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CAPÍTULO 12
PLÁSMIDOS Y TRANSMISIÓN HORIZONTAL DE GENES
Baltasar Mayo, Claudia Sánchez y Pablo Álvarez-Martín.
Instituto de Productos Lácteos de Asturias, Consejo Superior de Investigaciones Científicas,
Villaviciosa, Asturias.
ÍNDICE.
1.- INTRODUCCIÓN GENERAL.
1.-MECANISMOS DE REPLICACIÓN.
1.1.- Mecanismo de replicación RCM.
1.2.- Mecanismo de replicación tipo Theta.
1.3.- Replicación por desplazamiento de cadena.
2.- PLÁSMIDOS DE BACTERIAS LÁCTICAS Y BIFIDOBACTERIAS.
2.1.- Plásmidos de las bacterias lácticas
2.1.1.- Plásmidos que replican en RCM.
2.1.2.- Plásmidos que replican en Theta.
2.2.- Plásmidos de bifidobacterias.
3.- PROCESOS DE TRANSFERENCIA GENÉTICA ASOCIADA A PLÁSMIDOS.
3.1.- Conjugación.
3.1.1.- Plásmidos conjugativos.
3.1.2.- Transposones conjugativos.
3.2.- Transferencia horizontal de genes entre bacterias lácticas.
3.3.- Transferencia horizontal desde otros tipos microbianos.
3.4.- Intercambio génico entre cromosoma y plásmidos.
4.- CONCLUSIÓN.
5.- AGRADECIMIENTOS.
6.- BIBLIOGRAFÍA.
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1.- INTRODUCCIÓN GENERAL.
La mayor parte de los genes bacterianos están codificados en una larga molécula
generalmente circular de ADN en doble cadena denominada cromosoma bacteriano o, más
apropiadamente, genóforo. En un gran número de especies o de cepas, junto al cromosoma
aparecen una o varias moléculas menores denominadas plásmidos. Los plásmidos son
también moléculas de ADN de doble cadena y la mayoría de las veces circulares. En este
caso, la configuración del ADN plasmídico suele estar más enrollada que la del ADN
principal, propiedad que se utiliza para su aislamiento selectivo. El genoma bacteriano se
completa con los bacteriófagos integrados en el cromosoma (profagos), los transposones y las
secuencias o elementos de inserción (ISs).
La característica definitoria de los plásmidos es una replicación controlada e
independiente de la replicación del cromosoma. A pesar de su independencia, la replicación
requiere del concurso de la maquinaria metabólica celular. Otras características típicas de los
plásmidos son su pequeño tamaño (en comparación con el tamaño del cromosoma) y la de
codificar propiedades “no esenciales” para el desarrollo celular “normal”. Suelen codificar
actividades importantes para la adaptación o supervivencia en determinados ambientes o en
determinadas condiciones ambientales como resistencia a antibióticos y metales pesados,
utilización de azúcares u otras fuentes de carbono, producción de toxinas, pigmentos, factores
de adherencia, etc. (Reanney, 1976; Eberhard, 1989). Se denominan plásmidos crípticos a
aquellos que solo codifican la parte esencial de la maquinaria replicativa, de control y otras
funciones relacionadas con su diseminación.
El conocimiento de la existencia de elementos extracromosomales como el “Factor F”
de Escherichia coli es anterior incluso al descubrimiento de la estructura del ADN. De hecho,
el término “plásmido” lo introdujo Lederberg en 1952 para referirse a los determinantes
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hereditarios transmisibles (Lederberg et al., 1952). En la actualidad, se han detectado
plásmidos en la mayoría de los géneros bacterianos, en varios eucariotas inferiores como
hongos y levaduras y en los orgánulos (mitocondrias y cloroplastos) de algunos eucariotas
superiores. De forma más específica, se han encontrado plásmidos en todos los géneros de las
bacterias del ácido láctico (o bacterias lácticas). Su fácil manejo y una organización
relativamente sencilla convierten a los plásmidos en modelos adecuados para los estudios
moleculares. Así, el estudio de algunos de los cientos de plásmidos descritos ha contribuido
de forma significativa al desarrollo de diversas disciplinas de la Genética y la Biología
Molecular. Analizando la replicación plasmídica y su control, se han descubierto aspectos
destacados de los mecanismos de replicación del ADN y las interacciones moleculares de la
expresión génica (Cohen, 1993).
1.-MECANISMOS DE REPLICACIÓN.
Los plásmidos deben de portar obligatoriamente las señales y los elementos necesarios para el
inicio de su replicación. De forma típica suelen contener uno o más orígenes de replicación
(ori) y uno o más elementos de regulación en un segmento pequeño de ADN (entre 1 y 4
kbp). La mayoría de los plásmidos albergan un gen que codifica una proteína necesaria para la
replicación (Rep); otros codifican una molécula de ARN que actúa como cebador (“primer”)
en la iniciación de la síntesis de las nuevas copias de ADN (Actis et al., 1998; del Solar et al.,
1998). La replicación del ADN plasmídico ha de producirse acoplada al ciclo celular de la
bacteria hospedadora. De forma que en un hospedador determinado y bajo unas condiciones
de crecimiento dadas, todo plásmido tiene un número de copias característico. Para definir y
mantener ese número de copias, los plásmidos utilizan diversos mecanismos de regulación
negativa (del Solar et al., 1998; del Solar and Espinosa, 2000). Los mecanismos de control
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pueden mediarse a través de proteínas represoras, ARN antisentido (“counter-transcript
RNA”, ó ctRNA) y/o secuencias de ADN repetidas (iterones). Las proteínas represoras suelen
actuar en trans inhibiendo la transcripción del gen esencial rep. Los ctRNAs se encuentran en
cis con las secuencias ori aunque funcionan también en trans, inhibiendo el procesamiento del
cebador o influyendo en la transcripción y/o en la traducción del ARN mensajero de Rep. En
el caso de los iterones (dispuestos en tándem dentro o próximos al origen de replicación) la
inhibición se produce por la unión a ellos de la proteína Rep, lo que conlleva una titulación de
la proteína iniciadora y, cuando su concentración es demasiado elevada, el apareamiento de
las moléculas plasmícas (“handcuffing”), lo que dificulta una replicación eficiente. De esta
forma, Rep regula su propia expresión. El control se puede ejercer mediante uno sólo de estos
mecanismos, mediante la acción de un mecanismo principal y otro auxiliar, o por la acción
conjunta y simultánea de todos ellos (Kittel and Helinski, 1992; Khan, 1997; del Solar et al.,
1998; Chattoraj, 2000).
Muchos plásmidos portan, además, genes dispensables (a pesar de que algunos pueden
participar activamente en la replicación, en su control o en la interacción del plásmido con el
hospedador: reparto de moléculas en la progenie, estabilidad plasmídica, transferencia a
nuevas células, etc.). Así, los plásmidos de bajo número de copias codifican diversos
mecanismos para evitar la pérdida segregacional durante la división celular. Entre éstos,
podemos citar sistemas para la resolución de multímeros, sistemas para la muerte de las
células libres de plásmidos y mecanismos de partición activa (Nordström and Austin, 1989;
Williams and Thomas, 1992; Gerdes et al., 2000). Entre los genes plasmídicos accesorios a la
replicación, habrá que incluir también todos aquellos que en las bacterias lácticas codifican
los fenotipos útiles para su aplicación industrial y que hemos enumerado anteriormente.
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Basándose en la comparación de secuencias y en la organización de las regiones de
replicación, se han encontrado cuatro mecanismos de replicación bien definidos en los
plásmidos de las bacterias Gram-positivas: el tipo círculo rodante (“rolling circle
mechanism”, ó RCM) y el tipo Theta de los plásmidos circulares, y los dos mecanismos
distintos de los plásmidos lineales de Streptomyces y Borrelia (Hinnebusch and Tilly, 1993;
Actis et al., 1998; del Solar et al., 1998). Dado que hasta el momento pocos han sido los
plásmidos lineales observados en las bacterias lácticas (Roussel et al., 1993; B. Mayo,
resultados no publicados) y que los plásmidos circulares son los que presentan mayores
posibilidades de manejo, en lo sucesivo nos vamos a ocupar únicamente de éstos.
1.1.- Mecanismo de replicación RCM.
Un gran número de plásmidos multicopia replica según el mecanismo de círculo rodante
(RCM) observado originalmente en los bacteriófagos de ADN de cadena sencilla de E. coli.
La replicación RCM se detectó pronto en plásmidos de bacterias Gram-positivas aunque en la
actualidad se ha visto que es corriente en plásmidos de todos los tipos bacterianos. Este tipo
de replicación lo utilizan también los virus animales de la familia de los parvovirus, varios
viroides vegetales y algunos plásmidos mitocondriales de plantas superiores (Khan, 1997).
En términos de su organización estructural y funcional, los plásmidos RCM forman un
grupo muy homogéneo cuyo tamaño oscila entre un poco más de 1 y 10 kpb. Poseen
estructuras compactas y en la mayoría de los casos todos sus genes se transcriben en la misma
dirección. Su característica más típica es la formación de intermediarios replicativos de ADN
de cadena sencilla (“single-stranded DNA”, ó ssDNA). De hecho, la detección de moléculas
de ssDNA en extractos celulares se utiliza como prueba de este tipo de replicación. La
replicación es unidireccional y asimétrica, ya que la síntesis de la cadena líder (“leading
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strand”) y la de la cadena retrasada (“lagging strand”) no están acopladas (para revisión ver,
Gruss and Ehrlich, 1989; del Solar et al., 1993; Espinosa et al., 1995; Khan, 1996; Khan,
1997; del Solar et al., 1998).
La organización estructural de estos plásmidos es muy similar y consiste en varios
módulos intercambiables. El primer módulo -el único estrictamente esencial- comprende el
ori, el gen rep y algunos elementos de control. En la Figura 1 se representa de manera
esquemática la región del inicio de replicación de los plásmidos RCM del grupo
pMV158/pE194 y su control. La figura se complementa con la secuencia nucleotídica de la
región de inicio de pBM02, sobre la que se han representado los elementos del esquema. El
origen de replicación de la cadena doble (“double-strand origin”, ó dso) consta de una
secuencia de reconocimiento en la molécula de ADN para la proteína iniciadora Rep [que
puede estar constituída por repeticiones directas (“direct repeat”, ó DR), como en el caso de
pMV158, o de una repetición invertida (“inverted repeat” ó IR), como en pT181] y de una
secuencia de corte (“nick”) situada también en una IR. En un segundo módulo situaríamos
una o más regiones con fuerte simetría axial, IRs, que constituyen el punto de inicio de la
síntesis de la cadena retrasada a partir del intermediario de cadena sencilla. A estas secuencias
se las denomina origen de replicación de la cadena sencilla (“single-strand origin”, ó sso). Los
módulos restantes incluyen todos los elementos que no están involucrados de forma directa en
la replicación (Khan, 1997; del Solar et al., 1998). En función de la homología de las
secuencias de ADN del ori y de la secuencia aminoacídica de las proteínas Rep, en las
bacterias Gram-positivas se han identificado cinco familias principales de plásmidos RCM,
representadas respectivamente por los plásmidos pT181, pC194, pMV158/pE194, pNS2 y
pTX14-3 (Khan, 1997). Todos guardan una gran homología estructural y funcional, pero las
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secuencias nucleotídicas sólo se conservan dentro de las familias (sobre todo en la región
nick).
En los plásmidos RCM la replicación consta de cuatro etapas distintas. La primera
implica la unión de la proteína Rep a la molécula de ADN. Esta unión se produce
frecuentemente en la DR del dso próxima al sitio de corte de la cadena líder. Tras la unión, en
un segundo paso, se produce el corte en un punto del bucle de la IR, de forma que queda libre
un extremo 3´-OH que se utiliza como cebador para la síntesis de una nueva cadena líder. En
muchos plásmidos la proteína Rep permanece unida covalentemente al extremo 5´de la
cadena cortada y, de alguna forma, se asocia después a la cadena retrasada (Thomas, 1988).
En los plásmidos de la familia de pMV158/pE194, el punto de corte se sitúa en una IR con la
secuencia consensus 5´-TACTACGAC-3´ en el bucle, y el corte se produce entre los
nucleótidos G y A (Figura 1B). La tercera fase consiste en la elongación de la cadena y el
consiguiente desplazamiento de la cadena líder inicial. La elongación continúa hasta que Rep
reconoce el dso recién sintetizado y corta y cierra la nueva cadena, mientras que la cadena
líder desplazada (original) se separa como una molécula circular de ssDNA. En aquellos
plásmidos en los que la proteína Rep se une de forma covalente al DNA, la proteína iniciadora
queda inactivada por unión a un pequeño segmento de ADN que sobrepasa el dso. En la
última fase, se produce la síntesis de la cadena retrasada; es decir, la molécula de ssDNA se
convierte en una forma de ADN de cadena doble (“double-stranded DNA”, ó dsDNA). El
inicio de la síntesis se produce en el sso. Los factores de replicación de ADN del hospedador
reconocen la o las IRs y sintetizan un cebador de ARN a partir del cual se continúa la
elongación. Finalmente, las moléculas resultantes adquieren el superenrollamiento
característico por acción de las ADN-girasa celulares.
