phỤ lỤc 1: cÁc phƯƠng phÁp phÂn tÍch · 123 phỤ lỤc 1: cÁc phƯƠng phÁp phÂn...

123

PHỤ LỤC 1: CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH

1.1 Xác ñịnh ñộ ẩm

Cân 5 gam mẫu ñem ñi sấy ở nhiệt ñộ 105°C ñến khối lượng không ñổi. Thường thời gian

sấy khoảng 8-10 giờ thì ñạt. Cân khối lượng trước và sau khi sấy, tính ra phần trăm ñộ ẩm có trong mẫu vật.

m0 – m1

W = 5

x 100%

Trong ñó:

W: ðộ ẩm (%)

m0: Khối lượng chén và mẫu trước khi sấy (g)

m1: Khối lượng chén và mẫu sau khi sấy (g)

1.2 Xác ñịnh hàm lượng protein tổng số bằng phương pháp Kjeldahl

1.2.1 Nguyên tắc

Tất cả các dạng nitơ có trong cơ thể hay trong các mô ñược gọi là nitơ tổng số, nitơ có trong thành phần amino acid của protein là nitơ protein. Nitơ không có trong thành phần protein

như các muối vô cơ, acid nitric, các amino acid tự do, các peptid, ure… là nitơ phi protein.

Nitơ tổng số = Nitơ protein + Nitơ phi protein

Trước tiên mẫu ñược vô cơ hóa bằng H2SO4 ñậm ñặc ở nhiệt ñộ cao và có chất xúc tác. Các phản ứng của quá trình vô cơ hóa xảy ra như sau:

2H2SO4 → 2H2O + 2SO2↑ + O2

Oxy tạo thành trong phản ứng lại oxy hóa các nguyên tố khác, Các phân tử chứa nitơ dưới

tác dụng của H2SO4 tạo thành NH3. NH3 kết hợp với H2SO4 dư tạo thành (NH4)2SO4 tan trong dung dịch.

NH3 + H2SO4→ (NH4)2SO4

ðẩy NH3 ra khỏi dung dịch bằng NaOH, hấp thụ NH3 bằng dung dịch H3BO3 có chứa chất chỉ thị, sau ñó ñem chuẩn ñộ bằng dung dịch H2SO4 0,1N

(NH4)2SO4 + NaOH → Na2SO4 + H2O + 2NH3

2NH4OH + 4H3BO3 → (NH4)2B4O7 + 7H2O

124

(NH4)2B4O7 + H2SO4 → (NH4)2SO4 + H3BO3

1.2.2 Tiến hành

* Vô cơ hóa mẫu

Cân khoảng 0,3 - 0,5 gam mẫu cho vào bình Kjeldahl, thêm vào 10ml H2SO4 ñậm ñặc và

một ít bột xúc tác ñun trên bếp. Nhiệt ñộ và thời gian gia nhiệt ñược chọn tuỳ thuộc vào mẫu phân tích (nhiệt ñộ 300 - 4000C). Vô cơ hóa mẫu ñến khi thu ñược dung dịch trong suốt

không màu hoặc có màu xanh lơ của CuSO4, ñể nguội ñến nhiệt ñộ phòng.

* Chuẩn bị chưng cất ñạm

Chuẩn bị dung dịch ở bình hứng NH3, dùng pipet cho vào bình hứng 20ml acid boric, có thêm 6 giọt chất chỉ thị (Bromocresolgreen và metyl ñỏ) ñặt bình vào hệ thống sao cho ñầu

ống sinh hàn ngập trong dung dịch.

Sau khi vô cơ hóa mẫu hoàn toàn, lắp bình Kjeldahl vào hệ thống cất ñạm.

Sau ñó thêm vào khoảng 10ml NaOH 30%. Quan sát khi dung dịch trong bình chuyển sang màu xanh ñen, chứng tỏ dung dịch trong bình cất ñã ñủ kiềm ñể ñẩy NH3 ra khỏi (NH4)2SO4.

Bắt ñầu chưng cất ñạm cho ñến khi dung dịch trong bình hứng ñạt 80 - 100ml (thời gian khoảng 5 phút). Dùng nước cất ñể rửa ñầu ống sinh hàn, lấy bình hứng ra và ñem ñi chuẩn ñộ

bằng H2SO4 0,1N.

1.2.3 Tính kết quả

0,00142 x VH2SO4 x 100 Hàm lượng nitơ tổng số (%) =

m

Trong ñó:

V: thể tích H2SO4 0,1 N dùng ñể chuẩn ñộ (ml)

m: khối lượng nguyên liệu vô cơ hóa (g)

0,00142: Số g nitơ tương ñương với 1 ml H2SO4 0,1N

Dựa vào tỷ lệ nitơ tương ñối trong thành phần protein ñể xác ñịnh hệ số protein. Hàm lượng nitơ toàn phần trong protein ñộng vật khoảng 16 %, khi ñó hệ số protein K là:

K = 100/16 = 6,25

Hàm lượng protein tổng số (CP) ñược tính theo công thức:

% protein tổng số = %N * K

125

1.3 Xác ñịnh hàm lượng protein

Hàm lượng protein ñược xác ñịnh theo phương pháp Lowry [61]

* Chuẩn bị hóa chất:

Pha dung dịch A: Na2CO3 2% trong NaOH 0,1N; Dung dịch B1: CuSO4 1%; Dung dịch B2: Kali-Natri tartrat 2%

Dung dịch C = B1 : B2: A = 0,5: 0,5: 50

* Xây dựng ñường chuẩn BSA: Dung dịch BSA gốc 1mg/ml pha trong H2O.

Bảng 2.1 Xây dựng ñường chuẩn với các nồng ñộ BSA khác nhau

Nồng ñộ (µg/ml) 0 40 80 120 160 200 240 280 320

V BSA( µl) 0 20 40 60 80 100 120 140 160

V H2O (µl) 500 480 460 440 420 400 380 360 340

V dd C (ml ) 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5

V TT Folin 1N (ml) 1 1 1 1 1 1 1 1 1

ðể yên 30 phút. ðo ở bước sóng 750 nm.

* Tiến hành ño mẫu protein tương tự như các mẫu ở ñường chuẩn.

Phân tích kết quả dựa trên ñường chuẩn ñã xây dựng. Mỗi mẫu phân tích 3 lần lặp lại lấy kết quả trung bình

1.4 Xác ñịnh hoạt tính protease trên casein

+ Hoạt tính protease thủy phân casein ñược xác ñịnh theo phương pháp Anson cải tiến [4]

với cơ chất casein 1%.

ðơn vị hoạt tính enzyme biểu hiện qua tyrosine unit (U)/mg protein. Một ñơn vị enzyme là

lượng enzyme cần thiết xúc tác thủy phân casein, tương ñương 1 µmol tyrosine sinh ra trong một phút ở 30oC; pH 7,5.

* Dựng ñường chuẩn Tyrosine

Tyrosine chuẩn pha trong HCl 0,2 M → dd gốc 1 µmol / ml.

126

Bảng 2.2 Xây dựng ñường chuẩn với các nồng ñộ Tyrosine khác nhau

Nồng ñộ(µmol/µl) 0 0,1 0,15 0,2 0,25 0,5 0,6 1

V Tyrosine (µl) 0 50 75 100 125 250 300 500

V HCl 0,2 M (µl ) 500 450 425 400 375 250 200 0

V Na2CO3/NaOH (ml) 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5 2,5

V TT Folin 1N (µl) 100 100 100 100 100 100 100 100

Lắc ñều các ống nghiệm. ðể yên 30 phút ở nhiệt ñộ phòng. ðo ở bước sóng 750 nm.

* ðo hoạt tính enzyme:

Mẫu ñối chứng: Cho 400 µl dung dịch ñệm + 200µl dịch chiết enzyme + 600µl TCA 10% + 200 µl casein 1%.

Mẫu enzyme: Cho 400 µl dung dịch ñệm + 200 µl dịch chiết enzyme + 200 µl casein 1%. Ủ ở 30oC trong 10 phút + 600 µl TCA 10%.

Ly tâm mẫu ñối chứng và mẫu enzyme ở 13000 vòng/phút trong 10 phút.

→ Lấy 500 µl dịch sau ly tâm + 2,5 ml Na2CO3 /NaOH + 100µl thuốc thử Folin.

ðể yên 30 phút. ðo ở bước sóng 750 nm.

Mỗi mẫu phân tích ño hoạt tính gồm 1 ñối chứng và 3 mẫu có enzyme, lấy kết quả trung

bình.

1.5 Kỹ thuật ñiện di trên gel SDS-PAGE [53]

1.5.1 Nguyên tắc

Kỹ thuật ñiện di dựa trên nguyên tắc trong một ñiện trường các phân tử tích ñiện âm sẽ di

chuyển về cực dương của ñiện trường và ngược lại. Tốc ñộ di chuyển của các phân tử này tùy thuộc vào kích thước, hình dạng, ñiện tích và lực ñiện trường.

1.5.2 Tiến hành

Hóa chất

* Dung dịch pha mẫu có chứa: Tris-HCl, pH; SDS 10%; Glycerol; β-mercaptoetanol và

Bromophenol blue

* Dung dịch chạy ñiện di có chứa: 3g Tris; 14,4 g Glycine; 1g SDS

* Dung dịch nhuộm gel: Comassie R-250 pha trong dung dịch methanol

127

• Dung dịch rửa gel gồm methanol : acid acetic : nước cất

• Các bước chạy ñiện di:

* Chuẩn bị hộp ñiện di: Khuôn kính ñể ñổ gel, lược cài và hộp ñiện di phải ñược rửa sạch và lau khô bằng cồn. Sau ñó ráp thành khuôn ñể chuẩn bị ñổ gel.

* Chuẩn bị mẫu ñiện di:

Pha mẫu tỷ lệ 1 : 2. Cho vào ống eppendorf 100 µl mẫu chứa protein và 200 µl dung dịch

ñệm pha mẫu ñã chuẩn bị.

Lắc ñều và ñun cách thủy ở 95°C, 5 phút. ðể nguội.

* Chuẩn bị gel phân tích và gel tập trung polyacrylamide 12%:

Dung dịch gel phân tích và tập trung gồm H2O; Acrylamide 30% (Bio-Rad), Tris-HCl pH 8; SDS 10% và ammonium per sulfate (APS) ñược trộn lẫn bằng máy khuấy từ. Sau ñó cho một

ít TEMED vào dung dịch, khuấy ñều và nhanh chóng dùng pipet 1000 ml cho vào khung kiếng ñổ gel. Gel sẽ ñược bơm ñến vạch cách lược là 0,5 cm. Chú ý không bơm quá nhanh sẽ

tạo bọt trong gel.

Cẩn thận bơm tiếp một lớp nước cất lên trên bề mặt gel ñể tạo cho bề mặt gel phẳng. Gel sẽ ñông lại sau 20 - 30 phút.

Khuấy ñều dung dịch trên máy khuấy từ. Trước khi ñổ gel tập trung, ta phải ñổ bỏ phần nước phía trên gel phân tích bằng cách nghiêng và dùng giấy thấm.

Tương tự gel phân tích, sau khi cho TEMED vào, dung dịch phải ñược ñưa nhanh vào khung ñổ gel. Dùng giấy thấm ñể loại hết nước trên bề mặt gel phân tích. Cho gel tập trung vào,

ñưa lược vào lớp gel. Chú ý ñưa lược vào cẩn thận ñể tránh tạo lớp bọt dưới phía chân lược. Gel tập trung sẽ ñông tụ lại khoảng sau 20 phút. ðánh dấu lại các vị trí lỗ giếng.

* ðưa mẫu vào các giếng:

Sau khi gel tập trung ñông, lắp bộ khung ñổ gel vào khung chạy ñiện di.

ðổ ñầy dung dịch chạy ñiện di vào phía bên dưới và bên trên bộ chạy ñiện di.

Cẩn thận lấy lược ra và cho mẫu vào các giếng.

ðưa 8 µl mẫu vào các lỗ giếng. Chú ý không ñể mẫu tràn qua các giếng bên cạnh.

Ghi chép lại vị trí các mẫu ñưa vào giếng.

128

* Chạy ñiện di:

Sau khi hoàn tất việc ñưa mẫu vào, ñậy nắp hộp ñiện di lại và cho dòng ñiện ñi qua. Dòng ñiện chạy ñiện di là 25 mA/40V.

Thông thường, thời gian ñể chạy ñiện di vào khoảng 2 - 3 giờ. Ta có thể quan sát quá trình dịch chuyển của protein nhờ vào dải băng màu xanh của bromophenol blue R-250.

* Nhuộm gel:

Gel ñược lấy ra khỏi hộp gel cẩn thận và cho vào dung dịch nhuộm ñã pha. ðể làm nhanh quá trình nhuộm màu, hệ thống sẽ ñược ñặt trên máy lắc. Thông thường thời gian nhuộm

trong vòng 1 giờ.

* Tẩy màu:

Tẩy gel bằng dung dịch tẩy. Ngâm gel trong dung dịch tẩy và ñặt trên máy lắc từ 2 - 3 giờ. Kết thúc quá trình tẩy gel khi nhận thấy gel ñã sạch lớp màu nền và các băng protein hiện rõ

trên gel.

* Sấy gel:

ðể giữ gel ñược lâu, người ta có thể sấy gel. Gel ñược sấy bằng thiết bị sấy hút chân không ở

nhiệt ñộ 55°C, thời gian khoảng 4 giờ.

ðể xác ñịnh trọng lượng phân tử protein của mẫu thí nghiệm, ta vẽ ñường logM của thang protein chuẩn.

1.6 ðIỆN DI HAI CHIỀU

1.6.1 Quy trình tính sạch protein cho ñiện di 2 chiều bằng kít (2D-Clean up kit)

1. 100 µl mẫu (protein 5 mg/ml) vào ống 1,5 ml

2. 300 µl chất tạo kết tủa 1 vào mẫu protein và trộn ñều bằng vortex. Ủ ở 40C trong 15

phút.

