được xây dựng dựa trên trình tự gen phytase và 6 gen cho thấy: trong cây xây dựng dựa trên 6

gen, vị trí của chủng SP1901 rất gần với 2 chủng Bacillus amyloliquefaciens subsp.

amyloliquefaciens DSM7 và Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum FZB42, tuy nhiên

trong cây dựa trên trình tự gen phytase, vị trí chủng SP1901 chỉ gần với Bacillus

amyloliquefaciens subsp. plantarum FZB42 và xa so với chủng Bacillus amyloliquefaciens

subsp. amyloliquefaciens DSM7. Như vậy, có thể thấy rằng trình tự gen phytase của các

chủng trong cùng loài Bacillus amyloliquefaciens rất đa dạng và khẳng định thêm kết quả

định danh chủng SP1901 đến mức dưới loài là Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum.

Hình 20. Cây phát sinh chủng loại của chủng vi khuẩn SP1901 và các loài Bacillus

có quan hệ họ hàng gần dựa vào trình tự gen mã hóa phytase

Bacillus subtilis E20_FJ541287 B. amyloliquefaciens subsp plantarum CAU B946_HE617159

Bacillus subtilis_AJ584664

64

Bacillus sp. MD2_GU143090 Bacillus sp. DS11_U85968

72

Bacillus subtilis_WYCQ02_FJ986327

79

Bacillus subtilis_ARRMK33 _EF092835 Bacillus subtilis_AF292103

Bacillus subtilis IDCC 1102_DQ346197

86

Bacillus amyloliquefaciens FZB42_CP000560

100

Bacillus sp. HQ730912_B13

62

SP 19.01

89

Bacillus sp. SDBZ4_GU198969 Bacillus subtilis_AF298179 Bacillus subtilis B9601-Y2 _EU624118

Bacillus amyloliquefaciens_FZB45_ AY055220 B.amyloliquefaciens subsp plantarum YAU B9601-Y2_HE774679 Bacillus amyloliquefaciens Y2_CP00333 Bacillus subtilis WHNB02_AY220075 Bacillus sp. SD01N_AY518208 48

74 64

61

62

82

98

68

57

Bacillus amyloliquefaciens LL3_CP002634 Bacillus amyloliquefaciens TA208_CP002627 Bacillus amyloliquefaciens XH7_CP002927

93

Bacillus amyloliquefaciens DSM 1061 HM747163

92

Bacillus amyloliquefaciens_AF453255

93

Bacillus amyloliquefaciens DSM7_FN597644 Bacillus amyloliquefaciens BAP_AY836773 Bacillus subtilis ATCC 12711_JQ437256

100

Bacillus subtilis McCoyRa_JN886002

100

Bacillus subtilis_AF029053

100

Bacillus subtilis_AJ277890

100

Bacillus subtilis US417 _AM501550

100

Bacillus subtilis XF-8_HM070997

99

97

100

100

0.01

18

3.5.2 Đặc tính enzyme phytase thô

Hình 21. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến độ

bền của phytase chủng SP1901

Hình 22. Khả năng bền nhiệt của

phytase trên cơ chất đƣợc sấy khô ở 50oC

trong 24h

Hình 23. pH hoạt động thích hợp của

phytase chủng SP1901

Hình 24. Nhiệt độ hoạt động thích hợp

của phytase chủng SP1901

19

Hình 25. Ảnh hƣởng của các ion kim loại

đến hoạt tính của phytase chủng SP1901

Hình 26. Ảnh hƣởng của enzyme

tiêu hóa đến hoạt động của phytase

chủng SP1901

Hình 27. Ảnh hƣởng của Ca2+

đến độ bền nhiệt của phytase chủng SP1901 xử lý ở 60oC

(phải), xử lý ở 70oC (trái)

Như vậy với các kết quả nghiên cứu đặc tính enzyme phytase của chủng SP1901 cho

thấy rằng: phytase của chủng bền ở 60oC (vẫn giữ được 90% hoạt tính sau 30 phút xử lý ở

60oC), hoạt động tối ưu ở pH 5,6-7,2 và 50

oC. Sự có mặt của Ca

2+ và Cu

2+ làm tăng nhẹ hoạt

tính phytase và sự có mặt EDTA từ 2mM trở lên làm ức chế hoàn toàn hoạt tính phytase. Ca2+

làm tăng độ bền nhiệt của phytase ở 60 và 70oC, khi không có mặt Ca

2+ ở 70

oC sau 30 phút

xử lý hoạt tính chỉ còn 28% tuy nhiên khi có mặt Ca2+

, sau khi xử lý 30 phút ở 70oC hoạt tính

vẫn giữ được 95% hoạt tính. Khả năng bền nhiệt của phytase trên cơ chất sấy khô tăng đáng

kể, sau 30 phút xử lý ở lần lượt 60, 70 và 80oC hoạt tính phytase giữ được 90, 77 và 49%, sau

10 phút xử lý ở 90oC hoạt tính phytase chỉ còn 31%. Phytase của chủng SP1901 bền với

20

enzyme tiêu hóa trypsinee 0,1mg/ml pH 8 khi được ủ với trypsinee trong 30 phút và bị giảm

dần hoạt tính khi tăng dần thời gian ủ với pepsine 10 mg/ml pH 3.

