physiologische methoden in der neurowissenschaft ... · 1 physiologische methoden in der...
TRANSCRIPT
1
Physiologische Methoden in der Neurowissenschaft Praktikumsskript, 11.-15. März 2019, sowie 25.-29. März 2019, Institut für Pathophysiologie, Karlsburg Die Reihenfolge der Versuche im Skript entspricht nicht der chronologischen Reihenfolge. Der Zeitplan wird spätestens am 1. Praktikumstag ausgegeben.
1. Ableitung spannungsgesteuerter Na+-Ströme mittels „whole cell recording“
1.1 Spannungsgesteuerte Na+-Kanäle
Im menschlichen Genom gibt es 9 Gene, die für spannungsgesteuerte Na+-Kanalproteine,
Nav1.1 bis Nav1.9. (Abb. 1) kodieren. Davon werden 7 im Nervensystem exprimiert, unter
Anderem der Nav1.2. Na-Kanäle sind für den schnellen Na+-Einstrom und den Aufstrich der
Aktionspotenziale aller erregbaren Zellen notwendig. Spannungsgesteuerte Ionenkanäle
lassen sind im homologen Gewebe (Nervenzellen) oder in Testzellen untersuchen. Letztere
müssen vorher mit entsprechender Fremd-DNA „transfiziert“ werden. Testzellen vom Typ
HEK-239 wurden mit der cDNA kodierend für den neuronalen Na+-Kanal der Ratte (Nav1.2)
transfiziert und über längere Zeit kultiviert. Der Kanal wird stabil exprimiert.
Abb. 1: Membrandomänendiagramm des Nav1.2 mit 4 Domänen der -Untereinheit sowie
der 1-Untereinheit. Die -Untereinheit besteht bei Mensch und Ratte aus 2005 Aminosäuren (228 kDa). Die S4-Segmente tragen positive Ladungen (Arginine), welche den Spannungssensor des Kanals ausmachen. Mutationen, die zu Aminosäure-Austauschen führen (rote Kreise) verursachen eine frühkindliche Form der Epilepsie mit
2
Elektrode vorsichtig nähern
leichtes Ansaugen
cell-attached Modus
CsC
NaCl
kräftiges Ansaugen: whole-cell Modus möglich
Vorgabe der Spannung und Ableitung der Ströme
Fieber. Nach Berkovic et al., Ann Neurol, 55:550-557, 2004. R-Arginin, Q-Glutamin, L,- Leucin, V-Valin, I-Isoleucin, F-Phenylalanin.
Alternativ zu den transfizierten HEK-293 Zellen können Nervenzellen verwendet werden. Ihre
Isolierung und Kultivierung ist jedoch nicht einfach und auch die Ableitung von Ionenströmen
ist aufgrund der Zellmorphologie problematisch. Daher sucht man für verschiedene
Fragestellungen nach Modellsystemen. Ein geeignetes Modellsystem, um grundsätzliche
Eigenschaften von Neuronen zu analysieren, sind Neuroblastomzellen. Neuroblastomzellen
leiten sich von Tumorzellen ab und sind in Form von Zelllinien unbegrenzt in Kultur
vermehrbar. Einige Neuroblastomzellen lassen sich mittels Veränderungen des
Kulturmediums oder dem Zusatz von Chemikalien zur Differenzierung bringen. Sie entwickeln
sich dann innerhalb einiger Tage zu einem Neuronen-ähnlichen Phänotyp. Die in der Literatur
gut beschriebene Zelllinie „neuro-2a“ (LePage et al., Crit Rev Neurobiol. 17:27-50, 2005)
erfüllt die genannten Bedingungen und dient uns als alternatives Modell zu den HEK-Zellen.
1.2 Ableitung in der whole-cell Konfiguration
Na+-Ströme können mittels „whole cell recording“ von HEK-293 Zellen (und alternativ dazu
von Neuroblastomzellen (neuro-2a) abgeleitet werden. Dazu wird eine mit Elektrolytlösung
(interne Lösung) gefüllte Glaskapillare (Elektrode, Spitzendurchmesser, ca. 1 µm) in Kontakt
mit einer einzelnen HEK-Zelle gebracht und der Ganzzellmodus (whole cell) hergestellt.
3
Abb. 2: Vorgehensweise zur Ableitung von Na+-Strömen. Die Glaskapillare (Elektrode) wird mit gepufferter CsCl-Lösung gefüllt (s.u. interne Lösung). Die Elektrode wird der Zelle genähert und der cell-attached Modus hergestellt. Durch einen kurzen, kräftigen Unterdruck gelingt es hin und wieder, die unter der Kapillare befindliche Membran zu durchbrechen, ohne die Verbindung von Zelle zu Kapillare zu beschädigen. In dieser Situation sollte ein Haltepotenzial von ca. - 80 mV eingestellt werden. Das Zellinnere füllt sich rasch mit CsCl. Durch Applikation von Spannungspulsen können nun Einströme durch Na+-Kanäle der Zellmembran gemessen werden. Sie betragen erfahrungsgemäß 2 bis maximal 10 nA. Gewisse Leckströme (roter Doppelpfeil) lassen sich bei den Messungen nicht vermeiden.
Mittels Testpulsen, in der Regel 10 ms-lange Rechteckpulse von 10 mV lassen sich die
verschiedenen in Abb. 2 dargestellten Konfigurationen kontrollieren.
Durch repetitive Spannungspulse (Rechteckpuls, 10 mV) kann man den Elektrodenwiderstand
der Patchpipette bestimmen. Er sollte im Bereich von 2-3 M (Megaohm) liegen.
Versuchen Sie, die Glaselektrode mittels Mikromanipulator an eine Zelle heranzuführen und
durch leichtes Ansaugen einen „Gigaseal“ herzustellen. In dieser Situation lassen sich die
Zellen meistens vom Schalenboden ablösen.
Stellen Sie durch einen kurzen abrupten Unterdruck die „whole cell“ Konfiguration her. In
dieser Situation lassen sich die Zellen ebenfalls meistens vom Schalenboden ablösen, ohne
die Konfiguration zu zerstören.
