plagiat merupakan tindakan tidak terpujiberkat, kesabaran, kekuatan, dan karunia-nya, sehingga...

ISOLASI DAN IDENTIFIKASI BAKTERI ENDOFIT DALAM BATANG TANAMAN Artemisia Annua L.

YANG DIUJI POTENSI ANTIBAKTERINYA TERHADAP Eschericia coli DAN Staphylococcus aureus

Skripsi Diajukan Untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi ( S. Farm. ) Program Studi Farmasi

Oleh : Antonius Alfian Yuan Dias Priharta

NIM : 038114064

FAKULTAS FARMASI UNIVERSITAS SANATA DHARMA

YOGYAKARTA 2008

PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI

Skripsi

ISOLASI DAN II}ENTTFIKASI BAKTERI ENDOFTTDALAM BATANG TANAMAN Artemisia AnnuaL.

YANG DIUJI POTENSI ANTIBAKTERINYATERHADLP Eschericia co# DAN Staphylococcus aureils

Iliajukan Oleh :

Antonius Alfian Yuan Dias Priharta

NIM:038114064

Telah disetujui oleh:

Pembimbing:

o{ t ^,s' , i I ( '

,'u!L--'Maria Dwibudi Jumpowati, S.Si.

Tanggaf , ?1 ..fov.*.,.i..*g.o8(,

I I I


Pengesahan Skripsi

Berjudul:

ISOLASI DA}{ IDENTIFIKASI BAKTERI ENIX}FTTDALAM BATANG TANAMAN Artemisis Anw* L

YAITG DIUJI POTENSI ANTIBAKTEilNYATERAD AP Exhefcia coli DAlt Staphytoeorus sursus

OIetrAntonius Alfian Yuan Dias Priharta

NIM:038114S64

Dipertahankan di hadapan Panitia Penguji SlripsiFakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma

Pada tanggal : 15 Januari 3008

Fakultas FarmasiDharma

*r.rt., urt.Pembimbing:

MariaDwi Budi Jumpowafi, S.Si.

Panitia Pengr$i :

1. Mari*Dwi Budi Jumpowati, S.Si.

2. Y*stina Sri Hartini, M.Si., Apt.

3. Igl Y" Kristio Budiasmoro, M.Si.

Tanda Tangan

0&v44,,YTwr

1Y

Mengetahui


Skripsi ini dipersembahkan untuk :

Yesus Kristus

Bapak Bernardinos Dias Sidharta

Ibu Caecilia Enita Amarwati

Crezensia Alfiora Dea Dema Dias Oktabenita

Felisita Anesti Kusumastuti

Without Love, I’m Nothing . . . .

v


LEMBAR PER}IYATAA}{ PENSETilJUAI{PUBLIKASI KARYA ILMIAH T]NTUK KEPEI{TINGAI\I AI{ADEMIS

Yaag bertanda tangan di bawah ini, saya mahasiswa Universias Sanata Dharma :

: Antonius Alfian Yuan Dias hihffa

Nomor lrdahasiswa : 038114064

Deui pengembangan ilmu pengetahuan, saya meilbtrikar ke,pada Perpustakaaa

Universitas Sanah Dharma karya ilmiah saya yang berjudtl :

"ISOLASI DAN IDENTIFIKASI BAIffSRI ENDOFIT DAI,AMBATAFIG TANAMAN Artenisin an $til L. YAFIG IIIUJI POTENSIANTIBAI(IERIIYYA TERIIADAP Escheria cotri DAF{ Str,phyloeweetsasteuf

beserta perangkat yang diperlukan (bila ada). Dengan demikian saya memkrikm

k€pada Perpusakaan Universitas Sanata Dharua bak unt* mcnyimparq me-

ngnlihkan dalam bentuk media lain, mengelolanya dalam bsh* pang*alan data

memdisribusikan s€cara terbatas, dan merrpublikasikannya di Internet dau media

tain untr* kepentingan akademis tanpa perlu meminta ijin dari $lya malryut

mcrrberikan rcyalti kepada saya selama t€tap mencatrfimkm nama saya s*agai

pmulis. Derrikian psmyafaan ini yang saya buat dengru sebenarnya.

Dibnatdi Yoryaka*a

Padatanggal : 30 Jauuari 2008

Yrnn Dias Priharta)


PRAKATA

Puji dan syukur ke hadirat Tuhan Yesus Kristus yang telah melimpahkan

berkat, kesabaran, kekuatan, dan karunia-Nya, sehingga penulis dapat

menyelesaikan skripsi ini dengan baik. Skripsi yang penulis susun berjudul

ISOLASI DAN IDENTIFIKASI BAKTERI ENDOFIT DALAM BATANG

TANAMAN Artemisia Annua L. YANG DIUJI POTENSI ANTIBAKTERINYA

TERHADAP Eschericia coli DAN Staphylococcus aureus.

Skripsi ini disusun untuk memenuhi salah satu syarat memperoleh gelar

Sarjana Farmasi (S.Farm) Program Studi Farmasi, Fakultas Farmasi Universitas

Sanata Dharma Yogyakarta. Pada kesempatan ini tidak lupa penulis mengucapkan

banyak terimakasih kepada :

1. Tuhan Yesus Kristus yang telah memberi rahmat dan berkat-Nya serta

perlindungan dan bimbingan-Nya pada setiap umat-Nya.

2. Bapak, Ibu, dan adik Dhea atas doa, kasih sayang, perhatian, dan

dukungannya baik moril maupun materiil yang selalu diberikan padaku.

3. Ibu Maria Dwi Budi Jumpowati, S.Si., selaku dosen pembimbing utama yang

telah memberikan bimbingan, pengarahan, waktu, kesabaran, dan saran hingga

skripsi ini dapat tersusun.

4. Ibu Yustina Sri Hartini, M.Si., Apt., selaku dosen penguji yang telah banyak

memberikan saran dan masukan kepada penulis.

5. Bapak Ign. Y. Kristio Budiasmoro, M.Si., selaku dosen penguji yang telah

banyak memberikan saran dan masukan kepada penulis.

6. Pihak BPTO Tawangmangu, terutama Bapak Agus. Terimakasih telah

vi


membantu dalam pengadaan dan determinasi tanaman Artemisia annua L.

7. Eyang Putri beserta keluarga besar di Klaten, terimakasih atas doa, perhatian,

kasih sayang, nasehat, dan dukungan untukku.

8. Pakdhe dan Budhe beserta keluarga, terutama Budhe Erlin, terimakasih atas

perhatian, nasehat, dan dukungan untukku.

9. Felisita, terimakasih untuk doa, perhatian, cinta, kesabaran, serta dukungan

yang sangat berkesan untukku.

10. Pak Kartatmo, Pak Mukmin, Mas Narto selaku Staff Sekretariat Fakultas

Farmasi Universitas Sanata Dharma, terimakasih telah membantu dalam

memperlancar administrasi hingga tersusunnya skripsi ini.

11. Mas Sarwanto, Mas Sigit, Mas Wagiran selaku Laboran Laboratorium Biologi

Farmasi, terimakasih atas semua bantuannya selama ini.

12. Teman-teman kelompok C 2003 : Anien, Siska, Eveline, Hartono, Komang,

Indhu, Devi, Titien, Ratna, Yulia, Madya, Punto, Esti, Tata, Budi, Rosa, Vera,

Ratih, dan Maria. Terimakasih atas kerjasama dan kebersamaannya selama ini.

Che 03 Never Die...

13. Anak-anak kontrakan : Abang Aan, Hengky, Manto, Irwan, Ndaroe, Topan,

dll. Thanks untuk kebersamaaannya. Keep the Spirit..

14. Anak-anak No Label cabang Teknik Sipil Atma Jaya, thanks untuk

kebersamaaannya. Tetap semangat mengejar wanita sampai Nirwana..

15. Teman-teman KKN USD XXXIII Gantiwarno Kelompok 29 : Mbak Non

(PBI), Valent (MIPA), Melinda (Psi), Sandra (S.Ing), Ika (P.Mat), Dika

(IKOM), Punto (PBI), dan Bu Parlan selaku Ibu Pondokan, terimakasih atas

vii


bantuan, dukungan dan kebersamaannya selama ini.

16. Lukas Eko, teman skripsi Rosa, dan Bayu (PBI), terimakasih atas kerjasama,

bantuan, dan kebersamaannya selama ini.

17. Yoyok, thanks telah membawakan tanaman Artemisia annua L. dari

Tawangmangu sampai ke Jogja.

18. Teman-teman angkatan 2003 yang tidak mungkin saya sebutkan satu persatu,

terimakasih atas kebersamaannya selama ini.

19. Semua pihak yang telah membantu dan mendukung penulis hingga

tersusunnya skripsi ini.

Penulis sangat menyadari bahwa dalam skripsi ini masih banyak terdapat

kesalahan dan kekurangan, oleh karena itu saran dan kritik yang sifatnya

membangun sangat penulis harapkan demi kesempurnaan penulisan ini.

Akhirnya penulis berharap semoga skripsi ini bermanfaat bagi

pengembangan ilmu farmasi pada khususnya dan kemajuan ilmu pengetahuan

pada umumnya.

Yogyakarta, 21 November 2007

Hormat penulis

Antonius Alfian Yuan Dias Priharta

viii


PER}IYATAAH KEASLIAN PENELITIAI{

Saya menyatakan dengan sesuagguhnya bahwa slcripsi yang saya ftrlis tm

tidak memuat karya atau bgian karya orang lain, kecuali yarrg tetah disebrskan

dalam daftar pustaka sebgaimana layaknya karyailmiah.

Yogyakarfa, 21 November 2007

Antonius YuanDias Prihsrra

tx


INTISARI

Tanaman Artemisia annua L. merupakan tanaman yang digunakan sebagai

obat anti malaria. Pada tanaman A.annua L ini diketahui ada mikrobia endofit yang membentuk koloni dalam jaringan pada daerah batang sampai akar (Simanjuntak dkk, 2004). Mikrobia endofit tumbuh di jaringan vaskular dari tanaman inangnya (Stone et al, 2000). Mikrobia endofit diketahui dapat memperbaiki pertumbuhan tanaman karena kemampuannya menekan pertumbuhan mikrobia-mikrobia patogen dengan cara kompetisi, menghasilkan senyawa antibiotik, atau menginduksi ketahanan tanaman (Pudaritadesantamaria, 2004).

Tujuan penelitian ini adalah mengetahui adanya isolat bakteri endofit dalam batang tanaman A.annua L., menguji potensi antibakteri dari isolat bakteri endofit tersebut terhadap bakteri Eschericia coli dan Staphylococcus aureus serta mengetahui identitas bakteri endofit penghasil senyawa antibakteri tersebut.

Penelitian ini merupakan penelitian eksperimental murni dan bersifat eksploratif-deskriptif. Isolasi bakteri endofit dari batang tanaman A.annua L. dilakukan dengan metode streak plate, potensi antibakteri diuji dengan metode paper disc. Identifikasi bakteri endofit dilakukan dengan pengamatan morfologi koloni, morfologi sel, dan uji biokimia.