KẾT LUẬN

- Từ 346 chủng, đã sàng lọc được 91 chủng chịu nhiệt có khả năng sinh trưởng được ở

40oC. Các chủng này được nuôi trên môi trường PSM, định lượng trên môi trường dịch thể,

lên men xốp và kiểm tra khả năng bền nhiệt đã chọn được chủng SP1901 có hoạt tính phytase

cao và bền nhiệt.

- Chủng SP1901 được định danh là loài B. amyloliquefaciens subsp. plantarum dựa trên

phân tích trình tự ADNr 16S và trình tự kết nối của 6 gen gyrA, rpoB, purH, polC, groEL,

16S rRNA.

- Điều kiện nhân giống thích hợp của chủng SP1901: môi trường thạch thường ở 40oC,

pH 6, điều kiện hiếu khí sau 16-24 h nuôi cấy.

- Điều kiện lên men xốp thích hợp của chủng SP1901 cho hoạt tính phytase cao nhất: cơ

chất là ngô vỡ (đạt 4,68U/g), độ ẩm là 50%, tỷ lệ cấy giống phù hợp nhất là từ 10-20% và sau

84 h nuôi cấy, nguồn cacbon là lactose, glycerol, sucro, CMC và nguồn nitơ là ure. Ion Ca2+

có vai trò rất quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp phytase ở nồng độ 0,2-0,8%.

- Thu hồi enzyme bằng dung dịch chiết SDS 1% và nước máy cho hiệu quả chiết xuất

cao nhất (5,74 và 5,54 U/g). Phytase bị mất hoạt tính hoàn toàn ở tất cả các phân đoạn khi tủa

21

bằng (NH4)2SO4, khi tủa bằng cồn và acetone phytase tủa nhiều nhất ở nồng độ 70% đạt 91-

95%.

- Phytase của chủng SP1901 bền ở 60oC, hoạt động tối ưu ở pH 5,6-7,2 và 50

oC. Sự có

mặt của Ca2+

và Cu2+

làm tăng hoạt tính phytase và sự có mặt EDTA từ 2 mM làm ức chế

hoàn toàn hoạt tính phytase. Ca2+

làm tăng độ bền nhiệt của phytase ở 60oC và 70

oC. Khả

năng bền nhiệt của phytase trên cơ chất sấy khô tăng đáng kể, phytase của chủng SP1901 mẫn

cảm với pepsine và không mẫn cảm với trypsine.

References

TIẾNG VIỆT

1. Đỗ Thị Ngọc Huyền (2007), Nghiên cứu tính chất phytase tự nhiên và tái tổ hợp của vi

khuẩn Bacillus subtilis, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt

Nam.

2. Ngô Thanh Xuân (2011), Nghiên cứu phytase tái tổ hợp từ Aspergillus niger XP trong

Pichia pastoris và bước đầu ứng dụng trong chăn nuôi. Luận án tiến sĩ, Đại học sư

phạm Hà Nôi.

3. Nguyễn Thùy Châu (2009), Hoàn thiện công nghệ sản xuất enzym phytaza để bổ sung

vào thức ăn chăn nuôi và phục vụ một số ngành công nghiệp. Báo cáo dự án khoa học

kỹ thuật - Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, Viện Cơ điện Nông nghiệp và Công

nghệ sau thu hoạch.

TIẾNG ANH

4. Anderson RJ (1914), A contribution to the chemistry of phytin. I. Composition of

barium phytate and phytic acid. II. A study of the properties of phytic acid and its

decomposition products. Eighth paper on phytin. Journal Biological Chemistry 17: 171-

190.

5. Angel R, Tamim NM, Applegate TJ, Dhandu AS, Ellestad LE (2002), Phytic acid

chemistry: influence on phytin-phosphous availability and phytase efficacy. Journal

Applied Poultry Research 11: 471-480.

6. Alvarez F, Castro M, Principe A, Borioli G, Fischer S, Mori G & Jofre E (2012), The

plant-associated Bacillus amyloliquefaciens strains MEP2 18 and ARP2 3 capable of

producing the cyclic lipopeptides iturin or surfactin and fengycin are effective in

biocontrol of sclerotinia stem rot disease. Journal of applied microbiology 112(1): 159-

174.

7. Arguelles-Arias A, Ongena M, Halimi B, Lara Y, Brans A, Joris B & Fickers P (2009),

Bacillus amyloliquefaciens GA1 as a source of potent antibiotics and other secondary

metabolites for biocontrol of plant pathogens. Microbial Cell Factories 8: 63.

8. Ash C, Farow JAE, Wallbanks S & Collins MD (1991), Phylogenetic heterogeneity of

the genus Bacillus revealed by comparative analysis of small-subunit-ribosomal RNA

sequences. Letters in Applied Microbiology 13(4): 202-206.

9. Bae HD, Yanke LJ, Cheng KJ, Selinger LB. (1999), A novel staining method for

detecting phytase activity. Journal of Microbiological Methods - Elsevier 39(1):17-22.

22

10. Baldi BG, Franceschi VR, Loewus FA (1987), Localization of phosphous and cation

reserves in Lilium longiflorum pollen. Plant Physiology 83(4): 1018-1021.