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La regulación de la replicación en los plásmidos RCM está controlada
fundamentalmente por dos mecanismos distintos (Figura 1A). El primero de ellos involucra a
una proteína represora (Cop), codificada en una pauta abierta de lectura inmediatamente
anterior a la que codifica Rep (desde el promotr Pcr, Figura 1A y 1B). Los genes cop y rep se
co-transcriben, y Cop actuaría como regulador negativo de la replicación mediante la unión a
su propio promotor/operador. La unión al operador se realizaría con la lámina beta del motivo
“ribbon-helix-helix” que las proteínas Cop presentan. Un segundo mecanismo de control se
efectúa a través de un ctRNA (sintetizado desde el promotor PctRNA, Figura 1A y 1B). Esta
molécula (de unos 50 nucleótidos en los plásmidos de las bacterias lácticas) se transcribe en
sentido inverso al mensajero rep y se uniría a la región complementaria del ARNm gracias a
su antiparalelismo, impidiendo su traducción. La funcionalidad del promotor PctRNA,
presente en la secuencia de todos los plásmidos, se ha demostrado experimentalmente (Duan
et al., 1998). En algunos plásmidos, como ocurre en pT181, existe la posibilidad de que haya
dos moléculas ctRNA (Kumar and Novick, 1985).
1.2.- Mecanismo de replicación tipo Theta.
Replicones de este tipo se describieron en primer lugar en plásmidos de bacterias Gram-
negativas aunque, al igual que los plásmidos RCM, están extendidos en todos los grupos
microbianos. Una de las diferencias más relevantes de los plásmidos de tipo Theta respecto a
los de tipo RCM es que las moléculas intermediarias de la replicación son ADN de cadena
doble. Otro criterio importante para su identificación es el tamaño, ya que todos los plásmidos
con un tamaño superior a 12 kpb cuyo mecanismo de replicación se conoce pertenecen a este
grupo. No obstante, el tamaño varía notablemente, desde las 2,6 kpb del plásmido Theta más
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pequeño (pRJF1) (Hefford et al., 1993), hasta más de 100 kpb (Seegers et al., 1994; Prévots
et al., 1994).
La organización estructural y funcional de los plásmidos de tipo Theta es muy
heterogénea, a diferencia de lo que ocurre con los de tipo RCM. Los plásmidos varían en
tamaño -como hemos visto-, en el fenotipo que presentan, en la dirección de replicación, en
los requerimientos de factores plasmídicos y celulares y en los elementos de control.
Basándose en estas distintas organizaciones y en los elementos que requieren del hospedador,
se distinguen tres clases de replicones (denominadas A, B y C).
Los replicones de la clase A poseen un ori que consiste en una región rica en A-T,
adyacente a un número varible de iterones (excepto en algún caso, como R1) que son
esenciales en cis para el inicio de la replicación. Estos replicones requieren de una proteína
Rep codificada por el plásmido; lo que implica la existencia en el ori de secuencias
específicas con las que Rep interactúa. En la zona del origen son típicos también uno o más
motivos de unión para DnaA, la proteína iniciadora de la replicación del cromosoma
(denominados cajas dnaA: 5’-TTATCCACA-3’) (Bramhill and Kornberg, 1988; Kornberg
and Baker, 1992). A esta clase pertenecen la mayoría de los plásmidos de lactococos con tipo
Theta de replicación; los más estudiados de las bacterias lácticas. En la Figura 2 se representa
de forma esquemática la región del origen de replicación del grupo plasmídico mayoritario de
los lactococos. Complementando la figura, se incluye también la secuencia nucleotídica del
origen de replicación de pBL1 (Figura 2B). La unión de DnaA a su secuencia de
reconocimiento implica la formación con ésta de un complejo núcleo-proteico capaz de
separar las dos hebras parentales de ADN en la zona rica en A-T. En esta situación las
proteínas requeridas para la síntesis pueden ensamblarse y crear una región de ADN de
cadena sencilla. A continuación se sintetiza un cebador de ARN (pARN) que se utilizará para
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la extensión covalente de la cadena de ADN (Kornberg and Baker, 1992). El papel exacto de
la proteína Rep en el complejo de iniciación no se conoce. Podría estabilizar el complejo
ARN/ADN que se forma con el pARN para un correcto procesado por la RNAsa H celular; o,
alternativamente, reconocer al híbrido y procesarlo ella misma generando el cebador maduro.
La síntesis de ADN es continua en una de las cadenas (cadena líder) y discontinua en la otra
(cadena retrasada) aunque, a diferencia de lo que ocurre en el modo RCM, la síntesis de las
dos cadenas está acoplada (Kelman and O’Donnell, 1995). La síntesis puede comenzar en uno
o varios puntos y la replicación puede ser uni- o bi-direccional, aunque se desconocen los
mecanismos que determinan estas características. En las bacterias Gram-positivas, la
replicación de éstos plásmidos es independiente de la ADN polimerasa I del hospedador.
Las clases B y C carecen de la región ori típica y requieren la actuación de la ADN
polimerasa I celular para su replicación. La diferencia entre los replicones de la clase B y los
de la clase C es que los primeros no codifican proteína iniciadora. La replicación de los
plásmidos de la clase B se inicia con la síntesis de un cebador de ARN por la ARN polimerasa
del hospedador (Itoh and Tomizawa, 1980). Esta clase de replicones está representada por los
plásmidos del tipo ColE1 de E. coli. De la clase C, por su parte, sólo se conocen los plásmidos
emparentados ColE2 y ColE3 también de E. coli (Itoh and Horii, 1989). El inicio de la
replicación en este último tipo de plásmidos requiere del ensamblaje en el ori de toda una
compleja maquinaria que incluye el holoenzima de la ADN polimerasa III, la helicasa DnaB y
la ADN-primasa (Takechi et al., 1995)
Los detalles de la regulación sólo se conocen en unos pocos plásmidos. En bacterias
Gram-positivas los plásmidos más estudiados son pAMβ1 de Enterococcus faecalis y
pSM19035 de Streptococcus pyogenes (del Solar et al., 1998). En la mayoría de los plásmidos
sólo se dispone de la homología de secuencia con éstos y con otros plásmidos de bacterias
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Gram-negativas de la clase A (con una organización similar del ori en DRs y IRs)
(Nordström, 1990; Chattoraj and Schneider, 1997; del Solar et al., 1998; Chattoraj, 2000; del
Solar and Espinosa, 2000). Los iterones parecen jugar en muchos casos un papel destacado en
el inicio y en el control de la replicación. Suelen estar organizados en estructuras de tipo
tándem y se sitúan a una distancia múltiplo de 11 (11 bases equivalen a una vuelta de hélice
en la doble cadena de ADN). Las DRs sirven como sitio de unión para las proteínas Rep, de
forma que copias adicionales de los iterones en cis reducen la frecuencia de replicación,
resultando en un menor número de copias por célula. Algunos plásmidos poseen fuera del
origen de replicación iterones extra no esenciales (como F, P1 y RK2); cuando se eliman se
incrementa el número de copias.
Los mecanismos y funciones de estabilidad distintos de los directamente implicados
en la replicación tampoco se conocen con exactitud. Ni está claro el mecanismo por el que
varios plásmidos pueden coexistir de manera compatible y estable en una misma célula. A
pesar del alto grado de similitud, las claves quizá se encuentren en las pequeñas diferencias.
Así, por ejemplo, las secuencias de los iterones varían entre los diversos plásmidos, de forma
que las proteínas Rep, aunque también parecidas, pueden tener distinta especificidad. Sin
embargo, aún no se han llevado a cabo experimentos de complementariedad entre las
estructuras y los elementos de plásmidos distintos.
1.3.- Replicación por desplazamiento de cadena.
Una clase especial de replicación de tipo Theta es la replicación por desplazamiento de
cadena. En este tipo de replicación también se generan como intermediarias moléculas de
ssDNA (como ocurría en los plásmidos RCM). Los plásmidos con este mecanismo requieren
de la acción de tres proteínas plasmídicas, denominadas RepA, RepB y RepC. El concurso de
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las tres es suficiente para iniciar el proceso sin la participación de los factores celulares. La
replicación se produce en ambas direcciones por un mecanismo de desplazamiento de las
cadenas. El producto final es una mezcla de círculos de ssDNA desplazados y círculos de
dsDNA superenrollados. Los ejemplos mejor conocidos de esta clase son los plásmidos
promiscuos de la familia IncQ (Sakai and Komano, 1996). La independencia de los factores
celulares para su replicación parece ser la causa de su amplio rango de huésped.
2.- PLÁSMIDOS DE BACTERIAS LÁCTICAS Y BIFIDOBACTERIAS.
2.1.- Plásmidos de las bacterias lácticas.
La inestabilidad de la capacidad de utilización de la lactosa y las caseínas de la leche en
diversas cepas de lactococos se conocen desde hace muchos años (referenciada de manera
excelente en McKay, 1983). La constatación sistemática de la pérdida espontánea en diversas
cepas de estas características se remonta a los años 30. La observación de que su tratamiento
con agentes que interfieren en la replicación del ADN como los colorantes de acridina o el
crecimiento a elevadas temperaturas aumentaba la frecuencia de pérdida sugería que los
determinantes genéticos se localizaban en elementos inestables. Sin embargo, la propuesta de
que la inestabilidad podría estar asociada a plásmidos no llega hasta el año 1971 (Pearce and
Skipper, 1971, citado en Cords et al., 1974), cuando la presencia de elementos genéticos
extracromosomales estaba ya bien documentada en varias cepas de la familia
Enterobacteriaceae, en cepas de Staphylococcus aureus y en algunas especies de
Pseudomonas y Bacillus. La primera demostración concluyente de la presencia de plásmidos
en cepas de lactococos la realizaron Cords y colaboradores (Cords et al., 1974). Al año
siguiente, la pérdida de la actividad proteinásica se asoció con la pérdida de un plásmido
concreto en la cepa Lactococcus lactis C2 (McKay and Baldwin, 1975). Desde entonces la
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descripción de plásmidos en los géneros y especies de bacterias lácticas y su asociación con
diferentes fenotipos ha sido una constante (para revisión, McKay, 1983; Gasson and Davies,
1984; Hill and Ross, 1998; Tabla 1).
Las cepas de lactococos suelen ser especialmente abundantes en estas moléculas de
ADN extracromosómico. De forma frecuente, se encuentran entre 4 y 7 tipos plasmídicos
distintos por célula, pudiendo llegar a 12 o más (McKay, 1983; Gasson and Davies, 1984;
Mills et al., 2006;). El rango de tamaño varía entre las 2 y las 70-80 kpb, aunque se han
descrito plásmidos de más de 130 kpb (Harmon and McKay, 1987; Prévots et al., 1994). Los
plásmidos son también abundantes en algunas especies del género Lactobacillus como Lact.
plantarum y Lact. pentosus (Mayo et al., 1989; Ruiz-Barba et al., 1991). Por el contrario, son
más escasos en otras especies, como ocurre en las cepas de Streptococcus thermophilus y
Lact. delbrueckii subsp. bulgaricus (Somkuti and Steinberg, 1988; Mercenier, 1990).
En las bacterias lácticas se han asociado con plásmidos fenotipos tan diversos como la
actividad proteinásica extracelular, la utilización de la lactosa (tanto a través del sistema de la
permeasa como del transportador PEP-PTS), la utilización de citrato, diversos mecanismos de
resistencia a bacteriófagos, la producción de polisacáridos extracelulares, la producción de
bacteriocinas, la resistencia al estrés térmico y a la acidez, la resistencia a diversos
antibióticos y metales pesados, y otros (McKay, 1983; Gasson and Davies, 1984; David et al.,
1992; Pouwels and Leer, 1993; Vaughan et al., 1995; Wang and Lee, 1997; Hill and Ross,
1998). En muchos casos, un solo plásmido puede codificar más de una, lo que indica que en
una sola molécula se reclutan diversas características (Akcelik, 1999; Siezen et al., 2005).
Como fácilmente se desprende de la enumeración anterior, gran parte de estas
propiedades son esenciales en la aplicación industrial de las bacterias lácticas. La pérdida de
alguna de ellas durante las fermentaciones causa la descalificación de los productos, con las
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consiguientes pérdidas materiales; de ahí la importancia del estudio de los plásmidos en que
se asientan. Además, en los últimos años, el conocimiento de la biología de los plásmidos y
sus interacciones con las células hospedadoras ha posibilitado el desarrollo de herramientas
biotecnológicas (células libres de plásmidos, vectores de clonación, de expresión, de
integración, etc.) que se utilizan para el estudio molecular de las propiedades más relevantes
y, llegado el caso, para su manipulación (Kok, 1991; de Vos and Simons, 1994; de Vos, 1999;
Mills et al., 2006). La finalidad de estos estudios es reproducir las fermentaciones
tradicionales de manera más fiable y eficiente, así como utilizar a las bacterias lácticas en
otras aplicaciones más novedosas (elaboración de nuevos productos fermentados, expresión
de compuestos de interés médico-farmaceútico, inmunización oral, etc.).