3. Thêm vào 300 µl tác nhân gây tủa 2 vào dung dịch rồi vortex.

4. Ly tâm 3500 vòng/phút trong 5 phút ñể tủa dính chặt vào thành ống.

5. Dùng pipet nhẹ nhàng hút bỏ dịch nổi.

6. Ly tâm giống như lần trước trong vòng 15- 30 giây. Cẩn thận hút bỏ dịch nổi còn lại bằng pipet.

7. Thêm 40µl tủa 2, ly tâm 3500 vòng/phút trong 5 phút.

8. Lắng cặn, loại bỏ dịch rửa bên trên.

129

9. Thêm 25µl nước cất 2 lần. Vortex trong 10- 20 giây. Cặn phân tán không hòa tan trong

nước.

10. Thêm 1 ml dung dịch rửa 2 (ñã ñược làm lạnh ở -200C ít nhất một giờ), sau ñó vortex

trong 1 phút.

11. Ủ ở -20oC trong 30 phút.

12. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút, loại bỏ dịch nổi. Ly tâm nhẹ trong 15-30 phút và hút bỏ dung dịch còn lại. Làm khô tủa ở nhiệt ñộ phòng trong 5 phút.

13. Hòa tan tủa bằng 100 µl dung dịch chạy ñiện di, vortex trong 30 giây. Ủ ở nhiệt ñộ

phòng 3-5 phút.

14. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút ở nhiệt ñộ phòng, thu dung dịch bên trên., ta

ñược mẫu tinh sạch dùng ñiện di protein, giữ lạnh ở -80oC

1.6.2 Chạy ñiện di hai chiều

ðiện di chiều thứ nhất

1. ðưa thanh ñiện di IEF (IPG strip) có gradient pH từ 3-10 về nhiệt ñộ phòng.

2. Hút 125µl (≈100µg protein) mẫu protein ñã tách chiết cho vào các rãnh của khay ñiện di cách hai ñầu rãnh 1cm, tránh ñể bọt khí.

3. Dùng kẹp tách cẩn thận lớp nhựa plastic bao thanh IPG từ ñầu có ghi pH 3-10.

4. Nhẹ nhàng ñặt thanh IPG strip lên dung dịch protein. Dấu “+” và “pH 3-10” nằm về

phía bên trái của khay. Tránh không ñể mẫu dính lên bề mặt lớp nhựa của thanh IPG strip vì như thế mẫu sẽ không hấp thụ lên gel. Chắc chắn rằng không có bọt khí nằm dưới strip.

Nếu có, cẩn thận dùng kẹp nhấc strip lên xuống 1-2 lần cho bọt khí ra khỏi strip.

5. Phủ lên thanh IPG strip dầu khoáng nhằm ngăn chặn sự bay hơi trong quá trình ñiện di.

Thêm dầu khoáng chầm chậm bằng cách di chuyển pipet dọc theo chiều dài của strip.

6. Chương trình của PROTEAN IEF sử dụng thích hợp ñối với tất cả chiều dài thanh IPG

strip, sử dụng nhiệt ñộ mặc ñịnh 20oC, với cường ñộ tối ña 50μA/ strip.

130

Sau khi ñiện di xong, lấy các strip và loại bỏ dầu khoáng như trên, sau ñó ñặt các strip

vào khay sạch mặt gel quay lên trên (giữ nguyên vị trí mẫu). Nếu chưa ñiện di SDS-PAGE, các strip nên ñược bao phủ bởi plastic và giữ ở -700C.

ðiện di chiều thứ hai SDS-PAGE cho 2-D

Chuẩn bị gel

ðổ gel phân tích 10% acrylamide ñể chạy ñiện di SDS-PAGE cho ñiện di hai chiều thì không cần gel tập trung.

Cân bằng thanh IPG-Strip

ðặt miếng giấy lọc ñã làm ẩm bằng nước cất lên mặt phẳng khô và sạch, ñặt thanh IPF

Strip lên miếng giấy lọc (bề có lớp nhựa úp xuống dưới) và úp miếng giấy lọc khô lên, quá trình này nhằm loại bỏ dầu khoáng còn dư. Cân bằng thanh IPG Strip trong dung dịch

I và II ( Kit Bio-Rad)

Loading gel

- Làm tan agargose trong lò microwave 25-30 giây chuẩn bị load gel.

- ðặt strip lên mặt của phiến kính ñiện di lớn và bề mặt strip hướng lên (hay về phía phiến

kính nhỏ). Dùng pipet cho strip lên trên bản gel.

- ðưa strip vào bên trong phần của lược IPG sát với bề mặt gel.

- ðể thẳng ñứng cho agarose ñông.

- ðặt vào hộp ñiện di ñứng.

Chạy ñiện di

- Cho dung dịch ñệm ñiện di 1X Tris/glycine/SDS và bắt ñầu ñiện di. Sự di chuyển của

Bromophenol Blue, hiện diện trong gel agarose, ñược dùng ñể chỉ thị quá trình ñiện di.

- ðiều kiện ñiện di: 100V, thời gian chạy khoảng 90 phút.

Nhuộm gel bằng BioSafe Coomassie Blue

- Cho nước cất tinh khiết vào khay nhuộm (150 – 200ml cho mỗi gel riêng biệt)

- Mở gel ñã ñiện di cho vào khay nước

- Rửa bằng nước 3 lần, mỗi lần 5 phút

- ðổ vừa ñủ thuốc nhuộc BioSafe Coomassie Blue ngập gel

- Lắc khoảng 1 giờ, bỏ dung dịch nhuộm và rửa gel bằng dung dịch tẩy 2 lần.

ðọc kết quả

- Scan gel (sử dụng thiết bị Scan Gel-Doc Bio-Rad) và dùng phần mềm PDQuest ñể phân

tích kết quả.

131

1.7 Phân tích protein bằng MALDI-TOF-TOF

1.7.1 Chuẩn bị mẫu: Các mẫu protein cắt từ gel ñiện di hai chiều sẽ tiến hành khử cầu nối disulfide, alkyl hóa nhóm SH và thủy phân bằng enzyme trypsin theo protocol của trung tâm

phân tích protein và proteomic ðại Học Quốc gia Singapor.

Hóa chất

Acid Formic 5%

Nitrogen Gas, Prepurified

Nước cất tinh khiết (18MegaOhms)

Dung dịch 10mM ammonium bicarbonate

Dung dịch 100mM DTT/ 100mM ammonium bicarbonate

Dung dịch 155mM Iodoacetamide /100mM ammonium bicarbonate.

Dung dịch 12.5mg/µl Trypsin / 500mM ammonium bicarbonate

Tiến hành

1. Chuẩn bị gel và dehydration

Cắt gel từ bản gel ñiện di hai chiều cho vào eppendorf 200µl. Nghiền nhỏ và thêm khoảng

100 µl of 500 mM NH4HCO3 /50% acetonitrile. Votex và ñể yên 5 phút. Loại bỏ dung dịch.

Lập lại 2-3 lần. Tiếp tục thêm 50µl acetonitrile. Votex và ñể yên 5 phút. Cẩn thận loại bỏ acetonitrile, lập lại 2 - 3 lần.

2. Làm khô

Làm khô các eppendorf bằng ly tâm chân không (Speed-vac)

3. Khử cầu nối disulfide

Thêm dung dịch 10omM DTT in 10mM ammonium bicarbonate cho ngập gel và thổi khí N2

vào ñể loại O2. ðậy eppendorf kín và ủ ở nhiệt ñộ 57oC trong 1 giờ.

4. Alkyl hóa nhóm SH

Làm lạnh ñến nhiệt ñộ phòng. Loại bỏ dung dịch DTT, thêm 55mM Iodoacetamide/ 100mM ammonium bicarbonate. Thổi khí N2 vào và ñậy kín eppendorf. Phủ kín eppendorf bằng một

lớp giấy nhôm và ủ ở nhiệt ñộ phòng trong 1 giờ.

5. Rửa gel

Cẩn thận loại bỏ dung dịch Iodoacetamide, thêm 100µl dung dịch 10mM ammonium bicarbonate. ðể yên ở nhiệt ñộ phòng 5 phút, sau ñó loại bỏ dung dịch ra khỏi eppendorf.

132

Thêm 10µl acetonitrile, votex và ñể yên trong 5 phút. Cẩn thận loại bỏ dịch bên trên.

Lập lại việc thêm dung dịch 100mM ammonium bicarbonate và 100µl acetonitrile 1 lần nữa. Sau ñó loại bỏ dung dịch và làm khô bằng ly tâm chân không (Speed-vac)

6. Thủy phân

Thêm vào eppendorf 15-30µl dung dịch 12.5mg/µl trypsin in 50mM ammonium bicarbonate.

ðể yên ở 4oC trong 30 phút. Cẩn thận loại bỏ dung dịch trypsin thừa và thêm 15µl of 50mM

ammonium bicarbonate. Ủ qua ñêm (6-15hrs) ở nhiệt ñộ 37oC.

7. Chiết tách dịch thủy phân

ðem các eppendorf thủy phân về nhiệt ñộ phòng. Ly tâm 6000 vòng trong 10 phút. Dùng pipet hút cẩn thận dịch bên trên và giữ lại. Phần còn lại thêm tiếp 20mM ammonium

bicarbonate. Votex và ly tâm 6000 vòng trong 10 phút, thu dịch bên trên và giữ lại.

Tiếp tục thêm vào eppendorf 5% acid formic 50% acetonitrile (10-25µl). ðể yên 5-10 phút

và ly tâm 6000 vòng trong 10 phút. Dùng pipet hút cẩn thận dịch bên trên và giữ lại.

Thu hồi dịch bên trên cả 3 lần và làm khô bằng ly tâm chân không. Gửi mẫu phân tích.

8. Cô ñặc dịch peptide

Sử dụng cột Zip-Tip C18 Cartridge và bước này ñược thực hiện tại trung tâm phân tích

protein và proteomic ðại Học Quốc gia Singapor.

1.7.2 Xác ñịnh khối lượng peptide

Thiết bị MS sử dụng: MALDI-Tof-Tof MS: 4800 Proteomics Analyzer, S/N AK01860603 (Applied Biosystems, Framingham, MA, USA)

1.8 Xác ñịnh hàm lượng ñạm amine bằng phương pháp OPA [85]

1.8.1 Nguyên tắc

Các nhóm amine của amino acid hoặc peptide phản ứng với với sự có mặt của –SH của

dithiothreitol (DTT) hoặc β-mercaptoethanol sẽ tạo ortho-phthaldialdehyde ra hợp chất có

khả năng hấp thụ ở bước sóng 340 nm.

1.8.2 Tiến hành

* Pha dung dịch OPA:

+ Dung dịch 1:18,7 g Borax + 68 mg SDS + nước cất = 500 ml.

133

+ Cân chính xác 400 mg OPA pha trong 5 ml etanol ñể hòa tan hết, thêm vào 44 mg

dithiothreitol (DTT), sau ñó thêm 37,5 ml dung dịch 1 rồi pha thành 50 ml ta ñược dung dịch OPA (chỉ pha trước khi dùng).

* Pha serine chuẩn: Cân 10 mg serine pha trong bình ñịnh mức 100 ml ñược nồng ñộ 0,1 mg/ml.

* ðo mẫu :

+ 200 µl dd serine chuẩn + 1,5 ml OPA + 200 µl nước + 1,5 ml OPA + 200 µl dd thủy phân

ñã pha loãng + 1,5 ml OPA, rồi ñể yên 2 phút, ñem ño ở bước sóng 340 nm.


Hàm lượng ñạm amine ñược tính theo công thức:

VS 14,2 MN = CS x

1000 x

m x 100 (mgN/g)

Trong ñó: MN: hàm lượng ñạm amine

ODS – ODO CS =

ODSD – ODO x 0,9516 (mMol/L)

0,9516: mMol/L Serine (tương ñương 0,9516 Mmol/L Nitơ)

VS :Thể tích dịch thủy phân (ml)

m: khối lượng mẫu(g)

100: hệ số pha loãng

ODSD, ODS, ODO: ñộ hấp thụ 340 nm mẫu chuẩn serine, mẫu thật, mẫu không

MN x100 Hiệu suất thủy phân (N%) =

MN tổng số

Trong ñó :

N: hiệu suất thủy phân (%)

MN : lượng nitơ ñạm amine trong dịch thủy phân

MN tổng số: lượng nitơ ñạm amine tổng số

134

1.9 Phương pháp phân tích nitơ amoniac (ñạm amôn)

1.9.1 Nguyên tắc

ðẩy muối amôn ra thể tự do (thường dưới dạng muối NH4Cl) bằng một chất kiềm mạnh hơn

amoniac như Mg(OH)2. Dùng hơi nước kéo amoniac ñã ñược giải phóng sang bình hấp thụ chứa dung dịch acid boric (H3BO3) với chất chỉ thị màu (hỗn hợp bromoresol green và

methyl red) tạo thành muối amôn tetraborat

2 NH4Cl + Mg (OH)2 → MgCl2 + 2 NH3↑ + 2 H2O

2 NH3 + 4 H3BO3 → (NH4)2B4O7 + 5 H2O

Sau ñó ñịnh phân lượng nitơ trong dung dịch (NH4)2B4O7 bằng dung dịch acid mạnh H2SO4 0,05N (chuẩn) ñến khi dung dịch chuyển từ màu xanh sang ñỏ nâu

(NH4)2B4O7 + H2SO4 + 5 H2O → (NH4)2SO4 + 4 H3BO3

1.9.2 Tiến hành

* Chuẩn bị hoá chất:

+ Hỗn hợp chỉ thị màu: Cân 0,099 g bromoresol green và 0,066 g methyl red hoà tan trong 100 ml ethanol

+ Dung dịch acid boric-chỉ thị màu: Cân 20 g acid boric (H3BO3) hòa tan trong 950 ml nước cất, sau ñó cho 20 ml dung dịch chất chỉ thị màu khuấy ñều, cho thêm nước cất cho vừa ñủ

1000 ml (dung dịch có màu ñỏ). Dùng NaOH 0,1N ñiều chỉnh màu của dung dịch về màu ñỏ nâu sắp chuyển sang màu xanh (pH = 5)

+ MgO bột

+ Dung dịch chuẩn H2SO4 0,05N

• Chưng cất:

Cho vào bình của hệ thống chưng cất 50 ml nước cất, hút chính xác 1 ml mẫu nước cần phân tích (1 g ñối với chất khô), cho thêm 3 g Mg(OH)2. Làm kín hệ thống và chưng cất cho hơi

nước và NH3 tạo thành NH4OH vào cốc chứa 10 ml dung dịch acid boric-chất chỉ thị màu. Sau ñó hứng khoảng 50 ml dung dịch có màu xanh nước biển (thử bằng cách dùng giấy quỳ:

nếu nước tụ từ ống sinh hàn làm giấy quỳ chuyển sang màu xanh thì trong nước còn lượng NH3 quá trình chưng cất chưa kết thúc, giấy quỳ không ñổi màu chứng tỏ trong nước không

có NH3 quá trình chưng cất kết thúc).

