UvA-DARE is a service provided by the library of the University of Amsterdam (http://dare.uva.nl)

UvA-DARE (Digital Academic Repository)

Photosynthetic polyol production

Savakis, P.E.

Link to publication

Citation for published version (APA):Savakis, P. E. (2016). Photosynthetic polyol production.

General rightsIt is not permitted to download or to forward/distribute the text or part of it without the consent of the author(s) and/or copyright holder(s),other than for strictly personal, individual use, unless the work is under an open content license (like Creative Commons).

Disclaimer/Complaints regulationsIf you believe that digital publication of certain material infringes any of your rights or (privacy) interests, please let the Library know, statingyour reasons. In case of a legitimate complaint, the Library will make the material inaccessible and/or remove it from the website. Please Askthe Library: https://uba.uva.nl/en/contact, or a letter to: Library of the University of Amsterdam, Secretariat, Singel 425, 1012 WP Amsterdam,The Netherlands. You will be contacted as soon as possible.

Download date: 04 Feb 2020

PHOTOSYNTHETIC POLYOL PRODUCTION

Keywords: cyanobacteria, biofuels, genetic engineering, microbial consortia

Printed by: Ipskamp Drukkers B.V.

Front & Back: Blueprint-style illustration of the topic of this thesis. Sunlight drives pho-tosynthesis in a cyanobacterium, which converts carbon dioxide into bu-tanediol or glycerol.

Chapters 1, 4, 7, 8, 9: © 2016 by P. E. SavakisChapters 2, 3, 5: © 2014, 2013, 2014 by Elsevier B.V. (reprinted with permission)

Chapter 6: © by the authors.

All rights reserved. No part of this publication may be reproduced in any form withoutprior written permission from the copyright holders.

The research reported in this thesis was carried outin the Molecular Microbial Physiology Group of the Swammerdam Institute for Life

Sciences, Faculty of Science, University of Amsterdam, Amsterdam, The Netherlandsand the Metabolic Engineering Group of the Qingdao Institute of Bioenergy and

Bioprocess Technology, Qingdao, People’s Republic of China.

This work was carried out within the research programme of BioSolar Cells, co-financed bythe Dutch Ministry of Economic Affairs.

The thesis layout is based on the TU Delft LaTeX template.

ISBN 978-94-028-0372-3

PHOTOSYNTHETIC POLYOL PRODUCTION

ACADEMISCH PROEFSCHRIFT

ter verkrijging van de graad van doctor

aan de Universiteit van Amsterdam,

op gezag van de Rector Magnificus

prof. dr. ir. K.I.J. Maex,

ten overstaan van een door het College voor Promotie ingestelde commissie,

in het openbaar te verdedigen in de Agnietenkapel

op dinsdag 1 november 2016, te 10:00 uur

door

Philipp Emmanuil SAVAKIS

geboren te Aken, Duitsland.

Promotiecommissie:

Promotor: prof. dr. K. J. HellingwerfCopromotor: dr. F. Branco dos Santos

Overige leden: prof. dr. M. A. Haring Universiteit van Amsterdamdr. E. P. Hudson KTH Royal Institute of Technology, Stockholm, Zwedenprof. dr. J. Hugenholtz Universiteit van Amsterdamprof. dr. R. Wever Universiteit van Amsterdamprof. dr. A. Wilde Albert-Ludwigs Universität Freiburg, Duitsland

Faculteit der Natuurwetenschappen, Wiskunde en Informatica

SUMMARY

I N recent decades, there has been an increasing awareness that the societal dependenceon fossil fuels has drastic ecological consequences. In this context, the use of "biofuels",

combustible compounds that are derived from organic matter, has been proposed to mit-igate man-made carbon emissions. First generation biofuels are derived from food crops.Their use thus requires arable land and competes with food supply. Therefore, alternativesare currently being explored.

Cyanobacteria are prokaryotic organisms that are able to convert light, water and car-bon dioxide into biomass, in a process referred to as oxygenic photosynthesis. Cyanobacte-ria perform photosynthesis more efficiently than plants, since the latter devote biomass toroots, stems and mitochondria, among other things.This thesis explores the use of genetically engineered Synechocystis sp. PCC6803 (Syne-chocystis) as cell factories for the production of organic molecules – the polyols glycerol and2,3-butanediol, as well as butanone and s-butanol. The general approach for this is to in-troduce one or more enzymes into the cells. Thus, molecules from the central metabolismcan be converted to products of interest.