11. Billington DC, editor (1993), The inositol phosphates: chemical synthesis and biological

significance. Weinheim Verlag Chemic: 153.

12. Bogar B, Szakacs G, Linden JC, Pandey A, Tengerdy RP. 2003, Optimization of

phytase production by solid substrate fermentation. Journal of industrial microbiology

and biotechnology 30(3):183-9.

13. Borriss R, Chen XH, Rueckert C, Blom J, Becker A, Baumgarth B, Fan B, Pukall R,

Schumann P, Spröer C, Junge H, Vater J, Pühler A, Klenk HP. (2011), Relationship of

Bacillus amyloliquefaciens clades associated with strains DSM 7T and FZB42T: a

proposal for Bacillus amyloliquefaciens subsp. amyloliquefaciens subsp. nov. and

Bacillus amyloliquefaciens subsp. plantarum subsp. nov. based on complete genome

sequence comparisons. International Journal of Systematic and Evolutionary

Microbiology 61(8): 1786-1801.

14. Bourdillon J (1951), A crystalline bean seed protein in combination with phytic acid.

Journal Biological Chemistry 189(1): 65-72.

15. Byrd CA, Matrone G (1965), Investigations of chemical basis of zinc-calcium-phytate

interaction in biological systems. Proceedings of the Society for Experimental Biology

and Medicine 119: 347-349.

16. Cao H, He S, Wei R, Diong M & Lu L (2011), Bacillus amyloliquefaciens G1: A

Potential Antagonistic Bacterium against Eel-Pathogenic Aeromonas hydrophila. Evid

Based Complement Alternat Med 2011: 7.

17. Caldwell AG, Black CA (1958), Inositol hexaphosphate. III. Content in soils. Soil

Science Society of America Journal 22: 290-293.

18. Cheryan M (1980), Phytic acid interaction in food systems. CRC critical reviews in food

science and nutrition 13: 297-335.

19. Chen XH, Koumoutsi A, Scholz R, Eisenreich A, Schneider K, Heinemeyer I,

Morgenstern B, Voss B, Hess WR, Reva O, Junge H, Voigt B, Jungblut PR, Vater J,

Süssmuth R, Liesegang H, Strittmatter A, Gottschalk G, Borriss R. (2007), Comparative

analysis of the complete genome sequence of the plant growth-promoting bacterium

Bacillus amyloliquefaciens FZB42. Nature Biotechnol 25(9): 1007-1014.

20. Choi YM, Suh HJ, Kim JM (2001), Purification and properties of extracellular phytase

from Bacillus sp KHU-10. Journal of Protein Chemistry 20(4): 287-292.

21. Chun J & Bae KS (2000), Phylogenetic analysis of Bacillus subtilis and related taxa

based on partial gyrA gene sequences. Antonie Van Leeuwenhoek 78(2): 123-127.

22. Cosgrove DJ, Irving GCJ, editors (1980), Inositol Phosphates: Their chemistry,

Biochemistry and Physiology. North Holland, Inc., New York: Elsevie: 191.

23. Davies NT, Nightingale R (1975), The effects of phytate on intestinal absorption and

secretion of zinc,and whole body retention of zinc, copper, iron, and manganese in rats.

Bristish Journal of Nutriton 34(2): 243-258.

24. Davies NT, A. FA (1978), The similarity between alkaline phosphatase (EC.3.1.3.1) and

phytase (EC.3.1.3.8) activity in rat intestine and their importance in phytate induced zinc

deficiency. Bristish Journal of Nutriton 39(2): 307-316.

23

25. David B, Mitchell, Kurt Vogel, Bernd J, Weimann, Luis Pasamontes, Adolphus P G M,

van Loon (1997), The phytase subfamily of histidine acid phosphatases: Isolation of

genes for two novel phytases from the fungi Aspergillus terreus and Myceliophthora

thermophila. Microbiology 143: 245-252.

26. Dvoráková J (1998), Phytase: sources, preparation and exploitation. Folia

Microbiologica 43(4): 323-338.

27. Dyer WJ, Wrenshall CL, Smith GR (1940), The isolation of phytin from soil. Science

91(2361): 319–321.

28. Earl AM, Losick R, Kolter R. 2008, Ecology and genomics of Bacillus subtilis. Trends

in Microbiology 16(6): 269-75.

29. Farhat A., Chouayekh H., Mounira B., Bouchaala K., Bejar S. (2008), Gene Cloning and

Characterization of a Thermostable Phytasefrom Bacillus subtilis US417 and

Assessment of its Potentialas a Feed Additive in Comparison with a Commercial

Enzyme. Molecular Biotechnology 40(2): 127–135.

30. Ferguson EL, Gibson RS, Thompson LU, Ounpuu S (1989), Dietary calcium, phytate,

and zinc and the calcium, phytate and zinc molar ratios of the diets of East-African

children. The American Journal of Clinical Nutrition 50(6): 1450-1456.

31. Fontaine TD, Pons WA, Irving GW (1946), Protein-phytic acid relationship in peanuts

and cottonseed. Journal Biological Chemistry 164(2): 487-507.

32. Fu SJ, Sun JY, Qian LC, Li ZY (2008), Bacillus phytases: Present scenario and future

perspectives. Applied Biochemistry and Biotechnology 151(1): 1-8.