Hasil dari penelitian ini adalah senyawa antibakteri yang dihasilkan bakteri endofit yang diisolasi dari tanaman A.annua L. mempunyai potensi antibakteri terhadap bakteri Eschericia coli dan Staphylococcus aureus, serta diketahui identitas bakteri endofit penghasil senyawa antibakteri tersebut adalah genus Amphibacillus.

Kata kunci : Bakteri endofit, zona hambat, Artemisia annua L., Eschericia coli, Staphylococcus aureus, Amphibacillus.

x


ABSTRACT

Artemisia annua. L. is a plant which is used as antimalaria. At this A.annua. L. is known that is endophytic mikrobia forming colony in tissue at stem area until root (Simanjuntak et al, 2004). Endophytic mikrobia grew in vascular tissue from the plant (Stone et al, 2000). Endophytic microbia can fix up the development of the plant because its ability to suppress the pathogenic development in survival way, producing antibiotic compounds, or inducting the vurnability of the plant (Pudaritadesantamaria, 2004).

The purpose of this research was to find the endophytic bacteria isolate toward Eschericia coli and Staphylococcus aureus, and to find the identity of the endophytic bacteria which produced this antibacteria compounds.

This result was pure experimental research and it was an explorative descriptive research. The endophytic bacteria isolation from A.annua. L.’s stem was used streak plate method, the antibacterial potential was tested using paper disc method. The identification of endophytic bacteria was using colony morphology observation, cell morphology, and biochemical test.

The result of this research were an antibacterial compounds which was produced by endophytic bacteria was isolated from A.annua. L, had the potential antibacteria to E.coli and S.aureus, and it was known that the identity of the endophytic bacteria which produced this antibacteria compounds was Amphibacillus.

Key words : endophytic bacteria, inhibition zone, Artemisia annua L., Eschericia coli, Staphylococcus aureus, Amphibacillus.

xi


DAFTAR ISI

Halaman Judul..................................................................................................... ii

Halaman Persetujuan Pembimbing...................................................................... iii

Halaman Pengesahan........................................................................................... iv

Halaman Persembahan........................................................................................ v

Prakata................................................................................................................. vi

Pernyataan Keaslian Karya................................................................................. ix

Intisari................................................................................................................. x

Abstract............................................................................................................... xi

Daftar Isi............................................................................................................. xii

Daftar Tabel....................................................................................................... xvi

Daftar Gambar................................................................................................... xvii

Daftar Lampiran................................................................................................ xviii

BAB I. PENDAHULUAN

A. Latar Belakang.................................................................................. 1

1. Permasalahan.............................................................................. 3

2. Keaslian Penelitian..................................................................... 3

3. Manfaat Penelitian...................................................................... 4

B. Tujuan Penelitian.............................................................................. 4

BAB II. PENELAAHAN PUSTAKA

A. Antibiotik......................................................................................... 5

B. Mikrobia Endofit............................................................................. 7

xii


C. Artemisia annua L. ......................................................................... 10

D. Rekombinasi Genetik..................................................................... 12

E. Bakteri Uji...................................................................................... 14

F. Metode Pengujian Potensi Senyawa Antimikrobia........................ 16

G. Identifikasi Mikrobia...................................................................... 18

H. Keterangan Empiris....................................................................... 21

BAB III. METODOLOGI PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian..................................................... 23

B. Variabel dan Definisi Operasional................................................. 23

C. Bahan dan Alat Penelitian.............................................................. 25

D. Tahapan Penelitian........................................................................ 28

1. Determinasi tanaman Artemisia annua L. ................................ 28

2. Pengumpulan batang Artemisia annua L. ................................. 28

3. Pembuatan MS Medium (Murashige-Shoog Medium).............. 28

4. Disinfeksi Batang Artemisia annua L. .................................. 31

5. Penanaman Batang Artemisia annua L. pada MS Medium...... 31

6. Isolasi Bakteri Endofit dengan Metode Streak

Plate........................................................................................... 32

7. Pengujian Potensi Antibakteri dari Isolat Bakteri Endofit

Terhadap E.coli dan S.aureus Secara Difusi Paper

disc............................................................................................. 32

8. Identifikasi Bakteri Endofit........................................................ 33

xiii


E. Analisis Hasil................................................................................. 40

BAB IV. HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN

1. Determinasi Tanaman Artemisia annua L. ................................... 43

2. Pengumpulan Batang Tanaman Artemisia annua L. ..................... 43

3. Pembuatan MS Medium (Murashige-Shoog Medium).................. 44

4. Disinfeksi Batang Tanaman Artemisia annua L. ...................... 46

5. Penanaman Batang Artemisia annua L. pada MS Medium........... 47

6. Isolasi Bakteri Endofit dengan Metode Streak Plate..................... 49

7. Pengujian Potensi Antibakteri dari Senyawa Antibakteri yang

Dihasilkan Isolat Bakteri Endofit kode B dan kode D Terhadap

S.aureus dan E.coli Secara Difusi Paper disc............................... 52


Dihasilkan Isolat Bakteri Endofit dengan Bakteri Uji

S.aureus.......................................................................................... 54


Dihasilkan Isolat Bakteri Endofit dengan Bakteri Uji E.coli......... 59

10. Identifikasi Bakteri Endofit kode B dan Bakteri Endofit kode

D............................................................................... 63

a. Pengamatan Morfologi Sel Isolat Bakteri Endofit kode B dan

Bakteri Endofit kode D.............................................................. 64

b. Pengamatan Morfologi Koloni Isolat Bakteri Endofit kode B

dan Bakteri Endofit kode D....................................................... 71

c. Uji Biokimia.............................................................................. 73

xiv


BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan.................................................................................... 85

B. Saran.............................................................................................. 85

DAFTAR PUSTAKA........................................................................................ 86

LAMPIRAN...................................................................................................... 90

BIOGRAFI PENULIS....................................................................................... 102

xv


DAFTAR TABEL

Tabel I. Hasil Pengukuran Diameter Zona Hambat dari Senyawa

Antibakteri yang Dihasilkan Bakteri Endofit kode B Terhadap

S.aureus dengan Waktu Inkubasi 24 Jam.......................................... 56

Tabel II. Hasil Pengukuran Diameter Zona Hambat dari Senyawa

Antibakteri yang Dihasilkan Bakteri Endofit kode D Terhadap

S.aureus dengan Waktu Inkubasi 24 Jam.......................................... 57

Tabel III. Hasil Pengukuran Diameter Zona Hambat dari Senyawa

Antibakteri yang Dihasilkan Bakteri Endofit kode B Terhadap

E.coli dengan Waktu Inkubasi 24 Jam .............................................. 60

Tabel IV. Hasil Pengukuran Diameter Zona Hambat dari Senyawa

Antibakteri yang Dihasilkan Bakteri Endofit kode D Terhadap

E.coli dengan Waktu Inkubasi 24 Jam .............................................. 61

Tabel V. Hasil Uji Biokimia Bakteri Endofit kode B dan Bakteri Endofit

kode D................................................................................................ 82

Tabel VI. Hasil Identifikasi Bakteri Endofit kode B, Bakteri Endofit kode D,

dan Bakteri Genus Amphibacillus .................................................. 84

xvi


DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Skema Kerja Penelitian .................................................................. 42

Gambar 2. Hasil Pengujian Potensi Senyawa Antibakteri yang Dihasilkan

Bakteri Endofit kode B Terhadap S.aureus dengan Waktu

Inkubasi 24 Jam ............................................................................ 55


Bakteri Endofit kode D Terhadap S.aureus dengan Waktu

Inkubasi 24 Jam ............................................................................ 57


Bakteri Endofit kode B Terhadap E.coli dengan Waktu Inkubasi

24 Jam ........................................................................................... 60


Bakteri Endofit kode D Terhadap E.coli dengan Waktu Inkubasi

24 Jam ........................................................................................... 61

Gambar 6. Pengecatan Gram Isolat Bakteri Endofit kode B .......................... 65

Gambar 7. Pengecatan Gram Isolat Bakteri Endofit kode D .......................... 66

Gambar 8. Pengecatan Spora Isolat Bakteri Endofit kode B .......................... 67

Gambar 9. Pengecatan Spora Isolat Bakteri Endofit kode D .......................... 68

Gambar 10. Pengecatan Acid Fast Isolat Bakteri Endofit kode B .................... 69

Gambar 11. Pengecatan Acid Fast Isolat Bakteri Endofit kode D .................... 70

xvii


DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Surat Keterangan Determinasi Tanaman A.annua L.................... 90

Lampiran 2. Tanaman A.annua L..................................................................... 92

Lampiran 3. Isolasi Bakteri Endofit pada MS Medium dengan Waktu

Inkubasi 3 hari ............................................................................. 92

Lampiran 4. Isolasi Kembali Bakteri Endofit dengan Metode Streak Platting

dengan Waktu Inkubasi 24 Jam ................................................... 93

Lampiran 5. Hasil Uji Motilitas Bakteri Endofit kode B dan Bakteri Endofit

kode D pada Medium Semi Solid ................................................ 93

Lampiran 6. Hasil Uji Morfologi Koloni Bakteri Endofit kode B dan Bakteri

Endofit kode D pada Nutrient Broth ............................................ 94


Endofit kode D pada Nutrient Agar Tegak .................................. 94


Endofit kode D pada Nutrien Agar Miring .................................. 95

Lampiran 9. Hasil Uji Asam sulfida (H2S) ....................................................... 95

Lampiran 10. Hasil Uji Dekarboksilasi Lisin ..................................................... 96

Lampiran 11. Hasil Uji Indol .............................................................................. 97

Lampiran 12. Hasil Uji Methylen Red (MR) ..................................................... 97

Lampiran 13. Hasil Uji Sitrat ............................................................................. 98

Lampiran 14. Hasil Uji Katalase ........................................................................ 99

Lampiran 15. Hasil Uji Oksidase ....................................................................... 99

xviii


Lampiran 16. Hasil Uji Gelatin .......................................................................... 100

Lampiran 17. Hasil Uji Oksidasi-Fermentasi (OF) tanpa Paraffin .................... 100

Lampiran 18. Hasil Uji Oksidasi-Fermentasi (OF) dengan Paraffin ................. 101

xix


BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Antibiotik merupakan substansi yang dihasilkan oleh mikrobia yang

dalam konsentrasi rendah mampu menghambat pertumbuhan atau membunuh

mikrobia lain. Setiap antibiotika mempunyai aktivitas penghambatan hanya

terhadap kelompok mikrobia tertentu yang disebut spektrum penghambatan

(Suwandi, 1989)

Pada tanaman A.annua L ini diketahui bahwa ada mikrobia endofit yang

membentuk koloni dalam jaringan pada daerah batang sampai akar, dari hasil

identifikasi diketahui bahwa mikrobia tersebut adalah Bacillus polymixa

(Simanjuntak, Bustanusallam, Malini, Otovina, Rahayuningsih, & Said, 2004).