Wenden Sie die voreingestellten Spannungspulsprogramme an:
1. Variation des Testpotenzials (I/V – Kurve)
2. Variation des Präpotenzials (Inaktivierungskurve)
4
1.3 Fragen
Wieso kommt es bei Erhöhung der Spannungspulse (Testpotenziale) im Bereich von -50 mV
bis -10 mV zunächst zur Vergrößerung der Stromamplitude und bei weiterer Erhöhung im
Bereich von -10 bis +50 mV zur Verminderung/Auslöschung der Ströme?
Wie lässt es sich erklären, dass mit steigendem Präpotenzial bei konstanten Testpulsen die
Stromamplitude immer weiter abnimmt? Worin liegt die biologische Bedeutung des Effekts?
1.4. Zusammensetzungen der verwendeten Lösungen
externe Lösung (in mM):
140 NaCl, 3,5 KCl, 1,0 CaCl2, 1,0 MgCl2, 5 HEPES-NaOH, pH 7.4.
interne Lösung (für Glaselektrode, in mM):
140 CsCl, 1,4 MgCl2, 10 EGTA, 10 HEPES-CsOH, pH 7.4.
5
2. Kalziumtransienten in Neuroblastomzellen und/oder HEK 293 Zellen
2.1 Bradykinin-induzierte Kalziumtransienten in Neuroblastomzellen
Fura-2 ist ein Ca2+-sensitiver Fluoreszenzfarbstoff, der mit Ca2+-Ionen Chelatkomplexe bildet
und als Indikator für die intrazelluläre Kalziumkonzentration dient. Wenn Ca2+ an Fura-2
gebunden ist, lässt sich das Molekül mit einer Wellenlänge von 340 nm anregen.
Kalziumfreies Fura-2 hat hingegen eine optimale Anregungswellenlänge von 380 nm. Mit Hilfe
des Verhältnisses (Quotient, ratio) der Fluoreszenzsignale nach Anregung mit 340 bzw. 380
nm lassen sich Änderungen des intrazellulären Kalziumspiegels in einzelnen Zellen
detektieren (ratiometrische Messung).
Ein geeignetes Modellsystem, um grundlegende Eigenschaften von Neuronen zu analysieren,
sind Neuroblastomzellen. Neuroblastomzellen leiten sich von Tumorzellen ab und sind in Form
von Zelllinien unbegrenzt in Kultur vermehrbar. Einige Neuroblastomzellen lassen sich durch
Veränderungen des Kulturmediums oder dem Zusatz von Chemikalien zur Differenzierung
bringen. Sie entwickeln sich dann innerhalb einiger Tage zu einem Neuronen-ähnlichen
Phänotyp. Die in der Literatur gut beschriebene Maus-Neuroblastom-Zelllinie „neuro-2a“
(LePage et al., Crit Rev Neurobiol. 17:27-50, 2005) erfüllt die genannten Bedingungen und
dient uns als Modell, um einen rezeptorvermittelten Anstieg des intrazellulären Kalziums zu
detektieren. Neuro-2a Zellen exprimieren Bradykininrezeptoren. Das Neuropeptid Bradykinin
wird bei Entzündungsreaktionen freigesetzt, sensibilisiert nozizeptive Neurone und führt zur
Vasodilatation (Endothel-vermittelt). Bradykininrezeptoren sind auch im ZNS exprimiert.
Die schnelle Applikation von Bradykinin (BK) und die Bindung an BK-Rezeptoren hat einen
Anstieg der zytosolischen Kalziumkonzentration zur Folge. Die BK-Rezeptoren B1 und B2 (für
den genauen Signalweg siehe Lehrbücher der Physiologie und Neurowissenschaften, Bear, S.
452ff) sind G-Protein gekoppelte Rezeptoren.
6
Abb. 3: Bradykinin-induzierter Kalziumtransient einer Neuroblastomzelle. Aufgetragen
ist der Quotient der Fluoreszenzintensität nach Anregung mit UV-Licht der Wellenlängen
340 und 380 nm. Zugabe von 1µM Bradykinin nach etwa 5 s.
Versuchsdurchführung:
- Die Zellen werden in Standard-Extrazellulärlösung (Zusammensetzung siehe unten)
mit 2 μM Fura-2/AM inkubiert (wichtig: Zellen müssen dunkel lagern)
- Nach 45 Minuten wird die Fura-2-haltige Extrazellulärlösung durch Extrazellulärlösung
ohne Fura-2 ersetzt.
- Die Zellen werden in der dafür vorgesehenen Badkammer auf das
Fluoreszenzmikroskop verbracht.
- Durch den Strahlengang des Mikroskops wird monochromatisches Licht (380 nm) auf
die Zelle eingestrahlt und das bei 505-530 nm emittierte Signal zuerst durch das Oku-
lar und danach auf dem Computerbildschirm bei 400-facher Vergrößerung betrachtet.
- 340 nm und 380 nm-Signale werden alternierend mit einer Frequenz von 4 Hz auf die
ausgesuchte Zelle, die sich unbedingt im Fokus befinden muss, appliziert und die
emittierten Signale werden mit Hilfe der zugehörigen Software aufgezeichnet.
- Über eine Glaskapillare, die an ein Luftdrucksystem angeschlossen ist, wird ca. 20
Sekunden nach Beginn der Messung die vorgesehene Testlösung an die Zelle
appliziert. Die Kapillaren werden von den Studenten selbst mit Hilfe eines
Kapillarenziehgerätes hergestellt.
- Zur Auswertung der Transienten, die ungefähr wie in Abb. 3 aussehen sollten, ist die
Zeit von Beginn bis zum Maximum der Antwort und die Abklingzeit wichtig; dafür
stehen Auswerteprogramme zur Verfügung.
