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Planta Piloto de Fermentaciones

Departamento de Biotecnología

Precipitación

Sergio Huerta OchoaUAM-Iztapalapa



Precipitación

En la precipitación se concentra el soluto de una solución convirtiéndolo en sólido

mediante la acción de un agente precipitante.

Teóricamente la precipitación debe producir un soluto concentrado y puro, por lo que es una operación que se utiliza al inicio de un proceso de bioseparación



Ventajas

1. Operación que se adapta fácilmente a gran escala

1. Puede realizase en forma continua

2. El equipo que se utiliza es sencillo

3. Se dispone de diversos agentes precipitantes y en muchos casos éstos son baratos



Fundamentos

Principio Agente precipitante

Disminución de la solubilidad Sales (Sulfato de amonio)

pH (precipitación isoeléctrica)

Solventes (etanol)Solventes (etanol)

Polímeros no iónicos

Desnaturalización selectiva Temperatura

pH

Solventes

Afinidad Ligandos



Precipitación por disminución de la solubilidad

+ +

+

+

+

+

+

+ +

+

+

+

+

+

+

--

-

--

--

---

-

-

-

Al agregar un agente

precipitante

Las proteínas con mayor hidrofobicidad superficial precipitan primero

Precipitación de proteínas por disminución de la solubilidad

� Precipitación con sales� Precipitación isoeléctrica� Precipitación con solventes� Precipitación con polímeros no iónicos

++

++ +

+

+ +-

--

-

-

--

Regiones hidrofóbicas

precipitan primero



Precipitación con sales

Insolubilización

por salado

Solubilización

por salado

S

(Salting-out)(Salting-in)

[Sal]

Mecanismo

La adición de sales elimina el agua de la proteína hidratada, dejando las regiones hidrofóbicas en libertad de combinarse intermolecularmente



Precipitación por incremento de la fuerza iónica(“Salting-out”)

Proteína totalProteína de interés

Concentración relativa (%) 80

100

Concentración de Sal (% Saturación)

0 20 40 60 80 100

Concentración relativa (%)

0

20

40

60



Ecuación de la precipitación con sales

[ ]Sallog mAS −=Donde:S = Solubilidad de la proteína a un valor dado de concentración salina.

A = Constante que depende fuertemente del pH y la temperatura. Esta constante usualmente toma un valor mínimo en el punto isoeléctrico, es característica de cada proteína e independiente del tipo de sal.

m = Pendiente de la curva de solubilización por salado. Ésta es independiente del pH y la temperatura, pero varía con el tipo de sal y de proteína. Las sales que contienen aniones polivalentes tales como sulfatos y fosfatos tienen valores de mmayores que las sales univalentes. Los cationes polivalentes como el calcio y el magnesio disminuyen el valor de m.



Naturaleza de la sal

1. Los aniones son más efectivos en el siguiente orden (Series de Hofmeister):

−−−−−−−

−−−−−−

>>>>>>

>>>>>>

IClO�OBrClOClCOOCH

POHIOFSO

4333

423

2

4

23 tartratocitrato

2. Los cationes son efectivos en el siguiente orden:

3. Seleccionar una sal que sea barata debido a las altas concentraciones que requiere el método.

4. Seleccionar una sal que produzca un precipitado cuya densidad sea diferente a la de la solución para facilitar su separación.

5. Añadirla sal en forma sólida y no como solución, para minimizar la dilución.

>>>>>> IClO�OBrClOClCOOCH 4333

+++ >> �aK�H 4



Precipitación isoeléctrica

Esta técnica se basa en la disminución de la solubilidad en el punto isoeléctrico

Mecanismo

Las proteínas por su naturaleza anfotérica presentan una carga neta negativa a pH altos y una carga neta positiva a pH bajos. Existe un pH llamado pH isoeléctrico al cual la carga neta de la proteína es cero. A este pH la molécula es incapaz de desplazarse en un campo eléctrico