Song song với mẫu thử thật ta tiến hành mẫu thử không (thay lượng mẫu bằng lượng nước

cất) ñể loại trừ sai số.

135

* ðịnh phân: Dung dịch sau khi chưng cất ñạm có màu xanh nước biển ñem chuẩn ñộ bằng

dung dịch H2SO4 0,05N ñến khi dung dịch mất màu xanh và chuyển sang màu ñỏ nâu (pH = 5) thì kết thúc, ñọc số ml dung dịch H2SO4 0,05N sử dụng.


0,0007 x (V – V0) x 1000 0,7 x (V – V0)

Nitơ amoniac = m

(g/l) hay

(g/kg Dw) m

(g/l) hay

(g/kg Dw)

Trong ñó:

V: số ml H2SO4 0,05N dùng chuẩn ñộ mẫu

V0: số ml H2SO4 0,05N dùng chuẩn ñộ mẫu thử không

0,0007: số gam nitơ tương ứng với 1 ml H2SO4 0,05N

m: số ml mẫu (ñối với mẫu nước) hay số gam mẫu (ñối với mẫu khô) ñem phân tích

1000: hệ số quy ñổi từ ml sang lít hay từ gam sang kg

1.10 ðịnh lượng lipid bằng hệ thống Soxhlet

1.10.1 Nguyên tắc

Trong tế bào, lipid ở dạng tự do và liên kết. Lipid tự do tập trung chủ yếu ở các cơ quan dự

trữ như hạt, quả (ở thực vật) và mô mỡ (ở ñộng vật). Trong thực tế, sự xác ñịnh lipid dựa vào hàm lượng lipid ñược rút ra khỏi nguyên liệu bằng các dung môi hữu cơ.

1.10.2 Tiến hành

Hoá chất: Diethyl ether

Chuẩn bị túi bằng giấy lọc ñể ñựng nguyên liệu. Túi giấy lọc ñược cắt hình chữ nhật, chiều dài gấp 2,5 lần chiều rộng, gấp thành túi trụ có ñường kính bé hơn trụ chiết. Túi ñược sấy khô ñến trọng lượng không ñổi và ñược cân trên cân phân tích.

Nguyên liệu ñược nghiền nhỏ, sấy khô ñến trọng lượng không ñổi. Cân chính xác 2 – 5 g rồi cho mẫu vào túi giấy. Gấp kín mép túi, ñặt túi có mẫu phân tích vào trụ chiết.

Lắp trụ chiết vào bình cầu. Cho dung môi vào bình chiết ñến ngập túi nguyên liệu, mức dung môi ñến phần trên ống xi phông trụ chiết.

Lắp ống làm lạnh, ngâm nguyên liệu trong dung môi vài giờ.

ðặt máy Soxhlet vào nồi cách thủy (ñối với ether không quá 50°C) sao cho số lần dung môi

rút từ trụ chiết xuống bình cầu khoảng 10 – 15 lần trong 1 giờ (4 – 6 phút/lần).

136

Thử lipid ñã chiết rút hết hay chưa bằng cách lấy một vài giọt ether từ ñầu cuối trụ chiết cho

lên ñĩa kính ñồng hồ sạch. Cho bay hơi hết ether. Nếu không có lipid trên ñĩa kính, xem như lipid ñã ñược chiết hoàn toàn.

Lấy túi mẫu nguyên liệu ra khỏi bình chiết, cho bay hơi hết dung môi, sấy khô cho ñến khi trọng lượng không ñổi.


Hàm lượng lipid có trong 100 g mẫu nguyên liệu

Trong ñó:

X: hàm lượng chất béo tính bằng %

a: trọng lượng túi mẫu nguyên liệu trước khi chiết (g)

b: trọng lượng túi mẫu nguyên liệu sau khi chiết (g)

c: lượng nguyên liệu lấy ñể xác ñịnh hàm lượng chất béo (g)

1.11 Xác ñịnh hàm lượng tro

Cân 1 gam mẫu cho vào chén sứ ñã biết khối lượng. Nung mẫu ở nhiệt ñộ 560 - 600°C ñến

khối lượng không ñổi. ðể nguội trong bình hút ẩm ñến nhiệt ñộ phòng, cân mẫu và tính ñược hàm lượng tro còn lại. Thường thời gian nung khoảng 2 giờ.

T = (m0 – m1) x 100

Trong ñó: T: Hàm lượng tro (%)

m0: Khối lượng chén và mẫu trước khi nung (g)

m1: Khối lượng chén và mẫu sau khi nung (g)

1.12 Xác ñịnh ñộ tan trong nước

Cân 5 gam mẫu, ñem ngâm trong 200 ml nước cất. Sau 2 giờ ñem lọc qua giấy lọc, sấy ở

nhiệt ñộ 105°C ñến khối lượng không ñổi. Cân khối lượng còn lại và tính ñộ tan trong nước.

m0 – m1 DT =

5 x 100%

Trong ñó: DT: ðộ tan trong nước (%)

m0: Khối lượng chén, giấy và mẫu ban ñầu (g)

m1: Khối lượng chén, giấy và mẫu sau khi lọc và sấy khô (g)

(a – b) x 100

X= c

137

Bảng 1.6: Tiêu chuẩn thức ăn hỗn hợp dạng viên cho tôm sú (Tiêu chuẩn ngành 28TCN 102: 2004)

Loại thức ăn Chỉ tiêu Số 1 Số 2 Số 3 Số 4 Số 5 Số 6

1. Hình dạng bên ngoài Viên hình trụ hoặc mảnh ñều nhau, bề mặt mịn, kích cỡ theo ñúng số hiệu của từng loại thức ăn.

2. Màu sắc Nâu vàng ñến nâu, ñặc trưng của nguyên liệu phối chế.

3. Mùi vị ðặc trưng của nguyên liệu phối chế, không có mùi men mốc và mùi lạ khác.

0,6 0,8 1,2 1,8 2,2 2,5 4. Kích cỡ - ðường kính viên (hoặc mảnh), mm (≤) - Chiều dài so với ñường kính viên (lần) nằm trong khoảng

1,5 – 2,5

5. Tỷ lệ vụn nát, % khối lượng (≤) 2 6. ðộ bền, giờ (≥) 1 7. Năng lượng thô, Kcal/kg (≥) 3400 3400 3200 3200 3000 3000 8. ðộ ẩm, % khối lượng (≤) 11 9. Hàm lượng protein thô, % khối lượng (≥) 42 40 39 38 37 35 10. Hàm lượng lipid thô, % khối lượng, trong khoảng

6 - 8 6 - 8 5 - 7 5 - 7 4 - 6 4 - 6

11. Hàm lượng xơ thô, % khối lượng (≤) 3 3 4 4 5 5 12. Hàm lượng tro, % khối lượng (≤) 14 14 15 15 16 16 13. Cát sạn (tro không hòa tan trong HCl 10%), % khối lượng (≤)

1 1 2 2 2 2

14. Hàm lượng Ca, % khối lượng (≤) 2,3 15. Tỷ lệ Ca/P, nằm trong khoảng 1,0 – 1,5 16. Hàm lượng NaCl, % khối lượng (≤) 2,5 17. Hàm lượng lysine, % khối lượng (≥) 2,10 2,10 1,80 1,80 1,70 1,70 18. Hàm lượng methionine, % khối lượng (≥) 0,90 0,90 0,80 0,80 0,70 0,70 19. Côn trùng sống Không cho phép 20. Vi khuẩn gây bệnh (Salmonella) Không cho phép 21. Nấm mốc ñộc (Aspergillus flavus) Không cho phép 22. Chất ñộc hại (Aflatoxin) Không cho phép 23. Các loại kháng sinh và hóa chất ñã bị cấm sử dụng theo Quyết ñịnh số 01/2002/QÐ-BTS ngày 22/01/2002 của Bộ trưởng Bộ Thủy sản. Không cho phép

Số 1: Loại dạng mảnh sử dụng cho cỡ tôm Postlarvae-15 có khối lượng: 0,01 - 0,20 g/con

Số 2: Loại dạng mảnh sử dụng cho cỡ tôm có khối lượng: 0,20 -1,00 g/con

Số 3: Loại dạng mảnh (hoặc viên) sử dụng cho cỡ tôm có khối lượng: 1,00 - 5,00 g/con

Số 4: Loại dạng viên sử dụng cho cỡ tôm có khối lượng: 5,00 -10,00 g/con

Số 5: Loại dạng viên sử dụng cho cỡ tôm có khối lượng: 10,00 - 20,00 g/con

Số 6: Loại dạng viên sử dụng cho cỡ tôm có khối lượng:lớn hơn 20,00 g/con

138

Hình 1.3 : Hệ thống bể thí nghiệm

Hình 1.1: Máy sấy phun

Hình 1.2: Tủ sấy

139

PHỤ LỤC 2: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU TINH SẠCH PROTEASE TRÙN QUẾ

2.1 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng ñến hoạt tính protease trùn quế tự phân

2.1.1 Ảnh hưởng của thời gian tự phân lên hoạt tính protease trùn quế

Bảng 2.1 Hoạt ñộ riêng của protease trùn quế theo thời gian tự phân

Thời gian Hoạt ñộ riêng Thời gian Hoạt ñộ riêng Ngày thứ 1 Ngày thứ 2

Ngày thứ 3 Ngày thứ 4



0,021 ± 0,002

0,032 ± 0,001

0,035 ± 0,000

0,036 ± 0,000

0,037 ± 0,001

0,037 ± 0,001

0,038 ± 0,000

0,040 ± 0,001




Ngày thứ 15

0,042 ± 0,000

0,045 ± 0,001

0,042 ± 0,001

0,038 ± 0,001

0,035 ± 0,002

0,033 ± 0,001

0,031 ± 0,002

2.1.2 Ảnh hưởng của nhiệt ñộ và pH lên hoạt tính protease trùn quế tự phân

Bảng 2.2 Ảnh hưởng của nhiệt ñộ và pH lên hoạt tính protease trùn quế tự phân

Nhiệt ñộ HðR HTTQ pH HðR HTTQ 30oC

35 40

45 50

55 60

65 70

75 80

0,044±0,002

0,061±0,004

0,076±0,003

0,082±0,004

0,091±0,001

0,094±0,001

0,092±0,002

0,046±0,003

0,019±0,001

0,006±0,001

0,000±0,000

47,04

65,04 80,13

86,59 96,55

100 97,61

48,72 19,68

6,46 0,00

2

3 4

5 6

7 8

9 10

11 12

13

0,002±0,001

0,016±0,001

0,003±0,001

0,034±0,001

0,038±0,001

0,045±0,001

0,044±0,002

0,047±0,001

0,054±0,001

0,052±0,001

0,055±0,002

0,003±0,000

4,40

28,75 6,23

62,64 69,51

81,68 81,23

86,2 98,35

94,96 99,91

5,22

2.1.3 Xác ñịnh ñiểm ñẳng ñiện protease trùn quế tự phân

Bảng 2.3 Hoạt ñộ tổng ở các pH khác nhau sau khi thu hồi tủa

pH Hoạt ñộ tổng pH Hoạt ñộ tổng

2

3 4

5

0,043±0,008

0,265±0,012

0,935±0,006

0,961±0,007

8

9 10

11

0,719±0,015

0,664±0,006

0,622±0,007

0,454±0,015

140

6

7

0,813±0,007

0,754±0,013

12

13

0,249±0,007

0,165±0,003

2.1.4 Ảnh hưởng các chất ức chế lên hoạt tính protease trùn quế

Bảng 2.4 Ảnh hưởng các chất ức chế lên hoạt tính protease trùn quế

Chất ức chế HðR HTTQ

ðối chứng Aprotinin SBTI

PMSF TPCK

TLCK

0,046±0,001

0,021±0,001

0,019±0,001

0,012±0,000

0,040±0,002

0,029±0,003

100 44,41 42,02

26,79 87,14

62,03

2.1.5 Thu nhận bằng phương pháp tủa dịch tự phân trùn quế

Bảng 2.5 Hoạt ñộ riêng của protease trùn quế tủa sơ bộ bằng aceton và tủa (NH4)2SO4 bh

Aceton (NH4)2SO4bh Tỉ lệ mẫu: aceton

(v/v) Hoạt ñộ riêng Tủa phân ñoạn (%) Hoạt ñộ riêng

1:0

1: 0,5 1: 1

1:1,5 1:2

1:2,5

1:3

0,045±0,000

0,000±0,000

0,041±0,004

0,112±0,004

0,138±0,002

0,099±0,001

0,105±0,006

0-20%

30% 40%

50% 60% 70%

80% 90%

0,029±0,000

0,044±0,003

0,088±0,004

0,081±0,001

0,147±0,007

0,081±0,005

0,097±0,002

0,088±0,007

2.2 Nghiên cứu ñặc tính hóa học các protease tinh sạch từ trùn quế tự phân

2.2.1 Ảnh hưởng các chất ức chế lên hoạt tính protease các phân ñoạn enzyme sau tinh sạch