33. Graf E, Eaton JW (1993), Suppression of colonic cancer by dietary phytic acid.

Nutrition and Cancer 19(1): 11-19.

34. Greiner R, Konietzny U, Jany KD (1993), Purification and characterization of two

phytases from Escherichia coli. Archives Biochemistry and Biophysics 303(1): 107-113.

35. Greiner R, Konietzny U (2006), Phytase for food application. Food Technology and

Biotechnology 44: 125-140.

36. Greiner E, Konietzny U (1996), Construction of a bioreactor to produce special

breakdown products of phytate. Journal Biotechnology 48(1-2): 153-159.

37. Gulati H. K., Chadha B. S., Saini H. S. (2007), Production and characterization of

thermostable alkaline phytase from Bacillus laevolacticus isolated from rhizosphere soil.

Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology 34(1): 91–98.

38. Gupta R, Beg QK & Lorenz P (2002), Bacterial alkaline proteases: molecular

approaches and industrial applications. Applied Microbiology and Biotechnology 59(1):

15-32.

39. Gupta SK, Venkatasubramanian TA (1975), Production of aflatoxyn on soybeans.

Applied Microbiology 29(6): 834-836.

40. Ha NC, Oh BC, Shin S, Kim HJ, Oh TK, Kim YO, Choi KY, Oh BH. (2000), Crystal

structures of a novel, thermostable phytase in partially and fully calcium-loaded states.

Nature Structural & Molecular Biology 7(2): 147-153.

41. Harland BF, Morris ER (1995), Phytin: A good or a bad food component. Nutrition

Research 15: 733-754.

42. Harland BF, Oberleas D (1987), Phytate in Foods. World Review of Nutrition &

Dietetics 52: 235-259.

24

43. Hartig T (1855), Über das Klebermehl. Bot Ztg 13: 881-882.

44. Hartig T (1856), Weitere mittheilungen das klebermehl (Aleuron) betreffend. Bot Ztg

14: 257-268.

45. Hawkins PT, Poyner DR, Jackson TR, Letcher AJ, Lander DA, Irvine RF (1993),

Inhibition of ironcatalysed hydroxyl radical formation by inositol polyphosphates: a

possible physiological function for myo-inositol hexakisphosphate. Biochemical Journal

294(3): 929-934.

46. Honke J, Kozlowska H, Vidal-Valverde C, Frias J, Gorecki R (1998), Changes in

quantities of inositol phosphates during maturation and germination of legume seeds. Z

Lebensm Unters Forsch A 206: 279-283.

47. Idriss EE, Makarewicz O, Farouk A, Rosner K, Greiner R, Bochow H, Richter T,

Borriss R. (2002), Extracellular phytase activity of Bacillus amyloliquefaciens FZB45

contributes to its plant-growth-promoting effect. Microbiology 148(7): 2097-2109.

48. Igbal TH, Lewis KO, T. CB (1994), Phytase activity in the human and rat small

intestine. Gut 35(9): 1233-1236.

49. Igbasan FA, Männer K, Miksch G, Borriss R, Farouk A SO (2000), Comparative studies

on the in vitro properties of phytases from various microbial origins. Archives of Animal

Nutrition 53(4): 353-373.

50. IUB (1979), Enzyme nomenclature. In: Recommendations of the Nomenclature

Committee of the International Union of Biochemistry. New York: Academic Press: 247.

51. Jackson JF, Jones G, Linskens HF (1982), Phytic acid in pollen. Phytochemistry 21(6):

1255-1258.

52. Jacobsen T, Slotfeldt DE (1983), Phytic acid and metal availability: a study of Ca and

Cu binding. Cereal Chemistry 60: 392-395.

53. Katayama T (1995), Effect of dietary sodium phytate on the hepatic and serum levels of

lipids and on the hepatic activities of NADPH-generating enzymes in rats fed on

sucrose. Bioscience, Biotechnology and Biochemistry 59(6): 1159-1160.

54. Kerovuo J, Lauraeus M, Nurminen P, Kalkkinen N, Apajalahti J (1998), Isolation,

characterization, molecular gene cloning and sequencing of novel phytase from Bacillus

subtillis. Applied Environmental Microbiology 64(6): 2079-2085.

55. Kerovuo J (2000), A Novel Phytase from Bacillus. Characterization and Production of

the Enzyme, PhD thesis, Faculty of Science, University of Helsinki, Finland.

56. Kerovuo J, Lappalainen I, Reinikainen T (2000), The metal dependence of Bacillus

subtilis phytase. Biochemical and Biophysical Research Communications 268(2): 365-

369.

57. Kim YO, Kim HK, Bae KS, Yu JH, Oh TK (1998), Purification and properties of a

thermostable phytase from Bacillus sp. DS11. Enzyme and Microbial Technology 22(1):

2-7.

58. Knuckles BE (1985), Effect of phytate and partially hydrolyzed phytate on in vitro

protein Digestibility. Journal of Food Science 50(4) : 1080–1082.

59. Konietzny U, Greiner R, editors (2003), Phytic acid and nutritional impact. 2 ed.

Amsterdam: Elsevier Science: 4546-4563.