In Chapter 1, attributes of oxygenic photosynthesis and the biology of cyanobacteriaare briefly introduced. Furthermore, 2,3-butanediol and glycerol, the two most importantmolecules this thesis revolves around, are presented. Finally, aspects of chemical reactionsand molecular symmetry (i.e. chirality) are briefly touched upon.

In Chapter 2, recent progress in the genetic engineering of cyanobacteria for the syn-thesis of fuels and chemical feedstocks is reviewed. Enzymatic pathways and final titres arepresented. Additionally, challenges that this relatively recent research field faces, are laidout and speculations for future developments are made.

Chapter 3 addresses the conversion of light, carbon dioxide and water into 2,3-butane-diol. There, an enzymatic pathway for the synthesis of meso-2,3-butanediol, derived fromchemotrophic bacteria, is introduced into Synechocystis. In the last step of this pathway,acetoin is reduced to butanediol, in an NADH-dependent reaction. It is demonstrated thatan increase in the availability of NADH increases the titre of butanediol.The yield of butanediol is further increased, when an enzyme is selected that prefers NADPHover NADH as the cosubstrate.

In Chapter 4, extracellular [butanediol]/[acetoin] ratios, measured in Chapter 3, areused to calculate intracellular [NAD(P)H]/[NAD(P)] ratios. It is found that the NADPH poolis more reduced than the NADH pool.

In Chapter 5, the enzyme phosphoglycerol phosphatase from Saccharomyces cerevisiaeis introduced into Synechocystis and so a mutant strain is generated that produces glycerolfrom light, water and carbon dioxide.The glycerol titres can further be increased through the addition of sodium chloride at low,but stressful concentrations. Interestingly, it was found that the wild-type strain of Syne-chocystis produces small amounts of glycerol under the same mild stress conditions.

v

vi SUMMARY

This latter finding inspired the research in Chapter 6, where it is demonstrated that theglycerol produced by Synechocystis stems from the degradation of an endogenous osmo-protectant, glucosylglycerol.An enzyme could be identified that is involved in the re-assimilation of glucosylglycerol.This enzyme, Slr1670, previously had no previously assigned function.Proteins with a homologous sequence are widely distributed in the cyanobacteria, purplebacteria and even in archaea. With genome-scale modeling, an increase in growth rate ispredicted, when exogenously supplied glucosylglycerol is used as a carbon source duringphotoheterotrophic growth.

In Chapter 7, a co-culturing approach for the synthesis of optically active alcohols ispresented. The compartmentalisation of oxidation and reduction reactions into Synechocys-tis and Escherichia coli or Bacillus subtilis, respectively, allows the construction of an enzy-matic pathway that would be difficult to realise in a single species.(S,S)-2,3-butanediol is utilised as a model system. Careful selection of the cosubstrate andenantiospecificity of two acetoin reductases allows the construction of a driving force to-wards this compound. This means that (S,S)-2,3-butanediol can be synthesised from anycompound (or mixture of compounds) within this pathway. An extension of the pathway isdemonstrated to be functional such that optically active 2,3-butanediol can be synthesisedfrom light, carbon dioxide and water. A inter-organismal electron-carrier system is envi-sioned, which allows the transfer of redox equivalents from Synechocystis to a chemotrophicorganism. This would allow the realisation of light-driven reduction reactions that wouldbe difficult to realise in cyanobacteria. This approach would further allow the autotrophicgrowth of an organism like Escherichia coli.

Chapter 8 addresses radical-mediated dehydration reactions to convert the polyols 2,3-butanediol and glycerol into the corresponding carbonyl compounds, butanone and reuter-in. These are subsequently converted into the corresponding alcohols, s-butanol and 1,3-propanediol. The conversion of meso-butanediol to butanone could be demonstrated inSynechocystis, albeit at low yields and under special conditions.Dehydratase reactions are oxygen-sensitive and therefore difficult to realise in cyanboacte-ria, which are oxygen-producing organisms in the light. Therefore, the use of the chemo-trophic organisms Escherichia coli and Lactobacillus reuteri is explored to perform thesereactions, instead of in Synechocystis. The conversion of meso-butanediol to butanone byrecombinant Escherichia coli is demonstrated.Furthermore, the conversion of CO2, light and water to 1,3-propanediol is demonstrated ina consortium of Synechocystis and Lactobacillus reuteri.