+ + ++++++

+

+

+ ++

+ ++

+ ++ +

++ +

++

++

++

+

+

----

-

--

-

-

---

-

-

--

-

Repulsión

Atracción

Baja interacción

en el punto

isoelécrico

Efecto de las fuerzas electrostáticas sobre la proteína



Precipitación con solventes

Esta técnica se basa en la disminución de la solubilidad mediante la adición de un solvente orgánico ligeramente polar

Mecanismo

El agua se caracteriza por su alta constante dieléctrica, lo cual significa que los iones ensolución acuosa presentan interacciones más débiles que con otros medios.La adición de un solvente orgánico (etanol o acetona) produce agregados de moléculasproteicas que tienden a precipitar, esto se debe a que el solvente presenta una

Mecanismoproteicas que tienden a precipitar, esto se debe a que el solvente presenta unaconstante dieléctrica menor que la del agua, lo cual produce un incremento en lasfuerzas de atracción entre cargas opuestas y una disminución en el grado de ionizaciónde los radicales de las proteínas, y en consecuencia una disminución en la solubilidad deésta.

Líquido D

Agua 80.0

Matanol 33.0

Etanol 24.0

Acetona 21.4

Benceno 2.3

Hexano 1.9

Constantes dieléctricas de algunos líquidos a 20⁰C



Ecuación de la precipitación con solventes

donde:S = Solubilidad de la proteína

20loglogSD

KSS +=

S = Solubilidad de la proteínaDS = Es la constante dieléctrica de la mezcla solvente-agua, misma que varía

dependiendo de la cantidad de solvente agregada.K = Es una constante que toma en cuenta la constante dieléctrica original del

medio acuoso.S0 = Es la solubilidad extrapolada

Selección

del solvente

El solvente debe ser completamente miscible en aguaNo debe reaccionar con las proteínasDebe ser un buen agente precipitanteDebe ser seguro (flamabilidad del solvente)



Precipitación con polímeros no iónicos

La precipitación de proteínas también puede realizarse utilizando polímeros neutros como el polietilenglicol (PEG) en lugar de sales o solventes.

El mecanismo no está claramente establecido; sin embargo, hay dos modelos

Mecanismo

Ogston y Laurent sugieren que los polímeros excluyen a las proteínas de parte de la solución y reducen la cantidad efectiva de agua disponible para su solvatación.

El modelo de Ogston se basa en la teoría termodinámica y concluye que los sistemas pueden ser explicados en términos de los coeficientes de interacción proteína-polímero, y proteína-proteína de las especies presentes.El modelo de Laurent se basa en un mecanismo de exclusión geométrica de regiones hidratadas de la proteína por el polímero.

El mecanismo no está claramente establecido; sin embargo, hay dos modelos propuestos.



Ecuaciones de la precipitación con solventes

Modelo de Laurent: KCkS −= loglogS = Solubilidad de la proteína

C = Concentración del polímero

k = constante de proporcionalidad

3

+

= ps rrvK

= Volumen parcial específico del polímero

r = Radio de la molécula de proteína

v

303.2

+=

p

ps

r

rrvK rS = Radio de la molécula de proteína

rP = Radio del cilindro del polímero

Modelo de Ogston: aCXS −=logS = Solubilidad de la proteína

C = Concentración del polímero

a = coeficiente de interacción proteína-polietilen glicol

RTX ii

0µµ −=

= Potencial químico de la proteína en presencia del polímero

= Potencial químico de la proteína en el estado estándar

R = Contante de los gases ideales

T = Temperatura absoluta

iµ0

iµ



Precipitación de proteínas por desnaturalización

selectiva

El objetivo de la desnaturalización selectiva es crear las condiciones en las cuales la proteína de interés no se desnaturaliza o su desnaturalización es mínimala proteína de interés no se desnaturaliza o su desnaturalización es mínima