Bacillus polymixa termasuk dalam genus Bacillus yang mempunyai ciri sel

berbentuk batang, gram positif, fakultatif anaerob, membentuk endospora, motil,

dan bersifat katalase positif (Holt, Krieg, Sneath, Staley, & Williams, 2000).

Mikrobia endofit adalah mikrobia yang hidup di jaringan tanaman pada

periode tertentu dan mampu hidup dengan membentuk koloni dalam jaringan

tanaman tanpa membahayakan inangnya. Mikrobia endofit tumbuh di jaringan

vaskular dari tanaman inangnya (Stone, Bacon, White, 2000). Setiap tanaman

tingkat tinggi dapat mengandung beberapa mikrobia endofit. Mikrobia endofit

tersebut mampu menghasilkan metabolit sekunder yang diduga sebagai transfer

genetik (genetic recombination) dari tanaman inangnya ke dalam mikrobia endofit


2

(Tan & Zou, 2001). Kemampuan mikrobia endofit memproduksi metabolit

sekunder yang sesuai dengan tanaman inangnya merupakan peluang yang sangat

besar dan dapat diandalkan untuk memproduksi metabolit sekunder dari mikrobia

endofit yang diisolasi dari tanaman inangnya tersebut (Radji, 2005). Bakteri

endofit Bacillus polymixa hasil isolasi dari tanaman A.annua L., dapat

memproduksi metabolit artemisinin yang sangat potensial sebagai anti malaria

(Simanjuntak, dkk, 2004).

Pada isolasi mikrobia endofit, diperlukan media yang dapat menyokong

pertumbuhan tanaman inang bakteri endofit (Mucciarelli, Scannerini, Bertea, &

Maffei, 2001). Media Murashige-Skoog (MS) merupakan media yang digunakan

untuk hampir semua macam tanaman karena mengandung konsentrasi garam-

garam mineral yang tinggi dan senyawa N dalam bentuk NO3- dan NH4+

(Hendaryono,1994).

Staphylococcus aureus dapat menghemolisis darah dan mengkoagulasi

plasma, juga menginfeksi bisul, impetigo, dan infeksi luka yang menimbulkan

nanah. Eschericia coli dapat menyebabkan infeksi saluran kemih, terjadinya diare,

sepsis, dan meningitis. (Jawetz, Melnick, & Adelberg, 1996). S.aureus (gram

positif) dan E.coli (gram negatif) dipilih untuk mengetahui keefektifan potensi

antibakteri dari senyawa yang dihasilkan oleh bakteri endofit terhadap bakteri

gram positif dan gram negatif, sehingga dapat diketahui spektrum penghambatan

dari senyawa antibakteri tersebut.

Jan G. Bruhn dan Lars Bohlin pada tahun 1997 memperkenalkan

molecular pharmacognosy, yang mendifinisikan pharmacognosy sebagai


3

pengetahuan molekuler yang menyelidiki hubungan struktur dan aktifitas dari

bahan-bahan alam dengan potensinya sebagai obat. Bahan-bahan alam yang

berpotensi sebagai obat dapat menjadi model atau prekursor dalam penemuan obat

baru (Samuelsson, 1999). Untuk memperoleh antibiotik baru perlu dilakukan

pencarian sumber penghasil antibiotik (Suwandi, 1989). Oleh karena itu,

eksplorasi mikrobia endofit potensial merupakan alternatif untuk mendapatkan

senyawa antibiotik baru. (Simanjuntak, dkk, 2004).

1. Permasalahan

Dari latar belakang yang telah diuraikan di atas, permasalahan yang

muncul dalam penelitian ini adalah :

a. Apakah bakteri endofit dapat diisolasi dari batang A.annua L. ?

b. Apakah senyawa yang dihasilkan bakteri endofit yang diisolasi dari batang

A.annua L. mempunyai potensi antibakteri terhadap E.coli dan S.aureus ?

c. Bagaimana identitas bakteri endofit penghasil senyawa antibakteri

terhadap E.coli dan S.aureus tersebut ?

2. Keaslian Penelitian

Sejauh penelusuran pustaka dan jurnal belum pernah dilakukan penelitian

tentang isolasi dan identifikasi bakteri endofit dari batang tanaman A.annua L.

yang mempunyai potensi antibakteri terhadap E.coli dan S aureus. Penelitian

isolasi dan identifikasi bakteri endofit dari batang tanaman A annua L yang

mempunyai potensi antibakteri terhadap E.coli dan S.aureus dilakukan

bersama dengan Rachmawati (2007). Perbedaan dari penelitian bersama ini

adalah digunakan bakteri uji yang berbeda, di mana Rachmawati (2007)


4

menggunakan bakteri uji Bacillus subtilis dan Salmonella thypii.

3. Manfaat penelitian

a. Manfaat teoritis

Penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi tentang

senyawa yang dihasilkan bakteri endofit yang diisolasi dalam batang

A.annua L. yang memiliki potensi antibakteri.

b. Manfaat praktis

Penelitian ini diharapkan dapat menemukan isolat bakteri endofit

penghasil senyawa antibakteri yang dapat mendukung bidang kefarmasian

dan mampu memberikan informasi tentang senyawa antibakteri yang

dihasilkan oleh bakteri endofit sebagai model atau prekursor dalam rangka

penemuan obat baru di masa yang akan datang.

c. Manfaat metodologis

Metode yang digunakan dalam penelitian ini dapat digunakan dan

terus dikembangkan dalam usaha pencarian bakteri endofit penghasil

senyawa antibakteri.

B. Tujuan Penelitian

Penelitian ini bertujuan untuk:

1. Mengisolasi bakteri endofit dalam batang A.annua L.

2. Menguji potensi senyawa yang dihasilkan bakteri endofit yang diisolasi dari

batang A.annua L. terhadap E.coli dan S.aureus.

3. Mengetahui identitas bakteri endofit penghasil senyawa antibakteri terhadap

E.coli dan S.aureus tersebut.


BAB II

PENELAAHAN PUSTAKA

A. Antibiotik

Antibiotik didefinisikan sebagai produk metabolit yang dihasilkan oleh

organisme tertentu, yang dalam konsentrasi rendah bersifat merusak atau

menghambat mikrobia lain. Dengan kata lain, antibiotik merupakan zat kimia

yang dihasilkan oleh suatu mikrobia yang dapat menghambat mikrobia lain

(Pelczar & Chan, 1988)

Antibiotik adalah zat-zat kimia yang dihasilkan oleh fungi dan bakteri,

yang mempunyai khasiat mematikan atau menghambat pertumbuhan mikrobia,

sedangkan toksisitasnya bagi manusia relatif kecil. Turunan zat tersebut yang

dibuat secara semi-sintetis termasuk kelompok ini, begitu pula senyawa sintesis

dengan khasiat antibakteri lazimnya disebut antibiotik (Pelczar & Chan, 1988).

Terjadinya resistensi mikrobia yang tadinya peka terhadap antibiotika

dapat terjadi melalui mutasi pada kromosomnya atau pertukaran materi genetik di

antara mikrobia. Pertukaran materi kromosomal sangat jarang, yang banyak

terjadi adalah pertukaran materi genetik ekstrakromosomal, baik berupa plasmid

konjugatif ataupun plasmid non konjugatif. Secara biokimiawi, resistensi bakteri

terhadap antibiotika dapat terjadi melalui mekanisme: (i). Berkurangnya

permeabilitas mikrobia terhadap obat, (ii). inaktifasi antibiotika oleh enzim yang

dihasilkan bakteri, (iii). modifikasi reseptor obat, (iv). meningkatnya sintesa

senyawa yang antagonistik terhadap obat (Sjahrurachman, 1996)


6

Resistensi mikrobia terhadap antibiotika akibat perubahan permeabilitas

dapat terjadi akibat perubahan pada reseptor obat, penurunan kapasitas transpor

obat dan perubahan struktur dinding sel. Mekanisme ini merupakan mekanisme

tersering dalam hal resistensi terhadap tetrasiklin dan sulfonamida. Resistensi

bakteri karena modifikasi obat secara enzimatik banyak ditemukan terhadap

antibiotika beta-laktam, kloramfenikol dan aminoglikosida. Enzim-enzim yang

memodifikasi antibiotika tersebut dapat disandi oleh gen kromosom maupun gen

ekstrakromosom, misalnya pada Staphylococcus yang resisten terhadap penisilin

G, menghasilkan β laktamase yang merusak obat tersebut (Jawetz dkk, 1996).

Resistensi bakteri terhadap antibiotika karena perubahan reseptor dapat ditemukan

pada resistensi terhadap streptomisin. Telah diketahui bahwa pada bakteri yang

resisten, ribosomnya berbeda dibandingkan dengan bakteri yang sensitif terhadap

streptomisin. Hal ini disebabkan terjadinya mutasi noktah satu asam amino pada

ribosom 30S. Dampak klinis resistensi tipe ini tidak begitu penting karena sifatnya

tidak menyebar. Contoh lain resistensi jenis ini adalah resistensi terhadap penisilin

pada bakteri Neisseria gonorrhoeae sebagai akibat perubahan pada penicillin

binding protein (PBP) (Sjahrurachman, 1996).

Bahan-bahan alam telah sejak lama digunakan untuk pengobatan. Bahan

alam meliputi segala organisme seperti tanaman, hewan, dan mikroorganisme.

Obat-obat modern yang digunakan pada masa kini sekitar 40 persennya berasal

dari bahan-bahan alam. Obat-obatan dari bahan alam tersebut termasuk juga jenis

obat-obat penting seperti glikosida jantung, morfin, dan antibiotik. Beberapa jenis

antibiotik merupakan turunan dari bahan-bahan alam yang struktur kimianya telah


7

dimodifikasi untuk menghasilkan senyawa dengan efek farmakologis yang

diinginkan (Samuelsson, 1999).

B. Mikrobia Endofit

Mikrobia endofit adalah mikrobia yang hidup di dalam jaringan tanaman

pada periode tertentu dan mampu hidup dengan membentuk koloni dalam jaringan

tanaman tanpa membahayakan inangnya (Radji, 2005). Mikrobia endofit tumbuh

di jaringan vaskular dari tanaman inangnya (Stone et al, 2000). Jaringan vaskular

(pembuluh) terdapat di seluruh tubuh tanaman, mengangkut zat-zat antara akar

dan tunas (Campbell, Reece, Mitchell, 2002). Setiap tanaman tingkat tinggi dapat

mengandung beberapa mikrobia endofit yang mampu menghasilkan senyawa

biologi atau metabolit sekunder yang diduga sebagai akibat transfer genetik

(genetic recombination) dari tanaman inangnya ke dalam mikrobia endofit (Tan &

Zou, 2001).