Bảng 2.6: Ảnh hưởng các chất ức chế lên hoạt tính các protease sau tinh sạch

Chất ức chế Phân ñoạn Hoạt ñộ riêng (U/mg) Hoạt ñộ so với ñối chứng %

ðối chứng FI FII

FIII-1 FIII-2

FIII-3

1,224 ± 0,012 0,898 ± 0,041

0,953 ± 0,056 0,938 ± 0,043

1,052 ± 0,024

100 100

100 100

100

141

FIV 0,778 ± 0,008 100

PMSF FI FII

FIII-1 FIII-2

FIII-3 FIV

0,006 ± 0,002 0,002 ± 0,000

0,019 ± 0,003 0,037 ± 0,006

0,000 ± 0,000 0,065 ± 0,009

0,46 0,19

2,03 3,94

0,00 8,37

TPCK FI FII

FIII-1 FIII-2

FIII-3 FIV

1,227 ± 0,020 0,899 ± 0,024

0,917 ± 0,020 0,938 ± 0,010

0,799 ± 0,017 0,778 ± 0,019

100 100

96,28 100

75,98 100

Aprotinin FI FII

FIII-1 FIII-2

FIII-3 FIV

0,359 ± 0,013 0,854 ± 0,038

0,827 ± 0,069 0,893 ± 0,023

0,269 ± 0,004 0,552 ± 0,027

29,31 95,16

86,75 95,22

25,54 70,98

Leupeptin FI FII

FIII-1 FIII-2

FIII-3 FIV

0,233 ± 0,010 0,899 ± 0,023

0,930 ± 0,020 0,942 ± 0,025

0,221 ± 0,004 0,568 ± 0,012

19,07 100

97,62 100

21,03 72,95

SBTI FI

FII FIII-1

FIII-2 FIII-3

FIV

0,021 ± 0,002

0,683 ± 0,042 0,768 ± 0,050

0,870 ± 0,026 0,025 ± 0,011

0,000 ± 0,027

1,75

76,11 80,65

92,8 2,41

0,000

EDTA FI

FII FIII-1

FIII-2 FIII-3

FIV

1,226 ± 0,013

0,896 ± 0,035 0,951 ± 0,026

0,939 ± 0,035 1,043 ± 0,021

0,781 ± 0,014

100

100 100

100 100

100

142

Chymostatin FI

FII FIII-1

FIII-2 FIII-3

FIV

0,234 ± 0,009

0,902 ± 0,019 0,720 ± 0,029

0,941 ± 0,013 0,194 ± 0,003

0,698 ± 0,010

19,13

100 75,53

100 18,49

89,77

Pepstatin FI

FII FIII-1

FIII-2 FIII-3

FIV

1,192 ± 0,079

0,520 ± 0,035 0,573 ± 0,006

0,803 ± 0,020 0,870 ± 0,063

0,581 ± 0,047

97,34

57,95 60,10

85,60 82,72

74,63

2.2.2 Ảnh hưởng của nhiệt ñộ lên hoạt tính protease các phân ñoạn enzyme sau tinh sạch

Bảng 2.7: Ảnh hưởng của nhiệt ñộ lên hoạt tính các protease sau tinh sạch

Phân ñoạn

Nhiệt ñộ (oC)

Hoạt ñộ riêng (U/mg)

HT tương quan (% so với cực ñại)

Phân ñoạn

Nhiệt ñộ (oC)

Hoạt ñộ riêng (U/mg)

HT tương quan (% so với cực ñại)

FI 30 37

45 50 55

60 65

70 75

80

1,472± 0,070

2,113±0,023

2,422±0,018

2,585±0,068

2,718±0,040

2,785±0,015

2,715±0,060

2,551±0,035

2,123±0,073

1,196±0,055

52,87 75,86

86,94 92,80 97,57

100 97,46

91,9 76,24

42,93

FIII-2 30 37

45 50 55

60 65

70 75

80

0,761±0,039

1,086±0,033

1,303±0,018

1,489±0,026

1,561±0,047

1,577±0,014

1,696±0,026

1,357±0,005

0,610±0,030

0,167±0,005

44,87 64,03

76,86 87,78 92,03

92,96 100

80,02 35,97

9,83

FII 30 37

45 50

55 60

65 70

0,961±0,004

1,057±0,030

1,270±0,019

1,383±0,032

1,391±0,006

1,441±0,014

1,519±0,016

1,412±0,009

0,862±0,043

63,28 69,60

83,59 91,06

91,59 94,82

100 92,94

FIII-3 30 37

45 50

55 60

65 70

0,859±0,020

1,272±0,023

1,709±0,018

1,945±0,133

2,048±0,018

2,313±0,020

2,454±0,026

2,275±0,054

1,048±0,069

35 51,84

69,63 79,26

83,46 94,26

100 92,72

143

75

80

0,470±0,012 56,76

30,93

75

80

0,278±0,077 42,72

11,32

FIII-1 30

37 45

50 55

60 65

70 75

80

0,902±0,009

1,169±0,020

1,528±0,017

1,721±0,069

1,748±0,034

1,804±0,031

1,641±0,069

1,181±0,028

0,428±0,044

0,267±0,014

50,0

64,78 84,67

95,39 96,89

100 90,94

65,44 23,72

14,78

FIV 30

37 45

50 55

60 65

70 75

80

0,634±0,027

1,001±0,022

1,345±0,046

1,526±0,003

1,992±0,002

2,018±0,020

1,670±0,018

0,686±0,012

0,310±0,053

0,122±0,013

31,43

49,59 66,66

75,60 98,72

100 82,76

33,99 15,35

6,06

2.2.3 Ảnh hưởng của ñộ bền nhiệt theo thời gian lên hoạt tính protease các phân ñoạn enzyme sau tinh sạch

Bảng 2.8: Ảnh hưởng của ñộ bền nhiệt theo thời gian lên hoạt tính các protease sau tinh sạch

37oC 50oC 55oC Phân ñoạn

Thời gian (phút)

Hoạt ñộ riêng

(U/mg)

HT tương ñối so với

37oC

Hoạt ñộ riêng

(U/mg)


37oC

Hoạt ñộ riêng

(U/mg)


37oC

FI 10 30 60 120 180

1,849±0,007

1,791±0,045

1,768±0,002

1,721±0,026

1,736±0,009

100 100 100 100 100

1,779±0,031

1,870±0,060

1,794±0,015

1,777±0,009

1,583±0,043

96,2 104,4

101,5 103,2

91,2

1,909±0,057

1,845±0,064

1,858±0,019

1,706±0,021

1,726±0,057

103,2 103,1

105,1 99,1

99,4 FII 10

30 60 120 180

0,999±0,014

0,968±0,012

1,009±0,008

1,050±0,022

1,087±0,014

100 100 100 100 100

1,003±0,005

0,981±0,007

0,999±0,008

1,029±0,009

1,060±0,013

100,3

101,4 99

88 97,5

1,006±0,006

1,017±0,001

1,033±0,010

1,002±0,078

1,036±0,005

100,6

105 102,4

95,4 95,3

FIII-1 10 30 60 120 180

1,027±0,014 1,051±0,012

1,061±0,020 1,057±0,027

1,046±0,018

100 100

100 100

100

1,050±0,017 1,049±0,012

1,059±0,031 1,045±0,004

1,013±0,018

102,2 99,9

99,9 97,2

96,8

1,058±0,010 1,010±0,006

0,948±0,014 0,906±0,018

0,799±0,018

103 96,1

89,4 84,2

76,3 FIII-2 10 0,978±0,001 100 0,986±0,011 100,9 0,992±0,016 101,4

144

30 60 120 180

0,982±0,003

1,009±0,014 1,029±0,021

1,009±0,032

100

100 100

100

0,982±0,008

0,996±0,002 0,995±0,003

0,955±0,011

100

98,7 96,7

94,7

0,905±0,014

0,759±0,037 0,655±0,011

0,582±0,023

92,1

75,3 63,7

57,7 FIII-3 10

30 60 120 180

1,206±0,013

1,199±0,009 1,055±0,038

1,028±0,004 1,025±0,022

100

100 100

100 100

1,232±0,020

1,190±0,036 1,039±0,038

1,000±0,022 0,992±0,011

102,2

99,2 98,5

97,2 96,8

1,223±0,020

1,156±0,051 0,873±0,049

0,815±0,016 0,775±0,000

101,4

96,4 82,8

79,2 75,6

FIV 10 30 60 120 180

0,875±0,015 0,883±0,017

0,914±0,009 0,856±0,014

0,830±0,009

100 100

100 100

100

0,887±0,008 0,881±0,015

0,906±0,008 0,839±0,009

0,806±0,007

101,27 99,7

99,21 97,93

97,16

0,906±0,019 0,858±0,027

0,752±0,020 0,620±0,022

0,562±0,003

103,52 97,10

82,35 72,38

67,7

60oC 65oC 70oC Phân ñoạn

Thời gian (phút)

Hoạt ñộ riêng

(U/mg)


37oC

Hoạt ñộ riêng

(U/mg)


37oC

Hoạt ñộ riêng

(U/mg)


37oC

FI 10 30 60 120 180

1,735±0,072

1,669±0,041

1,792±0,033

1,811±0,022

1,764±0,024

93,8 93,2

101,4 105,2

101,6

1,551±0,005

1,557±0,062

1,478±0,026

1,153±0,043

0,867±0,000

83,9 87,0

83,6 67,0

50,0

1,041±0,022

0,349±0,022

0,074±0,002

0,032±0,003

0,018±0,002

56,3 19,5

4,2 1,8

1,0 FII 10

30 60 120 180

1,009±0,007

0,868±0,005

0,920±0,007

0,906±0,003

0,858±0,012

101

89,6 91,3

86,4 78,9

1,013±0,027

0,551±0,034

0,236±0,017

0,105±0,001

0,117±0,019

101,4

56,9 23,4

10 10,8

0,920±0,017

0,043±0,002

0,021±0,002

0,012±0,002

0,006±0,001

92

4,4 2,1

1,1 0,5

FIII-1 10

30 60

120 180

1,068±0,016

0,790±0,029

0,350±0,002

0,233±0,016

0,022±0,003

103,9

75,2 33

21,7 2,1

0,907±0,024

0,215±0,019

0,085±0,004

0,020±0,004

0,010±0,002

88,2

20,5 8

1,9 1

0,639±0,040

0,085±0,020

0,013±0,002

0,012±0,002

0,006±0,002

62,2

8,1 1,2

1,1 0,6

FIII-2 10 30

60

1,004±0,016

0,848±0,042

0,390±0,022

102,7 86,3

38,6

1,019±0,009

0,742±0,018

0,185±0,004

104,2 75,6

18,3

0,775±0,015

0,259±0,020

0,064±0,015

79,3 26,4

6,3

145

120

180

0,226±0,012

0,118±0,002

22

11,7

0,026±0,005

0,011±0,002

1,5

1,1

0,013±0,003

0,009±0,003

1,3

0,8 FIII-3 10

30 60

120 180

1,237±0,045

1,046±0,007

0,688±0,020

0,375±0,034

0,198±0,025

102,6

87.2 65,2

36,5 19,3

1,253±0,022

0,853±0,020

0,454±0,016

0,198±0,016

0,090±0,016

103,9

71,1 43,0

19,2 8,8

0,557±0,022

0,131±0,016

0,066±0,009

0,022±0,004

0,011±0,002

46,2

10,9 6,3

2,2 1,1

FIV 10 30

60 120

180

0,914±0,006

0,788±0,023

0,596±0,019

0,279±0,009

0,102±0,005

104,34 89,24

65,28 32,59

12,24

0,711±0,016

0,408±0,018

0,116±0,003

0,048±0,004

0,012±0,000

81,21 46,21

12,7 5,66

1,42

0,313±0,004

0,107±0,004

0,049±0,003

0,021±0,006

0,009±0,001

35,78 12,17

5,38 2,45

1,03

2.2.4 Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính protease các phân ñoạn enzyme sau tinh sạch

Bảng 2.9: Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính các protease sau tinh sạch

Phân ñoạn

pH Hoạt ñộ riêng (U/mg)

HTtương quan so với cực

ñại(%)

Phân ñoạn


HTtương quan so với cực ñại(%)

FI 2

3 4

5 6

7 8

9 10

11 12

13

0,000±0,000

0,000±0,000

0,061±0,013

0,459±0,015

0,856±0,004

1,787±0,033

1,226±0,050

1,111±0,043

1,560±0,020

1,965±0,050

1,071±0,017

0,437±0,076

0,00

0,00 3,12

23,34 43,56

90,94 62,37

56,52 79,39

100 54,49

22,25

FIII-2 2

3 4

5 6

7 8

9 10

11 12

13

0,003±0,002

0,004±0,003 0,097±0,005

0,261±0,027 0,489±0,013

0,969±0,090 0,679±0,054

0,807±0,038 1,097±0,062

0,979±0,003 0,704±0,038

0,480±0,054

0,31

0,41 8,89

23,80 44,54

88,36 61,90

73,55 100

89.28 64,15

43,71

FII 2

3 4

5 6

7 8

9

0,000±0,000

0,008±0,004

0,045±0,004

0,237±0,013

0,611±0,025

0,938±0,019

0,739±0,047

0,642±0,025

0

0,67 3,79

19,73 50,95

78,26 61,65

53,54

FIII-3 2

3 4

5 6

7 8

9

0,000±0,000

0,003±0,004

0,028±0,013

0,181±0,018 0,528±0,057

1,201±0,026

0,997±0,111

0,769±0,071

0,00

0,24 2,18

14,05 40,93

93,01 77,26

59,58

146

10

11 12

13

1,060±0,021

1,199±0,051

0,791±0,091

0,384±0,062

88,40

100 66.0

31,99

10

11 12

13

1,022±0,022

1,291±0,031 0,885±0,066

0,582±0,053

79,20

100 68,54

45.05 FIII-1 2

3 4

5 6

7 8

9 10

11 12

13

0,010±0,011

0,000±0,000

0,101±0,011

0,336±0,017

0,668±0,004

0,995±0,000

1,090±0,024

1,152±0,050

1,430±0,057

1,405±0,059

1,042±0,040

1,255±0,026

0,73

0,00 7,08

23,52 46,68

69,57 76,20

80,56 100

98,27 72,84

17,80

FIV 2

3 4

5 6

7 8

9 10

11 12

13

0,001±0,002

0,000±0,000 0,052±0,000

0,240±0,014 0,587±0,004

0,734±0,030 0,852±0,035

0,738±0,018 0,833±0,002

0,882±0,032 0,748±0,049

0,119±0,011

0,14

0,00 5,90

27,25 66,57

83,28 96,62

83,70 94,52

100 84,84

13,48

2.2.5 Ảnh hưởng ñộ bền pH lên hoạt tính protease các phân ñoạn enzyme sau tinh sạch