Si la proteína que se desea purificar presenta estabilidad en condiciones extremas de temperatura, pH, o en solventes orgánicos, puede utilizarse esta propiedad en

las primeras etapas del proceso de purificación



Desnaturalización por temperatura

El proceso de desnaturalización de la proteína por efecto de la temperatura puede ser descrito como un proceso de primer orden

[ ] [ ]Pkdt

Pd−=

[P] = Concentración de la proteína disueltat = tiempot = tiempok = Velocidad específica de desnaturalización

−=RT

Ekk exp0

La dependencia del proceso de desnaturalización con la temperatura está dado por:

[ ] [ ]PRT

Ek

dt

Pd

−−= exp0

k0 = Constante característicaE = Energía de activación de la desnaturalizaciónR = Constante de los gasesT = Temperatura



Desnaturalización por pH

Debido a que ciertas proteínas son estables a pH’s extremos, se ha utilizado esta propiedad para purificarlas mediante su precipitación por desnaturalización selectiva de

las proteínas contaminantes.

La velocidad de desnaturalización a pK’s extremos ya sea ácidos o básicos depende del tiempo que tarde la proteína en abrirse y perder su conformación.

Desnaturalización por solventes orgánicos

tiempo que tarde la proteína en abrirse y perder su conformación.

La estabilidad que presentan algunas proteínas en una solución con solventes orgánicos es una propiedad que ha sido utilizada en procesos de purificación, mediante la

precipitación de proteínas contaminantes.

El pH y la temperatura de la solución deben definirse y manejarse cuidadosamente con el fin de maximizar el rendimiento y la pureza de la proteína de interés, y de lograr la

máxima precipitación de las proteínas contaminantes.



Precipitación por afinidad

La precipitación de proteinas por afinidad es un método de preciptación selectivo que se basa en la capacidad que tienen las proteínas para unirse con ligandos por medio

de sus sitios activos.

En el caso de la afinidad bioespecífica el ligando puede ser un sustrato, un inhibidor, o En el caso de la afinidad bioespecífica el ligando puede ser un sustrato, un inhibidor, o un anticuerpo.

En el caso de la pseudoafinidad los ligandos utilizados son colorantes o metales.

Nota: La simple adición de ligandos a una solución proteica generalmente no es suficiente para que ocurra la precipitación. Es necesario que el ligando propicie un estado de agregación de los complejos ligando-proteína.



Equipos de precipitación

La operación de precipitación puede llevarse en diferentes tipos de reactores entre los que se encuentran los:

Intermitentes Continuos tipo tanque agitado

Alimentación

Producto

Alimentación Producto

Tubulares



Diseño de Precipitadores

Precipitación a gran escala

En el diseño de un proceso de precipitación debe tomarse como base el comportamiento

cinético de las partículas en solución. El conocimiento de este comportamiento permite

hacer la selección adecuada de la geometría en la que se realizará el proceso.

“Gran escala” significa procesos los cuales son 10 veces o más que los métodos de laboratorio existentes. En otras palabras se está interesado en el escalamiento.

La solubilidad de un soluto particular en un proceso a gran escala no es diferente al del proceso a pequeña escala. Lo que se puede cambiar en un proceso a gran escala es la cinética. Se desea que ambas cinéticas sean las mismas.

Se demuestra que la precipitación se obtiene con mejor éxito a una potencia por unidad de volumen constante (P/V).

Precipitación a gran escala



Se puede idealizar la precipitación como un mecanismo de 6 etapas:

1. Mezclado inicial: La alimentación conteniendo el soluto es mezclada con el no-solvente o la sal

2. Nucleación: Aparecen pequeñas semillas e inicia la precipitación

3. Crecimiento limitado por difusión: El precipitado crece por difusión3. Crecimiento limitado por difusión: El precipitado crece por difusión

4. Crecimiento influenciado por flujo: Nuevo crecimiento es ayudado por mezclado

5. Floculación: Partículas coloides se agregan en flóculos grandes

6. Centrifugación: Los flóculos son separados por los métodos ya descritos

Alguno de estos procesos ocurrirán simultáneamente, pero se discutirán como si ocurriesen secuencialmente



Mezclado Inicial:

El tiempo requerido para producir homogeneidad puede ser estimado de la ecuación:

D

lt

4

2

=

donde: l es el tamaño promedio de los “eddies” turbulentos causados por el mezclado y donde: l es el tamaño promedio de los “eddies” turbulentos causados por el mezclado y D es el coeficiente de difusión del soluto.