Kemampuan mikrobia endofit memproduksi senyawa metabolit sekunder

sesuai dengan tanaman inangnya merupakan peluang yang sangat besar dan dapat

diandalkan untuk memproduksi metabolit sekunder dari mikrobia endofit yang

diisolasi dari tanaman inangnya tersebut (Radji, 2005). Dari sekitar 300.000 jenis

tanaman yang tersebar di muka bumi ini, masing-masing tanaman mengandung

satu atau lebih mikrobia endofit yang terdiri dari bakteri atau fungi (Strobel &

Daisy, 2003). Sehingga apabila endofit yang diisolasi dari suatu tanaman obat

dapat menghasilkan metabolit sekunder sama dengan tanaman aslinya atau

bahkan dalam jumlah yang lebih tinggi, maka kita tidak perlu menebang tanaman


8

aslinya untuk diambil sebagai simplisia, yang kemungkinan memerlukan waktu

yang relatif lama untuk dipanen (Radji, 2005).

Mikrobia endofit meningkatkan adaptasi ekologi inangnya dengan

menaikkan toleransi mereka pada “stress” lingkungan (lingkungan yang kurang

menguntungkan) dan juga menaikkan resistensi inangnya terhadap fitopatogen

dan atau herbivora termasuk serangga yang memakan tanaman inang. Mikrobia

endofit juga dapat melindungi inangnya dari serangan bakteri atau fungi patogen

dari lingkungan disekitarnya (Tan & Zou, 2001).

Berbagai jenis mikrobia endofit telah berhasil diisolasi dari tanaman

inangnya, dan telah berhasil dibiakkan dalam medium pembenihan yang sesuai.

Demikian pula metabolit sekunder yang diproduksi oleh mikrobia endofit tersebut

dapat diisolasi dan dimurnikan serta dielusidasi struktur molekulnya (Radji,

2005).

Beberapa penelitian terkait dengan mikrobia endofit yang berpotensi

sebagai antibiotik telah dilakukan. Cryptocandin adalah antifungi yang dihasilkan

oleh mikrobia endofit Cryptosporiopsis quercina yang berhasil diisolasi dari

tanaman obat Tripterigeum wilfordii, dan berkhasiat sebagai antifungi yang

patogen terhadap manusia yaitu Candida albicans dan Trichopyton spp. (Strobel,

Miller, Miller, Condron, Teplow, & Hess, 1999). Phomopsiahalasin merupakan

metabolit yang diisolasi dari mikrobia endofit Phomopsis spp.berkhasiat sebagai

antibakteri Bacillus subtilis, Salmonella enterica, Staphylococcus aureus, dan

dapat juga menghambat pertumbuhan fungi Candida tropicalis (Horn, Simmonds,

Schartz, & Blaney, 1995). Antibiotik berspektrum luas yang disebut munumbicin


9

dihasilkan oleh endofit Streptomyces spp. strain NRRL 30562 yang merupakan

endofit yang diisolasi dari tanaman Kennedia nigriscans, dapat menghambat

pertumbuhan Bacillus anthracis dan Mycobacterium tuberculosis yang

multiresisten terhadap berbagai obat anti TBC (Castillo et al, 2002).

Ditinjau dari hubungan tersebut, mikrobia endofit berpotensi untuk

digunakan pada pengobatan modern, pertanian, dan industri. Fungi dan bakteri

adalah mikrobia yang paling umum membentuk koloni pada jaringan tanaman,

yang selanjutnya disebut mikrobia endofit (Strobel & Daisy, 2003). Endofit

umumnya tidak ditemukan pada organ yang spesifik tetapi kebanyakan spesies

mikrobia endofit diisolasi dari batang dan juga dari daun (Anonim, 2005).

Untuk mengidentifikasi suatu jenis mikrobia perlu dilakukan isolasi

untuk memperoleh biakan murni. Menurut Pelczar & Chan (1986) setiap koloni

yang berlainan mewakili macam mikrobia yang berbeda sehingga hal ini dapat

digunakan untuk melakukan isolasi suatu mikrobia. Untuk mengisolasi mikrobia

di bawah kondisi laboratorium perlu disediakan nutrien dan kondisi fisik yang

akan memenuhi persyaratan tipe mikrobia tertentu yang sedang ditelaah. Sejalan

dengan hal tersebut, berbagai macam medium digunakan di dalam mikrobiologi,

dikombinasikan dengan berbagai kondisi fisik untuk inkubasi (Pelczar & Chan,

1986).

Banyak prosedur untuk isolasi mikrobia endofit yang relatif mudah dan

biasa digunakan oleh orang yang terlatih dalam dasar teknik mikrobiologi. Setiap

tanaman tingkat tinggi dapat mengandung beberapa mikrobia endofit. Endofit

tidak menunjukkan tanda- tanda keberadaan mereka sehingga sulit dideteksi dan


10

hanya dapat diteliti dengan menggoreskan secara hati- hati permukaan jaringan

yang telah dibersihkan dengan etanol dan NaOCl (pemutih). Penambahan dan

waktu untuk pencelupan dalam NaOCl beragam sesuai dengan jaringan dari inang

(Anonim, 2005).

Mikrobia endofit dapat diisolasi dari permukaan jaringan tanaman yang

telah dibersihkan dan ditumbuhkan pada medium pertumbuhan yang sesuai. Pada

isolasi mikrobia endofit, diperlukan medium yang dapat menyokong pertumbuhan

tanaman inang bakteri endofit (Mucciarelli, Scannerini, Bertea, & Maffei, 2001).

Medium Murashige-Skoog (MS) merupakan medium yang digunakan untuk

hampir semua macam tanaman karena mengandung konsentrasi garam-garam

mineral yang tinggi dan senyawa N dalam bentuk NO3- dan NH4+ (Hendaryono,

1994). Jaringan tanaman yang dikultur memerlukan unsur hara makro dan unsur

hara mikro dari dalam medium tumbuh, dari dalam medium kultur juga harus ada

bahan-bahan lain yang berguna untuk merangsang pertumbuhan serta

perkembangan sel jaringan yang dikulturkan. Pemisahan eksplan dari tanaman

induk menyebabkan perubahan biosintesa dalam tanaman tersebut, sehingga

pemberian unsur hara kedalam medium kultur untuk membantu eksplan supaya

dapat tumbuh dan berkembang. Bahan-bahan itu adalah bahan organik yang

meliputi karbohidrat, vitamin, asam amino, serta zat yang mengatur pertumbuhan

(Katuuk, 1989)

C. Artemisia annua L.

Tanaman A.annua termasuk Familia Asteraceae ; Genus Artemisia ;

Spesies Artemisia annua L. Mempunyai nama daerah : Anuma (Irian Jaya);


11

Anuma (Jawa) (Anonim, 1999)

Tanaman A.annua L. merupakan terna semusim, tinggi 30–100 cm.

Batang tegak, bulat persegi, berwarna hijau kecoklatan. Daun majemuk, bentuk

oval, lonjong, panjang 10-18 cm, lebar 6-15 cm, ujung runcing, pangkal tumpul,

anak daun bentuk oval, tepi bergerigi, pertulangan daun tegas, warna ungu

kehijauan, hijau. Bunga majemuk, bentuk tandan, terletak di ujung batang,

panjang mencapai 30 cm, kelopak hijau, bentuk bintang, berlekuk lima, mahkota

halus mengelilingi cawan bunga tempat benang sari dan putik, diameter 2-3 mm,

warna putih gading. Biji berbentuk lanset, kecil, berwarna coklat. Akar serabut,

berwarna putih kekuningan. Bagian daun dari tanaman A.annua L. biasa

digunakan sebagai obat demam (anti piretik) dan dapat juga digunakan sebagai

obat anti malaria. Kandungan kimia dari tanaman A.annua L. yaitu saponin,

flavonoida, polifenol, dan minyak atsiri (Anonim, 1999).

A.annua L. adalah tumbuhan obat berupa perdu berasal dari Cina. Di

Cina tumbuhan ini disebut qinghao. Di Amerika Serikat tumbuhan ini dikenal

dengan nama sweet annie atau wormwood. Sejak zaman dulu, menurut catatan

“Chinese Handbook of Prescriptions for Emergency Treatments,” yang dicetak

tahun 340 sebelum Masehi, orang Cina menggunakannya untuk mengobati

demam (Anonim, 2005).

Minyak atsiri yang dihasilkan tanaman Artemisia annua L diketahui

dapat menghambat dengan baik pertumbuhan bakteri Gram Positif Enterococcus.

Kandungan minyak atsiri dari A.annua L meliputi camphor (44%), germacrene D

(16%), trans-pinocarveol (11%), beta-selinene (9%), beta-caryophyllene (9%) and


12

artemisia ketone (3%) (Juteau, Masotti, Bessiere, Dherbomez, & Viano, 2002).

Minyak tersebut merupakan metabolit sekunder yang kaya akan senyawa

terpenoid. Contoh umum terpenoid adalah methanol, camphor (monoterpen),

famesol, dan artemisinin (sesquiterpenoid). Artemisinin dan derivatifnya alpha-

arteether digunakan sebagai antimalaria. Terpen atau terpenoid aktif terhadap

bakteri, fungi, virus, dan protozoa. Mekanisme kerja terpen belum diketahui

dengan baik dan dispekulasi terlibat dalam perusakan membran sel oleh senyawa

lipofilik (Anonim, 2005). Pada tanaman A.annua L ini diketahui bahwa ada

mikrobia endofit yang membentuk koloni dalam jaringan pada daerah batang

sampai akar, dari hasil identifikasi diketahui bahwa mikrobia tersebut adalah

Bacillus polymixa (Simanjuntak dkk, 2004). Mikrobia endofit dapat memproduksi

senyawa metabolit sekunder sesuai dengan tanaman inangnya. Dari hasil

penelitian Simanjuntak (2004), diketahui bahwa mikrobia endofit (Bacillus

polymixa) hasil isolasi dari tanaman A.annua L dapat memproduksi senyawa

antimalaria artemisinin.

D. Rekombinasi Genetik

Setiap tanaman tingkat tinggi dapat mengandung beberapa mikrobia

endofit yang mampu menghasilkan senyawa biologi atau metabolit sekunder yang

diduga sebagai akibat terjadinya transfer genetik (genetic recombination) dari

tanaman inangnya ke dalam mikrobia endofit (Tan & Zou, 2001).

Transfer DNA atau perpindahan DNA ke dalam bakteri endofit dari

tanaman Artemisia annua L. diduga melalui cara transformasi. Transformasi

merupakan pengambilan DNA oleh bakteri dari lingkungan di sekelilingnya.


http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=pubmed&cmd=Search&itool=pubmed_Abstract&term=%22Bessiere+JM%22%5BAuthor%5Dhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=pubmed&cmd=Search&itool=pubmed_Abstract&term=%22Dherbomez+M%22%5BAuthor%5Dhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=pubmed&cmd=Search&itool=pubmed_Abstract&term=%22Viano+J%22%5BAuthor%5D

13

DNA yang berada di sekitar bakteri (DNA asing) dapat berupa potongan DNA

atau fragmen DNA yang berasal dari sel bakteri lainnya atau organisme lainnya.