In Chapter 9, the findings of this thesis are put into ecological, societal and economiccontext. Strategies for the optimisation of product yield are discussed. Additionally, currentchallenges of this research field are examined and solutions are proposed.

SAMENVATTING

I N recente decennia is er een toenemende bewustwording van het feit dat de maatschap-pelijke afhankelijkheid van fossiele brandstoffen drastische ecologische gevolgen heeft.

In deze context is het gebruik van ‘biobrandstoffen’, brandbare stoffen afkomstig van bio-logisch materiaal, voorgesteld ter compensatie voor de koolstofemissies waarvoor de mensverantwoordelijk is. De eerste generatie biobrandstoffen zijn afkomstig van landbouwge-wassen waarvoor vruchtbare landbouwgrond nodig is en wat tevens concurreert met devoedselvoorziening. Om die reden worden alternatieven onderzocht. Cyanobacteriën zijnprokaryote organismen die in staat zijn licht, water en koolstofdioxide om te zetten in bi-omassa, een proces waaraan gerefereerd wordt als oxygene fotosynthese. Aangezien cy-anobacteriën geen wortels hebben, is hun fotosynthetische efficiëntie hoger dan dat vanplanten. Deze is hoger omdat planten wortels, een stam en andere onderdelen moeten ma-ken die niet direct bijdragen aan fotosynthese. Dit proefschrift verkent de mogelijkhedenvoor genetisch bewerkte Synechocystis sp. PCC6803 (Synechocystis) om ze in te zetten als zo-genaamde ‘cellulaire fabrieken’ voor de productie van organische moleculen – de polyolenglycerol en 2,3-butaandiol – alsook butanon en s-butanol. De algemene aanpak hiervoor isom één of meerdere enzymen te introduceren in de cellen. Hiermee kunnen moleculen uithet centrale metabolisme van de cellen worden omgezet in de gewenste producten.

In Hoofdstuk 1 worden de eigenschappen van de oxygene fotosynthese en de biologievan cyanobacteriën kort geïntroduceerd. Voorts worden 2,3-butaandiol en glycerol, de tweebelangrijkste moleculen waar dit proefschrift om draait, gepresenteerd. Als laatste wordenaspecten van chemische reacties en moleculaire symmetrie (chiraliteit) kort genoemd.

In Hoofdstuk 2 wordt een overzicht gegeven van de recente vooruitgang in de geneti-sche bewerking van Synechocystis voor de synthese van brandstoffen en grondstoffen voorde chemische industrie. Enzymatische routes en maximale concentraties worden gepre-senteerd. Daarnaast worden de uitdagingen waar dit relatief nieuwe onderzoeksgebiedvoor staat blootgelegd en wordt er gespeculeerd over toekomstige ontwikkelingen.

Hoofdstuk 3 bespreekt de omzetting van licht, koolstofdioxide en water in 2,3-butaan-diol. In dit Hoofdstuk wordt een enzymatische route, afgeleid van chemotrofe bacteriën,geïntroduceerd in Synechocystis. In de laatste stap van deze route wordt acetoïne geredu-ceerd tot butaandiol in een NADH-afhankelijke reactie. De relatie tussen de beschikbaar-heid van NADH en de maximale concentraties van butaandiol wordt gedemonstreerd. Deopbrengst van butaandiol wordt verder verhoogd wanneer een enzym geselecteerd wordtdat NADPH prefereert boven NADH as co-substraat.

In Hoofdstuk 4, worden extracellulaire [butanediol]/[acetoin] verhoudingen, bepaald inHoofdstuk 3, gebruikt om intracellulaire [NAD(P)H]/[NAD(P)] verhoudingen te berekenen.In Synechocystis zijn de NADPH/NADP ratio’s groter is dan de NADH/NAD ratio’s.