7
2.2 Kalziumanstieg durch Aktivierung des Transient Receptor Potential Kanals
TRPC6 in HEK-293 Zellen (alternativer Versuch zu 2.1. oder 2.2)
HEK-293 ist eine seit mehr als 30 Jahren kultivierte Zelllinie, die sich durch ihre leichte
Kultivier- und Transfizierbarkeit als nützliches Modell in der Forschung etabliert hat. Es stehen
herkömmliche HEK-Zellen und HEK-Zellen, die den canonischen Transient Receptor Potential
Kanal TRPC6, einen nicht-selektiven Kationenkanal mit einer hohen Leitfähigkeit für Kalzium,
stabil exprimieren, zur Verfügung. Der TRPC6-Kanal wird direkt durch Diacylglycerol (DAG)
aktiviert. Im Praktikumsversuch wird 1-Oleoyl-2-acetyl-sn-glycerol (OAG), ein DAG-Derivat
appliziert und die Antworten von TRPC6-transfizierten und nicht-transfizierten Zellen auf OAG-
Applikation sollen miteinander verglichen werden. Die Versuchsdurchführung geschieht wie in
2.1 beschrieben.
2.3. Zusammensetzungen der verwendeten Lösungen
(alle Konzentrationen in mMol/l)
Extrazellulärlösung:
Angaben in mM: 140 NaCl, 2,7 KCl, 1,5 CaCl2, 1 MgCl2, 6 Glukose: 6, 12 HEPES
Der pH-Wert wird mit NaOH auf 7,3 eingestellt
Endkonzentration Bradykinin: 1 μM
Endkonzentration OAG: 150 μM
Bradykinin und OAG werden in normaler Extrazellulärlösung gelöst und sind in Form von
höher konzentrierten Stammlösungen vorhanden.
8
3. Methoden in der Zellkultur und Transfektion
Neben der Untersuchung frischer Organ- und Gewebeproben steht der modernen Molekular-
und Zellbiologie die Kultivierung von Säugetierzellen außerhalb eines Organismus zu
Verfügung, was eine deutliche Vereinfachung bei der Bearbeitung verschiedenster
Fragestellungen ermöglicht.
In der Zellkultivierung unterscheidet man hierbei zwischen primären und so genannten
permanenten Zelllinien. Während primäre Linien aus frischen Geweben gewonnen werden
und nur über eine begrenzte Passagierbarkeit (Lebensdauer) verfügen, sind permanente
Zelllinien immortalisiert (viral, chemisch oder physikalisch) und können nahezu unbegrenzt
vermehrt werden, ohne dass sie ihre grundlegenden Eigenschaften verlieren.
Im Rahmen der folgenden Versuche sollen grundlegende Methoden in der Zellkultur anhand
der permanenten Zelllinie HEK293 vermittelt werden.
Bei den seit den frühen 70iger Jahren existierenden HEK293 Zellen handelt es sich um eine
viral transformierte Zelllinie menschlicher embryonaler Nierenzellen (human embryonic
kidney), in die DNA-Sequenzen des humanen Adenovirus 5 übertragen wurden.
HEK293 Zellen zeigen eine Fibroblasten-ähnliche Morphologie und wachsen in Kulturgefäßen
zu einem einschichtigen Zellrasen (Monolayer) aus (Abb. 4). Aufgrund der Einfachheit, mit der
diese Zellen kultiviert und transfiziert werden können, sind HEK293 Zellen heute in der
Forschung und Entwicklung weit verbreitet.
Abb. 4: HEK-Zellkultur im
Phasenkontrast
HEK-293
9
3.1: Versuch 1: Mikroskopische Untersuchung und Anzucht von HEK293 Zellen
Im ersten Versuch soll eine Kultur von HEK-293 Zellen unter dem Lichtmikroskop begutachtet
werden. Die Zellen sollen anschließend mittels Trypsinverdau vom Kulturgefäß gelöst und in
eine neue 6-well Kulturschale eingesät werden.
Achtung: Steriles Arbeiten unter einer Laminarbox – Desinfektionsmittel und Handschuhe
benutzen!
3.1.1. Umsetzen von Zellen mittels Trypsinverdau:
Mit einer serologischen 10 ml Pipette wird das Kulturmedium vollständig aus der
Flasche abgesaugt und verworfen.
Die Zellen vorsichtig mit ca. 2 ml PBS (phosphat buffered saline,pH 7.4) überschichten
und durch sanftes Schwenken der Kulturflasche waschen.
Die Waschlösung nun ebenfalls vollständig absaugen und die Zellen mit 4 ml Trypsin-
Lösung überschichten. Anschließend wird die Flasche bis zum vollständigen Ablösen
des Zellrasens bei RT inkubiert (ca. 5 min).
Die Zellsuspension wird hiernach mit 4 ml frischem Kulturmedium versetzt und durch
sanftes Auf- und Abpipettieren vorsichtig homogenisiert.
Anschließend werden 7 ml der Zellsuspension aus der Flasche entnommen und für
eine neue Aussaat in ein 15 ml Falcon-Röhrchen überführt. Die ausgedünnte Kultur in
der Flasche wird mit ca. 25 ml frischem Kulturmedium versetzt und nach sanftem
Mischen im Zellkulturbrutschrank weiter inkubiert.
3.1.2. Anlegen einer frischen 6-well Kulturschale:
Für die frische Aussaat einer 6-well Kulturschale werden ca. 1 ml der aus der
Kulturflasche entnommenen Zellsuspension (1.1) in einem neuen Falcon mit 15 ml
frischem Kulturmedium gemischt.
Anschließend werden die Zellen zu jeweils 2,5 ml / well in eine 6-well Schale gegeben
und die Platte durch sanftes Kreisen vorsichtig gemischt.
Die Kulturschale wird über Nacht im Zellkulturschrank inkubiert und die Zellen am
folgenden Tag mikroskopisch begutachtet.