DNA yang masuk ke dalam sel bakteri selanjutnya dapat berintegrasi dengan

DNA bakteri sehingga terbentuk DNA rekombinan (Tjahjoleksono, 2005).

Proses transfer genetik ini melibatkan juga enzim restriksi, enzim restriksi

adalah enzim yang dapat memotong molekul DNA pada lokasi-lokasi spesifik

yang jumlahnya terbatas, potongan molekul DNA ini disebut fragmen restriksi.

Fragmen restriksi berupa fragmen DNA untai-ganda dengan sedikitnya satu ujung

untai-tunggal, yang disebut ujung lengket (Campbell et al, 2002). Ujung lengket

plasmid bakteri endofit akan berpasangan dengan ujung lengket yang

berkomplementer dari fragmen DNA A.annua L sehingga didapatkan plasmid

rekombinan. Sel bakteri endofit kemudian mengambil plasmid rekombinan

dengan mekanisme transformasi. Transformasi merupakan pengambilan DNA

oleh bakteri dari lingkungan di sekelilingnya. DNA yang berada di sekitar bakteri

(DNA asing) dapat berupa potongan DNA atau fragmen DNA yang berasal dari

sel bakteri lainnya atau organisme lainnya (Tjahjoleksono,2005). Menurut Radji

(2005), kemampuan bakteri endofit dalam memproduksi senyawa metabolit

sekunder yang sesuai dengan tanaman inangnya merupakan suatu koevolusi

antara bakteri endofit dengan tanaman inangnya. Koevolusi adalah pengaruh

mutual pada evolusi dari dua spesies berbeda yang berinteraksi satu sama lain dan

yang secara timbal balik saling mempengaruhi adaptasi masing-masing (Campbell

et al, 2002).


14

E . Bakteri Uji

Pewarnaan Gram memilahkan bakteri menjadi kelompok Gram-positif

dan Gram-negatif. Bakteri Gram-positif berwarna ungu karena tetap mengikat

kompleks zat warna kristal violet-yodium meskipun diberi larutan pemucat

(alkohol 95%). Bakteri Gram-negatif berwarna merah karena kompleks kristal

violet-yodium larut sewaktu pemberian larutan pemucat, dan dapat diwarnai oleh

cat lawan yang berwarna merah (Lay, 1994). Dalam penelitian ini, bakteri yang

digunakan sebagai bakteri uji bersifat gram positif yaitu Staphylococcus aureus

dan sebagai gram negatif adalah Eschericia coli.

1. Eschericia coli

E.coli merupakan bakteri gram negatif yang berbentuk batang lurus,

bergerak dengan flagel atau tidak dapat bergerak, mudah tumbuh dengan

pembenihan sederhana. Pada pembiakan, E.coli membentuk koloni bulat

konveks, halus, dan pinggir-pinggir nyata (Jawetz et al, 1986). E.coli

termasuk dalam genus Eschericia, dengan ciri berukuran 1,1-1,5 μm x 2,0-6,0

m, bersifat fakultatif anaerob, tumbuh dengan optimal pada suhu 37μ 0 C.

Memberikan reaksi negatif untuk tes oksidase, hidrolisis urea, tes H2S, dan tes

sitrat, mereduksi nitrat, memberikan reaksi positif untuk tes katalase dan tes

Methylen Red (Holt et al, 2000).

E.coli adalah anggota flora usus normal, umumnya tidak menyebabkan

penyakit bila masih dalam usus. E.coli dapat menyebabkan penyakit bila telah

mencapai jaringan di luar tractus digestivus, seperti saluran kemih, saluran

empedu, paru-paru, peritoneum, dan selaput otak (Jawetz et al, 1996).


15

E.coli adalah penyebab yang paling lazim dari infeksi saluran kemih dan

merupakan penyebab infeksi saluran kemih pertama pada kira-kira 90%

wanita muda. E.coli yang menyebabkan diare sangat sering ditemukan di

seluruh dunia, dan diklasifikasikan oleh ciri khas sifat-sifat virulensinya

(Jawetz et al, 1996).

Bila pertahanan inang normal tidak mencukupi, E.coli dapat memasuki

aliran darah dan menyebabkan sepsis. E.coli merupakan penyebab meningitis

pada bayi, dan E.coli merupakan penyebab pada sekitar 40% kasus meningitis

neonatal (Jawetz et al, 1996).

2. Staphylococcus aureus

S.aureus adalah jenis bakteri yang berbentuk bulat, berdiameter kurang

lebih 1 m, hidup bergerombol seperti buah anggur. Berdasar pengecatan

gram, S.aureus termasuk gram positif yang ditunjukkan dengan warna ungu.

S.aureus mempunyai ciri dapat memfermentasi manitol yang dapat

memberikan warna kuning keemasan pada tes biokimiawi, memberi reaksi

positif terhadap reaksi katalase dan koagulasi (Jawetz et al, 1996).

μ

S.aureus termasuk dalam genus Staphylococcus yang mempunyai ciri non

motil, tidak mempunyai spora, dan bersifat fakultatif anaerob. Koloni dari

Staphylococcus tidak tembus cahaya (opaque), berwarna putih atau krem, dan

kadang berwarna kuning sampai orange, memberi reaksi negatif pada tes

oksidasi, mereduksi nitrat menjadi nitrit. Staphylococcus sering ditemukan

pada produk makanan, sampah, dan air (Holt et al, 2000).

S.aureus sering menghemolisis darah dan mengkoagulasi plasma, densitas


16

kolonisasi antara lain pada kulit dan selaput lendir manusia, juga menginfeksi

berupa bisul, impetigo, dan infeksi luka yang menimbulkan nanah (Jawetz et

al, 1996).

Pada suhu 300C pertumbuhannya sangat cepat, sedangkan pembentukan

pigmen terbaik pada suhu 200C. Koloni pada pembenihan padat berbentuk

bulat, halus, menonjol, dan berkilauan, membentuk pigmen warna kuning.

S.aureus dapat menjadi resisten terhadap banyak zat antimikrobia dan

menyebabkan masalah pengobatan menjadi sulit. Penanahan setempat adalah

kekhususan infeksi S.aureus (Trihendrokesowo, 1986).

F. Metode Pengujian Potensi Senyawa Antimikrobia

Potensi antimikrobia dapat ditetapkan dengan berbagai cara antara lain :

1. Metode Difusi

Cara ini berdasarkan kemampuan obat untuk berdifusi dalam medium

tempat mikrobia dapat berkembang biak secara optimal. Disk antibiotik

diletakkan di atas agar atau bila dengan metode sumuran antibiotik

dimasukkan dalam sumuran. Besarnya daerah difusi tergantung dengan

daerah pertumbuhan atau hambatan mikrobia uji dan sebanding dengan

kadar obat yang diberikan. Pada pelaksanaannya, metode difusi ada

beberapa cara, yaitu:

a. Cara Kirby Bouwer

Cara ini dilakukan dengan cara menggoreskan suspensi mikrobia

tertentu, umumnya 106 Colony Forming Unit (CFU) per-ml pada

permukaan medium hingga merata. Kertas disk yang mengandung


17

antibiotik diletakkan di atas medium lalu diinkubasikan pada suhu

37oC selama 18-24 jam, setelah itu dibaca hasilnya. Cara ini dikenal 2

macam zona, yaitu:

1). Zona radikal adalah suatu daerah di sekitar disk yang sama sekali

tidak ditemukan adanya pertumbuhan mikrobia.

2). Zona irradikal adalah suatu daerah disekitar disk yang

menunjukkan pertumbuhan mikrobia yang dihambat oleh

antibiotik tersebut tetapi tidak dimatikan (Hugo & Russel, 1987;

Anonim, 1986).

b. Cara paper disc

Cara ini adalah cara yang paling banyak digunakan untuk

menentukan kepekaan mikrobia terhadap berbagai macam obat-obatan.

Cara ini menggunakan cakram kertas saring atau tablet yang

mengandung suatu obat dengan kekuatan tertentu yang diletakkan pada

lempeng agar yang telah ditanami mikrobia yang akan diperiksa.

Hambatan akan terlihat sebagai daerah yang tidak memperlihatkan

adanya pertumbuhan mikrobia di sekitar cakram. Lebar hambatan ini

tergantung pada daya resap obat ke dalam agar dan kepekaan mikrobia

terhadap obat tersebut.

Hasil dibaca setelah inkubasi selama 18-24 jam. Pada keadaan

tertentu mungkin dapat dilakukan pembacaan pendahuluan setelah

inkubasi selama 6-8 jam, untuk menguatkan kemudian diulang setelah

18-24 jam. Daerah hambatan diukur dalam satuan milimeter, dengan


18

mengukur seluruh garis tengah hambatan dan cakram (Bonang &

Koeswardono, 1982).

c. Cara sumuran

Penyiapan dilakukan seperti cara Kirby Bouwer. Setelah biakan

siap, dibuat sumuran dengan diameter tertentu dan tegak lurus terhadap

permukaan agar, ke dalam sumuran diteteskan larutan uji lalu

diinkubasi selama 24 jam 37oC, setelah itu hasilnya dibaca seperti cara

Kirby Bouwer (Hugo & Russel, 1987).

2. Metode dilusi

Metode ini menggunakan senyawa anti mikrobia dengan kadar

menurun secara bertahap, baik dengan medium cair atau padat. Kemudian

medium diinokulasikan mikrobia uji dan diinkubasi. Tahap akhir dilarutkan

senyawa antimikrobia dengan kadar yang menghambat atau mematikan.

Pada uji kepekaan cara dilusi agar memakan waktu dan penggunaannya

dibatasi pada keadaan tertentu saja. Uji kepekaan cara dilusi cair dengan

menggunakan tabung reaksi, tidak praktis dan jarang dipakai, namun kini

ada cara yang sederhana dan banyak dipakai yakni menggunakan

microdilution plate. Keuntungan mikrodilusi cair adalah bahwa uji ini

memberi hasil kuantitatif yang menunjukkan jumlah antimikrobia yang

dibutuhkan untuk mematikan mikrobia uji (Jawetz et al ,2001).

G. Identifikasi Mikrobia

Untuk identifikasi dan determinasi suatu biakan murni suatu mikrobia

hasil isolasi perlu ditentukan morfologi sel individual, morfologi koloni, dan sifat-


19

sifat biokimianya (fisiologi), patogenisitas dan serologinya (Jutono, Soedarsono,

Hartadi, Kabirun, Suhadi & Soesanto,1980)

Pada identifikasi mikrobia mula-mula diamati morfologi individual

secara mikroskopik dan pertumbuhannya pada berbagai medium. Karena suatu

bakteri tidak dapat dideterminasi hanya berdasar sifat-sifat morfologinya saja,

maka perlu diteliti pula sifat-sifat biokimia dan faktor-faktor yang mempengaruhi

pertumbuhannya. Mikrobia yang morfologinya sama mungkin berbeda dalam

kebutuhan nutrisi serta persyaratan ekologi lainnya (temperatur, pH, dan

sebagainya). Patogenesis mikrobia patogen dapat dipakai untuk membantu

identifikasi dan determinasi bakteri tersebut. Apabila suatu bakteri memiliki sifat

yang hampir sama (terutama yang patogen), maka perlu diselidiki sifat ekologinya

(Jutono dkk,1980).