25

60. Kostrewa D, Wyss M, D'Arcy A, van Loon APGM (1999), Crystal structure of

Aspergillus niger pH 2.5 acid phosphatase at 2.4 A resolution. Journal Molecular

Biology 288(5): 965-974.

61. Koumoutsi A, Chen XH, Vater J & Borriss R (2007), DegU and YczE positively

regulate the synthesis of bacillomycin D by Bacillus amyloliquefaciens strain FZB42.

Applied Environmental Microbiology 73(21): 6953-6964.

62. Kubo Y, Rooney AP, Tsukakoshi Y, Nakagawa R, Hasegawa H & Kimura K (2011),

Phylogenetic analysis of Bacillus subtilis strains applicable to natto (fermented soybean)

production. Applied and Environmental Microbiology 77(18): 6463-6469.

63. Lei XG, Ku PK, Miller ER, Yokoyama MY (1993), Supplementing corn-soybean meal

diets with microbial phytase linearly improveshytate phosphous utilization by weanling

pigs. Journal Animal Science 71: 3359-3367.

64. Lei XG, Porres JM (2003), Phytase enzymology, applications, and biotechnology.

Biotechnology Letters 25(21): 1787-1794.

65. Lei Xin Gen, Porres Jesus M., Edward J. Mullaney and Henrik, Brinch-Pedersen,

Phytase: Source, structure and application. Industrial Enzymes: 505–529.

66. Lott JA, Ockenden I, Raboy V, Batten GD (2002), A global estimate of phytic acid and

phosphous in crop grains, seeds, and fruits. In: Reddy NR, Sathe SK, editors. Food

Phytates. Boca Raton, FL: CRC Press: 6-23.

67. Lott JNA, Buttrose MS (1978), Globoids in protein bodies of legume seed cotyledons.

Australian Journal of Plant Physiology 5: 89-111.

68. Lönnerdal B (2000), Dietary factors influencing zinc absorption. Journal Nutrition 130:

1378-1383.

69. Maddaiah VT, Kurnick AA, Riel BL (1964), Phytic acid study. Proceedings of the

Society for Experimental Biology and Medicine 115: 391-393.

70. Maddiaah VT, Kurnick AA, Hulett BJ, Reid BL (1964), Nature of intestinal phytase

activity. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine 115: 1054-

1057.

71. Maenz DD, Engele-Schaan CM, Newkirk RW, Classen HL (1999), The effect of

minerals and mineral chelators on the formation of phytase-resistant and phytase-

susceptible forms of phytic acid in solution and in a slurry of canola meal. Animal Feed

Science and Technology 81(3-4): 177-192.

72. Mallin MA (2000), Impact of industrial animal production on river and estuaries.

American Sciences 88(1): 26-73.

73. Maria I.; Aneli M.; Ana F.D. ; Asae S. (2002), Xylanase production by Trichoderma

hazianum Rifai by solid state fermentation on sugarcane bagasse. Brazilian Journal of

Microbiology 33(1): 67-72.

74. Marshall J. John 1980, Preservation of enzymes by conjugation with dextran. Chemical

Deterioration of Proteins 123: 125–143.

75. Martin CJ, Evans WJ (1989), Phvtic acid-enhanced metal ion exchange reactions: the

effect on carboxypeptidase A. Journal of Inorganic Biochemistry 35(4): 267-288.

76. Maugenest S, Martinez I, Lescure A M (1997), Cloning and characterization of a cDNA

encoding maize seedling phytase. Biochemistry J 322(2): 511-517.

26

77. McWard GW (1969), Effects of phytic acid and ethylenediaminetetraacetic acid

(EDTA) on the chick‘s requirement for magnesium. Poultry Science 48(3): 791-794.

78. Mellanby E (1949), The rickets-producing and anticalcifying action of phytate. Journal

of Physiology 109(3-4): 488-533.

79. Menniti FS, Oliver KG, Putney JW, Shears SB (1993), Inositol phosphates and cell

signalling: New views of InsP and InsP. Trends in Biochemical Sciences 18(2): 53-56.

80. Minihane AM, Rimbach G (2002), Iron absorption and the iron binding and anti-

oxydant properties of phytic acid. International Journal of Food Science and

Technology 37(7): 741-748.

81. Mittal Arpana, Singh Gulab, Goyal Varsha, Yadv Anita, Kumar Neeraj (2012),

Production of phytase by acido-thermophilic strain of Klebsiella sp. DB-3FJ711774.1

Using orange peel flour under submerged. Innovative Romanian Food Biotechnology

10: 18-27.

82. Morris ER, Ellis R (1976), Phytate as a carrier for iron: A breakthrough in iron

fortification of foods. National Agricultural Library 50(3): 28-33.

83. Moushree Pal Roy, Madhumita Poddar, Kamal Krishma Singh và Shilpi Ghosh (2012),

Purification, characterization and properties of phytase from Shigella sp. CD2. India

journal Biochemistry & Biophysics 49: 266-271.

84. Mullaney EJ, Ullah AHJ (2003), The term phytase comprises several different classes of

enzymes. Biochemical and Biophysical Research Communications 312(1): 179-184.