10
3.1.3. Benötigte Medien und Lösungen – Versuch 1:
PBS (phosphat buffered saline, pH 7.4):
140 mM NaCl
6,5 mM Na2HPO4
1,5 mM KH2PO4
2,7 mM KCl
Kulturmedium für Zellen:
225 ml DMEM (Dulbecco’s modified eagle medium)
25 ml fetales Kälberserum
Trypsinlösung
1 ml 10x Trypsin-EDTA Lösung (0,5%)
9 ml PBS (pH 7.4)
3.2. Ver
Unter T
eukaryo
bedient
Express
vermitte
werden
Episom
Vektors
Transfe
Im zwe
subkonf
TRPV4-
Das Pla
dessen
Der Ve
TRPV4
und füh
Über d
Transfe
rsuch 2: Tr
Transfektion
otische Zie
man sich
sion eines Z
eln. Zelllinie
. Während
im Zellker
s ins zellulä
ektion kann
eiten Versu
fluenter Ze
-YFP transf
asmid pEGF
Expression
ektor pcDNA
der Maus (
rt in transfiz
ie Eigenflu
ektion am Fl
ransfektion
n versteht
lzellen (ver
einer Reih
Zielgens un
en können
in transien
rn verbleibt
re Genom.
man dies te
ch sollen d
lldichte (en
fiziert werde
FP-N1 kodi
n durch eine
A-TRPV4-Y
(transient re
zierten Zielz
oreszenz d
uoreszenzm
n von HEK2
man das
rgleichbar
he kommer
nter Kontroll
transient (z
nt transfizie
t, resultiere
Durch den
eilweise bee
die zuvor f
tspricht ca.
en (Abb. 6)
iert für das
e deutliche
YFP hingeg
eceptor pote
zellen zu ein
der Zielprot
mikroskop ü
293 Zellen
Einbringen
mit Transf
rzieller erhä
le eines zum
zeitlich beg
erten Zellen
en stabil tra
Wachstum
einflussen.
frisch ausg
. 60-80%) m
EGFP-Pro
grüne Fluo
gen kodiert
ential vanill
ner gelben
teine kann
überprüft we
n von Frem
ormation b
ältlicher Ve
meist starke
grenzt) ode
n die Plasm
ansfizierte
mszustand d
gesäten HE
mit den Ve
tein (enhan
oreszenz in
t für ein F
loid 4) und Y
Fluoreszen
die Trans
erden.
md-DNA (o
bei Bakterie
ktoren, we
en Promoto
r stabil (pe
mid-DNA z
Linien aus
der Zielzelle
EK-293 Zel
ktoren pEG
nced green
den Zielze
usionsprote
YFP (yellow
z.
fektionseffiz
oder auch
en, Abb. 5
elche die ko
ors viralen U
ermanent) t
zumeist aut
der Integr
en zum Zeit
Abb. 5. von Fremeine Säuge
len (Versu
GFP-N1 und
fluorescen
ellen signali
ein des Ion
w fluorescen
zienz 16-24
11
RNA) in
5). Hierfür
onstitutive
Ursprungs
transfiziert
tonom als
ration des
tpunkt der
Einbringen d-DNA in
etierzelle.
ch 1) bei
d pcDNA-
nt protein),
siert wird.
nenkanals
nt protein)
4 h nach
12
Achtung: Steriles Arbeiten unter einer Laminarbox – Desinfektionsmittel und Handschuhe
benutzen!
3.2.1 Vorbereitung der Zellen Kontrolle der HEK293 Zellen am Lichtmikroskop. Die Zellen sollten zu einem 60-80%
geschlossenen Zellrasen (subkonfluent) ausgewachsen sein.
Mit Hilfe einer serologischen Pipette wird das Kulturmedium vorsichtig abgesaugt und
verworfen.
Die Zellen nun zügig (um ein Austrocknen zu vermeiden) mit 1 ml frischem
Erhaltungsmedium überschichten und durch sanftes Schwenken der Kulturplatte
waschen.
Die Waschlösung anschließend wieder entfernen und die Zellen mit jeweils 2 ml / well
frischem Erhaltungsmedium überschichten.
Bis zum Aufbringen des Transfektionsgemisch werden die Zellen weiter im
Zellkulturbrutschrank inkubiert.
3.2.2 Herstellung des Transfektionsgemisches Als Transfektionsmittel wird Polyethylenimin (PEI) eingesetzt, welches in wässriger Lösung als
Polykation vorliegt und in der Lage ist, DNA zu komplexieren. Die zu transfizierende Plasmid-
DNA und PEI sollen hierbei im Verhältnis 1:2 verwendet werden.
Für die beiden Plasmid-Lösungen werden 2 µg pEGFP-N1 bzw. pcDNA-TRPV4-YFP in
100 µl serumfreiem Medium in 1,5 ml Eppendorfgefäßen gemischt und 5 min bei
Raumtemperatur inkubiert.
Parallel werden vom Transfektionsmittel PEI jeweils 4 µg (Verhältnis DNA:PEI = 1:2) in
100 µl serumfreiem Medium in 1,5 ml Eppendorfgefäßen gemischt und gleichfalls 5
min bei Raumtemperatur inkubiert.
Für die Komplexbildung werden nun die beiden DNA-Lösungen mit jeweils 100 µl PEI-
Lösung versetzt. Die Reaktionen werden vorsichtig gemischt und für weitere 20 min bei
Raumtemperatur inkubiert.
Anschließend werden die Transfektionsgemische vorsichtig über je ein gesamtes well
verteilt aufgetropft und die Kulturplatte durch sanftes Kreisen gemischt.
Die Zellen werden über Nacht im Brutschrank inkubiert. Die Transfektionseffizienz soll
am folgenden Tag am Fluoreszenzmikroskop überprüft und die Expression der beiden
Zielproteine diskutiert werden.
3.2.3. B
s
Benötigte M
serumfreies
Erhaltungsm
237
12
Polyethylen
pEGFP-N1
pcDNA‐TRPV
Medien und
s Medium: e
medium für
,5 ml DM
,5 ml feta
nimin Stock
Plasmid-Lö
V4‐YFP Plasm
d Lösungen
entspricht D
Zellen
EM (Dulbec
ales Kälbers
lösung: 1 µg
ösung: 1 µg
mid‐Lösung: 1
n – Versuch
DMEM (Dulb
cco’s modif
serum
g / µl
g / µl
1 µg / µl
h 2:
becco’s mo
fied eagle m
dified eagle
medium)
Ab
ver
mit
Res
cod
Pro
Ele
e medium)
b. 6. Aufbau
rwendeten V
t Schnittstelle
striktionsenz
dierenden Se
omotoren und
ementen.