En los últimos años, gracias a la generalización de las técnicas de secuenciación, se
han determinado las secuencias nucleotídicas de las regiones de replicación de un buen
número de plásmidos procedentes de los distintos géneros y especies de las bacterias lácticas,
y en muchos casos de los plásmidos completos (Tabla 1). La aplicación de las técnicas de
secuenciación genómica ha permitido la secuenciación de plásmidos de gran tamaño como
pMRC01 de 60,2 kpb (Dougherty et al., 1998) y pNP40 de 65,0 kpb (O’Driscoll et al., 2006),
o la secuenciación del complemento plasmídico completo de diversas cepas (van Kranenburg
et al., 2005; Desmond et al., 2005; Siezen et al., 2005).
2.1.1.- Plásmidos que replican en RCM.
Los primeros plásmidos de bacterias lácticas en los que se estudiaron los mecanismos de
replicación y su estructura molecular fueron los plásmidos pSH71 (de Vos, 1986), pDI25 (Xu
et al., 1991) y pWV01 (Leenhouts et al., 1991). Curiosamente, las regiones de replicación de
los tres plásmidos resultaron ser prácticamente idénticas y operativas en tipos bacterianos tan
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distintos como Bacillus subtilis y E. coli. Todos replican mediante un mecanismo RCM,
pertenecen a la familia pMV158/pE194 y su organización funcional se representa en la Figura
1. Debido a que fueron los primeros que se conocieron a nivel molecular y a su gran
promiscuidad, estos plásmidos han sido ampliamente utilizados en la construcción de vectores
bifuncionales (Kok, 1991; de Vos, 1999). En la actualidad se han secuenciado dos replicones
más de esta familia (pBM02 y pSRQ700; Tabla 1). El replicón parece estar bastante extendido
entre los lactococos, ya que muchas cepas presentan un plásmido con un módulo de
replicación homólogo. El plásmido pSRQ700 es un caso singular, puesto que el replicón
RCM está integrado en un plásmido con otro replicón de tipo Theta (Boucher et al., 2001).
Los plásmidos de lactococos presentan, sin embargo, un sso diferente a los de los
plásmidos pMV158 (que tiene un ssoA y un ssoU) y pE194 (que sólo tiene ssoA). El sso de
pWV01, denominado ssoW, ha sido estudiado a nivel molecular con cierto detalle (Seegers et
al., 1995; Jeong et al., 1997). A este mismo tipo pertenece el sso del plásmido pBM02, con
únicamente cuatro sustituciones nucleotídicas en un segmento de más de 200 pb (Sánchez and
Mayo, 2003). En esta región aparece una extensa IR de 140 pb, seguida de una IR menor
(Figura 1B). En el bucle de la IR mayor aparece la secuencia consensus que presentan muchos
ssos del tipo ssoA (del Solar et al., 1987), que guarda semejanza con el sso del fago øX174,
por lo que funcionará como lugar de ensamblaje de la maquinaria replicativa celular
(“primosome assembly site”). La IR menor es, probablemente, el lugar de reconocimiento de
la ARN polimerasa (el sitio RSB) (Kramer et al., 1997). El dso de pBM02 es típico, con una
IR (IR3) seguida a cierta distancia de una DR imperfecta repetida tres veces (Figura 1B).
Estas estructuras y la organización posterior de los genes copG y repB son semejantes a las
que aparecen en los miembros de la familia pMV158/pE194. Merece destacarse que la
homología aminoacídica de las proteías RepB y CopG de pBM02 fue máxima con dos
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plásmidos de la misma familia identificados en especies distintas de lactobacilos (pLB4 de
Lact. plantarum y pLF1311 de Lact. fermentum) (Tabla 1).
En otra cepa de L. lactis se ha detectado un plásmido (pWC1) con homología
nucleotídica y aminoacídica mayor con los plásmidos de la familia de pC194 (Pillidge et al.,
1996). Este replicón, sin embargo, no parece tan extendido entre las cepas de lactococos como
el de pWV01, aunque se han encontrado plásmidos relacionados en otras bacterias lácticas.
En la Figura 3A se muestran las relaciones filogenéticas entre los diversos plásmidos RCM
secuenciados de lactococos en función de las secuencias de sus proteínas Rep.
En estos momentos, se encuentran secuenciados un buen número de plásmidos RCM
procedentes de todos los géneros de bacterias lácticas (Tabla 1). Con alguna honrosa
excepción, como es el caso del plásmido p353-2 de Lact. pentosus (Pouwels et al., 1994), el
estudio de estos plásmidos se encuentra más retrasado que el de los lactococos. En la mayoría
de los casos, sólo se conocen las secuencias nucleotídicas y su homología con las de los
plásmidos tipo. Los parientes más próximos de algunos plásmidos son plásmidos de otras
especies o, incluso, de géneros distintos a los de las bacterias lácticas. Como es el caso de los
plásmidos pLB4 y pLF1311 ya citados. De igual forma, el plásmido pLA106 de Lact.
acidophilus es prácticamente idéntico a pTE15 de Lact. reuteri. Los plásmidos del grupo de
pST1 de S. thermophilus (pER16, pER35, pER36 y pCI65st) son más parecidos a plásmidos
de Streptococcus pneumonie que a otros de S. thermophilus (como pER13 y pSMQ172). Los
estudios filogenéticos indican que, en general, dentro de cada familia hay una buena
conservación nucleotídica en el ori y homología aminoacídica en las proteínas Rep.
La gran mayoría de los plásmidos RCM de las bacterias lácticas no codifican ninguna
característica fenotípica, aunque varios portan secuencias y factores relacionados con su
movilización (sitio oriT y proteína Mob) (Tabla 1). La excepción podríamos encontrarla en
17
varios plásmidos de lactobacilos que codifican genes de resistencia a antibióticos (como
pLEM3 y p121BS) o en los escasos plásmidos detectados en S. thermophilus que codifican
proteínas relacionadas con la resistencia al estrés térmico (calor) y sistemas de restricción-
modificación que dificultan la infección fágica; características importantes para su aplicación.
En esta especie, todos los plásmidos analizados son todos de tipo RCM.
2.1.2.- Plásmidos que replican en Theta.
Los replicones de tipo Theta de las bacterias Gram-positivas caracterizados a nivel molecular
pertenecen mayoritariamente al grupo de pAMβ1, con las características estructurales y
funcionales de los plásmidos Theta de la clase A. Así, codifican una proteína Rep esencial y
presentan una región ori con la organización típica (Figura 2). Sin embargo, su replicación es
unidireccional en todos los casos y requieren, por algún motivo, la actuación de la DNA
polimerasa I celular. Por esta razón, se los suele incluir también en una clase aparte
denominada clase D. La gran mayoría de los replicones de tipo Theta de los lactococos
pertenecen a este grupo y presentan un alto grado de conservación en los diversos elementos.
Los plásmidos tienen un número de copias pequeño y un rango de huésped limitado;
características interesantes para el desarrollo de vectores de tipo alimentario. En estos
momentos, este grupo cuenta con más de 35 replicones secuenciados (Tabla 1). A pesar de la
similitud en sus módulos de replicación, los plásmidos son extraordinariamente variables en
tamaño y fenotipo. Además, en una misma célula huésped pueden coexistir varios plásmidos
del mismo grupo. De hecho, algunas cepas poseen más de cuatro replicones estrechamente
emparentados (Seegers et al., 1994; Sánchez, 2002; Siezen et al., 2005). Es sorprendente
también la organización del plásmido de L. lactis pNZ4000 (de unas 40 kpb y que codifica la
18
síntesis de un polisacárido extracelular), ya que incluye en su molécula cuatro replicones
funcionales de este tipo y muy similares (van Kranenburg and de Vos, 1998).
El modo Theta de replicación se demostró experimentalmente en dos plásmidos:
pWV02 y pUCL22 (Kiewiet et al., 1993 y Frère et al., 1993, respectivamente); algo que ya
resultaba evidente de la homología de las secuencias con otras de plásmidos de bacterias
Gram-positivas y Gram-negativas en las que ya se había demostrado este tipo de replicación.
La región del ori consiste en un segmento de ADN capaz de actuar en cis y situado por
delante de la ORF que codifica la proteína de replicación Rep. Ésta puede actuar en trans
sobre el ori. Al gen rep le sigue una ORF, acoplada traduccionalmente, que codifica una
proteína con un motivo de unión a ADN. La función de esta proteína no se conoce, pero en
algunos casos participa en la estabilización de los plásmidos. Sin embargo, no es esencial y en
ocasiones, como ocurre en pWV02 y en otros plásmidos, se encuentra delecionada de forma
natural. El dominio del ori, por encima de rep, presenta diversos elementos con estructuras
muy conservadas entre los replicones del grupo (Figura 2A y 2B). En primer lugar aparece
una DR de 10 pb separada por una zona rica en A-T de una segunda DR de 22 pb repetida de
forma típica tres veces y media (iterones), y con homología parcial con la secuencia que
reconoce la proteína DnaA. En el caso del plásmido pCIC305 se ha comprobado que la
introducción de iterones suplementarios en un replicón compatible tiene el mismo efecto
inhibidor que el que se observa en los plásmidos de bacterias Gram-negativas (Foley et al.,
1996). La repetición final truncada forma parte además de una IR, IR1, que incluye parte de la
región -35 del promotor putativo de rep. IR1 se presume como el operador del gen rep. La
proteína Rep podría encontrarse en dos estados: monómero o dímero. El monómero se uniría
a los iterones, mientras que el dímero parece unirse al operador actuando como represor
(Figura 2A y 2B). Adyacente a IR1 se encuentra la posición -10 del promotor seguida de una
19
segunda IR, IR2, y de una tercera, IR3, situadas entre la región del promotor, la secuencia de
Shine-Dalgarno y el codón de iniciación. IR1 presenta homología parcial con las repeticiones
de 22 pb, y en el caso de pIC305 constituye el sitio principal de unión de Rep (Foley et al.,
1996). Se desconoce la función que pueden tener IR2 e IR3, aunque su extrecha organización
sugiere una interrelación entre ellas y su participación en la regulación para la transcripción y
en el control del número de copias.
La homología de las proteínas Rep entre los plásmidos de este grupo es muy alta, con
porcentajes de identidad aminoacídica mayores del 50% (Figura 3B). En ocasiones presentan
también identidad a nivel nucleotídico tanto en las secuencias traducidas como en las no
traducidas, tal es el caso de los plásmidos pCIC305, pAH33, pCI605 y pCIS3. Los replicones
de los plásmidos pBL1 y pIL2614 son también muy similares y parecidos al de pJW563, etc.
Recientemente, se ha identificado en Bacillus natto una nueva clase de plásmidos,
representada por el plásmido pLS32, con similitudes con los de la clase A pero con notables
diferencias. No presentan, por ejemplo, ninguna región rica en A-T que pueda funcionar como
ori. Aunque, dentro de la ORF que codifica Rep, se han encontrado varios iterones con una
organización parecida a los de la clase A. La replicación es independiente de la ADN
polimerasa I del hospedador, como también ocurre con los plásmidos de la clase A de las
bacterias Gram-negativas, (Tanaka and Ogura, 1998). A esta familia parecen pertenecer los
plásmidos de lactococos pIC2000 (Kearney et al., 2000) y pNP40 (O’Driscoll et al., 2006).
En estos plásmidos es novedosa también la presencia de mecanismos de partición activa
(ParA), sistemas poco descritos en bacterias Gram-positivas (Jannière et al., 1996; de la Hoz
et al., 2000). A la misma familia de pLS32 podrían pertenecer también los plásmidos pLJ1,
pSAK1 y pLH1 identificados en diferentes especies del género Lactobacillus (Tabla 1).
20
El plásmido pCRL291.1 formaría un tercer grupo de replicones de tipo Theta poco
frecuente en lactococos. Como puede verse en la Figura 3B, el replicón no está relacionado
con los del grupo de pWV02 ni con el de pIC2000. Presenta homología, sin embargo, con
plásmidos del género Lactobacillus (especialmente con pLA103) (Kanatani et al., 1995).
En estos momentos se han secuenciado al menos 15 plásmidos de diversas especies
del género Lactobacillus que podrían replicar mediante el modo Theta (Tabla 1). La principal
limitación para el estudio de los replicones plasmídicos de este grupo viene dada por la
necesidad de utilizar hospedadores homólogos libres de plásmidos en los que aislar los
replicones de interés, dado su estrecho rango de hospedador. Por si esto fuera poco, los
procesos de transferencia (incluida la electrotransformación) son ineficientes en un gran
número de especies. Una aproximación novedosa podría ser la clonación y secuenciación al
azar de los complementos plasmídicos. Esta técnica, que ha dado buenos resultados en el
análisis de otros tipos microbianos (Fraser et al., 1997), ya se ha utilizado en alguno de los
proyectos de secuenciación genómica (Kleerebezem et al., 2003). Dada la gran diversidad de
especies poco relacionadas que se incluyen en este género, el número de plásmidos
secuenciados es todavía reducido para sacar conclusiones generales. En general, no parecen
guardar gran homología de secuencia con los plásmidos del grupo mayoritario de los
lactococos. Como excepción, el plásmido pLA103 de Lact. acidophilus presenta una cierta
homología estructural en con el grupo mayoritario de los lactococos, con DRs de 22 pb en
tándem por delante de la proteína de replicación capaz a su vez de actuar en trans sobre la
zona del origen (Kanatani et al., 1995).