85. Nakamura LK, Roberts MS & Cohan FM (1999), Relationship of Bacillus subtilis

clades associated with strains 168 and W23: a proposal for Bacillus subtilis subsp.

subtilis subsp. nov. and Bacillus subtilis subsp. spizizenii subsp. nov. International

Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 49: 1211-1215.

86. Nayini NR, Markakis P (1986), Phytases. In: Graf E, editor. Phytic Acid: Chemistry and

Applications. Minneapolis, MN: Pilatus Press: 101-118.

87. Neuberg C (1908), An analysis of the constitution of phytin. Biochemistry Z 9: 557-560.

88. Neuberg C (1908), The connection of the circular inositol to the aliphatic sugar.

Biochemistry Z 9: 551-556.

89. Oberleas D, Muhrer ME, O‘Dell BL (1962), Effects of phytic acid on zinc availability

andparakeratosis in swine. Journal of Animal Science 21: 57-61.

90. O‘Dell BL, Yohe JM, Savage JE (1964), Zinc availability in the chick as affected by

phytate, calcium, and ethylenediamine-tetra-acetate. Poultry of Science 43(2): 415-419.

91. O‘Dell BL, deBoland A, Koirtyohann R (1972), Distribution of phytate and nutritionally

important elements among the morphological components of cereal grains. Journal of

Agricultural and Food Chemistry 20: 718-721.

92. O‘Dell BL, De Boland AR (1976), Complexation of phytin with proteins and cations in

corn germand oilseed meals. Journal of Agricultural and Food Chemistry 24: 804-808.

93. Ogawa M, Tanaka K, Kasai Z (1975), Isolation of high phytin containing particles from

rice grains using an aqueous polymer two phase system. Agricultural and Biological

Chemistry 39(3): 695-700.

94. Ogawa M, Tanaka K, Kasai Z (1979), Phytic acid formation in dissected ripening rice

grains. Agricultural and Biological Chemistry 43(10): 2211-2213.

27

95. Oh BC, Chang BS, Park KH, Ha NC, Kim HK, Oh BH, Oh TK (2001), Calcium-

dependent catalytic activity of a novel phytase from Bacillus amyloliquefaciens DS11.

Biochemistry 40(32): 9669-9676.

96. Oh BC, Choi WC, Park S, Kim YO, Oh TK (2004) Biochemical properties and substrate

specificities of alkaline and histidine acid phytase. Applied Microbiology and

Biotechnology 63(4): 362-372.

97. Oh BC, Kim MH, Yun BS, Choi WC, Park SC, Bae SC, Oh TK (2006), Ca2+

-inositol

phosphate chelation mediates the substrate specificity of β-propeller phytase.

Biochemistry 45(31): 931-939.

98. Pandey A, Szakacs G, Soccol C R, Rodriguez-Leon J A, Soccol V T (2001), Production,

purification and properties of microbial phytases. Bioresour Technology 77(3): 203-

214.

99. Phillippy BQ, Graf E (1997), Antioxydant functions of inositol 1,2,3-trisphosphate and

inositol 1,2,3,6-tetrakisphosphate. Free Radical Biology Medicine 22(6): 939-946.

100. Phillippy BQ (1999), Susceptibility of wheat and Aspergillus niger phytases to

inactivation by gastrointestinal enzymes. Journal of Agriculture and Food Chemistry

47(4): 1385-8.

101. Powar V K và Jagannathan V (1982), Purificaiton and properties of phytate-specific

phosphatase from Bacillus substilis. Journal of Bacteriology 151(3): 1102.

102. Prasad AS, Oberleas DT (1974), Thymidine kinase activity and incorporation of

thymidine into DNA in zinc-deficient tissue. Journal of Laboratory and Clinical

Medicine 83(4): 634-639.

103. Pratley CA, Stanley DW (1982), Protein-phytate interactions in soybeans. I.

Localization of phytate in protein bodies and globoids. Journal of Food Biochemistry

6(4): 243-253.

104. Priest FG, Goodfellow M, Shute LA & Berkeley RCW (1987), Bacillus

amyloliquefaciens sp. nov. norn. rev. . International Journal of Systematic and

Evolutionary Microbiology 37: 69-71.

105. Raboy V, Dickinson DB (1987) The timing and rate of phytic acid accumulation in

developing soybean seeds. Plant Physiology 85(3): 841-844.

106. Ralph A. Slepecky, H. Ernest Hemphill 2006, The Genus Bacillus—Nonmedical.

Prokaryotes 4: 530–562.

107. Rani R, Ghosh S. 2011, Production of phytase under solid-state fermentation using

Rhizopus oryzae: novel strain improvement approach and studies on purification and

characterization. Bioresour Technology.102(22): 10641-9.

108. Ravindran V, Ravindran G, Sivalogan S (1994), Total and phytate phosphous contents

of various foods and feedstuffs of plant origin. Food Chemistry 50(2): 133-136.

109. Ravindran V, Bryden WL, Kornegay ET (1995), Phytin: Occurrence, bioavailability and

implications in poultry nutrition. Poultry and Avian Biology Reviews 6: 125-143.

110. Reddy NR, Pierson MD, Sathe SK, Salunkhe DK, editors (1982), Phytates in cereals

and legumes. Advances in Food Reseach 28: 1-92.