13
u der
ektoren
en für
zyme,
equenzen,
d anderen
4. Geno
In der
gentech
gendefi
verwen
Genvari
werden
bezeich
In dies
Nuklein
vermitte
Versuch
In der b
Ausstatt
regelmä
jedoch i
Genabs
knock o
der gen
Restrikt
Abschni
charakt
Schritte
Die doppdenaturieine thebeginne
otypisierun
biomedizin
hnisch verä
ziente (kn
det. Die T
ianten sein
molekular
net.
sem Teil d
säuren an
elt werden.
h 4: Genoty
biomedizinis
tung verw
äßig zu übe
in der Rege
chnitte, in
out Mutante
nomischen
tionsanalyse
itte eines G
erisiert wer
einer PCR (s
pelsträngigeiert, an die üermostabile nd anschließ
ng
nischen Gr
nderte Zell
ock out)
Tiere könn
n. Zur Kont
rgenetische
des Praktik
nhand eine
.
ypisierung v
schen Forsc
wendeter
erprüfen, u
el nicht das
die spezifi
en). Währe
DNA nach
e von F
Gens mittels
rden.
schematisch
Ausgangs‐Düber homoloDNA‐abhängßend zwei ne
rundlagenfo
en und Ze
Mäuse ein
nen homo
trolle von
e Untersuch
kums sollen
er Genoty
verschieden
chung ist es
Labororgan
m eventue
gesamte Ge
sche Verän
end einige M
weisen, z.B
ragmentlän
s PCR (poly
):
DNA (Templaoge Basenpagige DNA‐Poeue Doppelst
orschung i
lllinien sow
ngesetzt. A
zygot ode
Genvariant
hungen du
n einige S
ypisierung
ner Labor‐M
s heutzutag
nismen (M
elle Verände
enom analy
nderungen
Methoden
B. Sequenz
ngen‐Polym
ymerase cha
ate) wird duaarung kurzeolymerase (ztränge (Kopie
nklusive de
wie Mausmu
Auch ander
r heterozy
ten in Zell
rchgeführt,
Standardme
vier versc
Mausstämm
ge unerlässl
Mikroorganis
erungen so
ysiert, sond
eingebrach
genetische
zierung, Nu
morphismen
ain reaction
rch kurzes Ee Oligonukleoz.B. Taq‐Polyen) amplifizi
er Neurow
utanten, tra
re Modello
ygot für e
kulturen un
die man
ethoden zu
chiedener
me
ich, die gew
smen, Säu
ofort festzus
ern nur aus
t wurden (
Unterschie
ukleinsäure‐
, können
n) amplifizie
Erhitzen auf otid‐Primer ymerase) weert.
wissenschaft
ansgene M
organismen
eine oder
nd in der
als Genoty
ur Bearbeit
Labor‐Mau
wünschte g
ugetierzelle
stellen. Hie
sgewählte G
(z.B. transg
ede direkt a
‐Hybridisier
auch b
ert und ans
95 °C in Einbinden könnerden an de
14
t werden
Mäuse und
n werden
mehrere
Tierzucht
ypisierung
tung von
usstämme
genetische
n, Tiere)
erbei wird
Gene bzw.
gene oder
auf Ebene
rung oder
bestimmte
chließend
nzelstränge nen. Durch en Primern
15
In diesem Versuch sollen in vier verschiedenen Mausstämmen die Gene für Dystrophin und
den Kationenkanal TRPV4 (transient receptor potential) analysiert werden.
Mausstämme: C57BL/6J Wildtyp
C57BL/6J‐TRPV4‐/‐ TRPV4 knock out Mutante
C57BL/6J‐MDX5Cv Dystrophin knock out Mutante
C57BL/6J‐MDX5Cv‐TRPV4‐/‐ Dystrophin/TRPV4 knock out Mutante
Gen‐spezifische Nachweismethoden:
Entsprechend der Art der Veränderung in den beiden zu analysierenden Genen, kommen hier
zwei unterschiedliche Methoden der Genotypisierung zur Anwendung:
TRPV4‐Lokus: (amplified fragment length polymorphism)
Der TRPV4 knock out wurde durch die Deletion des Exon 12 im TRPV4‐Gen generiert. Zur
Amplifikation von PCR‐Fragmenten, die den Mutationsort einschließen, werden ein upstream
der Mutation bindender Forward‐Primer zusammen mit einem in der Deletion bindenden
Revers‐Primer (spezifisch für den Wildtyp) eingesetzt. Darüber hinaus wird ein zweiter,
downstream der Deletion bindender Revers‐Primer (spezifisch für den knock out) verwendet.
Das Resultat sind Genotyp‐spezifische Fragmentlängen der PCR‐Produkte.
Dystrophin‐Lokus: (amplified restrictions fragment length polymorphism)
Der Dystrophin knock out in MDX5Cv (MDX – muscular dystrophy X) Maus‐Mutante wird durch
eine Punktmutation (A/T) im Exon 10 des Dystrophin‐Gens verursacht, die auf mRNA‐Ebene
zur Generation eines Stopcodons führt. Außerdem entsteht durch diese Basensubstitution
eine neue Erkennungssequenz für die Restriktionsendonuklease HphI. Den Mutationsort
umfassende PCR‐Produkte von knock out Tieren werden somit durch das Enzym HphI
gespalten, während Wildtyp‐Sequenzen intakt bleiben.
Für den folgenden Versuch erhält jede Gruppe vier Biopsien (verblindet) und soll mittels
standardisierter Protokolle die Genotypen der einzelnen Proben bestimmen. Hierzu soll aus
den Biopsien die genomische DNA (gDNA) gewonnen und aus allen Proben mittels Taq‐
Polymerase PCR mit für die beiden beschrieben Mutationen spezifischen Primern PCR‐
Produkte generiert werden.
Die Größen der TRPV4‐PCR‐Produkte sollen anschließend mittels horizontaler
Agarosegelelektrophorese analysiert werden.
Die PCR‐Produkte des Dystrophin‐Gens sollen zunächst mit dem Enzym HphI verdaut und die
Restriktionsmuster anschließend in einem Agarosegel bewertet werden.
Als Referenz werden genomische DNA‐Präparationen von Wildtyp (BL/6J) und knock out
Mutanten (MDX5CV und TRPV4‐KO) zur Verfügung gestellt.
16
Tag 1:
4.1. Aufarbeitung der Biopsien zur Gewinnung der genomischen DNA
Jeder Gruppe werden vier Biopsien (Schwanzspitzen) von Mäusen zur Verfügung gestellt. Die
Aufarbeitung der Proben erfolgt mittels eines kommerziellen Kits der Firma AnalytikJena nach
Vorgabe des Herstellers.