De forma reciente, se ha caracterizado el plásmido de bajo número de copias p256 en
una cepa de Lact. plantarum que podría presentar un mecanismo nuevo de replicación de tipo
Theta (Sorvig et al., 2005). La región esencial de replicación de este plásmido, de tan sólo
21
700 pb, no codifica ninguna proteína de replicación. También ha resultado novedosa la
presencia en el plásmido de un sistema de mantenimiento adictivo (toxina-antitoxina).
2.2.- Plásmidos de bifidobacterias.
Aunque poseen algunas características comunes con las bacterias del ácido láctico, las
bifidobacterias no están emparentadas evolutivamente con ellas sino que pertenecen a la clase
Actinobacteria caracterizada por un alto contenido CG en su genoma (Scardovi, 1986). En los
últimos tiempos, sin embargo, se las incluye en el mismo grupo con motivo de encontrarse en
los mismos hábitats y tener aplicaciones industriales similares, incluyendo su abundante
utilización como probióticos (Lehay et al., 2005).
A pesar de que la presencia de plásmidos en especies el genero Bifidobacterium ha
sido descrita desde el año 1982 (Sgorbati et al., 1982) su incidencia es mucho menor que en
otras especies del ámbito intestinal. Hasta la fecha tan solo 18 plásmidos han sido
completamente secuenciados, de los que 11 pertenecen a cepas de Bifidobacterium longum
(Tabla 1). El rango de tamaño varía entre las 1,8 kpb de pMB1 y las 10,2 kpb de pNAC3
(Tabla 1). El significado de la presencia de estos elementos de replicación autónoma en el
género Bifidobacterium sigue siendo confuso puesto que sólo codifican la maquinaria
replicativa y secuencias relacionadas con la movilización. La excepción pudiera ser un
plásmido no caracterizado de B. bifidum que codifica una bacteriocina (Yildirim et al., 1999).
Asimismo, en únicamente tres cepas de B. longum se ha econtrado más de un plásmido (Park
et al., 1997; Corneau et al., 2004; Lee and O’Sullivan, 2006).
La mayoría de los plásmidos descritos en bifidobacterias se postula que replican
mediante un mecanismo RCM, sin embargo solamente se ha demostrado experimentalmente
para los plásmidos pKJ50 (Park et al., 1997), pCIBb1 (O’Riordan and Fitzgerald, 1999),
22
pNAC1 (Corneau et al., 2004) y pDOJH10L (Lee and O’Sullivan, 2006). En función de la
similitud de secuencias, otros tres plásmidos se sospecha que replican mediante el sistema
Theta: pMB1 (Rossi et al., 1996), pDOJH10S (Lee and O’Sullivan, 2006) y pBC1 (Álvarez-
Martín et al., 2006). Un caso especial es el del plásmido pDOJH10L que contiene replicones
de tipo RCM y Theta (Lee and O’Sullivan, 2006). En ambos tipos de plásmidos son
frecuentes en el ori diversas estructuras de iterones (DRs de unas 22 pb), secuencias ricas en
ATs e IRs. En los plásmidos de tipo Theta, acoplado al gen de la replicasa se ha identificado
una pauta abierta de lectura (orfX) similar a la que presentan los plásmidos de lactococos con
la misma función desconocida. En la Figura 4 se presenta la organización genética y funcional
del plásmido pBC1 (Figura 4A) (Álvarez-Martín et al., 2006), aislado de la cepa B.
catenulatum L48, junto con la estructura molecular de la región del ori (Figura 4B).
3.- PROCESOS DE TRANSFERENCIA GENÉTICA ASOCIADA A PLÁSMIDOS.
La transmisión génica horizontal se define como la transferencia entre células o genomas por
mecanismos distintos a los de la reproducción (división) normal. La transferencia horizontal
de genes ha tenido y tiene un papel destacado en la adaptación de los organismos a nuevos
ambientes. Sin duda, uno de los procesos más documentados es la propagación de la
resistencia a antibióticos entre las bacterias (Maiden, 1998). La transferencia horizontal,
además, no está restringida a los procariotas y se piensa que, en términos evolutivos, ha sido
importante también en plantas y animales superiores (Syvanen, 1985).
3.1.- Conjugación.
Los procesos mediante los que se pueden llevar a cabo la transferencia son la transformación
natural, la conjugación y la transducción, seguidos de una recombinación con el material
23
genético residente. La introducción de ADN desnudo en el interior celular (transformación) es
un mecanismo común de transferencia génica que puede intercambiar cualquier fragmento de
ADN. Numerosos géneros presentan transformación natural (Streptococcus, Haemophilus,
Bacillus, Neisseria etc.) y el proceso se conoce con bastante precisión (Woodall, 2003). De
forma típica, por este mecanismo sólo se intercambian fragmentos cortos de ADN. La
conjugación, por su parte, requiere un contacto físico entre las células y puede llevarse a cabo
entre bacterias no relacionadas evolutivamente. Por medio de este mecanismo, además, se
pueden transferir largos segmentos de ADN. La transducción, por último, requiere que
receptor y donador compartan los mismos receptores celulares para los fagos que llevan a
cabo el proceso. Éste sólo se produce, por tanto, entre bacterias muy relacionadas. La longitud
del ADN que se puede transferir está limitada por tamaño de la cabeza del fago.
En las bacterias lácticas la transformación natural tan sólo se ha descrito en una cepa
de Leuconostoc carnosum (Helmark et al., 2004). Hay que mencionar, sin embargo, la
presencia en los genomas de L. lactis y de Lact. plantarum de un set completo, y
posiblemente operativo, de los genes tardíos de competencia; sugiriendo la posibilidad de que
la competencia pueda alcanzarse de alguna forma todavía desconocida (Bolotin et al., 2001;
Kleerebezem et al., 2003). Por otro lado, los procesos de transducción se comentarán en el
capítulo de bacteriófagos, así que en lo que sigue nos centraremos en los plásmidos y
transposones conjugativos y en los intercambios que éstos promueven.
3.1.1.- Plásmidos conjugativos.
Plásmidos que codifican sistemas de transferencia con los cuales dirigen su transmisión a
células que no los poseen fueron descritos pronto en varias especies bacterianas; baste
mencionar nuevamente el caso del “Factor F” de E. coli (Lederberg et al., 1952). Las primeras
24
reseñas de transferencia conjugativa en las bacterias lácticas involucraban el paso de los genes
necesarios para la utilización de la lactosa entre distintas cepas de L. lactis subsp. lactis
(Kempler and McKay, 1979; Gasson and Davies, 1980). Desde entonces, se ha comprobado
que muchos de los plásmidos que codifican la capacidad de utilización de la lactosa y/o la
actividad proteinásica son conjugativos (para revisión ver, Fitzgerald and Gasson, 1988;
Gasson, 1990). La transferencia ocurre a baja frecuencia (alrededor de 10-7 transconjugantes
por receptor); aunque también se han encontrado cepas capaces de transferir plásmidos a una
frecuencia mucho mayor (por encima de 10-1 transconjugantes por receptor). En estas cepas,
la transferencia está asociada a la capacidad de las células para adherirse unas a otras
formando agregados. Los agregados podrían atrapar a las células receptoras de modo que se
asegure el contacto esencial entre donador y receptor (Gasson and Davies, 1980). La
conjugación tiene una enorme importancia desde el punto de vista aplicado, ya que se ha
utilizado repetidamente forma corriente para la diseminación entre las cepas “starter” de
varias características tecnológicas deseables encontradas en otras cepas. Podemos citar la
transferencia de los genes para la producción y resistencia a bacteriocinas (Davey and Pearce,
1982; Neve et al., 1984; Scherwitz et al., 1983), la producción y resistencia a nisina (Gasson,
1983) y la dispersión entre cepas o la concentración en una sola de un buen número de
sistemas de resistencia a bacteriófagos (para revisión ver, Daly et al., 1996; Forde and
Fitzgerald, 1999).
Los mecanismos moleculares del proceso de conjugación entre las cepas de lactococos
se desconocen. En estos momentos se ha secuenciado la región conjugativa (región Tra) de
los plásmidos pMRC01 (Dougherty et al., 1998) y pNP40 (O’Driscoll et al., 2006) de L. lactis
y la de pWCFS103 de Lact. plantarum (van Kranenburg et al., 2005). Estas regiones tienen
un tamaño de 18-20 kbp y codifican alrededor de 16-19 genes organizados en operones. En
25
pMRC01 tanto la región Tra como la región codificadora de la bacteriocina están flanqueadas
por secuencias de inserción, como ocurre con muchos otros fenotipos plasmídicos. La
organización y los productos génicos presentan similitudes con los que aparecen en las
regiones conjugativas de los plásmidos de estafilococos pSK41 y pGO1, así como con los de
un segmento secuenciado del plásmido conjugativo pIP501 de Streptococcus agalactiae. Las
similitudes estructurales indican, posiblemente, semejanzas funcionales; si bien la presencia
de genes únicos en cada sistema podría resultar en marcadas diferencias.
La transferencia conjugativa de características tecnológicas en otras bacterias lácticas
parece ser un fenómeno menos frecuente que en los lactococos. Como excepciones notables
podemos citar la transferencia de un plásmido de la lactosa entre cepas de Lact. casei (Chassy
et al., 1978) y la resistencia y producción de una bacteriocina entre cepas de Lact. acidophilus
(Muriana and Klaenhammer, 1987). Esto quizá sea debido a una codificación cromosómica de
las características o, nuevamente, a la falta de cepas libres de plásmidos capaces de actuar
como receptoras sin la interferencia de los plásmidos residentes. Ya que la transferencia
conjugativa de plásmidos de resistencia a antibióticos con amplio rango de huésped, como
pAMβ1 o pIP505 no parece presentar problemas, ni siquiera cuando donador y receptor
pertenecen a distinta especie o género (para revisión ver, Gasson, 1990). Como tampoco
parece haberlos para la introducción de los transposones Tn916 y Tn919 (Fitzgerald and
Gasson, 1988; Gasson, 1990).
En algunos casos la transferencia de una determinada propiedad precisa de una
cointegración previa del plásmido portador con el verdadero plásmido conjugativo (Walsh
and McKay, 1981). En este caso se habla de plásmidos movilizables. La cointegración está
mediada nuevamente por secuencias de inserción (Walsh and McKay, 1982; Anderson and
Mckay, 1984). En esta categoría encontramos plásmidos que codifican la maquinaria
26
completa (sitio de reconocimiento y corte de una de las cadenas, sitio oriT, y diversas
proteínas involucradas en la transferencia) y otros que únicamente presentan en su molécula el
sitio físico oriT. En estos casos los plásmidos sólo pueden transferirse cuando en la célula
donadora se encuentran los demás componentes del sistema. Pero, dado que muchas especies
albergan un buen número de plásmidos de diversos tipos, no es extraño que uno o más porten
la maquinaria de transferencia completa. Además, existen ciertas cepas de L. lactis que
presentan en su cromosoma un factor sexual (Gasson et al., 1992). Este factor participa
frecuentemente en la transferencia conjugativa del plásmido de la lactosa y parece que es
capaz también de movilizar genes cromosómicos (Bringel et al., 1992). La existencia de un
factor de movilización similar al “Factor F” de E. coli podría explicar las grandes
reorganizaciones genómicas que, como en otros grupos microbianos, parecen ser frecuentes
en las cepas de lactococos (Daveran-Mingot et al., 1998; Le Bourgeois et al., 2000).
En los lactococos y en diversas especies de Lactobacillus algunos de los fenotipos
tecnológicamente más relevantes para su empleo en las fermentaciones lácticas (genes de
utilización de la lactosa, proteinasa, producción de nisina y otras bacteriocinas, resistencia a
fagos, producción de exopolisacáridos, etc.), y otros como hemos visto, están asociados
comúnmente con ISs (para revisión ver, Romero and Klaenhammer, 1993; Davidson et al.,
1996). En este sentido, en el análisis genómico de la cepa L. lactis subsp. lactis IL1403 se han
encontrado 43 ISs (con una distribución no aleatoria, lo que sugiere que el cromosoma actual
es el resltado de una recombinación reciente entre dos genomas relacionados) (Bolotin et al.,
2001). En el genoma de Lact. plantarum WCFS1 han aparecido, al menos, 12 ISs
pertenecientes a dos clases distintas (Kleerebezem et al., 2003). Las ISs son también
abundantes también en los plásmidos de gran tamaño (Dougherty et al., 1998; Siezen et al.,
2005; O’Driscoll et al., 2006). La posición y el número de ISs sugieren que juegan un papel
27
importante en la captación desde el entorno de los genes necesarios para su adaptación al
medio lácteo (Siezen et al., 2005; O’Driscoll et al., 2006).
3.1.2.- Transposones conjugativos.