El tamaño de estos “eddies” puede ser estimado de la ecuación:

4

13

/

=

VPl

ρν

donde: ρ es la densidad de la solución, ν es la viscosidad cinemática, y P/V es la potencia por volumen de la agitación.



Nucleación:

La nucleación es la parte del proceso donde pequeñas partículas aparecen y empiezan a crecer:

� En sistemas inorgánicos, la nucleación puede ser lenta y la sobresaturación puede persistir por largos periodos

� Para sistemas coloides, este proceso es efectivamente instantáneo



Crecimiento limitado por difusión (Crecimiento Pericinético):

Después de la nucleación, las partículas del precipitado crecen cuando el soluto disuelto difunde hacia ellos de la solución circundante. Este crecimiento usualmente sigue un proceso de segundo orden:

2

ii ky

dt

dy−=

dt

donde: yi es la concentración de partículas de soluto, y k es la constante de la tasa del proceso.

La constante k es una función del coeficiente de difusión D:

DdÑk π8=donde: d es el diámetro del soluto, y Ñ es el número de Avogadro.



La ecuación de segundo orden puede ser fácilmente integrada:

ktyy ii

+=0

11

donde: yio es la concentración inicial de soluto. Sin embargo, frecuentemente es más difícil medir yi que determinar el peso molecular Sin embargo, frecuentemente es más difícil medir yi que determinar el peso molecular promedio del precipitado. La ecuación anterior se puede escribir en términos del peso molecular mediante un balance de masa

M

00MyMy ii =

donde: es el peso molecular del soluto inicial.Combinando las dos ecuaciones previas:

0M

( )ktyMM i010 +=

Así las mediciones del peso molecular promedio contra el tiempo provee valores de la constante k.



Crecimiento influenciado por flujo (Crecimiento o agregación ortocinética):

La difusión limita el crecimiento de pequeñas partículas pero es menos importante que el crecimiento de partículas grandes.

Para estas partículas grandes, el crecimiento usualmente involucra coalisión entre especies las cuales son barridas junto con el mezclado.

El crecimiento en esta región obedece a una cinética de segundo orden:

2

ii ky

dt

dy−=

donde la constante de la tasa está dada por:

2/1

3 /

3

2

=

ρνα

VPÑdk

donde: α es un coeficiente de pegamiento, un factor insertado para considerar el hecho de que no todas las coaliciones producen crecimiento .



La integración directa de esta ecuación es complicada por el hecho de que el diámetro de la partícula y la constante de la tasa k son función del tiempo.

Se puede resolver la complicación considerando una fracción de volumen del soluto ψ

Ñyd i

= 3

6

1πψ

Esta fracción de volumen es independiente del tiempo. Así podemos reescribir las Esta fracción de volumen es independiente del tiempo. Así podemos reescribir las ecuaciones anteriores en términos de ψ

ii y

VP

dt

dy

=−

2/1

/4

ρναψ

π

Integrando encontramos:

−= t

VP

y

y

i

i

2/1

/4exp

0ρν

αψπ

Ejemplo 9.3



Floculación:

Los flujos altos para el crecimiento de partículas pequeñas puede destruir los flóculosmás grandes, así esta etapa es algunas veces llevada a cabo en tanques no agitados.

Los polielectrolitos sintéticos pueden algunas veces ayudar a la floculación, tal como ocurre en la filtración.

Nota: Recuerde que si el precipitado es el producto deseado, el polielectrolito debe ser removido después.

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