Bảng 2.10: Ảnh hưởng của ñộ bền pH lên hoạt tính các protease sau tinh sạch

Phân ñoạn



ñại(%)

Phân ñoạn



FI 2

3 4

5 6

7 8

9 10

11 12

13

0,012±0,004

0,319±0,017

0,739±0,026

0,954±0,013

1,066±0,007

1,117±0,017

1,108±0,026

1,111±0,035

1,103±0,020

1,095±0,013

1,043±0,078

0,328±0,013

1,1

28,57 66,21

85,44 95,47

100 99,18

99,45 98,77

98,08 93,41

29,40

FIII-2 2

3 4

5 6

7 8

9 10

11 12

13

0,009±0,003

0,035±0,005 0,510±0,002

0,680±0,024 0,732±0,027

0,807±0,003 0,794±0,002

0,780±0,025 0,784±0,006

0,788±0,002 0,776±0,008

0,633±0,005

1,11

4,31 63,20

84,31 90,70

100 98,48

96,67 97,23

97,64 96,25

78,48

FII 2 3 4

0,000±0,000

0,301±0,009

0,754±0,027

0,00 29,49 73,91

FIII-3 2 3 4

0,025±0,004

0,040±0,004

0,732±0,009

2,19 3,57

65,29

147

5

6 7

8 9

10 11 12 13

0,858±0,019

0,929±0,006

1,020±0,051

0,965±0,023

0,968±0,030

0,961±0,017

0,981±0,004

0,904±0,038

0,599±0,042

84,14

91,08 100

94,62 94,89

94,23 96,20 88,59 58,71

5

6 7

8 9

10 11 12

13

0,977±0,028

1,038±0,011

1,122±0,024

1,091±0,046

1,094±0,020

1,077±0,009

1,082±0,028

1,088±0,020

0,494±0,015

87,11

92,59 100

97,26 97,53

96,02 96,43 96,98 44,03

FIII-1 2 3

4 5

6 7

8 9

10 11

12 13

0,001±0,002

0,006±0,002

0,640±0,024

0,830±0,002

0,850±0,011

0,956±0,011

0,931±0,020

0,852±0,007

0,888±0,026

0,896±0,011

0,892±0,002

0,607±0.039

0.14 0.68

66.99 86.82

88.86 100

97.42 89.13

92.94 93.75

93.35 63.45

FIV 2 3

4 5

6 7

8 9

10 11

12 13

0,001±0,002 0,157±0,019

0,714±0,002 0,810±0,011

0,805±0,004 0,836±0,030

0,792±0,004 0,810±0,007

0,826±0,009 0,821±0,009

0,748±0,063 0,419±0,000

0,15 18,82

85,49 96,89

96,30 100

94,82 96,89

98,82 98,23

89,49 50,08

148

2.2.6 Ảnh hưởng ñộ bền enzyme các phân ñoạn protease sau tinh sạch theo thời gian bảo quản

Bảng 2.11 Hoạt ñộ riêng các protease sau tinh sạch theo thời gian bảo quản trong môi trường nước cất

Phân ñoạn

Tháng Hoạt ñộ riêng (U/mg)


ñại(%)

Phân ñoạn



I 1

2 3

4 5

6 7

8 9

10

1,532±0,079

1,504±0,041

1,429±0,016

1,488± 0,024

1,435±0,046

1,429±0,033

1,447±0,019

1,347±0,010

1,416±0,009

1,370±0,014

100

98,14 93,27

97,12 93,64

93,28 94,43

87,90 92,43

88,42

FIII-2 1

2 3

4 5

6 7

8 9

10

0,688±0,019

0,686±0,017 0,666±0,011

0.669±0,050 0,680±0,026

0,681±0,009 0,661±0,010

0,669±0,057 0,666±0,005

0,687±0,013

100

99,89 97,30

97,18 98,87

98,95 96,03

97,30 96,75

99,83

FII 1 2

3 4

5 6

7 8

9 10

0,702±0,017

0,693±0,012

0,617±0,003

0,652±0,006

0,651±0,046

0,672±0,014

0,690±0,016

0,647±0,009

0,660±0,009

0,656±0,017

100 98,74

87,87 92,86

92,75 95,67

98,3 92,21

96,82 93,47

FIII-3 1 2

3 4

5 6

7 8

9 10

1,722±0,011 1,316±0,022

1,305±0,011 1,319±0,018

1,315±0,024 1,267±0,057

1,201±0,018 1,270±0,048

1,241±0,013 1,178±0,012

100 76,43

75,77 76,61

76,39 73,59

69,73 73,77

72,06 68,41

FIII-1 1 2

3 4

5 6

7 8

9 10

0,557±0,028

0,559±0,013

0,559±0,007

0,539±0,015

0,545±0,009

0,545±0,016

0,555±0,010

0,540±0,003

0,558±0,005

0,546±0,017

100 99,85

99,81 96,18

97,40 97,31

99,11 96,46

99,60 98,00

FIV 1 2

3 4

5 6

7 8

9 10

0,360±0,008 0,361±0,010

0,355±0,011 0,355±0,016

0,354±0,010 0,336±0,004

0,331±0,004 0,324±0,006

0,329±0,004 0,322±0,002

100 100,23

98,63 98,62

98,33 93,28

92,01 89,95

91,35 89,51

149

Bảng 2.12 Hoạt ñộ riêng các protease sau tinh sạch theo thời gian bảo quản trong dung dịch ñệm pH 7,5

Phân ñoạn



ñại(%)

Phân ñoạn



FI 1

2 3

4 5

6 7

8 9

10

1,755±0,036

1,607±0,016

1,518±0,032

1,562±0,049

1,588±0,004

1,541±0,019

1,520±0,037

1,466±0,010

1,489±0,009

1,445±0,024

100

95,00 89,72

92,33 93,84

91,10 89,82

86,67 87,98

85,42

FIII-2 1

2 3

4 5

6 7

8 9

10

0,719±0,036

0,714±0,016 0,674±0,021

0,648±0,019 0,655±0,019

0,643±0,031 0,624±0,007

0,635±0,010 0,632±0,026

0,585±0,038

100

99,29 93,72

90,13 91,12

89,50 86,84

88,29 87,87

81,37

FII 1 2

3 4

5 6

7 8

9 10

0,648±0,015

0,639±0,017

0,603±0,006

0,591±0,015

0,603±0,025

0,577±0,015

0,574±0,021

0,550±0,009

0,555±0,004

0,554±0,015

100 98,58

92,99 91,27

93,03 89,09

88,63 84,95

85,62 85,44

FIII-3 1 2

3 4

5 6

7 8

9 10

1,667±0,023 1,599±0,016

1,560±0,034 1,540±0,031

1,545±0,032 1,573±0,008

1,547±0,010 1,546±0,008

1,501±0,009 1,495±0,013

100 97,47

95,09 93,87

94,14 95,86

94,26 94,18

91,45 91,10

FIII-1 1 2

3 4

5 6

7 8

9 10

0,589±0,007

0,588±0,010

0,519±0,006

0,516±0,024

0,501±0,015

0,496±0,013

0,477±0,008

0,472±0,006

0,447±0,005

0,436±0,018

100 99,78

88,14 87,59

85,00 84,25

80,92 80,19

75,90 74,07

FIV 1 2

3 4

5 6

7 8

9 10

0,502±0,014 0,412±0,018

0,397±0,009 0,391±0,007

0,390±0,009 0,369±0,005

0,371±0,006 0,363±0,002

0,340±0,003 0,368±0,007

100 82,11

79,00 77,84

77,67 73,52

73,83 72,34

67,77 71,66

150

PHỤ LỤC 3a: SẮC KÝ ðỒ LỌC GEL CÁC PROTEASE SAU TINH SẠCH

mm

0.0

25.0

50.0

75.0

100.0% Buffer B

-0.10

0.00

0.10

0.20

0.30

0.40

0.50

0.60

0.70

0.80

0.90

1.00

-50.0

0.0

50.0

100.0

150.0

200.0

250.0

300.0

350.0

400.0

450.0

500.0

00:00:00 00:30:00 01:00:00

Fractions

Hr:Min:Sec mS/cmAU

FI

0.0

25.0

50.0

75.0

100.0% Buffer B

-0.050

0.000

0.050

0.100

0.150

0.200

0.250

0.300

0.350

0.400

-50.0

0.0

50.0

100.0

150.0

200.0

250.0

300.0

350.0

400.0

450.0

500.0

00:00:00 00:30:00 01:00:00

Fractions

Hr:Min:Sec mS/cmAU

FII

Hình 3.1: Sắc ký ñồ lọc gel trên cột Superose 12 phân ñoạn FI và FII

151

Hình : Sắc ký ñồ lọc gel trên cột Superose 12 phân ñoạn FI và FII

0.0

25.0

50.0

75.0

100.0% Buffer B

-0.10

0.00

0.10

0.20

0.30

0.40

0.50

0.60

0.70

0.80

0.90

1.00

-50.0

0.0

50.0

100.0

150.0

200.0

250.0

300.0

350.0

400.0

450.0

500.0

00:00:00 00:30:00 01:00:00

Fractions

Hr:Min:Sec mS/cmAU

FIII-1

0.0

25.0

50.0

75.0

100.0% Buffer B

-0.050

0.000

0.050

0.100

0.150

0.200

0.250

0.300

0.350

0.400

-50.0

0.0

50.0

100.0

150.0

200.0

250.0

300.0

350.0

400.0

450.0

500.0

00:00:00 00:30:00 01:00:00

Fractions

Hr:Min:Sec mS/cmAU

FIII-2

Hình 3.2 : Sắc ký ñồ lọc gel trên cột Superose 12 phân ñoạn FIII-1 và FIII-2

152

Hình : Sắc ký ñồ lọc gel trên cột Superose 12 phân ñoạn FIII-1 và FIII-2

0.0

25.0

50.0

75.0

100.0% Buffer B

-0.050

0.000

0.050

0.100

0.150

0.200

0.250

0.300

0.350

0.400

-50.0

0.0

50.0

100.0

150.0

200.0

250.0

300.0

350.0

400.0

450.0

500.0

00:00:00 00:30:00 01:00:00

Fractions

Hr:Min:Sec mS/cmAU

FIII-3

Hình 3.3 : Sắc ký ñồ lọc gel trên cột Superose 12 phân ñoạn FIII-3 và FIV

0.0

25.0

50.0

75.0

100.0% Buffer B

-0.10

0.00

0.10

0.20

0.30

0.40

0.50

0.60

0.70

0.80

0.90

1.00

-50.0

0.0

50.0

100.0

150.0

200.0

250.0

300.0

350.0

400.0

450.0

500.0

00:00:00 00:30:00 01:00:00

Fractions

Hr:Min:Sec mS/cmAU

FIV

153

PHỤ LỤC 3b : KẾT QUẢ PHÂN TÍCH CÁC PROTEASE SAU TINH SẠCH BẰNG KỸ

THUẬT MALDI-TOF-TOF

FIII-1

799.0 1341.6 1884.2 2426.8 2969.4 3512.0

Mass (m/z)

245.3

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% Intensity

4700 Reflector Spec #1 MC[BP = 860.0, 245]

860.0377

1994.0341

1179.6359

857.0517

1475.7902

1277.7533

1308.7114

832.5123

1044.0826

1638.9353

1487.7954

973.5573

1194.6476

1300.0669

1234.7249

897.4337

2497.2634

835.2999

1107.5930

1157.6158

1997.0459

929.3343

1036.5864

1646.8790

1493.7701

1586.8792

2716.3691

2873.5056

1274.6423

1716.9156

2067.0408

1229.6885

1851.9337

1406.6902

1306.6547

1766.8392

1682.8793

1365.7032

2831.2656

2351.1819

2150.1523

2975.2383

799.0 1341.6 1884.2 2426.8 2969.4 3512.0

Mass (m/z)

111.4

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% Intensity

4700 Reflector Spec #1 MC[BP = 860.0, 111]860.0363

1064.5026

929.3148

856.0479

1994.0178

877.3292

1638.8839

1302.7675

817.3899

913.3064

1475.7690

1179.6238

1641.9205

1323.2695

1794.9891

2511.1848

1743.7616

1390.7233

2315.9517

2593.6631

1890.6533

2369.2642

FI.a

FI.b

Hình 3.4 : Phổ MALDI-TOF-TOF hai protease FI-b và FI-b

154

799.0 1441.8 2084.6 2727.4 3370.2 4013.0

Mass (m/z)

99.6

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% Intensity


2040.1346

2522.3281

2010.1682

2265.2214

2538.3755

FIII-3a

799.0 1441.8 2084.6 2727.4 3370.2 4013.0

Mass (m/z)