111. Reddy NR, Pierson MD, Sathe SK, Salunkhe DK (1989), Interactions of phytate with

proteins and minerals. In: Reddy NR, Pierson MD, Sathe SK, Salunkhe DK, editors.

Phytate in legumes and cereals. CRC press: 57-70.

28

112. Reddy NR, Sathe SK, editors (2002), Food Phytate. CRC Press LLC: 258.

113. Reinhold JG (1973), Phytate concentrations of leavened and unleavened bread. Ecology

of Food and Nutrition 1: 187-192.

114. Reva ON, Dixelius C, Meijer J & Priest FG (2004), Taxonomic characterization and

plant colonizing abilities of some bacteria related to Bacillus amyloliquefaciens and

Bacillus subtilis. FEMS Microbiology Ecology 48(2): 249-259.

115. Rezaei F, Joh LD, Kashima H, Reddy AP, VanderGheynst JS. (2011), Selection of

Conditions for Cellulase and Xylanase Extraction from Switchgrass Colonized by

Acidothermus cellulolyticus. Applied Biochemical Biotechnology 164(6): 793–803.

116. Rimbach G, Pallauf J (1997), Cadmium accumulation, zinc status, and mineral

bioavailability of growing rats fed diets high in zinc with increasing amounts of phytic

acid. Biological Trace Element Research 57(1): 59-70.

117. Roberts AH, Yudkin J (1960), Dietary phytate as a possible cause of magnesium

deficiency. Nature 185: 823-825.

118. Rodriguez E, Porres JM, Han Y, Lei XG (1999), Different sensitivity of recombinant

Aspergillus niger phytase (r-PhyA) and Escherichia coli pH 2.5 acid phosphatase (r-

AppA) to trypsin and pepsin in vitro. Archives of Biochemistry and Biophysics 365(2):

262-267.

119. Rooney AP, Price NP, Ehrhardt C, Swezey JL & Bannan JD (2009), Phylogeny and

molecular taxonomy of the Bacillus subtilis species complex and description of Bacillus

subtilis subsp. inaquosorum subsp. nov. International Journal of Systematic and

Evolutionary Microbiology 59(10): 2429-2436.

120. Sandberg AS, Hulthen LR, Turk M (1996), Dietary Aspergillus niger phytase increases

iron absorption in humans. Journal of Nutrition 126(2): 476-480.

121. Sansinenea E & Ortiz A (2011), Secondary metabolites of soil Bacillus spp.

Biotechnology Letters 33(8): 1523-1538.

122. Scott JJ, Loewus FA (1986), Phytate metabolism in plants. In: Graf E, editor. Phytic

Acid: Chemistry and Applications. Minneapolis, MN: Pilatus Press: 23-42.

123. Segueilha L, Lambrechts C, Boze H, Moulin G, Galzy P (1992), Purification and

properties of the phytase from Schwanniomyces castellii. Journal of Fermentation and

Bioengineering 74(1): 7-11.

124. Siegel H, editor (1976), Metal ions in biological systems: Reactivity of coordination

compounds N.Y.: M. Dekker, Inc: 384.

125. Simon O, Igbasan F (2002), In vitro properties of phytases from various microbial

origins. International Journal of Food Science & Technology 37(7): 813-822.

126. Simpson CJ, Wise A (1990), Binding of zinc and calcium to inositol phosphates

(phytate) in vitro. Bristish Journal of Nutrition 64(1): 225-232.

127. Sharpe LM, Peacock WC, Cooke R, Hams RS (1950), The effect of phytate and other

food factors on iron absorption. Journal of Nutrition 41(3): 433-446.

128. Shieh TR, Ware JH (1968), Survey of microorganism for the production of extracellular

phytase. Applied Microbiology 16(9): 1348-1351.

129. Shimizu M (1992), Purification and characterization of phytase from Bacillus subtilis

(natto) N-77. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry 56: 1266-1269.

29

130. Smith AK, Rackis JJ (1957), Phytin elimination in soybean protein isolation. Journal of

the American Chemical Society 79: 633-637.

131. Steinke FH, Hopkins DT (1978), Biological availability to the rat of intrinsic and

extrinsic iron with soybean protein isolates. Journal of Nutrition 108(3): 481-489.

132. Susana Rod ríguez Couto, M Ángeles Sanromán (2006), Application of solid-state

fermentation to food industry—A review. Journal of Food Engineering 76(3): 291–302.

133. Tambe SM, Kaklij GS, Kelkar SM, Parekh LJ (1994), Two distinct molecular forms of

phytase from Klebsiella aerogenes: Evidence for unusually small active enzyme

peptide. Ferment Bioeng 77(1): 23-27.

134. Tanaka K, Yoshida T, Kasai Z (1974), Radio autographic demonstration of the

accumulation site of phytic acid in rice and wheat grains. Plant Cell Physiol 15(1): 147-

151.

135. Tanaka K, Kasai Z (1981), Phytic acid in rice grain. In: Ory RLD, editor. Antinutrients

and natural toxycants in food. Westport, CT: Food and Nutrition press: 239-260.

136. Thompson DB, Erdman JW (1982), Phytic acid determination in soybeans. Journal of

Food Sciences 47(2): 513-517.

137. Thompson LU (1986), Phytic acid: a factor influencing starch digestibility and blood

glucose response. In: Graf E, editor. Phytic Acid: Chemistry and Applications.