In Hoofdstuk 5 wordt het enzym fosfoglycerolfosfatase van Saccharomyces cerevisiaegeïntroduceerd in Synechocystis waarmee een mutant gegenereerd wordt dat glycerol pro-duceert uit licht, water en koolstofdioxide. De maximale concentraties van glycerol kun-nen verder worden verhoogd door toevoeging van natriumchloride in lage, doch stress-

vii

viii SAMENVATTING

inducerende concentratie. Een interessante observatie is dat het wild type van Synecho-cystis onder deze condities ook kleine hoeveelheden glycerol produceert. Deze ontdekkinginspireerde het onderzoek beschreven in Hoofdstuk 6, waarin gedemonstreerd wordt datglycerolproductie in Synechocystis afhankelijk is van de afbraak van een Synechocystis-eigenmolecuul dat beschermt tegen osmotische stress, namelijk glucosylglycerol. Een enzym datbetrokken is bij de her-assimilatie van glucosylglycerol kon worden geïdentificeerd. Dit en-zym, Slr1670, had geen eerder bekende functie. Eiwitten met homologe sequentie zijn wijd-verspreid onder cyanobacteriën, purperbacteriën en zelfs onder de Archea. Een toename ingroeisnelheid werd voorspeld met behulp van een genoom-schaal stoichiometrisch modelwanneer glucosylglycerol kunstmatig wordt toegevoegd als koolstofbron tijdens fotohete-rotrofe groei.

In Hoofdstuk 7 wordt een methode voor co-cultivatie voor de synthese van optischactieve alcoholen gepresenteerd. Het onderverdelen van de oxidatie- en reductiereactiesin compartimenten, respectievelijk in Synechocystis en Escherichia coli of Bacillus subtilis,maakt het mogelijk een enzymatische route te construeren die moeilijk te realiseren is ineen enkel organisme. (S,S)-2,3-butaandiol is gebruikt als modelsysteem waarin zorgvuldigeselectie van co-substraat en enantiospecificiteit van twee acetoïnereductases een drijvendekracht richting het gewenste product creëert. Dit betekent dat (S,S)-2,3-butaandiol gesyn-thetiseerd kan worden uit elke stof (of mengsel van stoffen) dat deel uitmaakt van deze en-zymatisch route. Een functionele extensie van de route dat optisch actief 2,3-butaandiolsynthetiseert uit licht, koolstofdioxide en water is aangetoond. Een inter-soortelijke elek-tronentransportketen, waarin redoxequivalenten van Synechocystis naar een chemotrooforganisme getransporteerd worden behoort hiermee tot de mogelijkheden. Dit maakt licht-gedreven reductiereacties mogelijk die moeilijk zijn te realiseren in cyanobacteriën. Daar-naast maakt deze aanpak ook autotrofe groei van een organisme zoals Escherichia coli mo-gelijk.

In Hoofdstuk 8 wordt de radicaal-gemedieerde dehydratatie van polyolen 2,3-butaan-diol en glycerol naar de corresponderende carbonylen, butanon en reuterine, besproken.Deze worden verder omgezet in de alcoholen s-butanol en 1,3-propaandiol. De omzettingvan meso¬-butaandiol naar butanon kon worden aangetoond in Synechocystis, hoewel metlage opbrengst en onder speciale omstandigheden. Dehydratiereacties zijn zuurstofgevoe-lig en daarom moeilijk te realiseren in cyanobacteriën, welke zuurstof produceren wanneerblootgesteld aan licht. De mogelijkheid deze reacties te laten uitvoeren door chemotrofe or-ganismen Escherichia coli en Lactobacillus reuteri in plaats van Synechocystis is onderzocht.De omzetting van meso-butaandiol naar butanon door een gemodificeerde Escherichia coliis aangetoond. Verder is de omzetting van koolstofdioxide, licht en water in 1,3-propaandiolaangetoond in een consortium van Synechocystis en Lactobacillus reuteri.

In Hoofdstuk 9 worden de verkregen inzichten van dit proefschrift in ecologische, maat-schappelijke en economische context geplaatst. Strategieën voor de optimalisatie van pro-ductopbrengst worden besproken. Daarnaast worden de huidige uitdagingen van het on-derzoeksveld uitgelicht en oplossingen voorgesteld.