2134.9

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% Intensity


1959.9811

1475.7322

1179.5847

2352.0837

1646.7656

1707.7433

1307.6573

1993.9427

1365.6228

2497.1492

1109.4835

1383.6693

842.5034

2383.9060

1838.9066

1234.6626

1638.8376

1165.5695

1320.5664

1716.8251

973.5225

2065.9417

1585.8080

1090.5201

1493.7129

1941.9626

2016.9934

1033.5026

1791.7039

1539.7002

2705.1355

807.3889

1434.7333

847.4460

2904.3506

993.4897

1733.7928

897.4075

1393.7030

1184.5837

1357.6785

1310.6638

2150.0344

3312.2524

3052.5793

1628.8013

1141.5157

1589.7769

2561.2231

2831.1394

2295.0913

1262.5886

2510.0957

1979.9756

1095.5336

2950.3105

951.4675

2212.0625

2410.0256

2107.9626

1490.7145

1890.9628

2257.0205

3223.2422

2060.0432

3264.4690

2342.9724

1933.8877

1674.7787

1222.5780

1851.8912

2749.2856

3350.5247

2663.2642

FIII-3b

Hình 3.5 : Phổ MALDI-TOF-TOF hai protease FIII-3a và FIII-3b

155

799.0 1341.6 1884.2 2426.8 2969.4 3512.0

Mass (m/z)

548.4

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% Intensity


1781.8599

2249.1553

825.3991

2299.0200

2221.1470

1906.9617

2198.1482

2228.1677

1147.6206

1466.7108

2187.1738

2253.1560

2292.1545

1949.9695

2255.1343

2216.1509

1620.7837

1120.5811

2316.0544

2423.1602

1888.9619

1163.5984

827.3933

1994.9899

1739.8499

1358.7015

2093.0679

973.5811

1420.6594

2180.1531

1277.7500

2268.0654

1484.6959

2027.0388

1807.8981

1024.5028

3166.5610

1561.7352

1921.9174

1957.7747

2414.0354

1054.5573

2461.2341

FIV

Hình 3.6: Phổ MALDI-TOF-TOF hai protease FII và FIV

799.0 1341.6 1884.2 2426.8 2969.4 3512.0

Mass (m/z)

404.5

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% Intensity


2249.0977

1333.7096

1557.7533

1994.0177

2265.0947

1941.9861

1487.7877

2247.1108

2353.1499

1277.7308

2308.0176

2203.2136

2520.3901

1572.7645

1485.7239

2276.6428

2670.3320

1033.5458

1797.0529

1638.9283

852.7836

3049.7437

2459.0344

2864.6580

1345.9323

2976.0559

3174.8833

3355.6318

FII

156

799.0 1441.8 2084.6 2727.4 3370.2 4013.0

Mass (m/z)

2356.5

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% Intensity


2184.1260

2187.1440

2249.1157

1781.8213

2298.9731

2228.1211

1634.7682

2334.1033

1358.6836

1446.7169

2169.0813

2097.0347

1993.9630

1277.7115

1179.5911

1678.7676

842.5035

1838.8832

2924.3430

1125.0643

3166.4700

1407.6996

2696.3413

3670.9102

799.0 1441.8 2084.6 2727.4 3370.2 4013.0

Mass (m/z)

6426.3

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% Intensity


2184.1230

1446.7133

1475.7518

2169.1074

1358.6709

1179.5944

1781.8140

1277.7043

2249.1157

1993.9642

3670.8433

842.5062

1036.5299

2097.0591

1707.7621

1638.8539

1838.9180

1234.6761

2206.0999

1522.6434

1107.5448

2383.9202

1320.5870

973.5349

807.4017

1434.7594

2421.1282

897.4207

2584.1313

2298.9829

2872.3601

2462.2266

1890.9459

2962.4841

3038.4524

3616.8232

2705.1726

2510.1094

3579.8259

2831.1624

3822.8306

3456.6375

3166.4143

3873.9114

FIII-2

Hình 3.7 : Phổ MALDI-TOF-TOF hai protease FIII-1 và FIII-2

FIII-1

157

BLASTP 1.4.0 for FIII-1 Reference: Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schäffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997), "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402. Query= C:\ABMALDIData\DeNovo\Results\GPS\WXH_2008\080909_95\C11_E16\DenovoSub mission1Spot E2 Spectrum10_1466.DeNovo (1861 letters) Database: Sprot_20060314.fasta 211,104 sequences; 77,361,893 total letters Color Key: red = positive hit; green = borderline hit; black = negative result High Subtotal Sequences producing High-scoring Segment Pairs: Score Score FIBC_LUMRU (P83298) Fibrinolytic enzyme, isozyme C (EC 3.4.2... 63 63 FIBC_LUMRU (P83298) Fibrinolytic enzyme, isozyme C (EC 3.4.21.-) (F-II) Length = 242 Score = 33.6 bits (63) Identities = 11/21 (52%), Positives = 13/21 (61%) Query: 812 LPVNTELKFVGVTCTLSGWGR 832 LP N + G TC +SGWGR Sbjct: 114 LPANNNNDYAGTTCVISGWGR 134 Score = 22.5 bits (41) Identities = 6/11 (54%), Positives = 8/11 (72%) Query: 456 DVDSIMVHEDY 466 +VDS HE+Y Sbjct: 73 NVDSYTMHENY 83

158

BLASTP 1.4.0 for FIII-2 Reference: Altschul, Stephen F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schäffer, Jinghui Zhang, Zheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997), "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402. Query= C:\ABMALDIData\DeNovo\Results\GPS\WXH_2008\080909_95\C11_E16\DenovoSub mission3Spot E3 Spectrum10_1460.DeNovo (1876 letters) Database: Sprot_20060314.fasta 211,104 sequences; 77,361,893 total letters Color Key: red = positive hit; green = borderline hit; black = negative result High Subtotal Sequences producing High-scoring Segment Pairs: Score Score FIBC_LUMRU (P83298) Fibrinolytic enzyme, isozyme C (EC 3.4.2... 80 80 FIBC_LUMRU (P83298) Fibrinolytic enzyme, isozyme C (EC 3.4.21.-) (F-II) Length = 242 Score = 42.2 bits (80) Identities = 13/24 (54%), Positives = 15/24 (62%) Query: 410 SNNANSAAHCVNGAIVSKIKVIAG 433 S A SA HCV+G + I VIAG Sbjct: 36 STSALSASHCVDGVLPNNIRVIAG 59 Score = 27.6 bits (51) Identities = 8/13 (61%), Positives = 10/13 (76%) Query: 147 ILGGVEASPGEMP 159 ++GG ASPGE P Sbjct: 1 VIGGTNASPGEFP 13 Score = 20.0 bits (36) Identities = 5/6 (83%), Positives = 5/6 (83%) Query: 1515 FPWNLS 1520 FPW LS Sbjct: 12 FPWQLS 17

159

PHỤ LỤC 4 : KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH TỰ PHÂN ðỂ SẢN XUẤT BỘT ðẠM

TỪ TRÙN QUẾ & NUÔI THỬ NGHIỆM ẤU TRÙNG TÔM SÚ

4.1 Số liệu và kết quả khảo sát các nhân tố ảnh hưởng ñến quá trình tự phân trùn quế

Bảng 4.1: Hàm lượng ñạm amine sinh ra và hiệu suất (N%) của mẫu thủy phân khảo sát pH

N amine N tổng Hiệu suất pH (mg N/g) (mg N/g) (N%)

6 36,31 111,7 32,51 ± 0,40c

7 39,58 111,7 35,43 ± 2,36abc

8 38,85 111,7 34,78 ± 2,79abc

9 40,80 111,7 36,53 ± 2,45ab

10 42,39 111,7 37,95 ± 1,79a

11 41,46 111,7 37,12 ± 2,59ab

12 40,54 111,7 36,29 ± 0,18ab

13 37,73 111,7 33,78 ± 1,42bc

Bảng 4.2: Kết quả phân tích Anova theo hiệu suất (N%) của mẫu thủy phân khảo sát pH

ANOVA Table for Hieu suat by pH

Analysis of Variance

-----------------------------------------------------------------------------

Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value

-----------------------------------------------------------------------------

Between groups 68.1832 7 9.74045 2.48 0.0629

Within groups 62.8732 16 3.92958

-----------------------------------------------------------------------------

Total (Corr.) 131.056 23

Bảng 4.3 : Kết quả so sánh trung bình nghiệm thức theo hiệu suất (N%) của mẫu thủy phân khảo sát pH

Multiple Range Tests for Hieu suat by pH

--------------------------------------------------------------------------------

Method: 95.0 percent LSD

pH Count Mean Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

6 3 32.5067 X

13 3 33.78 XX

8 3 34.7833 XXX

7 3 35.43 XXX

12 3 36.2967 XX

9 3 36.5267 XX

11 3 37.1233 XX

10 3 37.9467 X

--------------------------------------------------------------------------------

160

Bảng 4.4: Hàm lượng ñạm amine sinh ra và hiệu suất (N%) của mẫu thủy phân khảo sát loại dung dịch

N amine N tổng Hiệu suất Loại dung dịch (mg N/g) (mg N/g) (N%)

Nước cất 49,01 111,7 43,87 ± 0,94a

ðệm glycine-NaOH pH 10 46,26 111,7 41,41 ± 1,67a

Bảng 4.5 : Phân tích Anova theo hiệu suất (N%) của mẫu thủy phân khảo sát loại dung dịch

ANOVA Table for Hieu suat by Loai dung dich


-----------------------------------------------------------------------------


-----------------------------------------------------------------------------

Between groups 9.10202 1 9.10202 4.97 0.0897

Within groups 7.32747 4 1.83187

-----------------------------------------------------------------------------

Total (Corr.) 16.4295 5

Bảng 4.6 : Kết quả so sánh trung bình nghiệm thức theo hiệu suất (N%) của mẫu thủy phân khảo sát loại dung dịch

Multiple Range Tests for Hieu suat by Loai dung dich

--------------------------------------------------------------------------------


Loai dung dich Count Mean Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

2 3 41.41 X

1 3 43.8733 X

--------------------------------------------------------------------------------

Bảng 4.7: Hàm lượng ñạm amine sinh ra và hiệu suất (N%) của mẫu thủy phân khảo sát nồng ñộ cơ chất

N amine N tổng Hiệu suất Nồng ñộ cơ chất (%) (mg N/g) (mg N/g) (N%)

3 54,17 111,7 48,50 ± 0,68a

4 53,00 111,7 47,45 ± 1,60a

5 55,28 111,7 49,48 ± 1,04a

6 54,05 111,7 48,39 ± 3,98a

7 53,93 111,7 48,28 ± 1,65a

8 53,33 111,7 47,75 ± 1,19a

9 52,78 111,7 47,26 ± 1,67ab

10 49,21 111,7 44,05 ± 1,79bc 11 48,16 111,7 43,12 ± 1,60c

161

Bảng 4.8: Kết quả phân tích Anova theo hiệu suất (N%) của mẫu thủy phân khảo sát nồng ñộ cơ chất

ANOVA Table for Hieu suat by Nong do co chat


-----------------------------------------------------------------------------


-----------------------------------------------------------------------------

Between groups 109.197 8 13.6496 3.77 0.0093

Within groups 65.2115 18 3.62286

-----------------------------------------------------------------------------

Total (Corr.) 174.408 26

Bảng 4.9: Kết quả so sánh trung bình nghiệm thức theo hiệu suất (N%) của mẫu thủy phân khảo sát nồng ñộ cơ chất

Multiple Range Tests for Hieu suat by Nong do co chat

--------------------------------------------------------------------------------


Nong do co chatCount Mean Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

11 3 43.1167 X

10 3 44.0533 XX

9 3 47.2567 XX

4 3 47.4433 X

8 3 47.7467 X

7 3 48.2833 X

6 3 48.39 X

3 3 48.5 X

5 3 49.4833 X

--------------------------------------------------------------------------------

Bảng 4.10: Hàm lượng ñạm amine sinh ra và hiệu suất (N%) của mẫu thủy phân khảo sát nhiệt ñộ

N amine N tổng Hiệu suất Nhiệt ñộ(°C) (mg N/g) (mg N/g) (N%)

40 40,04 111,7 35,84 ± 1,41d

45 46,52 111,7 41,64 ± 0,99bc

50 48,16 111,7 43,12 ± 1,97ab

55 49,94 111,7 44,71 ± 0,55a

60 45,51 111,7 40,74 ± 1,05c

65 44,42 111,7 39,77 ± 1,30c

70 36,38 111,7 32,57 ± 0,95e

Bảng 4.11: Kết quả phân tích Anova theo hiệu suất (N%) của mẫu thủy phân khảo sát nhiệt ñộ

ANOVA Table for Hieu suat by Nhiet do


-----------------------------------------------------------------------------


-----------------------------------------------------------------------------

Between groups 321.892 6 53.6487 34.65 0.0000

Within groups 21.6783 14 1.54845

-----------------------------------------------------------------------------

Total (Corr.) 343.571 20

162

Bảng 4.12: Kết quả so sánh trung bình NTtheo hiệu suất (N%) mẫu thủy phân khảo sát nhiệt ñộ

Multiple Range Tests for Hieu suat by Nhiet do

--------------------------------------------------------------------------------


Nhiet do Count Mean Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

70 3 32.5733 X

40 3 35.84 X

65 3 39.7667 X

60 3 40.7433 X

45 3 41.6433 XX

50 3 43.1167 XX

55 3 44.71 X

--------------------------------------------------------------------------------

Bảng 4.13: Hàm lượng ñạm amine sinh ra và hiệu suất (N%) của mẫu thủy phân khảo sát thời gian

N amine N tổng Hiệu suất Thời gian (giờ) (mg N/g) (mg N/g) (N%)

1 21,88e 108 20,26 ± 0,23e

4 36,98d 108 34,25 ± 0,65d

8 44,04c 108 40,78 ± 0,00c

12 46,24b 108 42,82 ± 1,37b

24 49,89a 108 46,20 ± 1,52a

36 49,61a 108 45,94 ± 1,09a

Bảng 4.14: Kết quả so sánh trung bình nghiệm thức theo hàm lượng ñạm amine (mg N/g) của mẫu thủy phân khảo sát thời gian

Multiple Range Tests for Ham luong dam amin by Thoi gian

--------------------------------------------------------------------------------


Thoi gian Count Mean Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

1 3 21.88 X

4 3 36.9833 X

8 3 44.04 X

12 3 46.2433 X

36 3 49.61 X

24 3 49.89 X

--------------------------------------------------------------------------------

Bảng 4.15: Kết quả phân tích Anova theo hiệu suất (N%) của mẫu thủy phân khảo sát thời gian

