Place et perspectives de l’exploration biochimique dans les maladies mitochondriales ?

Pascal Reynier

Naïg Gueguen, Valérie Desquiret-Dumas,

Magalie Barth, Patrizia Bonneau, Vincent Procaccio, Gilles Simard

Sfeim, 17 novembre 2014

Techniques & Echantillons

ACTIVITES I, I+III, II, II+III, III, IV, V, CS

FONCTIONNALITE Respirométrie

STRUCTURE BN-PAGE

Génétique moléculaire

«ASPECTS METABOLIQUES

GENERAUX» L, P, L/P, 3OH-But/AcAC,

CAO, CAA,…

«ASPECTS + RECHERCHE»

Synthèse ATP ? Pot. Mb ROS ?

Cybrides ? …

Muscle Fibroblastes Foie Autres…

Enzymologie: Contrôles inter-laboratoire, EEQ, CIQ,…

Le casse-tête… du réseau MM Mitochondries de cœurs de bœufs (J Lunardi, G Hardy, Grenoble)

Variabilité inter-laboratoires Protocoles consensuels

Billes 2004

Contrôles inter-laboratoires, EEQ, CIQ,…10 LBM S Allouche – A Slama

Billes 2008

C I

C I+III

C II

C II+III

C III

C IV

CS

C/CS

100

97

85

45

540

C/CS

128

90

97

154

282

C/CS

65

57

48

148

298

C/CS

75

44

32

37

255

207

C/CS

79

35

63

37

252

353

Billes 2012

C I

C I+III

C II

C II+III

C III

C IV

CS

C I

C I+III

C II

C II+III

C III

C IV

CS

C/CS

89

196

159

140

702

343

C/CS

58

54

100

98

60

235

C/CS

69

0

52

42

48

279

C/CS

76

0

79

74

218

C/CS

32

0

89

36

127

262

C/CS

71

52

55

39

155

177

C/CS

67

48

67

36

319

335

ACCREDITATION ISO 15189 Harmoniser procédures, fournisseurs, lots de réactifs (cyt c),… Quels EEQ et CIQ ? Polarographie, BN-Page… Ou disparaître… en 2020…

II

IV

Con

trôle

ne

g. 1

Pa

tie

nt

Hybridation

COX I

Hybridation

COX Va

IV

III2

Gel : condition native gradient 4 – 16 %

Con

trôle

ne

g. 2

III2IV

III2IV

Pa

tie

nt

Con

trôle

ne

g. 3

SU

RF

1

complexes anticorps

Hybridation

IIIcore3

Hybridation

II70

SU

RF

1

Apport BN-PAGE ? Ex Surf1: ano assemblage Cx IV

7 millions de cellules Purification mitos Extraction protéines 20 µg prot par puits (en double)

Gel : condition native gradient 3-15 %

Hybridation

Vβ +Vα

anticorps 0 1 2,5 5 0 1 2,5 5 min

Contrôle ATP6 9176 T>C

T°

à 40°C

2,5 min

à 40°C

m.9176 T>C

Ctr

+ (

Rh

Oo

)

contrôles P1

P2

P3

P4

P5

V Gel : condition native gradient 3-15 %

Apport BN-PAGE ? Ex ATP6/m.9176T>C: ano stabilité Cx V

Apport BN-PAGE ? Cx I

Grim 19

NDUFS2

+

NDUFB6

+

NDUFS1

II70

Té

moin

H

Té

moin

F

Té

moin

F

ND

UF

S4

ND

UF

S4

Patiente

PJ

Patiente

PC

ND

1

ND

1

ND

UF

V1

Cx I holoEnz

~1000 kDaInterm.

~830 kDa800kDa

400kDa

~830 kDa

Cx I holoEnz

~600 kDa

superCx I+III

~830 kDa

Cx I holoEnz

~600 kDa

superCx I+III

N module

~300 kDa

Cx II

Interface

Matricielle

Transmb

N module Abs N module NDUFS4

Complémentarité Enzymo/Polaro/BN-Page ?

Faisceau d’arguments

ADNmt ADNnuc

Confirmer la pathogénicité des variants ADNmt issus du NGS MitoMap et Cybrides

Fibroblastes - Actinomycine D Rho° 143B (ostéosarcome), TK-

PEG

Mutation ? Taux de mutant ? Biochimie ?