Um eine Kontamination der Proben zu vermeiden müssen Handschuhe getragen und
Einmalplastik‐Materialien verwendet werden!
Die Eppendorfgefäße mit je einer Biopsie mit wasserfestem Stift beschriften und mit
Tesafilm umkleben.
Zu jeder Probe werden nun 400 µl Lysispuffer und 40 µl des Enzyms Proteinase K
gegeben. Die Reaktionsgefäße fest verschließen und auf einem Tischvortex kurz
mischen.
Anschließend werden die Gefäße aller Gruppen in einen Wasserbadschwimmer
(Schaumstoff) eingesteckt und die Proben über Nacht im Wasserbad bei 56 °C unter
Schütteln aufgeschlossen.
17
Tag 2:
4.2. Gewinnung der genomischen DNA
Das zelluläre Gewebe (jedoch nicht die Haare) der am Vortag eingelegten Biopsien
sollte sich über Nacht vollständig aufgelöst haben.
Die Reaktionsgefäße aus dem Wasserbad entnehmen und kurz abtrocken lassen.
Zur Sedimentation der Haare die Proben 1 min bei 10.000 x g zentrifugieren und den
wässrigen Überstand möglichst vollständig (aber ohne Haare) in ein neues
Eppendorfgefäß überführen.
Zu jeder Proben werden nun 400 µl Bindungspuffer (Achtung – zähflüssig)
hinzugegeben und die Proben bis zur vollständigen Durchmischung ca. 15 sec auf dem
Tischvortex gemixt.
Die gesamte Reaktion (ca. 900 µl) in eine Säule mit Auffanggefäß pipettieren und in
einer Tischzentrifuge 2 min bei 12.000 x g zentrifugieren.
Der Durchfluss samt Auffanggefäß wird verworfen und die Säule in ein neues
Auffanggefäß gestellt. Auf die Säule 500 µl Waschpuffer 1 pipettieren und die Proben
erneut für 1 min bei 10.000 x g zentrifugieren
Den Durchfluss samt Auffanggefäß verwerfen und die Säule in ein neues Auffanggefäß
stellen. Auf die Säule 750 µl Waschpuffer 2 geben und die Proben erneut für 1 min bei
10.000 x g zentrifugieren.
Den Durchfluss samt Auffanggefäß wieder verwerfen und die Säule in ein neues
Auffanggefäß stellen. Die Proben werden zum Entfernen von Restalkohol leer für
2 min bei 12.000 x g zentrifugiert.
Das Auffanggefäß verwerfen und die Säule in ein neues beschriftetes 1,5 ml
Eppendorfgefäß stellen. Zur Elution der DNA 50 µl Elutionspuffer mittig auf die
Säulenmatrix geben – die Matrix dabei aber nicht berühren. Die Proben zunächst
3 min bei RT stehen lassen und anschließend 1 min bei 8000 x g zentrifugieren.
Nun erneut 25 µl Elutionspuffer mittig auf die Säulenmatrix geben und die Probe noch
einmal 2 min bei 10.000 x g zentrifugieren. Die Säule kann anschließend verworfen
werden und von der gewonnen DNA‐Lösung eine Konzentrationsbestimmung
durchgeführt werden.
18
4.3. Photometrische Bestimmung der DNA‐Konzentration
Die frisch gewonnene genomische DNA vorsichtig mischen. Die Messung der Proben
erfolgt mit einem 5 µl Aliquot in einer 1 : 50 Verdünnung (5 µl DNA + 45 µl Wasser).
Für jede zu messende Probe werden in einem neuen 1,5 ml Eppendorfgefäß 45 µl
steriles Aqua dest (A. dest) vorgelegt. Für den späteren Blank (Leerwert) werden in ein
weiteres Reaktionsgefäß 50 µl A. dest pipettiert.
Von jeder Proben werden nun 5 µl in die vorbereiteten Messgefäße pipettiert (sauber
in die Lösung pipettieren).
Die Proben sanft mischen und in der Tischzentrifuge kurz anzentrifugieren.
Die gesamten 50 µl der Messverdünnung, sowie den Leerwert luftblasenfrei auf den
Boden einer Photoküvetten pipettieren – Achtung, die Küvetten nur oben anfassen um
eine Beschmutzung der Messfläche zu vermeiden!
Die Messung erfolgt am Eppendorf Tischphotometer (Labor E006):
Gerät einschalten und Programm dsDNA wählen, Drucker einschalten
den Leerwert mit Markierung (Pfeil auf Küvettenrand) in den Lichtweg
orientiert ins Gerät einstecken und die Taste – BLANK betätigen
für die Messung der Proben unter Taste – DILUTION die Verdünnung
[5 – Enter – 45 – Enter] eingeben und danach die Extinktionen der
eingesteckten Proben durch Taste – SAMPLE messen
über die ermittelte Konzentration der Proben soll nun das notwendige Volumen für die
anschließende PCR berechnet werden.
Von jeder Probe sollen ca. 300 ng als Template in insgesamt 10 µl eingesetzt werden:
Konzentrationen genomischer DNA (gDNA) und Template‐Volumen:
Probe Probe 1 Probe 2 Probe 3 Probe 4
Konzentration in ng / µl
Volumen 300 ng gDNA
Volumen A.dest ad 10 µl
19
4.4. PCR‐Amplifikation
Von allen Proben sowie den drei Referenz‐DNAs (BL/6J, MDX5CV, TRPV4‐KO) werden jeweils
zwei verschiedene PCR‐Reaktionen (eine Dystrophin‐ bzw. eine TRPV4‐spezifische Reaktion)
angefertigt. Für beide Reaktionen soll auch eine Wasserkontrolle (enthält A.dest anstelle von
Template‐DNA) mitgeführt werden.