La transferencia horizontal puede estar mediada también por transposones conjugativos. Ya
hemos mencionado la transmisión entre cepas de este grupo de los transposones heterólogos
Tn916 y Tn919. En las bacterias lácticas el transposón conjugativo más característico es el
que codifica la producción de nisina en diversas cepas de L. lactis. La transmisión conjugativa
o la pérdida en bloque de la producción y resistencia a nisina (asociada frecuentemente con la
capacidad para fermentar la sacarosa y la resistencia a bacteriófagos) sugería una codificación
plasmídica en varias cepas de L. lactis subsp. lactis (Gasson, 1984; Gonzalez and Kunka,
1984; Steele and McKay, 1986). Sin embargo, finalmente se vio que el elemento responsable
de la transmisión en bloque de todos estos caracteres era un transposón conjugativo,
denominado Tn5276 y Tn5301 (Horn et al., 1991; Rauch and de Vos, 1992). Los
transposones de nisina contienen, con pocas excepciones, una copia en cada extremo de la
IS904. Aunque debido a frecuentes reorganizaciones, se encuentra una amplia variabilidad en
su organización genética actual. Las variaciones incluyen el tipo de nisina que codifican
(NisA o NisZ), el número de copias de IS904 y el estado funcional o defectivo del transposón
(Rauch and de Vos, 1992; Rauch et a., 1994). La inestabilidad observada tradicionalmente en
los fenotipos que codifica el transposón parece relacionarse con el mecanismo de
transposición a través de intermediarios extracromosomales circulares (Rauch and de Vos,
1992; Rauch and de Vos, 1994).
3.2.- Transferencia horizontal de genes entre bacterias lácticas.
28
En estos momentos, parece claro que muchas características funcionales de las bacterias
lácticas se han diseminado de forma horizontal entre los diversos géneros y especies, siendo
los plásmidos los principales receptores del nuevo material genético. Así, es destacable la
diseminación reciente del gen que codifica la proteinasa extracelular entre las cepas de L.
lactis y entre algunas cepas de Lact. casei (Kok and de Vos, 1994). El gen está presente
también en diversos géneros que no pertenecen a las bacterias lácticas con una organización
similar (Siezen, 1999). La adaptación génica a cada especie hace que, en algunos casos, sólo
se conserve las secuencias aminoacídicas y, en otros, únicamente la estructura básica de los
domios. Un caso peculiar lo constituye la proteinasa extracelular de Lact. delbrueckii subsp.
bulgaricus (PrtB) en cuya organización todavía se aprecian restos de una estructura antigua
similar a la de L. lactis. Una reorganización génica posterior cambió el dominio catalítico, con
lo que se independizó de la proteína esencial de maduración PrtM (Gilbert et al., 1996).
El mismo caso parece darse con los genes de incorporación de la lactosa por la vía
PEP-fosfotranferasa (sistema PEP-PTS) y su posterior desdoblamiento mediante la β-fosfo-
galactosidasa, los cuales están codificados en plásmidos en muchas cepas de lactococos y en
algunas de Lact. casei (Chassy et al., 1978; Shimizu-Kadota, 1988). Esta vía de utilización de
la lactosa es más eficiente que la vía de la permeasa y es la vía mayoritaria en las cepas
“starter” de lactococos. En las cepas de L. lactis la región plasmídica de estos genes es muy
parecida a la región cromosómica que presentan las especies S. aureus y Streptococcus
mutans, lo que sugirió enseguida una transferencia horizontal (de Vos et al., 1990; de Vos and
Vaughan, 1994). En Lact. casei la región es también similar, aunque muestra cambios
posicionales respecto del orden génico encontrado en las otras especies. En todo caso, las
secuencias de los diversos componentes son muy parecidas entre ellos tanto a nivel
aminoacídico (83% de similitud) como nucleotídico (74% de similitud). La región plasmídica
29
de la cepa L. lactis MG1820 está delimitada en uno de sus extremos por una copia de ISS1,
que pudo haber participado en el proceso de diseminación (de Vos et al., 1990). Lo mismo
sucede con la región del plásmido pSK11L, delimitada por copias de IS981 y IS982 (Siezen et
al., 2005).
Los genes bicistrónicos que codifican la β-galactosidasa de Lact. casei, Lact.
plantarum, Lact. sakei, Lact. helveticus y Leuconostoc lactis son también prácticamente
idénticos (de Vos and Vaughan, 1994). ). Los genes se encuentran en el cromosoma en las
especies Lact. sakei y Lact. helveticus (Zwhalen and Mollet, 1993; Obst et al., 1995) y en
plasmidos en Lact. casei (Chassy, 1987) y Leuc. lactis (David et al., 1992); indicando, en este
último caso, una incorporación más reciente desde alguna otra especie. En Lact. plantarum
todas las cepas tienen una copia cromosómica y algunas tienen también copias plasmídicas,
con la misma organización genética en ambos casos (Fernández et al., 1999.
Los genes de la utilización de la lactosa de S. thermophilus y de Lact. delbrueckii
subsp. bulgaricus presentan también los mismos componentes, la misma organización y un
alto grado de homología (más del 60% de identidad en la secuencia de la proteína
transportadora LacS) (Schmidt et al., 1990; Schroeder et al., 1991). Además, los componentes
de este sistema no están relacionados con los tipos anteriores y tienen mayor parecido con los
de bacterias Gram-negativas como E. coli (de Vos and Vaughan, 1994). Esta homología es
más clara aún en el caso de la β-galactosidasa de la cepa L. lactis ATCC7962, que se codifica
en un operón en el que también se encuentra una thiogalactosidasa con homología a la que
aparece en el operón de E. coli, aunque el orden génico es diferente (Vaughan et al., 1998).
Todo esto parece indicar que las bacterias lácticas han adquirido los genes necesarios
para la utilización de la lactosa de manera independiente en más de una ocasión y de distintas
fuentes; genes que se han ido transfiriendo con posterioridad entre los miembros del grupo.
30
3.3.- Transferencia horizontal desde otros tipos microbianos.
Un caso espectacular de transferencia horizontal lo constituye el plásmido pK214 descubierto
recientemente en una cepa de L. lactis. Este plásmido, de unas 30 kpb, codifica resistencias a
diversos antibióticos mediadas por alguna de las seis ISs que posee (Perreten et al., 1997). En
el plásmido se han agrupado genes de resistencia a estreptomicina, cloranfenicol y
tetraciclina, además de un sistema inespecífico de resistencia. A juzgar por la organización
génica y la homología de secuencia de ADN, los segmentos en los que se encuentran los
genes de resistencia a antibióticos parecen provenir de plásmidos de S. aureus, Listeria
monocytogenes y Streptococcus ssp. (Perreten et al., 1997). Las mismas conclusiones parecen
derivarse del análisis del plásmido pMD5057 de Lact. plantarum, en el que parece haberse
insertado de forma reciente un gen de resistencia a tetraciclina (tetM) procedente de S. aureus
o Clostridium perfringens (Danielsen, 2002). Ambos plásmidos ejemplarizan el potencial de
la transferencia horizontal y el papel que ésta juega en la adaptación bacteriana a un ambiente
cada vez más cargado de antibióticos.
Esto puede llegar a tener repercusiones importantes de salud pública, dado que si los
genes de resistencia a antibióticos llegan a las bacterias de los alimentos, desde éstas podrán
fácilmente extenderse en el sistema gastrointestinal a muchas otras, entre ellas a las bacterias
oportunistas o patógenas, como parece que ya está sucediendo en la actualidad (Teuber et al.,
1999; Eaton and Gasson, 2001; Franz et al., 2001). Estos genes parecen transferirse con
posterioridad a las bacterias que colonizan el tracto gastrointestinal (para revisión ver, Teuber
et al., 1999). Como ejemplo podemos citar los determinantes genéticos de resistencia a
antibióticos que se han caracterizado en varias cepas de lactobacilos intestinales. Éstos
presentan una identidad total con los que se han caracterizado en otros tipos bacterianos. Tal
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es el caso del gen de resistencia a eritromicina del plásmido pLEM3 de Lact. fermentum con
un 98,2% de identidad respecto del gen del transposón conjugativo Tn1545 (Fons et al.,
1997). Por su parte, la metilasa que confiere resistencia a eritromicina codificada en el
plásmido pGT633 de Lact. reuteri, parece provenir del plásmido de S. aureus pE194. Ambos
determinantes comparten las mismas señales de iniciación de la transcripción y la traducción
y se expresan en bacterias Gram-positivas y Gram-negativas (Tannock et al., 1994). Otro
ejemplo más lo constituye el gen que determina la resistencia a cloranfenicol en el plásmido
de Lact. reuteri pTC82 que comparte un 95% de identidad nucleotídica con el gen de
resistencia a cloranfenicol del plásmido pC194 de S. aureus (Liu et al., 1996). Mención aparte
merece la cepa Lact. fermentum ROT1 resistente a novobiocina, tetraciclina, eritromicina y
dalfopristín (Gfeller et al., 2003). En esta cepa la resistencia a los dos últimos antibióticos está
codificada en un plásmido de 19,3 kpb.
En la era genómica se está comprobando que los procesos de intercambio horizontal
de material genético son mucho más frecuentes de lo que nunca se hubiera sospechado. Los
genomas microbianos están formados por pequeñas piezas de mosaico de procedencia diversa
(los genes) engarzadas primorosamente hasta conformar las eficientes y adaptadas especies
microbianas actuales (Nelson et al., 1999; Takami et al., 2000; Nölling et al., 2001). Aunque,
por su naturaleza, los procesos de adaptación no son definitivos y, de hecho, en algunos casos
parecen encontrarse en pleno desarrollo (Schell et al., 2002).
3.4.- Intercambio génico entre cromosoma y plásmidos.
Además de servir como receptores de ADN del “ambiente” con el que afrontar las situaciones
nuevas, los plásmidos participan también de un intercambio génico con el cromosoma del
huésped, en un proceso denominado “shuffling”. Éste sirve a los mismos propósitos que la
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adquisición de material genético del exterior. De manera general, cuando un gen
cromosómico pasa a estar en un plásmido aumenta el número de copias. El aumento de copias
tiene dos consecuencias inmediatas. En primer lugar, el producto génico aumenta debido al
aumento de copias y a un control de la expresión más laxo del que existe en el cromosoma. En
segundo lugar, con el aumento del número de copias aumentan las posibilidades de mutación,
lo que favorece la adaptabilidad.
Uno de los genes en los que se ha estudiado este fenómeno es el de la oligopeptidasa
PepF. En el plásmido que codifica la lactosa y la proteinasa en la cepa L. lactis subsp.
cremoris NCDO763 se encontró un gen especificando una oligopeptidasa que se denominó
PepF1 (Nardi et al., 1997). La secuencia del gen plasmídico pepF1p y las adyacentes son
idénticas a las de un segmento del cromosoma de la cepa L. lactis subsp. lactis IL1403. Por su
parte, la cepa NCDO763 presenta un gen cromosómico con un 80% de identidad respecto del
gen plasmídico y del gen cromosómico de IL1403. El gen plasmídico está flanqueado por una
copia de IS904 en un lado y una copia truncada de IS981 en el otro, lo que sugiere una
transferencia de pepF1 desde el cromosoma a un plásmido en L. lactis subsp. lactis IL1403 o
en una cepa equivalente. Dado que el plásmido que porta el gen es conjugativo, podría
haberse transferido posteriormente a diversas cepas entre ellas a NCDO763. El gen
cromosómico parece cotranscribirse con una metiltransferasa involucrada, posiblemente, en el
metabolismo de las proteínas anómalas. La pérdida del ligamiento y su inclusión en un
plásmido que codifica funciones esenciales para el crecimiento óptimo en leche sugieren una
función actual in vivo diferente para los dos enzimas (Nardi et al., 1997). En otras cepas de L.
lactis también se encuentra duplicado el gen que codifica la endopeptidasa PepO. La copia
adicional se encuentra localizada igualmente en el plásmido de la lactosa (Le Bourgeois et al.,
2000; Siezen et al., 2005). La ocurrencia independiente de estas duplicaciones indica que, de
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alguna forma, son beneficiosas para las células en el entorno lácteo. El mismo beneficio
pudiera atribuirse a la duplicación y transferencia a plásmidos del gen de la β-galactosidasa en
diversas cepas de Lact. plantarum que hemos mencionado (Fernández et al., 1999).
La posibilidad inversa, la integración en el cromosoma de un gen plasmídico también
está documentada. Así, se ha encontrado una cepa de L. lactis en la que el gen que codifica la
proteinasa extracelular está codificado en el cromosoma (Nissen-Meyer et al., 1992). La
consecuencia inmediata más importante en este caso es la estabilización genética del carácter,
lo que sin duda es un efecto positivo para aquellas características tecnológicas deseables.
4.- CONCLUSIÓN.