Sélection BrDU

Confirmer la pathogénicité des variants ADNmt Exemple 1: Insertion de 3C en 15537

Patient 25 ans Intolérance à l’effort invalidante depuis l’âge de 11 ans Epreuve d’effort pathologique évocatrice (décroissance lactate) Nombreuses RRF

Biochimie fibroblastes: Muscle: I/CS -55% et III/CS: -90% I+II -20% Fibros: I/CS -25% et III/CS: -50%

Variant ADNmt: Insertion de 3C en 15537 hétéroplasmique Gène cyt b Inconnue

Cybrides hétéroplasmiques:

Biochimie : Déficit Cx I (-60%) Déficit Cx III (-90%) Confirmation pathogénicité

• Agriculteur 35 ans

– Crises d’épilepsie pharmaco-résistantes

– Etat semi-végétatif et convulsions à l’admission

– Légère lactatorachie

• Déficit Cx IV (-63% muscle et -56% fibroblastes)

• Variant homoplasmique ADNmt inconnu:

– Gène COII: m.7757G>A p.Ala58Thr ?? AA très conservé

Confirmer la pathogénicité des variants ADNmt Exemple 2: m.7757G>A homoplasmique

I/CS II/CS III/CS IV/CS

Moy Témoin

ET

0.47 0.15

0.15 0.05

1.02 0.39

1.35 0.31

Fibros L 0.40 0.15 0.66 0.45

I/CS II/CS III/CS IV/CS

Moy Témoin

ET

0.17 0.04

0.16 0.04

0.54 0.13

0.37 0.12

Cyb L 0.12 0.16 0.28 0.07

Nucleotide

Position Locus

Nucleotide

Change Codon

Number Codon

Position

Amino

Acid

Change

GB

frequency References

7757 MT-CO2 G-A 58 1 non-syn:A-

T 1 references

MITOMAP: mtDNA Coding Region Sequence Polymorphisms

Pathogénicité

Confirmer la pathogénicité des variants nucléaires Confirmer déficit OXPHOS à la « sortie d’exome »

puis pour chaque nouveau variant (faux-sens++) du gène…

Disparition polyA dans 3 gènes ADNmt

Diminution d’expression des prot mito (WB)

Altération structure (BN-Page)

Déficit OXPHOS (Enzymo)

Vers une exploration plus intégrée ? Sondes multiples (ISE, fluorométrie)

• O2

• Synthèse ATP

• Pot de mb (ISE TPP+)

• ROS/H2O2

• Ca2+

• NO

• H2S

• …

Orientation pré-thérapeutique ? Répondeurs / non répondeurs ?

Idébénone / NOHL / Cx I Discordantes des résultats cliniques ?

Angebault et al, BMC Res Notes, 2011 P<0.002, WB nal

Echappement e- dus à fixation non spec ?

Evaluer l’influence globale du déficit OXPHOS ?

Foie de souris 2100 métabolites mitochondriaux

Roede et al, Plos One 2012

Plasma humain >4500 métabolites

HMDB

Evaluer l’influence globale du déficit OXPHOS

Evaluer l’influence globale du déficit OXPHOS

Phosphatidylcholines (42) Sphingomyléines (7) Acides aminés (11) Amines biogènes (3)

Interprétation ???

Csq déficit mito Ou csq souffrance cellulaire ?

Nouveaux biomarqueurs ?

Plasma (20 OPA1+/+/20 OPA1+/-)

Biocrates p180 kit AB Sciex QTRAP5500

OPLS-DA

Conclusions biochimie mitochondriale

• Diagnostic OXPHOS FORCE DU DIAG MITO Diagnostic génétique

• Repositionnement NGS Biochimie ? – Preuve fonctionnelle de la pathogénicité des variants (nouveaux gènes rares, peu de familles) – Evaluer l’expression du variant (pénétrance incomplète et expressivité) ? – Evaluer l’influence des facteurs complémentaires (multigénisme, fond génétique, âge,

épigénétique…) ? – Évaluer la sévérité du déficit – Évaluer un déficit secondaire

• Perspectives et nouveaux apports ? – Analyse physiopathologique plus globale (multi-sondes et métabolomique) – Métabolomique (nouveaux biomarqueurs diagnostiques, pronostiques et de suivi

thérapeutique ?) – Evaluer les conséquences fonctionnelles du déficit (variabilité inter-individuelle) – Tests pré-thérapeutiques ?

OPA1

J Chao de la Barca E Sarzi

C Angebault G Lenaers

BIOCHIMIE

N Gueguen Wetterwald C

G Simard

CR-MR

M Barth D Miléa C Verny

J Cassereau D Bonneau

RESEAU MM (V Procaccio)

10 LBM

GENETIQUE MOL.

P Amati-Bonneau V Desquiret-Dumas

C Bris V Procaccio