In den Einzelreaktionen sind die folgenden Komponenten enthalten:
Komponente TRPV4‐PCR Dystrophin‐PCR
Template gDNA bzw. A.dest
10 µl 300 ng / A.dest 10 µl 300 ng / A.dest
A.dest 3,3 µl (ad 30 µl) 5,8 µl (ad 30 µl)
10x Taq‐Reaktionspuffer 3,0 µl (1 x) 3,0 µl (1 x)
MgCl2 (50 mM) 1,0 µl (1,6 mM) 1,0 µl (1,6 mM)
Tween 20 (1:10) 3,0 µl (1 x) 3,0 µl (1 x)
DMSO 1,0 µl (3,3 %) 1,0 µl (3,3 %)
Primer‐Forward (10 µM) 2,5 µl TRPV4‐Geno 1 For 2,5 µl 5CV‐Geno 1 For
Primer‐Reverse (10 µM) 2,5 µl TRPV4‐Geno 1 Rev 2,5 µl TRPV4‐Rev 2
2,5 µl 5CV‐Geno 1 Rev
dNTPs (10 mM) 1,0 µl (0,33 mM) 1,0 µl (0,33 mM)
Taq‐Polymerase (5 U / µl) 0,2 µl (ca. 1 U) 0,2 µl (ca. 1 U)
Endvolumen 30 µl 30 µl
Alle benötigten Reagenzien werden steril und aliquotiert zur Verfügung gestellt.
Mit Ausnahme von DMSO müssen alle Reagenzien auf Eis (4°C) aufgetaut und bis zum
Abschluss der Arbeiten gekühlt werden.
Das Enzym Taq‐Polymerase wird als Glyzerolstock bei ‐20 °C gelagert und wird erst direkt vor
der Verwendung vom Kursleiter ausgegeben.
Die Einzelkomponenten (ohne Template) können für die beiden Gen‐spezifischen PCRs für alle
Proben (4x Sample, 3x Kontroll‐DNAs, 1x Wasserkontrolle) zusammen als Mastermix angesetzt
werden und anschließend á 20 µl dem vorgelegten Template bzw. A.dest – Volumen
hinzugefügt werden.
20
Anfertigen der PCR‐Reaktionen:
10 µl Template‐DNA bzw. A.dest (Wasserkontrolle) luftblasenfrei auf den Boden von
0,2 ml Reaktionsgefäßen pipettieren.
Die Einzelkomponenten (abzüglich des Templates) der TRPV4‐ bzw. Dystrophin‐PCR für
alle Reaktionen zusammen als Mastermix in 1,5 ml Reaktionsgefäße zusammengeben,
sorgfältig mischen und in einer Tischzentrifuge kurz anschleudern.
Jeweils 20 µl Mastermix luftblasenfrei zu den Proben hinzu pipettieren und die
Reaktionsgefäße fest verschließen.
Die Reaktionen werden nochmals vorsichtig gemischt und in einer Tischschleuder kurz
anzentrifugiert.
Die Reaktionsgefäße in den PCR‐Cycler einstellen und den Deckel schließen.
Anschließend die Deckelheizung über die Drehscheibe soweit absenken bis ein
Widerstand auftritt – keine grobe Gewalt!
Das PCR‐Programm wird vom Kursleiter erläutert und gestartet. Das Programm
beinhaltet folgende Schritte:
94 °C – 4 min initiale Denaturierung
[94 °C – 30 sec; 60 °C – 1 min; 72 °C – 1 min] x 40 Zyklen
72 °C – 10 min Endsynthese
10 °C – ∞ Programmpause
Nach Beendigung der PCR das Programm stoppen und die Deckelheizung ein wenig
nach oben drehen. Anschließend kann der Deckel vorsichtig geöffnet werden.
Die Deckel der Reaktionsgefäße kurz andrücken und die Reaktionen aus dem Gerät
nehmen.
Die TRPV4‐Reaktionen werden direkt im Anschluss im Agarosegel (4.6.) analysiert. Die
Dystrophin‐Reaktionen werden nach dem Protokoll – Restriktionsanalyse (4.5.) weiter
behandelt.
21
4.5. Restriktionsanalyse der Dystrophin‐PCR‐Produkte mit HphI
Für die Restriktionsspaltungen der PCR‐Fragmente der Dystrophin‐PCR werden von jeder
Probe sowie den Kontrollen BL/6J und MDX5CV jeweils 15 µl PCR‐Reaktion mit dem Enzym
HphI verdaut.
Das restliche Volumen der ungespaltenen PCR‐Reaktionen (15 µl) kann ebenfalls im
Agarosegel analysiert und die Effizienz der PCR‐Amplifikation der einzelnen Proben überprüft
werden.
Alle benötigten Reagenzien werden steril und aliquotiert zur Verfügung gestellt.
Das Enzym HphI wird als Glyzerolstock bei ‐20 °C gelagert und wird erst direkt vor der
Verwendung vom Kursleiter ausgegeben.
Eine 30 µl Reaktionen enthält die folgende Komponenten:
30 µl: 15 µl PCR‐Reaktion
11 µl A.dest
3 µl CutSmart‐Puffer
1 µl HphI‐Enzym
Die Einzelkomponenten (ohne die PCR/DNA) können für alle Reaktionen zusammen als
Mastermix angesetzt werden und anschließend á 15 µl zur vorgelegten DNA gegeben werden.
Die PCR‐Reaktionen vorsichtig mischen und in einer Tischschleuder kurz
anzentrifugieren
Jeweils 15 µl der Proben luftblasenfrei in ein neues 0,2 ml Reaktionsgefäß vorlegen.
Die weiteren Komponenten aller Einzelreaktionen zusammen in einem 1,5 ml
Reaktionsgefäß zu einem Mastermix mischen und á 15 µl den Proben hinzugeben.
Die Reaktionsgefäße fest verschließen, kurz mischen und in einer Tischschleuder
anzentrifugieren.
Alle Proben werden über Nacht im Brutschrank bei 37 °C inkubiert.
Jeweils 20 µl der Spaltungen sollen anschließend durch eine horizontale Agarose‐
gelelektrophorese analysiert werden.
22
Tag 2 und 3:
4.6. Agarosegelelektrophorese
Die amplifizierten bzw. HphI‐verdauten PCR‐Produkte werden im Agarosegel in einer
horizontalen Gelelektrophorese‐Apparatur der Größe nach aufgetrennt.