Los plásmidos se revelan como un material genético esencial al que se incorporan en primera
instancia los genes que las bacterias necesitan para responder a cambios rápidos en su
entorno; entorno del que sin duda toman los genes. El estudio de los plásmidos y de sus
propiedades, y su transferencia controlada a las cepas de nuestro interés, posibilitarán la
explotación de las bacterias lácticas en toda su potencialidad como agentes transformadores y
conservadores de alimentos. Por otra parte, el desarrollo de herramientas biotecnológicas de
última generación permitirá la manipulación genética en este grupo microbiano para la mejora
de las fermentaciones tradicionales y su aplicación en procesos más novedosos. Sin embargo,
en presencia de un ambiente hostil, como puede ser la presencia de antibióticos, los plásmidos
por su capacidad receptora pueden ponerse en nuestra contra.
5.- AGRADECIMIENTOS.
El trabajo en nuestro Laboratorio se ha financiado con un Proyecto FEDER del “Ministerio de
Ciencia y Tecnología” (Referencia CICYT-1FD97-0339) y un Proyecto de la “Fundación para
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el Fomento en Asturias de la Investigación Científica Aplicada y la Tecnología” (Referencia
PB-AGR 99-01). Claudia Sánchez ha sido becaria predoctoral de la “Agencia Española de
Cooperación Internacional”. P. Álvarez-Martín se ha beneficiado de un contrato del Programa
I3P del CSIC cofinanciado por el Fondo Social Europeo. Los autores agradecen sinceramente
a la Dra. Gloria del Solar, Centro de Investigaciones Biológicas, CSIC, la lectura crítica del
manuscrito.
6.- REFERENCIAS.
Actis, L. A., M. E. Tolmasky, and J. H. Crossa. 1998. Bacterial plasmids: replication of extrachromosomal genetic elements encoding resitance to antimicrobial compounds. Frontiers in Bioscience 3:d43-62. Akcelik, M. 1999. The conjugal plasmid pLL10236 encodes lactose fermentation ability, restriction/modification activity, bacteriocin production and immunity in Lactococcus lactis subsp. Lactis LL102. Food Microbiol. 16:487-494. Aleshin, V. V., E. V. Semenova, V. G. Doroshenko, Y. V. Jomantas, B. V. Taraknov, and V. A. Livshits. 1999. The broad host range plasmid pLF1311 from Lactobacillus fermentum VKM1311. FEMS Microbiol. Lett. 178:47-53. Álvarez-Martín, P., A. B. Flórez, and B. Mayo. 2006. Screening for plasmids among human bifidobacteria species: Sequencing and analysis of pBC1 from Bifidobacterium catenulatum L48. Plasmid doi:10.1016/j.plasmid.2006.07.004. Anderson, D. G., and L. L. McKay. 1984. Genetic and physical characterization of recombinant plasmids associated with cell aggregation and high-frecuency conjugal transfer in Streptococcus lactis ML3. J. Bacteriol. 158:954-962. Axelsson, L., A. Holck, S. E. Birkeland, T. Aukrust, and H. Blom. 1993. Cloning and nucleotide sequence of a gene from Lactobacillus sake Lb706 necessary for sakacin A production and immunity. Appl. Environ. Microbiol. 59:2868-2875. Azcárete-Peril, M. A., and R. Raya. 2002. Sequence analysis of pLBB1, a cryptic plasmid from Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus. Can. J. Microbiol. 48:105-112. Bates, E. E. M., and H. J. Gilbert. 1989. Characterization of a cryptic plasmid from Lactobacillus plantarum. Gene 85:253-258. Biet, F., Y. Cenatiempo, and C. Fremaux. 1999. Characterization of pFR18, a small cryptic plasmid from Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides FR52, and its use as a food grade vector. FEMS Microbiol. Lett. 179:375-383. Bolotin, A., P. Winker, S. Mauger, S., O. Jaillon, K. Malarme, J. Weissenbach, S. D. Ehrlich, and A. Sorokin. 2001. The complete genome sequence of the lactic acid bacterium Lactococcus lactis ssp. lactis IL1403. Genome Res. 11:731-753. Boucher, I., E. Emond, M. Parrot, and S. Moineau. 2001. DNA sequence analysis of three Lactococcus lactis plasmids encoding phage resistance mechanisms. J. Dairy Sci. 84:1610-1620.
35
Bouia, A., F. Bringel, L. Frey, B. Kammerer, A. Belarbi, A. Guyonvarch, and J. C. Hubert. 1989. Structural organization of pLP1, a cryptic plasmid from Lactobacillus plantarum CCM1904. Plasmid 22:185-192. Bourniquel, A. A., M. G. Casey, B. Mollet, and R. D. Pridmore. 2002. DNA sequence and functional analysis of Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis plasmids pN42 and pJBL2. Plasmid 47:153-157. Bramhill, D., and Kornberg, A. 1988. A model for initiation at origins of DNA replication. Cell 54:915-918. Bringel, F., G. L. van Alstine, and J. Scott. 1992. Transfer of Tn916 between Lactococcus lactis subsp. lactis strains is not-transpositional: evidence for a chromosomal fertility function in strain MG1363. J. Bacteriol. 174:5840-5847. Brito, L., G. Vieira, M. A. Santos, and H. Paveia. 1996. Nucleotide sequence and analysis of pOg32, a cryptic plasmid from Leuconostoc oenos. Plasmid 36:49-54. Chassy, B. M., E. Gibson, and A. Giuffrida. 1978. Evidence for plasmid associated lactose metabolism in Lactobacillus casei. Curr. Microbiol. 1:141-144. Chassy, B. M. 1987. Prospects for the genetic manipulation of lactobacilli. FEMS Microbiol. Rev. 46:297-312. Chattoraj, D. K., and T. D. Schneider. 1997. Replication control of plasmid P1 and its host chromosome: the common ground. Prog. Nuc. Acid Res. Mol. Biol. 57:145-186. Chattoraj, D. K. 2000. Control of DNA replication by iterons: no longer paradoxical. Mol. Microbiol. 37:467-476. Christensson, C., C. J. Phillidge, L. J. Ward, and P. W. O’Toole. 2001. Nucleotide sequence and characterization of the cell envelope proteinase plasmid in Lactococcus lactis subsp. cremoris HP. J. Appl. Microbiol. 91:334-343. Cocconcelli, P. S., M. Elli, B. Riboli, and L. Morelli. 1996. Genetic analysis of the replicon region of the Lactobacillus plasmid vector pPSC22. Res. Microbiol. 147:619-624. Coffey, A., A. Harrington, K. Kearney, C. Daly, and G. Fitzgerald. 1994. Nucleotide sequence and structural organization of the small, broad-host-range plasmid pCI411 from Leuconostoc lactis 533. Microbiol. 140:2263-2269. Cohen, S. N. 1993. Bacterial plasmids: their extraordinary contribution to molecular genetics. Gene 135:67-76. Cords, B. R., L. L. McKay, and P. Guerry. 1974. Extrachromosomal elements in group N streptococci. J. Bacteriol. 117:1149-1152. Corneau, N., E. Emond, and G. LaPointe. 2004. Molecular characterization of three plasmids from Bifidobacterium longum. Plasmid 51:87-100. Cuozzo, S. A., F. Sesma, J. M. Palacios, A. P. de Ruiz-Holgado, and R. R. Raya. 2000. Identification and nucleotide sequence of genes involved in the synthesis of lactocin 705, a two-peptide bacteriocin from Lactobacillus casei CRL705. FEMS Microbiol. Lett. 185:157-161. Daly, C., G. F. Fitzgerald, and R. Davies. 1996. Biotechnology of lactic acid bacteria with special reference to bacteriophage resistance. Antonie van Leeuwenhoek 70:99-110. Danielsen, M. 2002. Characterization of the tetracycline rsitance plasmid pMD5057 from Lactobacillus plantarum 5057 reveals a composite structure. Plasmid 48:98-103.
36
Daveran-Mingot, M.-L., N. Campo, P. Ritzenthaler, and P. Le Bourgeois. 1998. A natural large chromosomal inversion in Lactococcus lactis is mediated by homologous recombination between two insertion sequences. J. Bacteriol. 180:4834-4842. Davey, G. P., and L. E. Pearce. 1982. Production of diplococcin by Streptococcus cremoris and its transfer to nonproducing group N streptococci. In, Microbiology. D. Schelessinger (Ed.). pp. 221-224. ASM, Washington DC. David, S., H. Stevens, M. van Riel, G. Simons, and W. M. de Vos. 1992. Leuconostoc lactis β-galactosidase is encoded by two overlapping genes. J. Bacteriol. 174:4475-4481. Davidson, B. E., N. Kordias, M. Dobos, and A. J. Hillier. 1996. Genomic organization of lactic acid bacteria. Antonie van Leeuwenhoek 70:161-183. de Vos, W. M. 1986. Gene cloning in lactic streptococci. Neth. Milk Dairy J. 40:141-154. de Vos, W. M., I. Boerrigter, R. J. van Rooijen, B. Reiche, and W. Hengstenberg. 1990. Characterization of the lactose-specific enzymes of the phosphotransferase system in Lactococcus lactis. J. Biol. Chem. 256:22554-22560. de Vos, W. M., and G. Simons. 1994. Gene cloning and expression systems in Lactococci. In, Genetics and Biotechnology of Lactic Acid Bacteria. M. J. Gasson and W. M. de Vos (Eds.). pp. 52-105. Chapman and Hall, London. de Vos, W. M., and E. E. Vaughan. 1994. Genetics of lactose utilization in lactic acid bacteria. FEMS Microbiol. Rev. 15:217-237. del Solar, G., M. Moscoso, and M. Espinosa. 1993. Rolling circle-replication plasmids from gram-positive and –negative bacteria: a wall falls. Mol. Microbiol. 8:789-796. del Solar, G., R. Giraldo, M. J. Ruiz-Echevarría, M. Espinosa, and R. Díaz-Orejas. 1998. Replication and control of circular bacterial plasmids. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62:434-464. del Solar, G., and M. Espinosa. 2000. Plasmid copy number control: an ever growing story. Mol. Microbiol. 37:492-500. Desmond, C., P. R. Ross, G. Fizgerald, and C. Stanton. 2005. Sequence analysis of the plasmid genome of the probiotic strain Lactobacillus paracasei NFBC338 which includes the plasmid pCD01 and pCD02. Plasmid 54:160-175. Dougherty, B. A., C. Hill, J. F. Weidman, D. R. Richardson, J. C. Venter, and R. P. Ross. 1998. Sequence and analysis of the 60 kb conjugative, bacteriocin-producing plasmid pMRC01 from Lactococcus lactis DPC3147. Mol. Microbiol. 29:1029-1038. Duan, K., C.-Q. Liu, S. Supple, and N. W. Dunn. 1998. Involvement of antisense RNA in replication control of the lactococcal plasmid pND324. FEMS Microbiol. Lett. 164:419-426. Duan, K., C.-Q. Liu, J. Ren, and N. W. Dunn. 1999. Nucleotide sequence and thermostability of pND324, a 3.6-kb plasmid from Lactococcus lactis. Appl. Microbiol. Biotechnol. 53:36-42. Eaton, T. J., and M. J. Gasson. 2001. Molecular screening of Enterococcus virulence determinants and potential for genetic exchange between food and medical isolates. Appl. Environ. Microbiol. 67:1628-1635. Eberhard, W.G. 1989. Why do bacterial plasmids carry some genes and not others? Plasmid 21:167-174. Eguchi, T., K. Doi, K. Nishiyama, S. Ohmomo, and S. Ogata. 2000. Characterization of a phage resitance plasmid, pLKS, of silage-making Lactobacillus plantarum NGRI0101. Biosci. Biotechnol. Biochem. 64:751-756.