Untuk determinasi bakteri digunakan buku panduan baku determinasi

oleh Holt et al (2000), yang memuat sifat-sifat bakteri yang telah dikenal.

1. Sifat Morfologi

a. Morfologi sel individual, meliputi :

1) Ukuran, bentuk, dan rangkaian sel.

2) Ada tidaknya spora dan kedudukan spora.

3) Ada tidaknya flagella, kedudukan dan jumlah flagella.

4) Ada tidaknya kapsula.

5) Reaksi- reaksi pengecatan.

b. Morfologi koloni, meliputi : pertumbuhan, bentuk, ukuran, tekstur, bau,

konsistensi, kilat dan ciri- ciri optik dari isolat koloni bakteri pada


20

beberapa tipe medium yaitu medium agar miring, tegak dan cair. Pada

medium agar miring koloni bakteri diinokulasikan sepanjang agar secara

goresan dengan ose, pada medium agar tegak koloni bakteri

diinokulasikan secara tusukan, dan pada medium cair koloni bekteri

diinokulasikan langsung pada medium (Jutono dkk, 1980).

2. Sifat Biokimia

Pengujian sifat biokimia meliputi :

a. Pembentukan asam sulfida (H2S)

Uji ini bertujuan untuk menunjukkan adanya pembentukan H2S pada

medium TSIA (Triple Sugar Iron Agar) (Jutono dkk, 1980).

b. Dekarboksilase lisin

Uji ini bertujuan menunjukkan kemampuan bakteri dalam

mendekarboksilasi berbagai asam amino (Lay, 1994).

c. Pembentukan Indol

Uji pembentukan Indol menunjukkan adanya indol dan triptofan (Jutono

dkk, 1980).

d. Uji Methylen Red (MR)

Uji Methylen Red digunakan untuk menentukan adanya fermentasi asam

campuran (Lay, 1994).

e. Uji Sitrat

Uji sitrat digunakan untuk melihat mikrobia menggunakan sitrat sebagai

satu- satunya sumber karbon dan energi. Digunakan medium Simmon-

sitrat berupa medium padat (Lay, 1994).


21

f. Uji katalase

Katalase adalah enzim yang mengkatalisasikan penguraian hidrogen

peroksida ( H2O2 ) menjadi air dan O2. Pada bakteri yang bersifat

katalase-positif terlihat pembentukan gelembung udara sekitar koloni

(Lay, 1994)

g. Tes oksidase

Uji ini berfungsi untuk menentukan adanya oksidase sitokrom yang

ditemukan pada mikrobia tertentu (Lay, 1994).

h. Uji pencairan gelatin

Gelatin adalah protein yang diperoleh dari tulang, tulang rawan atau

tenunan ikat hewani lainnya. Hidrolisis gelatin oleh mikrobia tersebut

dikatalisis oleh eksoenzim yang disebut gelatinase. Gelatin yang dicerna

tidak mampu membentuk gel dan bersifat cair (Lay, 1994).

i. Uji oksidasi fermentasi (OF)

Uji ini bertujuan untuk menentukan kemampuan mikrobia untuk

memetabolisme karbohidrat secara oksidasi atau fermentasi (Lay, 1994).

H. Keterangan Empiris

Setiap tanaman tingkat tinggi dapat mengandung beberapa mikrobia

endofit yang mampu menghasilkan senyawa biologi atau metabolit sekunder yang

diduga sebagai transfer genetik (genetic recombination) dari tanaman inangnya ke

dalam mikrobia endofit (Tan & Zou, 2001).

A.annua L. telah diketahui merupakan tanaman yang menjadi inang

untuk mikrobia endofit, pada tanaman ini diketahui bahwa ada suatu spesies


22

bakteri yang membentuk koloni dalam jaringan pada daerah batang sampai akar

(Simanjuntak, dkk, 2004). Selain itu minyak essensial yang dihasilkan tanaman

A.annua L. juga diketahui menunjukkan aktivitas antibiotik (Juteau et al, 2002).

Bahan-bahan alam yang berpotensi sebagai obat dapat menjadi model atau

prekursor dalam penemuan obat baru (Samuelsson, 2000). Untuk memperoleh

antibiotik baru perlu dilakukan pencarian sumber penghasil antibiotik (Suwandi,

1989). Oleh karena itu, eksplorasi mikrobia endofit potensial merupakan alternatif

untuk mendapatkan senyawa antibiotik baru. (Simanjuntak, dkk, 2004).

Pengujian potensi antibakteri dari senyawa antibakteri dalam medium

produksinya dilihat dengan mengukur diameter zona hambat. Data untuk

identifikasi isolat bakteri endofit tersebut berupa data-data morfologi koloni,

morfologi sel, dan sifat-sifat biokimianya. Data hasil identifikasi bakteri endofit

kemudian dideterminasi dengan buku panduan determinasi bakteri (Holt et al,

2000) untuk mengetahui genus dari bakteri endofit yang diisolasi dari tanaman

A.annua L tersebut. Penelitian ini ditujukan untuk mengisolasi dan

mengidentifikasi bakteri endofit dari batang tanaman A.annua L, dan untuk

menguji potensi isolat bakteri endofit dari tanaman A.annua L terhadap E.coli

dan S.aureus.


BAB III

METODOLOGI PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian ini termasuk jenis penelitian eksperimental murni dan bersifat

eksploratif-deskriptif. Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Mikrobiologi,

Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma.

B. Variabel dan Definisi Operasional

1. Variabel penelitian

a. Variabel bebas : senyawa antibakteri yang dihasilkan bakteri endofit

yang diisolasi dari batang tanaman A. annua L.

b. Variabel tergantung : diameter zona hambat (mm).

c. Variabel pengacau terkendali : waktu inkubasi 24, 48, 72, 120 jam, suhu

inkubasi 370C; medium kultur tanaman inang yaitu MS (Murashige-

Shoog) medium; medium isolasi bakteri endofit, medium pemeliharaan

bakteri endofit, E.coli, dan S.aureus yaitu NA (Nutrient Agar); medium

produksi senyawa antibakteri yang dihasilkan bakteri endofit yaitu NB

(Nutrient Broth); batang tanaman A.annua L. yang sehat dan berumur 6

bulan; volume isolat bakteri endofit penghasil senyawa antibakteri yang

diinokulasikan dalam paper disk sebanyak 40 μL; volume suspensi E.coli

dan S.aureus setara dengan larutan standar Mc Farland II (6.108 CFU/ml)

sebanyak 1 ml.


24

2. Definisi operasional

a. Artemisia annua L. diperoleh dari Balai Penelitian Tanaman Obat

(BPTO) Tawangmangu dan diketahui bahwa ada suatu spesies bakteri

yang membentuk koloni dalam jaringan vaskular daerah batang sampai

akar tanaman A.annua L. ini.

b. Senyawa antibakteri adalah substansi yang dihasilkan oleh isolat bakteri

endofit dalam tanaman A.annua L. yang mampu menghambat

pertumbuhan atau membunuh E. coli dan S.aureus.

c. Bakteri endofit dari tanaman A.annua L. adalah bakteri yang membentuk

koloni dalam suatu sistem jaringan vaskular dari tanaman A.annua L.

yang dapat ditumbuhkan di MS Medium dan dapat menghasilkan

senyawa yang mempunyai potensi antibakteri terhadap E.coli dan

S.aureus.

d. Potensi antibakteri adalah kemampuan suatu zat atau substansi yang

dihasilkan oleh bakteri endofit dari tanaman A.annua L. yang mampu

menghambat atau mematikan bakteri E.coli dan S.aureus, ditandai

dengan adanya area hambatan di sekitar paper disk.

e. Eshericia coli ATCC 35218 dan Staphylococcus aureus ATCC 25923

dari Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran Universitas

Gadjah Mada, adalah bakteri uji, yaitu bakteri gram negatif dan bakteri

gram positif yang bersifat patogen terhadap manusia.

f. MS (Murashige-Shoog) medium adalah medium kultur tanaman A.annua

L. MS Medium mengandung garam-garam mineral yang cukup lengkap


25

untuk mendukung pertumbuhan eksplan ( batang tanaman A.annua L. )

dan mengandung senyawa nitrogen yang berguna dalam regenerasi sel

eksplan.

C. Bahan dan Alat Penelitian

1. Bahan penelitian

a. Tanaman Artemisia annua L. diperoleh dari Balai Penelitian Tanaman

Obat (BPTO) Tawangmangu dan berumur 6 bulan.

b. Biakan murni Eschericia coli ATCC 35218 dan Staphylococcus aureus

ATCC 25923 dari Laboratorium Mikrobiologi Fakultas Kedokteran

Universitas Gadjah Mada.

c. Medium kultur tanaman A.annua L yaitu MS (Murashige-Shoog)

medium dengan komposisi : NH4NO3, KNO3, CaCl2.2H2O,

MgSO4.7H2O, KH2PO4, unsur hara mikro, sukrosa, agar, vitamin,

hormon BAP dan 2,4 Diklorofenoksi Asetat, FeSO4.7H2O dan Na2

EDTA,

d. Medium isolasi bakteri endofit yaitu Nutrien Agar (Oxoid) takaran 28g/L

dengan komposisi (g/L) : “Lab-lemco” powder 1,0; yeast extract 2,0;

peptone 5,0; sodium chloride 5,0 agar 15,0.

e. Medium produksi senyawa anti bakteri yaitu medium Nutrient Broth

(Oxoid) takaran 37 g/L dengan komposisi (g/L) : “Lab-lemco” powder

1,0; yeast extract 2,0; peptone 5,0; sodium chloride 5,0.

f. Medium pemeliharaan E. coli, S. aureus, bakteri endofit dan medium

identifikasi bakteri endofit :


26

1) Nutrien Agar (Oxoid) takaran 28g/L dengan komposisi (g/L) : “Lab-

lemco” powder 1,0; yeast extract 2,0; peptone 5,0; sodium chloride

5,0 agar 15,0.

2) Nutrien Broth (Oxoid) takaran 37 g/L dengan komposisi (g/L) : “Lab-

lemco” powder 1,0; yeast extract 2,0; peptone 5,0; sodium chloride

5,0.

g. Bahan untuk uji biokimia :

1) Uji Oksidase : reagens tetramethyl-paraphenyldiamine.

2) Uji Katalase : reagens hydrogen peroksida (H2O2).

3) Uji hydrogen sulfida : medium TSIA (Triple Sugar Iron Agar)

(Oxoid).