Minneapolis, MN: Pilatus Press: 173-194.

138. Thompson LU (1993), Potential health benefits and problems associated with

antinutrients in foods. Food Research International 26(2): 131-149.

139. Thuy T. T. (2010), Thermostable alkaline phytase from Bacillus sp. MD2: effect of

divalent metals on activity and stability. Journal Inorganic biochemistry 105(7): 1000-

1007.

140. Thuy T. T. (2010), Thermostable phytase from a Bacillus sp. Heterologous production,

mutation, characterization and assay development, Doctoral Thesis, Department of

Biotechnology, Lund university, Sweden.

141. Thuy Thi Tran (2010), A thermostable phytase from Bacillus sp. MD2: cloning,

expression and high-level production in Escherichia coli. Journal of Industrial

Microbiology and Biotechnology 37(3): 279–287.

142. Tuyet T.T. , Nguyen Duy Long, Hoang Quoc Khanh (2004), ―Production of phytase by

Aspergillus niger NRRL 363‖. J Agri Sci Technol Nong Lam University 4: 28-32.

143. Ullah AHJ, Sethumadhavan K, Lei XG, Mullaney EJ (2000), Biochemical

characterization of cloned Aspergillus fumigatus phytase (phyA). Biochemical and

Biophysical Research Communications 275(2): 279-285.

144. Ullah AHJ, Sethumadhavan K, Mullaney E J, Ziegelhoffer T, Austin-Phillips S (2002),

Cloned and expressed fungal phyA gene in alfalfa produces a stable phytase.

Biochemical and Biophysical Research Communications 290(4): 1343–1348.

145. Ullah AHJ, Sethumadhavan K (2003), PhyA gene product of Aspergillus ficuum and

Peniophora lycii produces dissimilar phytases. Biochemical and Biophysical Research

Communications 303(2): 463-468.

146. Vaintraub IA, Bulmaga VP (1991), Effect of phytate on the in vitro activity of digestive

proteinases. Journal of Agricultural and Food Chemistry 39: 859-861.

30

147. Vallee BL, Galdes A (1984), The metallobiochemistry of zinc enzymes. Adv Enzymol

56: 283-340.

148. Vats P, Banerjee UC (2004), Production studies and catalytic properties of phytases

(myoinositolhexakisphosphate phosphohydrolase): an overview. Enzyme Micob Technol

35: 3-4.

149. Vohra A, Satyanarayana T (2003), Phytases: microbial sources, production, purification,

and potential biotechnological applications. Critical Reviews in Biotechnology 23(1):

29-60.

150. Vohra P, Gray GA, Kratzer FH (1965), Phytic acid-metal complexes. Proceedings of the

Society for Experimental Biology and Medicine 120(2): 447-449.

151. Walker ARP (1951), Cereals, phytic acid, and calcification. Lancet 2(6676): 244-248.

152. Wang LT, Lee FL, Tai CJ & Kasai H (2007), Comparison of gyrB gene sequences, 16S

rRNA gene sequences and DNA-DNA hybridization in the Bacillus subtilis group.

International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 57(8): 1846-1850.

153. Wang xueying (2003), Phytase studies: producer screening, enzyme purification and

characterization and gene cloning. PhD thesis, Faculty of graduate studies Mahidol

University.

154. Wills MR, Day RC, Phillips JB, Bateman FC (1972), Phytic acid and nutritional rickets

in immigrants. Lancet 1(7754): 771-773.

155. Wodzinski RJ, Ullah AHJ (1996), Phytase. Advances in Applied Microbiology 42: 263-

302.

156. Wyss M., Brugger R., Kronenberger A., Roland R., Fimbel R., Oesterhelt G., Lehmann

M., Adolphus P. G. M. Van Loon (1999), Biochemical Characterization of Fungal

Phytases (myo-Inositol hexakisphosphate Phosphohydrolases): Catalytic Properties.

Applied and environmental microbiology 65(2): 367–373

157. Yetti M., Rina D., Neni G. và Gita C. (2010), Identification Characterization and

Production of Phytase from Endophytic Fungi. World Academy of Science, Engineering

and Technology 65(2010): 1044.

158. Yi Z, Kornegay ET, Ravindran V, Denbow DM (1996), Improving phytate phosphous

availability in corn and soybean meal for broilers using microbial phytase and

calculation of phosphous equivalency values for phytase. Poultry Sciences 75(2): 240-

249.

159. Yoon JH, Thompson LU, Jenkins DJ (1983), The effect of phytic acid on in vitro rate of

starch digestibility and blood glucose response. The American Journal of Clinical

Nutrition 38(6): 835-842.

160. Yoon SJ, Choi YJ, Ki MH, Kwang CK, Wook KJ, Cheol LC, Hoo JY (1996), Isolation

and identification of phytase producing bacterium, Enterobacterium sp. 4, and

enzymatic properties of phytase enzyme. Enzyme Microbial Technology 18(6): 449-454.

WEBSITE

161. www.nature.com

162. www.ncbi.nml.nhi.com

163. www.elsevier.com

164. www.sciencedirect.com/science

31

165. www.scribd.com/doc/19835831/Enzyme-Hoc.