37
Émond, E., R. Lavall Ée, G. Drolet, S. Moineau, and G. Lapointe. 2001. Molecular characterization of a theta replication plasmid and its use for development of a two-component food-grade cloning system for Lactococcus lactis. Appl. Environ. Microbiol. 67:1700-1709. Espinosa, M., G. del Solar, F. Rojo, and J. C. Alonso. 1995. Plasmid rolling circle replication and its control. FEMS Microbiol. Lett. 130:111-120. Fernández, M., A. Margolles, J. E. Suárez, and B. Mayo. 1999. Duplication of the β-galactosidase gene in some Lactobacillus plantarum strains. Int. J. Food Microbiol. 48:113-123. Fitzgerald, G. F., and M. J. Gasson. 1988. In vivo gene transfer systems and transposons. Biochimie 70:489-502. Foley, S., S. Bron, G. Venema, C. Daly, and G. F. Fitzgerald. 1996. Molecular analysis of the replication origin of the Lactococcus lactis plasmid pCI305. Plasmid 36:125-141. Fons, M., T. Hege, M. Ladire, P. Raibaud, R. Ducluzeau, and E. Maguin. 1997. Isolation and characterization of a plasmid from Lactobacillus fermentum conferring erythromycin resistance. Plasmid 37:199-203. Forde, A., and G. F. Fitzgerald. 1999. Bacteriophages defence systems in lactic acid bacteria. Antonie van Leeuwenhoek 76:89-113. Franz, C. M. A., A. B. Muscholl-Silberhorn, N. M. K. Yousif, M. Vancanneyt, J. Swings, and W. H. Holzpfel. 2001. Incidence of virulence factors and antibiotic resistance among enterococos isolated from food. Appl. Environ. Microbiol. 67:4385-4389. Fraser, C. M., S. Casjens, W. M. Huang, G. G. Sutton, R. Clayton et al. 1997. Genomic sequence of a lyme disease spirochaete, Borrelia burgdorferi. Nature 390:580-586. Fremaux, C., M. Aigle, and A. Lonvaud-Funel. 1993. Sequence analysis of Leuconostoc oenos DNA: organization of pLo13, a cryptic plasmid. Plasmid 30:212-223. Frère, J., M. Novel, and G. Novel. 1993. Molecular analysis of the Lactococcus lactis subsp. lactis CNRZ270 bidirectional theta replicating lactose plasmid pUCL22. Mol. Microbiol. 10:1113-1124. Gasson, M. J., and F. L. Davies. 1980. Conjugal transfer of the drug resistance plasmid pAMβ1 in lactic streptococci. FEMS Microbiol. Lett. 9:99-102. Gasson, M. J. 1984. Transfer of sucrose fermenting ability, nisin resistance and nisin production into Streptococcus lactis 712. FEMS Microbiol. Lett. 21:7-10. Gasson, M. J., and F. L. Davies. 1984. The genetics of lactic acid bacteria. In, Advances in Microbiology and Biochemistry of Cheese and Fermented Milk F. L. Davies and B. A. Law (Eds.). pp. 99-126. Elsevier Applied Science Publishers, NY. Gasson, M. J. 1990. In vivo genetics systems in lactic acid bacteria. FEMS Microbiol. Rev. 87:43-60. Gasson, M. J., S. Swindell, S. Maeda, and H. M. Dodd. 1992. Molecular rearrangement of lactose plasmid DNA associated with high-frecuency transfer and cell aggregation in Lactococcus lactis. Mol. Microbiol. 6:3213-3220. Gerdes, K., J: Møller-Jensen, and R. B. Jensen. 2000. Plasmid and chromosome partitioning: surprises from phylogeny. Mol. Microbiol. 37:455-466.
38
Gilbert, C., D. Atlan, B. Blanc, R. Portailer, J. E. Germond, L. Lapierre, and B. Mollet. 1996. A new cell surface proteinase: sequencing and analysis of the prtB gene from Lactobacillus delbruekii subsp. bulgaricus. J. Bacteriol. 178:3059-3065.
Gfeller, K. Y., M. Roth, L. Meile, and M. Teuber. 2003. Sequence and genetic organization of the 19.3-kb erythromycin- and dalfopristin-resistance plasmid pLME300 from Lactobacillus fermentum ROT1. Plasmid 50:190-201. Gonzalez, L. F., and B. S. Kunka. 1985. Transfer of sucrose fermenting ability and nisin production phenotype among lactic streptococci. Appl. Environ. Microbiol. 49:627-633. Gravesen, A., J. Josephen, A. von Wright, and F. K. Vogensen. 1995. Characterization of the replicon from the lactococcal theta-replicating plasmid pJW563. Plasmid 34:105-118. Gruss, A. D., and S. D. Ehrlich. 1989. The family of highly interrelated single-stranded deoxyribonucleic acid plasmids. Microbiol. Rev. 53:231-241. Harmon, K. S., and L. L. McKay. 1987. Restriction enzyme analysis of lactose and bacteriocin plasmids from Streptococcus lactis subsp. diacetylactis WM4 and cloning of BclII fragments coding for bacteriocin production. Appl. Environ. Microbiol. 53:1171-1174. Hashiba, H., R. Takiguchi, K. Joho, K. Aoyama, and T. Hirota. 1993. Identification of the replication region of Streptococcus thermophilus No. 29 plasmid pST1. Biosci. Biotechnol. Biochem. 57:1646-1649. Hayes, F., P. Vos, G. F. Fitzgerald, W. M. de Vos, and C. Daly. 1991. Molecular organization of the minimal replicon of novel narrow-host-range lactococcal plasmid pCI305. Plasmid 25:16-26. Hefford, M. A., R. M. Teather, and R. J. Forster. 1993. The complete nucleotide sequence of small cryptic plasmid from a rumen bacterium of the genus Butyrivibrio. Plasmid 29:63-69. Helmark, S., M. E. Hansen, B. Jelle, K. I. Sorensen, and P. R. Jensen. 2004. Transformation of Leuconostoc carnosum 4010 and evidence for natural competence of the organism. Appl. Environ. Microbiol. 70:3695-3699. Heng, N. C., J. M. Bateup, D. M. Loach, X. Wu, H. F. Jenkinson, M. Morrison, and G. W. Tannock. 1999. Influence of different functional elements of plasmid pGT232 on maintenance of recombinant plasmids in Lactobacillus reuteri populations in vitro and in vivo. Appl. Environ. Microbiol. 65:5378-5385. Hill, C., and R. P. Ross. 1998. Starter cultures for the dairy industry. In, Genetic Modification in the Food Industry. S. Roller and S. Harlander (Eds.). Blackie Academic and Professional, London. Hinnebusch, J., and H. Tilly. 1993. Linear plasmids and chromosomes in bacteria. Mol. Microbiol. 10:917-922. Horn, N., S. Swindell, H. Dodd, and M. J. Gasson. 1991. Nisin biosynthesis genes are encoded by a novel conjugative transposon. Mol. Gen. Genet. 228:129-35. Horng, J. S., K. M. Polzin, and L. L. McKay. 1991. Replication and temperature-sensitive maintenance functions of lactose plasmid pSK11L from Streptococcus lactis subsp. cremoris. J. Bacteriol. 173:7573-7581. Itoh, T., and J. Tomizawa. 1980. Formation of an RNA primer for initiation of replication of ColE1 DNA by ribonuclease H. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:2450-2454. Itoh, T., and T. Horii. 1989. Replication of ColE2 and ColE3 plasmids: In vitro replication dependent on plasmid-coded functions. Mol. Gen. Genet. 219:249-255.
39
Janhs, A., A. Schäfer, A. Geis, and M. Teuber. 1991. Identification, cloning and sequencing of the replication region of Lactococcus lactis ssp. lactis biovar. diacetylactis Bu2 citrate plasmid pSL2. FEMS Microbiol. Lett. 80:253-258. Janzen, T., J. Kleinschmidt, H. Neve, and A. Geis. 1992. Sequencing and characterization of pST1, a cryptic plasmid from Streptococcus thermophilus. FEMS Microbiol. Lett. 74:175-180. Jeong, J.-Y., G.-M. Yoon, K.-S. Seo, M. J. Cho, H. Sakai, T. Komano, and J.-D. Bahk. 1997. Functional features of an ssi signal of plasmid pGKV21 in Escherichia coli. J. Bacteriol. 179:5795-5801. Josson, K., P. Soetaert, F. Michiels, H. Joos, and J. Mahillon. 1990. Lactobacillus hilgardii plasmid pLAB1000 consists of two functional cassettes commonly found in other gram-positive organisms. J. Bacteriol. 172:3089-3099. Kanatani, K., T. Tahara, M. Oshimura, K. Sano, and C. Umezawa. 1995. Identification of the replication region of Lactobacillus acidophilus plasmid pLA103. FEMS Microbiol. Lett. 133:127-130. Kanatani, K., M. Oshimura, and K. Sano. 1995. Isolation and characterization of acidocina A and cloning of the bacteriocin gene from Lactobacillus acidophilus. Appl. Environ. Microbiol. 61:1061-1607. Kearney, K., G. F. Fitzgerald, and J. F. M. L. Seegers. 2000. Identification and characterization of an active plasmid partition mechanism for the novel Lactococcus lactis plasmid pCI2000. J. Bacteriol. 182:30-37. Kelman, Z., and M. O’Donnell. 1995. DNA polymerase III holoenzyme: structure and fuction of a chromosomal replicating machine. Annu. Rev. Biochem. 64:171-200. Kempler, G. M., and L. L. McKay. 1979. Genetic evidence for plasmid-linked lactose metabolism in Streptococcus lactis subsp. diacetylactis. Appl. Environ. Microbiol. 37:316-319. Khan, S. A. 1996. Mechanism of replication and copy number control of plasmids in Gram-positive bacteria. Genet. Eng. 18:183-201. Khan, S. A 1997. Rolling-circle replication of bacterial plasmids. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 61:442-455. Kiewiet, R., S. Bron, K. de Jonge, G. Venema, and J. F. M. L. Seegers. 1993. Theta replication of the lactococcal plasmid pWV02. Mol. Microbiol. 10:319-327. Kittell, B.L., and D. R. Helinski. 1992. Plasmid incompatibility and replication control. In, Bacterial Conjugation. D. B. Clewell (Ed.). pp. 223-242. Plenum Press, NY. Klein, J. R., C. Ulrich, and R. Plapp. 1993. Characterization and sequence analysis of a small cryptic plasmid from Lactobacillus curvatus LTH683 and its use for construction of new Lactobacillus cloning vectors. Plasmid 30:14-29. Kleerebezem, M., J. Boekhorst, R. van Kranenburg, D. Molenaar, O. P. Kuipers, R. Leer, R. Tarchini, S. A. Peters, H. M. Sandbrink, M. W. E. J. Fiers, W. Siekema, R. M. Klein Lankhorst, P. A. Bron, S. M. Hoffer, M. N. Nierop Groot, R. Kerkhoven, M. de Vries, B. Ursing, W. M. de Vos, and R. Siezen. 2003. Complete genome sequence of Lactobacillus plantarum WCFS1. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:1990-1995. Kok, J. 1991. Special-purpose vectors for lactococci. In, Genetics and Molecular Biology of Streptococci, Lactococci and Enterococci. III. Lactococci: Molecular Biology and Biotechnology. pp. 97-102G. M. Dunny, P. P. Clearly, and L. L. McKay (Eds.). ASM, Washington DC. Kok, J., and W. M. de Vos. 1994. The proteolytic system of lactic acid bacteria. In, Genetics and Biotechnology of Lactic Acid Bacteria. M. J. Gasson and W. M. de Vos (Eds.). pp. 169-210. Blackie and Professional, London. Kornberg, A., and T. Baker. 1992. DNA Replication. W. H. Freeman & Co., NY.
40
Leahy, S. C, D. G. Higgins, G. F. Fitzgerald, and D. van Sinderen. 2005. Getting better with bifidobacteria. J. Appl. Microbiol. 98:1303-1315. Le Bourgeois, P. M.-L. Daveran-Mingot, and P. Ritzenthaler. 2000. Genome plasticity among related Lactococcus strains: identification of genetic events associated with macrorestriction polymorphism. J. Bacteriol. 182:2481-2491. Lederberg, J., L. L. Cavalli-Sforza, and E. M. Lederberg. 1952. Sex compatibility in Escherichia coli. Genetics 37:720-730. Lee, J. H., and D. J. O’Sullivan. 2006. Sequence analysis of two cryptic plasmids from Bifidobacterium longum DJO10A and construction of a shuttle cloning vector. Appl. Environ. Microbiol. 72:527-535. Lee, L. J., J. B. Hansen, E. K. Jagusztyn-Krynicka, and M. B. Chassy. 1982. Cloning and expression of the β-D-phosphogalactosidase galactohydrolase gene of Lactobacillus casei in Escherichia coli. J. Bacteriol. 152:1138-1146. Leenhouts, K. J., B. Tolner, S. Bron, J. Kok, G. Venema, and J. F. M. L. Seegers. 1991. Nucleotide sequence and characterization of the broad-host-range lactococcal plasmid pWV01. Plasmid 26:55-66. Leer, R. J., N. van Luijk, M. Posno, and P. H. Pouwels. 1992. Structural and functional analysis of two cryptic plasmids from Lactobacillus pentosus MD353 and Lactobacillus plantarum ATCC8014. Mol. Gen. Genet. 234:265-274. Liu, C. Q., N. Khuajakr, L. G. Chiu, Y. M. Deny, P. Charoenchai, and N. W. Dunn. 1997. Genetics analysis of a region involved in replication and cadmium resitance of the plasmid pND302 from Lactococcus lactis. Plasmid 38:79-90. Liu, C. F., Z. F. Fung, C. L. Wu, and T. C. Chung. 1996. Molecular characterization of a plasmid-borne (pTC82) chloramphenicol resistance determinant (catTC) from Lactobacillus reuteri G4. Plasmid 36:116-124. Liu, M. L., J. K. Kondo, M. B. Barnes, and D. T. Bartholomew. 1988. Plasmid-linked maltose utilization in Lactobacillus species. Biochimie 70:351-355. Lucey, M., C. Daly, and G. Fitzgerald. 1993. Identification and sequence analysis of the replication region of the phage resistance plasmid pCI528 from Lactococcus lactis subsp. cremoris UC503. FEMS Microbiol. Lett. 110:249-256. Madsen, S. M., L. Andrup, and L. Boe. 1993. Fine mapping and DNA sequence of replication functions of Bacillus thuringiensis plasmid pTX14-3. Plasmid 30:119-130. Maiden, M. 1998. Horizontal gene exchange, evolution and spread of antibiotic resistance in bacteria. Clin. Infect. Dis. 27:S12-20. Martín, M., M. A. Corrales, D. de Mendoza, P. López, and C. Magni. 1999. Cloning and molecular characterization of the citrate utilization citMCDEFGRP cluster of Leuconostoc paramesenteroides. FEMS Microbiol. Lett. 174:231-238. Mayo, B., C. Hardisson, and A. F. Braña. 1989. Selected characteristics of several strains of Lactobacillus plantarum. Microbiología SEM 5:105-112. McKay, L. L., and K. A. Baldwin. 1975. Plasmid distribution and evidence for a proteinase plasmid in Streptococcus lactis C2. Appl. Microbiol. 29:546-548. McKay, L. L. 1983. Functional properties of plasmids in lactic streptococci. Antonie van Leeuwenhoek J. Microbiol. Serol. 49:259-274. Mercenier, A. 1990. Molecular genetics of Streptococcus thermophilus. FEMS Microbiol. Rev. 87:61-77.