ZUSAMMENFASSUNG

I N den letzten Jahrzehnten hat sich immer deutlicher abgezeichnet, dass die gesellschaft-liche Abhängigkeit von fossilen Brennstoffen drastische Konsequenzen für die Umwelt

hat. In diesem Zusammenhang wurden Biokraftstoffe vorgeschlagen, Substanzen mit ho-hem Energiegehalt, die aus Biomasse gewonnen werden können. Biokraftstoffe der erstenGeneration werden aus essbaren Pflanzen wie Mais oder Raps gewonnen und konkurrierendaher mit der Nahrungsmittelversorgung.Cyanobakterien sind prokaryotische Organismen, die Licht, Wasser und Kohlenstoffdioxidin Biomasse umwandeln können. Dieser Prozess heißt oxygene Photosynthese. Die cyano-bakterielle Photosynthese ist effizienter als die der Pflanzen, da die Letzteren unter ande-rem auch Biomasse für Wurzeln, Stämme und Stengel und Mitochondrien zur Verfügungstellen müssen.Diese Arbeit untersucht die Benutzung genetisch verbesserter Stämme des Cyanobakteri-ums Synechocystis sp. PCC6803 als Zellfabriken zur Synthese organischer Moleküle – derPolyole Glycerin und 2,3-Butandiol, sowie s-Butanol.Im Allgemeinen werden hierzu eines oder mehrere Fremdenzyme in die Zellen gebracht.So können Moleküle aus dem zentralen Stoffwechsel in wirtschaftlich interessante Stoffeüberführt werden.

In Kapitel 1 werden Aspekte der Photosynthese und der Biologie der Cyanobakterienkurz erläutert. Danach werden Glycerin und 2,3-Butandiol, die zwei Moleküle, mit denensich diese Arbeit im Wesentlichen befasst, vorgestellt. Zuletzt werden einige Attribute che-mischer Reaktionen und der Molekülsymmetrie (Chiralität) erläutert.

In Kapitel 2 wird der jüngste Fortschritt auf dem Gebiet der genetischen Veränderungvon Cyanobakterien zur Chemikalien- und Kraftstoffsynthese referiert. Enzymatische Reak-tionswege und Ausbeuten werden präsentiert. Zusätzlich wird darüber spekuliert, welchenHerausforderungen dieses Forschungsgebiet entgegenblickt.

In Kapitel 3 wird die Umwandlung von Kohlenstoffdioxid, Licht und Wasser zu 2,3-Butandiol demonstriert. In diesem Zusammenhang wird ein Reaktionsweg zur Synthesevon meso-2,3-Butandiol aus chemotrophen Bakterien in Synechocystis eingesetzt. Der letz-te Schritt dieses Reaktionsweges ist die NADH-abhängige Reduktion von Acetoin zu Butan-diol. Es wird gezeigt, dass eine Zunahme der NADH-Konzentration sich in einer Zunahmeder Butandiolausbeute auswirkt. Die Ausbeute konnte weiter erhöht werden, wenn statt derNADH- eine NADPH abhängige Acetoinreduktase eingesetzt wurde.

In Kapitel 4, werden extrazelluläre Verhältnisse von [Butandiol] zu [Acetoin], die bereitsInKapitel 3 gemessen wurden, in intrazelluläre [NAD(P)H]/[NAD(P)] Verhältnisse übersetzt.Es wird gezeigt, dass der NADPH pool weiter reduziert ist als der NADH pool.

In Kapitel 5 wird das Enzym Phosphoglycerinphosphatase aus Saccharomyces cerevisiaenach Synechocystis transferiert. Hierdurch wird eine Mutante generiert, die aus Licht, Koh-lenstoffdioxid und Wasser Glycerin produzieren kann. Die Glycerinausbeute kann weitererhöht werden, wenn Natriumchlorid in kleinen, aber zum Erzeugen einer Stressantwortausreichend hohen Mengen zugegeben wird. Interessanterweise stellte sich heraus, dass

ix

x ZUSAMMENFASSUNG

der Wildtyp unter den gleichen Stressbedingungen kleine Mengen an Glycerin absondert.Dieses Forschungsergebnis war die Grundlage für Kapitel 6. Dort wird gezeigt, dass das

Glycerin, das Synechocystis unter diesen Bedingungen produziert, aus dem Abbau von Glu-cosylglycerin, stammt. Die Synthese dieses Moleküls ist Teil der Salzstressantwort von Syn-echocystis.Es wurde ein Enzym identifiziert, das am Abbau von Glucosylglycerin beteiligt ist. DiesesEnzym, Slr1670, hatte keine zuvor bekannte Funktion. Proteine mit homologer Sequenzsind weitverbreitet unter den Cyanobakterien, finden sich aber auch in einigen Purpur-bakterien und sogar Archäen. Durch genomweite Modellierung wurde eine Steigerung derWachstumsrate vorhergesagt, wenn Glucosylglycerin über diesen neu identifizierten Stoff-wechselweg abgebaut wird.