4) Uji Dekarboksilasi lisin : medium LIA (Lisin Iron Agar) (Oxoid).

5) Uji Indol : medium peptone water dan reagens Kovac.

6) Uji MR : medium MR – VP (Methyl Red – Voges Proskauer), methyl

red.

7) Uji hidrolisis gelatin : dengan komposisi Nutrient Broth (Oxoid) dan

12% gelatin.

8) Uji Fermentasi karbohidrat : medium O-F (Difco).

9) Uji Sitrat : medium Simmon’s Citrate (Oxoid).

10) Uji Pergerakan mikrobia : Nutrient Broth (Oxoid), 0,2% – 0,4% Agar

Bacteriologycal (Oxoid).


27

h. Bahan untuk pengecatan bakteri :

1) Pengecatan Gram : kristal violet, larutan iodine, alkohol 95%,

safranin.

2) Pengecatan Spora : Malachite green 5%, safranin.

3) Pengecatan Acid Fast : cat Ziehl Neelson Carbolfuchsin, methylen

blue, alkohol 95%.

i. Paper disc dengan diameter 6 mm.

j. Kontrol positif : Amoxicilin untuk injeksi (Danoxilin®)

k. Kontrol negatif yaitu medium Nutrien Broth tanpa inokulasi mikrobia

endofit.

l. Larutan standar Mc Farland II (setara dengan kepadatan bakteri 6.108

CFU/ml).

m. Aquadest steril.

n. Alkohol 70%.

o. Minyak emersi.

p. Sodium hipoklorit (Bayclin) untuk pembersihan batang A.annua L.

q. Tween 80 sebagai wetting agent pada proses pembersihan batang

A.annua L.

2. Alat penelitian

Autoklaf (model KT-40, ALP Co. Ltd. Midorigouka Kamurashi, Tokyo,

Japan), Microbioogical Safety Cabinet (lokal), Inkubator (Memmert, tipe BE

400, Swahabach FRG, Germany), Vortex (Stuart Scientific); Neraca analitik

(Mettler Pc 2000); Sentrifuge (Heraeus Christ); Oven (WTC Binder);


28

Mikroskop cahaya (Olympus Type CH 30); mikropipet (Nichiryo 5000 DG),

Shaker Resiprok (Imorius Utrecht); beker glass (Pyrex), lemari pendingin

(Sharp, Japan), Cawan petri (Pyrex), kaca steril, pisau, botol kultur, Pipet

volume, Pipet tetes, glass firm, Tabung sentrifuge, Tabung reaksi, kaca arloji,

Erlenmeyer, Pinset, lampu spiritus, jarum inokulasi, penggaris, jarum ose, dan

alat- alat gelas.

D. Tahapan Penelitian

1. Determinasi Tanaman Artemisia annua L.

Determinasi tanaman A.annua L. dilakukan oleh Balai Penelitian Tanaman

Obat ( BPTO ), Tawangmangu, Karanganyar, Jawa Tengah, dengan

menggunakan kunci determinasi menurut Backer ( 1968 )

2. Pengumpulan Batang Artemisia annua L.

Sampel batang yang sehat (bagus/ tidak rapuh) tanaman A.annua L. yang

diperoleh dari Balai Penelitian Tanaman Obat ( BPTO ) Tawangmangu,

Karanganyar, Jawa Tengah, dipilih yang telah berumur dewasa, yakni yang

berumur 6 bulan. Sampel yang berupa batang disimpan di dalam kantong

plastik untuk mengurangi penguapan selama perjalanan dan penyimpanan

sementara.

3. Pembuatan MS Medium (Murashige-Shoog Medium)

a. Penimbangan unsur makro

Ditimbang bahan-bahan untuk unsur makro, antara lain : 1,65 g

NH4NO3 ; 1,9 g KNO3 ; 0,44 g CaCl2.2H2O ; 0,37 g MgSO4.7H2O ; 0,17

g KH2PO4.


29

b. Pembuatan larutan stok

1) Pembuatan larutan stok hara mikro

Ditimbang bahan-bahan untuk stok mikro, antara lain : 41,5 mg

kalium iodida; 310,0 mg asam borat; 845,0 mg mangansulfat-

tetrahidrat; 430,0 mg sengsulfat-heptahidrat; 1,25 mg tembaga (II)

sulfat; 12,5 mg natriummolibdat-dihidrat; 1,25 mg kobalt (II) klorida-

heksahidrat.

Masing-masing bahan tersebut dimasukkan satu persatu ke dalam

Beaker Glass 500 ml yang telah diisi dengan 300 ml aquadest, diaduk

hingga larut. Kemudian dipindahkan ke dalam labu ukur 500 ml,

diencerkan dengan aquadest sampai tanda. Untuk 1 liter medium

dibutuhkan 5 ml larutan stok ini.

2) Pembuatan larutan stok besi

Besi (II) sulfat-heptahidrat ditimbang sebanyak 139 mg dan 186,5

mg natrium etilen diamin tetra asetat. Dilarutkan dalam aquadest

masing-masing 15 ml secara terpisah. Untuk natrium etilen diamin

tetra asetat dibantu dengan pemanasan. Setelah larut dicampur dalam

Erlenmeyer dan diaduk rata. Larutan tersebut kemudian dipindahkan

ke dalam labu ukur 50 ml. Erlenmeyer tersebut dibilas dengan sisa

aquadest dan masukkan dalam labu ukur tersebut sampai tanda. Untuk

1 liter medium dibutuhkan 5 ml stok ini.


30

3) Pembuatan larutan stok vitamin

Erlenmeyer diisi dengan 50 ml aquadest, kemudian berturut-turut

dimasukkan 250,0 mg asam nikotinat; 250,0 mg piridoksin; 50,0 mg

tiamin; dan 100,0 mg glisin. Diaduk hingga jernih, kemudian

dipindahkan ke dalam labu ukur 500 ml. Ditambahkan aquadest

sampai tanda. Untuk 1 liter medium membutuhkan 5 ml larutan stok.

4) Pembuatan larutan stok mio-inositol

Ditimbang 10,0 mg mio-inositol, kemudian dimasukkan ke dalam

Beaker Glass satu liter yang terlebih dahulu telah diisi dengan 700 ml

aquadest. Setelah larut, dipindahkan ke dalam labu ukur 1 liter dan

diencerkan dengan aquadest sampai tanda. Untuk 1 liter medium

dibutuhkan larutan stok sebanyak 10,0 ml.

c. Pembuatan MS Medium (Murashige-Shoog Medium)

Aquadest sebanyak kurang lebih 300 ml dipanaskan dalam Beaker

Glass 1000 ml, kemudian bahan- bahan nutrisi makro dimasukkan ke

dalam Beaker Glass, sambil terus diaduk dengan pengaduk stirer.

Selanjutnya berturut-turut dimasukkan 5 ml larutan stok hara mikro; 5 ml

larutan stok besi; 5 ml larutan stok vitamin; serta 10 ml larutan stok mio-

inositol dalam campuran medium. Kemudian dimasukkan campuran 30 g

sukrosa dan 8-10 g agar. Aquadest ditambahkan sampai kurang lebih 1000

ml, diaduk, dan dipanaskan sampai jernih. Setelah jernih dan mendidih,

Beaker Glass diangkat dari pemanas. Zat pengatur tumbuh golongan

sitokinin yaitu BAP (Benzilaminopurin) ditambahkan sebanyak 1 ppm dan


31

medium dibagi menjadi tiga bagian untuk membuat variasi zat pengatur

tumbuh. Kemudian ditambahkan zat pengatur tumbuh auksin (2,4-D). pH

larutan medium diatur 5,2- 5,6. Jika terlalu alkali ditambahkan HCl 1N,

tetapi jika terlalu asam ditambahkan KOH 1N. Larutan medium

dipindahkan ke dalam botol kultur dengan ketebalan medium kurang lebih

satu cm. Botol tersebut kemudian ditutup dengan aluminium foil,

kemudian disterilisasi dengan autoklaf (121 °C, 15 menit). Medium yang

telah disterilkan tersebut selanjutnya disimpan ke dalam inkubator.

4. Desinfeksi Batang Artemisia annua L.

Batang dicuci dengan air mengalir selama ± 5-10 menit. Setelah itu,

batang dicuci dalam 10 ml bayclin (commercial bleaching yang mengandung

5,3% sodium hypokhlorit) dan 20 tetes Tween 80, kemudian bilas dengan

aquadest steril sampai bersih.

5. Penanaman Batang Artemisia annua L. pada MS Medium

Batang tanaman Artemisia annua L. yang telah dibersihkan ditanam secara

aseptis ke dalam MS medium. Penanaman dilakukan dengan menggunakan

pinset steril dan batang yang telah dibersihkan dipotong sepanjang ± 0,5-0,8

cm dan ditanamkan ke permukaan MS medium dengan hati-hati. Penanaman

batang dalam posisi horisontal dengan bekas potongan tertanam di permukaan

MS medium, kemudian diinkubasikan selama 2-3 hari. Setelah inkubasi, akan

tampak pertumbuhan bakteri endofit di sekitar batang A.annua L.


32

6. Isolasi Bakteri Endofit dengan Metode Streak Plate

Setelah didapatkan pertumbuhan bakteri endofit, kemudian dilakukan

isolasi bakteri endofit pada Nutrient Agar dalam cawan petri untuk

mendapatkan biakan murni bakteri endofit. Satu ose mikrobia yang didapat

diinokulasikan pada nutrient agar secara streak plate. Diinkubasikan pada

suhu 37oC selama 24 jam. Akan didapat koloni- koloni bakteri yang terpisah.

Koloni bakteri dari goresan terakhir diinokulasikan secara goresan ke dalam

medium NA miring untuk stok mikrobia.

7. Pengujian Potensi Antibakteri dari Isolat Bakteri Endofit Terhadap E.coli

dan S.aureus Secara Difusi Paper disc

a. Pembuatan Suspensi Bakteri Uji

Diambil ± 1 ose dari stok bakteri uji dari biakan murni E.coli ATCC

35218 dan S.aureus ATCC 25923, kemudian diinokulasikan pada Nutrien

Broth (NB) 9 ml sampai konsentrasi 6 x 108 CFU/ml (Larutan Standar

Mac Farland II).

b. Skrining Bakteri Endofit yang Memiliki Potensi Antibakteri terhadap

E.coli dan S.aureus

Biakan murni bakteri endofit yang diperoleh dari tahap 6 diuji potensi

antibakterinya terhadap E.coli dan S.aureus dengan metode Paper Disc

Agar Diffusion Technique. Biakan bakteri endofit tersebut kemudian

ditumbuhkan dalam medium Nutrient Broth dan digojog menggunakan

shaker inkubator pada suhu 37° C dengan kecepatan 170 rpm selama 3-4

hari. Pemisahan biomassa sel dengan medium Nutrient Broth yang


33

mengandung metabolit sekunder bakteri endofit (supernatan) dilakukan

dengan sentrifugasi pada kecepatan 5000 rpm selama 1 jam, supernatan

dipakai untuk skrining bakteri endofit penghasil senyawa antibakteri.