ANOVA Table for Hieu suat by Thoi gian


-----------------------------------------------------------------------------


-----------------------------------------------------------------------------

Between groups 1467.2 5 293.44 301.68 0.0000

Within groups 11.6723 12 0.972689

-----------------------------------------------------------------------------

Total (Corr.) 1478.87 17

163

Bảng 4.16: Kết quả so sánh trung bình NT theo hiệu suất (N%) của mẫu thủy phân khảo sát thời gian

Multiple Range Tests for Hieu suat by Thoi gian

--------------------------------------------------------------------------------



--------------------------------------------------------------------------------

1 3 20.26 X

4 3 34.2467 X

8 3 40.78 X

12 3 42.8167 X

36 3 45.9367 X

24 3 46.1967 X

--------------------------------------------------------------------------------

Bảng 4.17: Hàm lượng ñạm ammoniac (mg/g) của mẫu thủy phân khảo sát thời gian

Thời gian (giờ) 1 4 8 12 24 36 Hàm lượng ñạm ammoniac (mg/g) 0,00f 0,01e 0,05d 0,08c 0,13b 0,16a

Bảng 4.18: Kết quả so sánh trung bình nghiệm thức theo hàm lượng ñạm ammoniac (mg/g) của mẫu thủy phân khảo sát thời gian

Multiple Range Tests for Ham luong dam amon by Thoi gian

--------------------------------------------------------------------------------



--------------------------------------------------------------------------------

1 3 0.0 X

4 3 0.0133333 X

8 3 0.0466667 X

12 3 0.0833333 X

24 3 0.126667 X

36 3 0.163333 X

--------------------------------------------------------------------------------

Bảng 4.19: Tính hàm lượng ñạm amine sinh ra và hiệu suất (N%) của mẫu thủy phân khảo sát tương tác giữa nhiệt ñộ và thời gian

N amine N tổng Hiệu suất Nhiệt ñộ (°C) Thời gian (giờ) (mg N/g) (mg N/g) (N%)

12 42,51 108 39,36 ± 0,46d

24 47,14 108 43,65 ± 0,24c 50

36 48,58 108 43,77 ± 1,11c

12 43,78 108 40,55 ± 0,06d

24 49,76 108 46,08 ± 1,79a 55

36 49,41 108 45,35 ± 0,32ab

12 42,82 108 39,77 ± 0,56d

24 47,97 108 44,42 ± 0,43bc 60

36 48,36 108 43,57 ± 0,25c

164

Bảng 4.20: Kết quả phân tích Anova theo hiệu suất (N%) của mẫu thủy phân khảo sát tương tác giữa nhiệt ñộ và thời gian

Analysis of Variance for HSTP - Type III Sums of Squares

--------------------------------------------------------------------------------


--------------------------------------------------------------------------------

MAIN EFFECTS

A:Nhiet do 15.2422 2 7.62108 12.72 0.0004

B:Thoi gian 126.706 2 63.3528 105.72 0.0000

INTERACTIONS

AB 1.86744 4 0.466859 0.78 0.5532

RESIDUAL 10.7865 18 0.599252

--------------------------------------------------------------------------------

TOTAL (CORRECTED) 154.602 26

--------------------------------------------------------------------------------

Bảng 4.21: Kết quả so sánh trung bình nghiệm thức theo hiệu suất (N%) của mẫu thủy phân khảo sát tương tác giữa nhiệt ñộ và thời gian

Multiple Range Tests for HSTP by Tuong tac

--------------------------------------------------------------------------------


Tuong tac Count LS Mean Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

50-12 3 39.3633 X

60-12 3 39.77 X

55-12 3 40.5533 X

60-36 3 43.57 X

50-24 3 43.65 X

50-36 3 43.77 X

60-24 3 44.4167 XX

55-36 3 45.3467 XX

55-24 3 46.0767 X

--------------------------------------------------------------------------------

4.2 Số liệu và kết quả khảo sát ảnh hưởng của chế ñộ sấy ñến chất lượng bột trùn quế thủy phân

Bảng 4.22: Kết quả phân tích Anova theo hàm lượng ñạm tổng số (%) của mẫu khảo sát chế ñộ sấy

ANOVA Table for Ham luong dam tong so by Che do say


-----------------------------------------------------------------------------


-----------------------------------------------------------------------------

Between groups 49.1132 2 24.5566 23.78 0.0145

Within groups 3.09805 3 1.03268

-----------------------------------------------------------------------------

Total (Corr.) 52.2113 5

165

Bảng 4.23: Kết quả so sánh trung bình NT theo hàm lượng ñạm tổng số (%) mẫu khảo sát chế ñộ sấy

Multiple Range Tests for Ham luong dam tong so by Che do say

--------------------------------------------------------------------------------


Che do say Count Mean Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

3 2 75.44 X

2 2 75.7 X

1 2 81.635 X

--------------------------------------------------------------------------------

Bảng 4.24: Kết quả phân tích Anova theo hàm lượng ñạm amine (%) của mẫu khảo sát chế ñộ sấy

ANOVA Table for Ham luong dam amin by Che do say


-----------------------------------------------------------------------------


-----------------------------------------------------------------------------

Between groups 0.885267 2 0.442633 12.87 0.0068

Within groups 0.206333 6 0.0343889

-----------------------------------------------------------------------------

Total (Corr.) 1.0916 8

Bảng 4.25 Kết quả so sánh trung bình NT theo hàm lượng ñạm amine (%) của mẫu khảo sát chế ñộ sấy

Multiple Range Tests for Ham luong dam amin by Che do say

--------------------------------------------------------------------------------



--------------------------------------------------------------------------------

3 3 7.25333 X

2 3 7.51667 X

1 3 8.01 X

--------------------------------------------------------------------------------

Bảng 4.26: Kết quả so phân tích Anova theo hàm lượng ñạm ammoniac (%) của mẫu khảo sát chế ñộ sấy

ANOVA Table for Ham luong dam amon by Che do say


-----------------------------------------------------------------------------


-----------------------------------------------------------------------------

Between groups 0.00148889 2 0.000744444 3.05 0.1222

Within groups 0.00146667 6 0.000244444

-----------------------------------------------------------------------------

Total (Corr.) 0.00295556 8

166

Bảng 4.27: Kết quả so sánh trung bình NT theo hàm lượng ñạm ammoniac (%) của mẫu khảo sát chế ñộ sấy

Multiple Range Tests for Ham luong dam amon by Che do say

--------------------------------------------------------------------------------



--------------------------------------------------------------------------------

3 3 0.8 X

2 3 0.806667 X

1 3 0.83 X

--------------------------------------------------------------------------------

4.3 Số liệu và kết quả nuôi thử nghiệm ấu trùng và hậu ấu trùng tôm sú ñể ñánh giá khả năng sử dụng sản phẩm bột trùn quế thủy phân

4.3.1 Số liệu và kết quả thí nghiệm ñánh giá khả năng sử dụng TACB từ bột trùn quế thủy phân lên tỷ lệ sống và tăng trưởng của ấu trùng tôm sú

Bảng 4.28: Bảng theo dõi yếu tố nhiệt ñộ (°°°°C) trong quá trình ương ấu trùng tôm sú

NT1 NT2 NT3 Ngày Lặp lại

Sáng Chiều Sáng Chiều Sáng Chiều 1 27,0 28,0 27,5 28,5 27,5 28,5 2 27,5 28,5 27,5 28,0 27,5 29,0 1 3 27,5 28,5 27,5 29,0 27,0 28,0 1 27,5 29,0 28,0 29,0 28,0 29,0 2 28,0 28,5 28,0 29,0 28,0 28,5 2 3 28,0 29,0 28,0 28,5 28,0 29,0 1 29,0 29,0 29,0 29,0 29,0 29,0 2 29,0 29,0 29,0 29,0 29,0 29,0 3 3 29,0 29,0 29,0 29,0 29,0 29,0 1 28,0 28,0 28,0 28,0 28,0 28,0 2 28,0 28,0 28,0 28,0 28,0 28,0 4 3 28,0 28,0 28,0 28,0 28,0 28,0 1 29,0 29,5 29,0 29,5 29,0 29,5 2 29,0 29,5 29,0 29,5 29,0 29,5 5 3 29,0 29,5 29,0 29,5 29,0 29,5 1 29,0 29,5 29,0 29,5 29,0 29,5 2 29,0 29,5 29,0 29,5 29,0 29,5 6 3 29,0 29,5 29,0 29,5 29,0 29,5 1 29,0 30,0 29,0 30,0 29,0 30,0 2 29,0 30,0 29,0 30,0 29,0 30,0 7 3 29,0 30,0 29,0 30,0 29,0 30,0 1 29,0 30,0 29,0 30,0 29,0 30,0 2 29,0 30,0 29,0 30,0 29,0 30,0 8 3 29,0 30,0 29,0 30,0 29,0 30,0 1 27,0 28,0 27,0 28,0 27,0 28,0 9 2 27,0 28,0 27,0 28,0 28,0 28,5

167

3 27,0 28,0 27,0 28,5 27,0 28,5 1 27,5 28,5 27,5 28,5 27,5 28,5 2 27,5 28,5 27,5 28,5 28,0 29,0 10 3 27,5 28,5 27,5 29,0 27,5 29,0 1 27,0 28,5 27,0 28,0 27,0 28,0 2 27,0 28,5 27,0 28,0 27,0 28,5 11 3 27,0 28,5 27,0 28,5 27,0 28,5 1 27,5 28,5 27,5 28,5 27,5 28,5 2 27,5 28,5 27,5 28,5 27,5 29,0 12 3 27,5 28,5 27,5 29,0 27,5 29,0

Bảng 4.29: Bảng theo dõi yếu tố pH trong quá trình ương ấu trùng tôm sú


Sáng Chiều Sáng Chiều Sáng Chiều 1 7,8 7,8 7,8 7,7 7,7 7,8

2 7,7 7,8 7,8 7,8 7,8 7,8 1

3 7,8 7,8 7,8 7,9 7,8 7,8

1 7,8 7,8 7,8 7,7 7,8 7,7

2 7,7 7,8 7,7 7,7 7,7 7,8 2

3 7,8 7,8 7,8 8,0 7,8 7,9

1 7,8 7,8 7,7 7,8 7,7 7,7

2 7,7 7,7 7,8 7,7 7,7 7,8 3

3 7,8 7,9 7,7 7,9 7,8 7,8

1 7,7 7,8 7,7 7,9 7,7 7,8

2 7,7 7,7 7,7 7,7 7,7 7,8 4

3 7,6 7,7 7,6 7,6 7,7 7,8

1 7,7 7,7 7,7 7,7 7,6 7,6

2 7,7 7,7 7,6 7,6 7,7 7,9 5

3 7,6 7,7 7,7 7,7 7,7 7,8

1 7,7 7,7 7,7 7,7 7,6 7,7

2 7,8 7,8 7,6 7,6 7,7 7,8 6

3 7,7 7,7 7,7 7,7 7,7 7,8

1 7,7 7,7 7,7 7,7 7,7 7,8

2 7,8 7,8 7,7 7,6 7,8 7,8 7

3 7,7 7,8 7,7 7,8 7,8 7,8

1 8,0 8,0 8,0 8,0 8,0 7,8

2 8,0 8,0 8,0 7,9 8,0 7,9 8

3 8,0 8,1 8,0 8,1 8,0 8,1

1 7,9 8,0 8,0 7,9 8,0 8,0

2 8,0 8,0 7,9 7,9 7,9 7,9 9

3 8,0 8,0 8,0 8,0 8,0 8,0

168

1 8,0 8,0 8,0 8,0 7,8 8,0

2 8,0 8,0 7,9 8,0 7,8 7,9 10

3 7,9 8,0 8,0 8,0 7,9 8,0

1 7,8 8,0 7,8 8,1 7,8 8,0

2 8,0 8,2 7,9 8,1 7,8 7,9 11

3 7,8 8,0 8,0 8,0 7,9 8,0

1 7,8 8,0 7,8 8,0 7,8 8,0

2 8,0 8,2 7,9 8,1 7,8 7,9 12

3 7,8 8,0 8,0 8,1 7,9 8,1

Bảng 4.30: Tỷ lệ sống (%) của tôm giai ñoạn ấu trùng theo các nghiệm thức

Số lượng ñầu Số lượng cuối Tỷ lệ sống Nghiệm thức Lặp lại

(Nauplius) (Postlarvae-1) (%) 1 15000 2713 18,09 2 15000 5293 35,29 NT1

3 15000 3473 23,15 1 15000 5711 38,07 2 15000 7709 51,39 NT2

3 15000 6180 41,20 1 15000 5134 34,23

2 15000 6221 41,47 NT3

3 15000 4787 31,91

Bảng 4.31: Kết quả phân tích Anova theo tỷ lệ sống (%) của tôm giai ñoạn ấu trùng

ANOVA Table for Ty le song by Nghiem thuc


-----------------------------------------------------------------------------


-----------------------------------------------------------------------------

Between groups 491.925 2 245.963 4.87 0.0554

Within groups 303.024 6 50.504

-----------------------------------------------------------------------------

Total (Corr.) 794.949 8

Bảng 4.32: Kết quả so sánh trung bình nghiệm thức theo tỷ lệ sống (%) của tôm giai ñoạn ấu trùng

Multiple Range Tests for Ty le song by Nghiem thuc

--------------------------------------------------------------------------------


Nghiem thuc Count Mean Homogeneous Groups

--------------------------------------------------------------------------------

1 3 25.51 X

3 3 35.87 XX

2 3 43.5533 X

--------------------------------------------------------------------------------

169

Bảng 4.33: Chiều dài (mm) các giai ñoạn ấu trùng tôm sú

Nghiệm thức Lặp lại Zoea-3 Mysis-2 Postlarvae-1 1 2,93 4,27 5,90 2 2,97 4,08 5,97 NT1