Die Dichte (Porengröße) des benötigten Agarosegels richtet sich hierbei nach der Größe der zu
erwartenden DNA‐Fragmente. Für die Analyse der TRPV4‐PCR‐Produkte sowie der
Restriktionsspaltungen der Dystrophin‐PCRs sollen jeweils 2,5 % Agarosegele verwendet
werden.
Die zu erwartenden DNA‐Fragmentlängen sind nachfolgend zusammengefasst:
Stamm /
Fragmentlänge
C57BL/6J
(Wildtyp)
C57BL/6J‐MDX5Cv
(MDX5CV)
C57BL/6J‐TRPV4‐/‐
(TRPV4KO)
C57BL/6J‐
MDX5Cv‐TRPV4‐/‐
TRPV4‐Lokus 668 bp 668 bp 431 bp 431 bp
HphI‐Spaltung
Dystrophin‐Lokus 470 bp
332 bp
138 bp 470 bp
332 bp
138 bp
Die flüssige Agarose‐Lösung ist zur Detektion der aufgetrennten DNA‐Fragmente mit
0,3 µg/ml Ethidiumbromid (EtBr) versetzt und wird allen Gruppen temperiert auf 65 °C zur
Verfügung gestellt.
ACHTUNG: Ethidiumbromid ist giftig und karzinogen! Bitte Handschuhe tragen!
Zur späteren Abschätzung der Größen, sollen auf jedem Gel 8 µl eines Markers
(100 bp‐Ladder) mitgeführt werden:
Fragmente 100 bp‐Ladder:
23
Gießen der Agarosegele:
Den UV‐durchlässigen Gelträger in die Gießapparatur einspannen und einen
1 mm starken Kamm mit ausreichender Taschenanzahl einlegen.
Die flüssige Agaroselösung (Brutschrank E001) durch sanftes Kreisen vorsichtig
aufmischen (Achtung – 65 °C) und zu einem ca. 1 cm dicken Gel in den Gelträger
gießen (entspricht etwa ¾ der Kammhöhe). Eventuelle Luftblasen mit einer
Pipettenspitze entfernen.
Das Gel ca. 20 min abkühlen und hierdurch aushärten lassen.
Nach dem Aushärten durch gleichmäßiges senkrecht‐nach‐oben‐Ziehen vorsichtig den
Kamm entfernen.
Das Gel kann nun in eine mit 1 x TAE‐Laufpuffer gefüllte Elektrophoresekammer
eingelegt und mit den Proben beladen werden.
Auftragen der Proben:
Zur besseren Sicht der Taschen die schwarze Unterlegfolie unter die Elektrophorese‐
kammer schieben.
Die Proben vor dem Auftragen mit 1/10 Volumen 10 x DNA‐Probenpuffer versetzen,
vorsichtig mischen und kurz in der Tischschleuder anzentrifugieren.
Von jeder Probe sollen 20 µl ins Gel aufgetragen werden. Zur späteren Abschätzung
der Größen auf jedes Gel 1 x 8 µl des 100 bp Markers mit auftragen.
Vorsichtig den Deckel auf die Elektrophoresekammer auflegen und festdrücken.
Die Stromkabel in das Spannungsgerät einstecken. Die Elektrophorese erfolgt bei
80 V für ca. 45 min. Die Lauffront der Proben kann durch die Bromphenolblau‐Bande
des 100 bp Markers abgeschätzt werden.
Nach Beendigung der Elektrophorese das Spannungsgerät ausschalten, das Gel mit
dem Gelträger aus der Kammer entnehmen und in eine Fotoschale legen.
Die Detektion der Ethidiumbromid‐gefärbten DNA‐Banden erfolgt zusammen mit dem
Kursleiter am Geldokumentationsgerät im Labor E006.
24
4.7. Auswertung der Ergebnisse
Die DNA‐Fragmentlängen der TRPV4‐PCR‐Produkte sowie der mit HphI‐verdauten Dystrophin‐
PCR‐Produkte sollen anhand des mitgeführten 100 bp Markers aus den Agarosengelen
abgeschätzt und mit den zu erwartenden Fragmentlängen (siehe 4.6.) verglichen werden.
Welcher Genotyp lässt sich aufgrund der erhaltenen Ergebnisse den Proben 1 – 4 zuordnen?
Fragmente / PCR BL/6J
Referenz MDX5CVReferenz
TRPV4‐KOReferenz
Probe 1 Probe 2 Probe 3 Probe 4
TRPV4‐PCR
HphI‐Spaltung Dystrophin‐PCR
Genotyp
TRPV4‐Lokus:
Dystrophin‐Lokus:
Die Genotypen der verblindeten Proben werden abschließend vom Kursleiter bekannt
gegeben und die Ergebnisse sollen zusammen diskutiert werden.
25
4.8. Benötigte Materialien und Lösungen
Kommerzielle Kits: InnuPrep DNA Mini Kit (AnalytikJena)
Inkl. Proteinase K
Enzyme: Platinum Taq‐Polymerase Recombinant (Invitrogen)
Inkl. 10x Reaktionspuffer, 50 mM MgCl2, 10 mM dNTP‐Mix
Restriktionsendonuklease HphI (NEB)
Inkl. 10x CutSmart‐Puffer
Nukleotide: TRPV4‐Geno 1 For (10 µM) 5CV‐Geno 1 For (10 µM)
TRPV4‐Geno 1 Rev (10 µM) 5CV‐Geno 1 Rev (10 µM)
TRPV4‐Rev 2 (10 µM)
100 bp‐Ladder (NEB)
Reagenzien: steriles Aqua dest (A.dest)
Ethidiumbromid (10 mg/ml)
DMSO
Tween 20 (1:10)
1x TAE‐Puffer (40 mM Tris, 5 mM Natriumacetat, 1 mM EDTA, pH 7,8)
2,5 % (w/v) Agarose in 1x TAE
10x DNA‐Probenpuffer (30 % Glyzerin, 0,25 % (w/v) Xylencyanol)
Material: Reaktionsgefäße (entsprechend Volumen 0,2 – 2,0 ml)
UV‐Küvette micro (Brandt)
Pipettenspitzen (entsprechend Volumen für 0,5 – 1000 µl)
Pipetten (entsprechend Volumen für 0,5 – 1000 µl)