Sesudah supernatan disiapkan, paper disc steril diinokulasi 40 μl

supernatan. Untuk mengurangi ekses air, paper disc dikeringanginkan di

atas kaca arloji steril selama kurang lebih 1 jam. Mikrobia uji yaitu E.coli

dan S.aureus ditumbuhkan dalam NA secara pour platting pada petri yang

berbeda, yaitu dengan mengambil suspensi bakteri uji E.coli dan S.aureus

sebanyak 1 ml kemudian diinokulasikan ke dalam 20 ml Nutrient Agar

yang sedang mencair pada temperatur 50oC lalu dituang ke dalam cawan

petri dan digoyang perlahan- lahan untuk mencampur kultur bakteri

dengan agar. Setelah agar memadat, paper disc yang telah diinokulasi

supernatan ditempatkan di permukaan medium. Inkubasi dilakukan pada

suhu 37oC selama 24 jam atau sampai terbentuknya zona jernih di sekitar

paper disc. Potensi penghambatan diukur dengan mengukur diameter zona

jernihnya menggunakan penggaris.

8. Identifikasi Bakteri Endofit

a. Morfologi sel

1) Pengecatan Gram

Dibuat pulasan isolat bakteri endofit yang mempunyai potensi

penghambatan paling baik pada tahap 7 dari kultur umur 48 jam,

difiksasi di atas pembakar spiritus. Diteteskan cat kristal violet dan

didiamkan selama 45 detik. Sisa cat dicuci dengan air mengalir lalu


34

ditetesi larutan iodine dan didiamkan selama 1,5 menit. Dicuci dengan

air mengalir dan diberi larutan peluntur safranin, didiamkan selama 20

detik, kemudian dicuci dengan air mengalir, dikeringanginkan.

Diamati dibawah mikroskop dengan perbesaran 1000X dengan

menggunakan minyak immersi. Jika sel bakteri berwarna ungu berarti

isolat bakteri endofit yang diisolasi termasuk bakteri gram positif.

Tetapi jika sel bakteri berwarna merah berarti isolat bakteri endofit

termasuk bakteri gram negatif.

2) Pengecatan Spora


penghambatan paling baik pada tahap 7 dari kultur umur 48 jam dan

difiksasi di atas pembakar spiritus. Ditetesi dengan malachite green

dan dipanasi selama 1 menit. Dicuci dengan air mengalir lalu diberi cat

safranin dan didiamkan selama 30 detik kemudian dicuci di bawah air

mengalir lalu dikeringanginkan dan diamati di bawah mikroskop

dengan perbesaran kuat 1000X dengan minyak immersi. Spora

berwarna hijau dan sel vegetatif berwarna merah.

3) Pengecatan Acid Fast


penghambatan paling baik pada tahap 7 dari kultur umur 48 jam pada

kaca obyek dan difiksasi di atas pembakar spiritus. Lalu ditutup

dengan sepotong kertas filter, ditambah larutan carbolfuchsin dan

dipanaskan di atas pembakar spiritus dengan nyala api kecil.


35

Didinginkan, dicuci dengan air mengalir dan dikeringanginkan. Dicuci

dengan larutan peluntur sambil digoyang- goyangkan sampai seluruh

warna dari carbolfuchsin tidak tampak. Dicuci dengan air mengalir dan

dikeringkan. Setelah itu ditambahkan dengan metylen biru selama 20-

30 detik. Dicuci kembali dan diamati dengan perbesaran kuat 1000X.

Bakteri yang tidak tahan terhadap pencucian asam akan berwarna biru

sedangkan bakteri yang tahan asam akan berwarna merah.

4) Uji pergerakan

Isolat bakteri endofit yang mempunyai potensi penghambatan

paling baik pada tahap 7 dari kultur umur 48 jam diinokulasi dengan

cara tusukan dalam agar tegak dengan kandungan agar 0,2% – 0,4%.

Akan tampak pergerakan bakteri yang berupa serabut- serabut halus

disekitar tusukan, pergerakan bakteri ini disebabkan karena bakteri

memiliki flagela.

b. Morfologi Koloni

Diinokulasikan biakan bakteri endofit yang mempunyai potensi

penghambatan paling baik pada tahap 7 ke dalam medium cair ( Nutrient

Broth), NA tegak dengan menggunakan jarum inokulasi secara tusukan,

dan NA miring secara goresan dengan jarum ose. Diinkubasikan pada

suhu 37oC selama 24 jam. Pada medium cair diamati pertumbuhan pada

permukaan, endapan yang terjadi, bau, dan kekeruhan. Pada NA tegak

diamati tingkat pertumbuhan dan bentuk pertumbuhan pada bekas tusukan.

Pada NA miring diamati tingkat pertumbuhan, bentuk pertumbuhan pada


36

bekas tusukan, kilat, topografi, warna, ciri- ciri optik, bau, konsistensi dan

warna medium.

c. Uji biokimia

1) Uji pembentukan H2S

Diinokulasikan kultur isolat bakteri endofit yang mempunyai

potensi penghambatan paling baik pada tahap 7 dari kultur umur 48

jam dengan jarum inokulasi secara tusukan pada medium TSIA miring

dan pada permukaan medium diinokulasi secara goresan dengan

menggunakan ose. Diinkubasikan selama 48 jam pada suhu 37oC.

Pengamatan uji H2S dilakukan dengan cara membandingkan medium

yang diinokulasi isolat bakteri endofit terhadap kontrol (tanpa

inokulasi bakteri endofit). Pembentukan H2S ditunjukkan dengan

terbentuknya endapan hitam yang berarti bakteri mampu menghasilkan

senyawa desulfurase, selain itu dapat digunakan untuk mengamati

fermentasi gula. Jika pada bagian bawah medium berwarna kuning

sedang bagian atas berwarna merah berarti terjadi fermentasi glukosa.

Jika baik pada bagian atas ataupun bawah medium berwarna kuning

dan kadangkala disertai pembentukan gas berarti laktosa atau sukrosa

atau keduanya difermentasikan. Dan jika seluruh medium berwarna

merah berarti ketiga macam gula tidak difermentasikan.

2) Uji dekarboksilasi lisin




37

jam dengan cara tusukan dalam medium Lysin Iron Agar (LIA)

kemudian diinkubasikan pada suhu 37oC selama 24 jam dan 48 jam.

Pengamatan uji dekarboksilasi lisin dilakukan dengan membandingkan

medium LIA yang diinokulasikan isolat bakteri endofit terhadap

kontrol (tanpa inokulasi bakteri endofit) yang berwarna ungu. Hasil

diamati, positif bila terjadi perubahan warna dari ungu menjadi kuning

pada umur 24 jam dan kemudian berwarna ungu kembali. Perubahan

warna menjadi kuning menandakan bakteri dapat melakukan

fermentasi dan kembali berwarna ungu yang berarti lisin mengalami

dekarboksilasi.

3) Uji Indol

Diinokulasikan 1 ose kultur isolat bakteri endofit yang mempunyai


jam dalam masing- masing tabung reaksi yang berisi medium tripton

water. Inkubasi pada suhu 37oC selama 48 jam. Setelah itu

ditambahkan reagen Kovac. Pengamatan uji Indol dilakukan dengan

membandingkan medium yang diinokulasikan isolat bakteri endofit

terhadap kontrol (tanpa inokulasi bakteri endofit). Memberikan hasil

positif apabila terbentuk cincin merah yang tidak larut pada permukaan

medium. Hal ini dikarenakan bakteri dapat menghasilkan enzim

triptofanase.


38

4) Uji Methyl Red



jam dengan jarum inokulasi pada masing- masing tabung yang berbeda

berisi medium MR-VP. Diinkubasi pada suhu 37oC selama 48 jam.

Pengamatan uji Methyl Red dilakukan dengan membandingkan

medium yang diinokulasikan isolat bakteri endofit terhadap kontrol

(tanpa inokulasi bakteri endofit). Pada uji MR ditambah reagen methyl

red. Bakteri yang tidak dapat memfermentasikan gula akan merubah

warna menjadi merah pada uji MR. Sedangkan apabila terjadi

fermentasi gula, medium akan berubah menjadi kuning.

5) Uji sitrat

Diinokulasikan 1 ose kultur isolat bakteri endofit yang mempunyai


jam pada medium simmon’s citrate secara miring. Diinkubasi pada

suhu 37oC selama 24 jam. Pengamatan uji sitrat dilakukan dengan

membandingkan medium simmon’s citrate yang diinokulasikan isolat

bakteri endofit terhadap kontrol (tanpa inokulasi bakteri endofit).

Perubahan warna dari hijau menjadi biru menunjukkan bahwa bakteri

mampu menggunakan sitrat sebagai satu- satunya sumber karbon.

6) Uji katalase

Satu ose kultur isolat bakteri endofit yang mempunyai potensi

penghambatan paling baik pada tahap 7 diletakkan pada gelas benda.


39

Ditambahkan 1 tetes 30% H2O2. diamati dengan melihat terjadi atau

tidaknya pembentukan gelembung udara di sekitar koloni bakteri

endofit setelah diberi reagens 30% H2O2 dan dibandingkan dengan

kontrol (tanpa inokulasi bakteri endofit). jika terjadi gelembung udara

berarti bakteri memiliki enzim katalase.

7) Uji Oksidase

Pada kertas saring diteteskan reagens tetrametil paraphenildiamin.

Pada kertas saring yang diberi reagens diletakkan 1 ose kultur isolat

bakteri endofit yang mempunyai potensi penghambatan paling baik

pada tahap 7 dari kultur umur 48 jam. Diamati hasilnya dengan melihat

apakah terjadi perubahan warna koloni bakteri menjadi ungu tua

setelah diberi reagens dan dibandingkan dengan kontrol (tanpa

inokulasi bakteri endofit). Jika terjadi warna ungu tua setelah

didiamkan selama 10 menit berarti hasil positif bahwa bakteri uji

memiliki enzim oksidase sitokrom. Sedangkan hasil negatif ditandai

dengan tidak terjadinya perubahan warna.

8) Uji hidrolisis gelatin

Diinokulasi kultur isolat bakteri endofit yang mempunyai potensi

penghambatan paling baik pada tahap 7 dari kultur umur 48 jam secara

tusukan pada medium dengan komposisi gelatin 12% dan nutrient

broth dengan takaran 13 gram/L kemudian diinkubasikan selama 72

jam. Setelah 72 jam, tabung dimasukkan ke dalam lemari es selama 30

menit. Diamati apakah terjadi pencairan gelatin atau tidak dan


40

dibandingkan dengan kontrol (tanpa inokulasi bakteri endofit).

plagiat merupakan tindakan tidak terpujiberkat, kesabaran, kekuatan, dan karunia-nya, sehingga...

Documents