3 3,07 4,13 6,01 1 3,08 4,25 5,80 2 3,13 4,03 5,73 NT2

3 3,22 4,30 5,93 1 3,05 4,82 6,02

2 3,25 4,63 5,98 NT3

3 2,82 4,73 6,03

Bảng 4.34: Kết quả phân tích Anova theo chiều dài (mm) giai ñoạn Zoea-3

ANOVA Table for Chieu dai Zoea 3 by Nghiem thuc


-----------------------------------------------------------------------------


-----------------------------------------------------------------------------

Between groups 0.0366889 2 0.0183444 0.97 0.4304

Within groups 0.113067 6 0.0188444

-----------------------------------------------------------------------------

Total (Corr.) 0.149756 8

Bảng 4.35: Kết quả so sánh trung bình nghiệm thức theo chiều dài (mm) giai ñoạn Zoea-3

Multiple Range Tests for Chieu dai Zoea 3 by Nghiem thuc

--------------------------------------------------------------------------------



--------------------------------------------------------------------------------

1 3 2.99 X

3 3 3.04 X

2 3 3.14333 X

--------------------------------------------------------------------------------

Bảng 4.36: Kết quả phân tích Anova theo chiều dài (mm) giai ñoạn Mysis-2

ANOVA Table for Chieu dai Mysis 2 by Nghiem thuc


-----------------------------------------------------------------------------


-----------------------------------------------------------------------------

Between groups 0.606667 2 0.303333 23.12 0.0015

Within groups 0.0787333 6 0.0131222

-----------------------------------------------------------------------------


170

Bảng 4.37: Kết quả so sánh trung bình nghiệm thức theo chiều dài (mm) giai ñoạn Mysis-2

Multiple Range Tests for Chieu dai Mysis 2 by Nghiem thuc

--------------------------------------------------------------------------------



--------------------------------------------------------------------------------

1 3 4.16 X

2 3 4.19333 X

3 3 4.72667 X

--------------------------------------------------------------------------------

Bảng 4.38: Kết quả phân tích Anova theo chiều dài (mm) giai ñoạn Postlarvae-1

ANOVA Table for Chieu dai Postlarvae 1 by Nghiem thuc


-----------------------------------------------------------------------------


-----------------------------------------------------------------------------

Between groups 0.0582 2 0.0291 6.19 0.0348


-----------------------------------------------------------------------------


Bảng 4.39: Kết quả so sánh trung bình nghiệm thức theo chiều dài (mm) giai ñoạn Postlarvae-1

Multiple Range Tests for Chieu dai Postlarvae 1 by Nghiem thuc

--------------------------------------------------------------------------------



--------------------------------------------------------------------------------

2 3 5.82 X

1 3 5.96 X

3 3 6.01 X

--------------------------------------------------------------------------------

4.3.2 Số liệu và kết quả thí nghiệm ñánh giá khả năng sử dụng TACB từ bột trùn quế thủy phân lên tỷ lệ sống, tăng trưởng và chất lượng của hậu ấu trùng tôm sú

Bảng 4.40: Bảng theo dõi yếu tố nhiệt ñộ (°°°°C) trong quá trình ương hậu ấu trùng tôm sú


Sáng Chiều Sáng Chiều Sáng Chiều 1 28,3 28,8 27,4 27,9 28,0 28,5 2 28,3 28,8 27,2 27,7 28,1 28,6 1 3 28,4 28,9 27,7 28,2 27,6 28,1 1 28,8 29,3 28,5 29,0 28,3 28,8 2 28,0 28,5 28,3 28,8 28,4 28,9 2 3 28,1 28,6 27,9 28,4 27,4 27,9 1 28,4 28,9 28,1 28,6 28,2 28,7 2 28,3 28,8 27,9 28,4 28,3 28,8 3 3 28,4 28,9 28,1 28,6 27,5 28,0 1 28,3 28,8 27,4 27,9 28,2 28,7 2 28,0 28,5 28,5 29,0 27,8 28,3 4 3 27,7 28,2 28,4 28,9 28,3 28,8

171

1 28,2 28,7 28,5 29,0 28,1 28,6 2 28,0 28,5 28,6 29,1 28,3 28,8 5 3 27,6 28,1 28,3 28,8 27,4 27,9 1 27,5 28,0 28,3 28,8 27,0 27,5 2 27,2 27,7 27,6 28,1 27,4 27,9 6 3 27,4 27,9 27,8 28,3 28,1 28,6 1 27,6 28,1 27,6 28,1 27,8 28,3 2 27,5 28,0 28,5 29,0 28,1 28,6 7 3 27,5 28,0 28,3 28,8 28,4 28,9 1 27,8 28,3 28,3 28,8 28,1 28,6 2 27,5 28,0 28,5 29,0 27,6 28,1 8 3 28,3 28,8 27,4 27,9 27,0 27,5 1 27,4 27,9 27,5 28,0 28,3 28,8 2 27,0 27,5 28,0 28,5 28,0 28,5 9 3 27,4 27,9 28,1 28,6 27,8 28,3 1 28,6 29,1 28,0 28,5 28,3 28,8 2 27,5 28,0 27,9 28,4 28,2 28,7 10 3 28,1 28,6 28,3 28,8 28,1 28,6 1 28,3 28,8 28,5 29,0 28,1 28,6 2 28,5 29,0 29,3 29,8 28,1 28,6 11 3 28,4 28,9 28,3 28,8 28,3 28,8 1 28,1 28,6 28,1 28,6 27,6 28,1 2 28,5 29,0 27,9 28,4 28,3 28,8 12 3 28,0 28,5 28,1 28,6 28,3 28,8 1 27,4 27,9 27,4 27,9 28,1 28,6 2 27,0 27,5 27,5 28,0 28,0 28,5 13 3 27,5 28,0 27,6 28,1 28,1 28,6 1 27,1 27,6 27,6 28,1 28,0 28,5 2 27,0 27,5 27,7 28,2 27,9 28,4 14 3 27,5 28,0 28,1 28,6 27,8 28,3 1 29,3 29,8 28,4 28,9 28,4 28,9 2 29,5 30,0 28,3 28,8 28,5 29,0 15 3 28,9 29,4 28,4 28,9 27,9 28,4

Bảng 4.41: Bảng theo dõi yếu tố pH trong quá trình ương hậu ấu trùng tôm sú


Sáng Chiều Sáng Chiều Sáng Chiều 1 7,6 7,3 7,8 7,6 7,5 7,5 2 7,5 7,6 7,4 7,6 7,4 7,5 1 3 7,5 7,3 7,4 7,5 7,7 7,8 1 7,6 7,3 7,6 7,8 7,5 7,5 2 7,5 7,6 7,5 7,8 7,5 7,8 2 3 7,7 7,5 7,5 7,5 7,4 7,6 1 7,8 7,5 7,5 7,4 7,7 7,8 2 7,8 7,8 7,7 7,4 7,7 7,6 3 3 7,4 7,9 7,7 7,8 7,5 7,4 1 7,4 7,9 7,8 7,3 7,8 7,6 4 2 7,6 7,4 7,4 7,3 7,4 7,4

172

3 7,5 7,2 7,4 7,6 7,7 7,5 1 7,3 7,2 7,6 7,8 7,2 7,4 2 7,4 7,3 7,6 7,8 7,5 7,5 5 3 7,7 7,5 7,5 7,4 7,4 7,5 1 7,8 7,5 7,4 7,6 7,5 7,5 2 7,5 7,8 7,7 7,6 7,7 7,5 6 3 7,8 7,5 7,7 7,5 7,8 7,7 1 7,6 7,5 7,5 7,5 7,5 7,8 2 7,7 7,6 7,4 7,4 7,4 7,7 7 3 7,2 7,8 7,4 7,8 7,6 7,8 1 7,4 7,6 7,7 7,8 7,8 7,6 2 7,4 7,4 7,6 7,5 7,8 7,8 8 3 7,3 7,6 7,6 7,6 7,5 7,8 1 7,9 7,7 7,5 7,6 7,4 7,4 2 7,4 7,5 7,8 7,7 7,6 7,2 9 3 7,8 7,4 7,7 7,4 7,4 7,6 1 7,2 7,7 7,5 7,4 7,5 7,5 2 7,5 7,7 7,6 7,4 7,5 7,5 10 3 7,6 7,5 7,4 7,5 7,5 7,4 1 7,5 7,2 7,6 7,5 7,7 7,7 2 7,7 7,4 7,5 7,6 7,8 7,5 11 3 7,4 7,7 7,4 7,7 7,7 7,5 1 7,5 7,3 7,7 7,7 7,4 7,4 2 7,4 7,6 7,8 7,7 7,6 7,5 12 3 7,5 7,4 7,5 7,4 7,4 7,7 1 7,6 7,5 7,7 7,5 7,5 7,5 2 7,6 7,5 7,6 7,4 7,4 7,8 13 3 7,7 7,5 7,7 7,6 7,5 7,4 1 7,7 7,7 7,2 7,6 7,7 7,8 2 7,7 7,4 7,4 7,6 7,5 7,6 14 3 7,4 7,7 7,4 7,7 7,7 7,8 1 7,7 7,8 7,3 7,7 7,4 7,6 2 7,4 7,6 7,5 7,5 7,6 7,7 15 3 7,6 7,8 7,5 7,9 7,4 7,6

Bảng 4.42: Tỷ lệ sống (%) của tôm giai ñoạn hậu ấu trùng theo các nghiệm thức

Số lượng ñầu Số lượng cuối Tỷ lệ sống Nghiệm thức Lặp lại

(Postlarvae-1) (Postlarvae-15) (%) 1 2500 1600 64,00 2 2500 1485 59,40 NT1

3 2500 1775 71,00 1 2500 1780 71,20 2 2500 1525 61,00 NT2

3 2500 1385 55,40 1 2500 1575 63,00 NT3

2 2500 1510 60,40

173

3 2500 1730 69,20

Bảng 4.43: Kết quả phân tích Anova theo tỷ lệ sống (%) của tôm giai ñoạn hậu ấu trùng

ANOVA Table for Ty le song by Nghiem thuc


-----------------------------------------------------------------------------


-----------------------------------------------------------------------------

Between groups 8.27556 2 4.13778 0.10 0.9023

Within groups 237.467 6 39.5778

-----------------------------------------------------------------------------

Total (Corr.) 245.742 8

Bảng 4.44: Kết quả so sánh trung bình nghiệm thức theo tỷ lệ sống (%) của tôm giai ñoạn hậu ấu trùng

Multiple Range Tests for Ty le song by Nghiem thuc

--------------------------------------------------------------------------------



--------------------------------------------------------------------------------

2 3 62.5333 X

3 3 64.2 X

1 3 64.8 X

--------------------------------------------------------------------------------

Bảng 4.45: Chiều dài (mm) các giai ñoạn hậu ấu trùng tôm sú

Nghiệm thức Lặp lại Postlarvae-5 Postlarvae-10 Postlarvae-15 1 8,53 10,94 12,28 2 8,37 11,12 12,95 NT1

3 8,40 11,35 12,67 1 8,18 10,82 12,10 2 8,17 10,67 11,88 NT2

3 8,15 10,62 11,96 1 8,40 10,56 11,70

2 8,43 10,64 11,43 NT3

3 8,20 10,45 11,62




-----------------------------------------------------------------------------


-----------------------------------------------------------------------------

Between groups 0.110422 2 0.0552111 7.17 0.0257


-----------------------------------------------------------------------------

Total (Corr.) 0.156622 8

174



--------------------------------------------------------------------------------



--------------------------------------------------------------------------------

2 3 8.16667 X

3 3 8.34333 X

1 3 8.43333 X

--------------------------------------------------------------------------------




-----------------------------------------------------------------------------


-----------------------------------------------------------------------------

Between groups 0.555467 2 0.277733 13.40 0.0061

Within groups 0.124333 6 0.0207222

-----------------------------------------------------------------------------




--------------------------------------------------------------------------------



--------------------------------------------------------------------------------

3 3 10.55 X

2 3 10.7033 X

1 3 11.1367 X

--------------------------------------------------------------------------------




-----------------------------------------------------------------------------


-----------------------------------------------------------------------------

Between groups 1.68669 2 0.843344 17.46 0.0032

Within groups 0.289733 6 0.0482889

-----------------------------------------------------------------------------

Total (Corr.) 1.97642 8



--------------------------------------------------------------------------------



--------------------------------------------------------------------------------

3 3 11.5833 X

2 3 11.98 X

1 3 12.6333 X

--------------------------------------------------------------------------------

175

Bảng 4.52: Tỷ lệ sống (%) của hậu ấu trùng khi sốc formol

Nghiệm thức Lặp lại Số con/l Số tôm chết Tỉ lệ tôm chết (%) Tỉ lệ tôm sống (%) 1 50 1 2 98 2 50 1 2 98 1

3 50 0 0 100 1 50 3 6 94 2 50 3 6 94 2

3 50 3 6 94 1 50 3 6 94

2 50 2 4 96 3

3 50 2 4 96

Bảng 4.53: Kết quả phân tích Anova theo tỷ lệ sống (%) của hậu ấu trùng khi sốc formol

ANOVA Table for Ty le song khi soc formol by Nghiem thuc


-----------------------------------------------------------------------------


-----------------------------------------------------------------------------

Between groups 34.6667 2 17.3333 19.50 0.0024

Within groups 5.33333 6 0.888889

-----------------------------------------------------------------------------


Bảng 4.54: Kết quả so sánh trung bình nghiệm thức theo tỷ lệ sống (%) của hậu ấu trùng khi sốc formol

Multiple Range Tests for Ty le song khi soc formol by Nghiem thuc

--------------------------------------------------------------------------------



--------------------------------------------------------------------------------

2 3 94.0 X

3 3 95.3333 X

1 3 98.6667 X

--------------------------------------------------------------------------------

phỤ lỤc 1: cÁc phƯƠng phÁp phÂn tÍch · 123 phỤ lỤc 1: cÁc phƯƠng phÁp phÂn...

Documents