In Kapitel 7 wird ein Forschungsansatz verfolgt, in dem Kokulturen von rekombinan-ten Synechocystis-Stämmen und chemotrophen Bakterien, wie Escherichia coli oder Bacil-lus subtilis zur Synthese optisch aktiver Alkohole verwendet werden. Hier erlaubt räumlicheAuftrennung einen Reaktionsweg, der in einer einzigen Zelle schwierig umzusetzen gewe-sen wäre.Als Modellsystem wird S,S-2,3-Butandiol untersucht. Durch sorgfältige Auswahl der Kofak-torspezifität der beteiligten Acetoinreduktasen lässt sich eine Triebkraft konstruieren, dieden Reaktionsablauf in die gewünschte Richtung drängt. Das hat zur Folge, dass S,S-2,3-Butandiol aus jedem beliebigen Intermediat (oder Mischung von Intermediaten) im Re-aktionsweg mit dem gleichen Kokulturensystem hergestellt werden kann. Zusätzlich wirdgezeigt, wie der Reaktionsweg erweitert werden kann, sodass Kohlenstoffdioxid zu S,S-2,3-Butandiol umgesetzt werden kann. Konzeptionell lässt sich dieser Ansatz so verstehen, dassElektronen zwischen Synechocystis und dem chemotrophen Bakterium ausgetauscht wer-den. Es wäre daher möglich, Reduktionsreaktionen, die sich ohne weiteres nicht in Synecho-cystis durchführen ließen, dennoch lichtgetrieben zu realisieren.Des Weiteren wäre es möglich, Mutanten von Escherichia coli zu konstruieren, die selbst zurKohlenstofffixierung befähigt sind.

Kapitel 8 behandelt die radikalvermittelte Dehydratisierung von Polyolen. Diese Reak-tion setzt Diole zu Carbonylverbindungen um. Die nachfolgende Reduktion ergibt danndie entsprechenden Alkohole. Es konnte gezeigt werden, dass rekombinante Synechocystismeso-2,3-Butandiol zu Butanon umsetzen konnten, wenn auch mit geringen Ausbeutenund unter besonderen Reaktionsbedingungen. Da Dehydratasen sauerstoffanfällig sind, isteine funktionelle Produktion in Cyanobakterien, sauerstoffproduzierenden Organismen,schwierig. Deshalb wurde ein Ansatz verfolgt, in dem chemotrophe Organismen wie Esche-richia coli und Lactobacillus reuteri diese Reaktionen durchführen. Außerdem konnte einKokulturensystem gezeigt werden, in dem Synechocystis und Lactobacillus reuteri CO2, Lichtund Wasser zu 1,3-Propandiol umwandeln.

In Kapitel 9 werden die Ergebnisse dieser Arbeit in einen ökologischen, gesellschaft-lichen und wirtschaftlichen Zusammenhang gesetzt. Strategien zur Optimierung der Pro-duktausbeute werden vorgestellt. Zusätzlich werden gegenwärtige Herausforderungen die-ses Forschungsgebietes diskutiert und Lösungsansätze vorgeschlagen.

CONTENTS

Summary v

Samenvatting vii

Zusammenfassung ix

1 General Introduction 1

2 Engineering cyanobacteria for direct biofuel production from CO2 17

3 Synthesis of meso-2,3-butanediol by Synechocystis sp. PCC6803 25

4 Redox cosubstrate levels in mutant Synechocystis strains 55

5 Photosynthetic production of glycerol by a recombinant cyanobacterium 65

6 Identification of a novel protein from Synechocystis sp. PCC 6803 involved in re-assimilation of the osmolyte glucosylglycerol 75

7 A coculturing approach for generation of optically active 2,3-butanediol isomers 95

8 On polyol dehydration 109

9 General discussion 121

References 135

Bibliography 135

Appendix 155

A Abbreviations 157

B Alterations of the genome-scale model of Synechocystis 161

Acknowledgements 165

List of Publications 167

xi