41
Mills, S., O. E. McAuliffe, A. Coffey, G. F. Fizgerald, and R. P. Ross. 2006. Plasmids of lactococci. Genetic accessories or genetic necessities. FEMS Microbiol. Rev. 30:243-273. Muriana, M. P., and T. R. Klaenhammer. 1987. Conjugal transfer of plasmid-encoded determinants for bacteriocin production and immunity in Lactobacillus acidophilus 88. Appl. Environ. Microbiol. 53:553-560. Nardi, M., P. Renault, and V. Monnet. 1997. Duplication of the pepF gene and shuffling of DNA fragments on the lactose plasmid of Lactococcus lactis. J. Bacteriol. 179:4164-4171. Nelson, K. E., R. A. Clayton, S. R. Gill, M. L. Gwinn, et al. 1999. Evidence for lateral gene transfer between archaea and bacteria from genome sequence of Thermotoga maritima. Nature 399:323-329. Neve, H., A. Geis, and M. Teuber. 1984. Conjugal transfer and characterization of bacteriocin plasmids in group N (lactic acid) streptococci. J. Bacteriol. 113:833-838. Nissen-Meyer, J., D. Lillehaug, and I. F. Nes. 1992. The plasmid-encoded lactococcal envelope-associated proteinase is enconded by a chromosomal gene in Lactococcus lactis subsp. cremoris BC101. Appl. Environ. Microbiol. 58:750-753. Nölling, J., G. Breton, M. V. Omelchenko, K. S. Makarova, Q. Zeng, et al. 2001. Genome sequence and comparative analysis of the solvent-producing bacterium Clostridium acetobutylicum. J. Bacteriol. 183:4823-4838. Nordström, K., and S. J. Austin. 1989. Mechanisms that contribute to stable segregation of plasmids. Ann. Rev. Genet. 23:37-69. Nordström, K. 1990. Control of plasmid replication. How do DNA iterons set the replication frecuency? Cell 63:1121-1124. Obst, M., E. R. Meding, R. F. Vogel, and W. P. Hammes. 1995. Two genes encoding the beta-galactosidase of Lactobacillus sake. Microbiol. 141:3059-3066
O’Driscoll, J., F. Glynn, G. F. Fizgerald, and D. van Sinderen. 2006. Sequence analysis of the lactococcal plasmid pNP40: a mobile replicon for coping with environmental hazards. J. Bacteriol. 188:6629-6639. O’Riordan, K., and G. F. Fitzgerald. 1999. Molecular characterisation of a 5.75-kb cryptic plasmid from Bifidobacterium breve NCFB 2258 and determination of mode of replication. FEMS Microbiol. Lett. 174:285-294. O’Sullivan, T., D. van Sinderen, and G. Fitzgerald. 1999. Structural and functional analysis of pCI65st a 6.5-kb plasmid from Streptococcus thermophilus NDI-6. Microbiol. 145:127-134. O’Sullivan, D., R. P. Ross, D. P. Twomey, G. F. Fitzgerald, C. Hill and A. Coffey. 2001. Naturally occurring lactococcal plasmid pAH90 links bacteriophage resistance and mobility functions to a food-grade selectable marker. Appl. Environ. Microbiol. 67:929-937. Park, M. S., K. H. Lee, and G. E. Ji. 1997. Isolation and characterization of two plasmids from Bifidobacterium longum. Lett. Appl. Microbiol. 25:5-7. Pedersen, M. L., K. R. Arnved, and E. Johansen. 1994. Genetic analysis of the minimal replicon of the Lactococcus lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis citrate plasmid. Mol. Gen. Genet. 244:374-382. Perreten, V., F. Schwarz, L. Cresta, M. Boeglin, G. Dasen, and M. Teuber. 1997. Antibiotic resistance spread in food. Nature 389:801-802.
42
Pillidge, C. J., W. M. Cambourn, and L. E. Pearce. 1996. Nucleotide sequence of pWC1, a pC194-type rolling circle replicon in Lactococcus lactis. Plasmid 35:131-140. Powels, P. H., and R. J. Leer. 1993. Genetics of lactobacilli: plasmids and gene expression. Antonie van Leeuwenhoek J. 64:85-107. Powels, P. H., N. van Luijk, R. J. Leer, and M. Posno. 1994. Control of replication of the Lactobacillus pentosus plasmid p353-2: evidence for a mechanism involving transcription attenuation of the gene coding for the replication protein. Mol. Gen. Genet. 242:614-622. Prévots, F., F. Remy, M. Mata, and P. Ritzenthaler. 1994. Isolation and characterization of large lactococcal phage resistance plasmids by pulsed-field gel electrophoresis. FEMS Microbiol. Lett. 117:7-14. Pridmore, D., Stefanova, and B. Mollet. 1994. Cryptic plasmids from Lactobacillus helveticus and their evolutionary relationships. FEMS Microbiol. Lett. 124:301-305. Raha, A. R., E. Ross, K. Yusoff, M. Y. Manap, and A. Ideris. 2002. Characterization and molecular cloning of an erythromycin resistance plasmid of Lactococcus lactis isolated from chicken cecum. Biochem. Mol. Biol. Biophys. 6:7-11. Rauch, P. J. G., and W. M. de Vos. 1992. Characterization of the novel nisin-sucrose conjugative transposon Tn5276 and its insertion in Lactococcus lactis. J. Bacteriol. 174:1280-1287. Rauch, P. J. G., and W. M. de Vos. 1994. Transposition of the Lactococcus lactis conjugative transposon Tn5276: identification and characterization of genes involved in excision. J. Bacteriol. 176:2165-2171. Rauch, P. J. G., M. M. Beerthuyzen, and W. M. de Vos. 1994. Distribution and evolution of nisin-sucrose elements in Lactococcus lactis. Appl. Environ. Microbiol. 60:1798-1804 Reanney, D. 1976. Extrachromosomal elements as posible agents of adaptation and development. Bacteriol. Rev. 40:552-590. Romero, D. A., and T. R. Klaenhammer. 1993. Transposable elements in lactococci: a review. J. Dairy Sci. 76:1-19. Rossi, M., P. Brigidi, V. Gonzalez, and D. Matteuzzi. 1996. Characterization of the plasmid pMB1 from Bifidobacterium longum and its use for shuttle vector construction. Res. Microbiol. 147:133-143. Roussel, Y., C. Colmin, J. M. Simonet, and B. Decaris. 1993. Strain characterization, genome size and plasmid content in the Lactobacillus acidophilus group (Hansen and Mocquot). J. Appl. Bacteriol. 74:549-556. Ruiz-Barba, J. L., J.-C. Piard, and R. Jiménez. 1991. Plasmid profiles and curing of plasmids in Lactobacillus plantarum strains isolated from green olive fermentations. J. Appl. Bacteriol. 71:417-421. Sakai, H., and T. Komano. 1996. DNA replication of the IncQ broad-host-range plasmids in gram-negative bacteria. Biosci. Biotechnol. Biochem. 60:377-382. Sánchez, C., A. Hernández de Rojas, B. Martínez, M. E. Argüelles, J. E. Suárez, A. Rodríguez, and B. Mayo. 2000. Nucleotide sequence and analysis of pBL1, a bacteriocin-producing plasmid from Lactococcus lactis IPLA972. Plasmid 44:239-249. Sánchez, C. 2002. Clonación, secuencia y análisis de plásmidos de Lactococcus lactis y su empleo en la construcción de herramientas biotecnológicas. Tesis Doctoral, Universidad de Oviedo. Sánchez, C., and B. Mayo. 2003. Sequence and analysis of pBM02, an RCR cryptic plasmid from Lactococcus lactis subsp. cremoris P8-2-47. Plasmid 49:118-129.
43
Sano, K., M. Otani, Y. Okada, R. Kawamura, M. Umesaki, Y. Ohi, C. Umezawa, and K. Kanatani. 1997. Identification of the replication region of the Lactobacillus acidophilus plasmid pLA106. FEMS Microbiol. Lett. 148:223-226. Scardovi, V. 1986. Genus Bifidobacterium. In, Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology, P. H. A. Sneath, N.
S. Mair, M. E. Sharpe, and J. G. Holt (eds). Vol. 2. pp. 1418-1434.Williams and Wilkins, USA. Schäfer, A., A. Jahns, A. Geis, and M. Teuber. 1991. Distribution of the IS elements ISS1 and IS904 in lactococci. FEMS Microbiol. Lett. 80:311-318. Schell, M. A., M. Karmirantzou, B. Snel, D. Vilanova, B. Berger, G. Pessi, M.-C. Zwahlen, F. Desire, P. Bork, M. Delley, R. D. Pdridmore, and F. Arigoni. 2002. The genome sequence of Bifidobacterium longum reflects its adaptation to the human gastrointestinal tract. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:14422-14427. Scherwitz, K., K. A. Baldwin, and L. L. McKay. 1983. Plasmid linkage of a bacteriocin-like sustance in Streptococcus lactis subsp. diacetylactis strain WM4: transferability to Streptococcus lactis. Appl. Environ. Microbiol. 45:1506-1512. Schmidt, B. F., T. J. Royer, S. Yoast, and B. Poolman. 1990. The lactose transport gene from Lactobocillus delbrueckii subsp. bulgaricus: part of the lactose operon as in Streptococcus thermophilus. FEMS Microbiol. Rev. 87:Abstract, P18-A26. Schouler, C., F. Clier, A. L. Lerayer, S. D. Erlich, and M. C. Chopin. 1998a. A type IC restriction-modification system in Lactococcus lactis. J. Bacteriol. 180:407-411. Schouler, C., M. Gautier, S. D. Erlich, and M. C. Chopin. 1998b. Combinational variation of restriction modification specificities in Lactococcus lactis. Mol. Microbiol. 28:169-178. Schroeder, C. J., C. Robert, G. Lenzen, L. L. McKay, and A. Mercenier. 1991. Analysis of the lacZ sequences from two Streptococcus thermophilus strains: comparison with the Escherichia coli and Lactobacillus bulgaricus β-galactosidase sequences. J. Gen. Microbiol. 137:369-380. Seegers, J. F. M. L., S. Bron, C. M. Franke, G. Venema, and R. Kiewiet. 1994. The majority of lactococcal plasmids carry a highly related replicon. Microbiol. 140:1292-1300. Seegers, J. F. M. L., A. C. Zhao, W. J. J. Meijer, S. A. Khan, G. Venema, and S. Bron. 1995. Structural and functional analysis of the single-strand origin of replication from the lactococcal plasmid pWV01. Mol. Gen. Genet. 249:43-50. Seegers, J. F. M. L., D. van Sinderen, and G. F. Fitzgerald. 2000. Molecular characterization of the lactococcal plasmid pIS3 natural stacking of specific subunits of a type I restriction/modification system on a single lactococcal strain. Microbiol. 146:435-443. Sgorbati, B., V. Scardovi, and D. J. Leblanc. 1982. Plasmids in the genus Bifidobacterium. J. Gen. Microbiol. 128:2121-2131. Shimizu-kadota, M. 1988. Cloning and expression of the phospho-beta-galactosidase genes on the lactose plasmid and the chromosome of Lactobacillus casei C257 in Escherichia coli. Biochimie 70:523-529. Siezen, R. J. 1999. Multi-domain, cell-envelope proteinases of lactic acid bacteria. Antonie van Leeuwenhoek J. 76:139-155. Siezen, R. J., B. Renckens, I. van Swam, S. Peters, R. van Kranenburg, M. Klerebeezem, and W. M. de Vos. 2005. Complete sequences of four plasmids of Lactococcus lactis subsp. cremoris SK11 reveal extensive adaptation to the dairy environment. Appl. Environ. Microbiol. 71:8371-8382. Skaugen, M. 1989. The complete sequence of a small cryptic plasmid from Lactobacillus plantarum. Plasmid 22:175-179.
44
Solaiman, D. K., and G. A. Somkuti. 1998. Characterization of a novel Streptococcus thermophilus rolling-circle plasmid used for vector construction. Appl. Microbiol. Biotechnol. 50:174-180. Solow, B. T., and G. A. Somkuti. 2000. Comparison of low molecular-weight heat stress proteins encoded on plasmids in different strains os Streptococcus thermophilus Curr. Microbiol. 41:177-181. Somkuti, G. A., and D. H. Steinberg. 1988. Genetic transformation of Streptococcus thermophilus by electroporation. Biochimie 70:579-585. Somkuti, G. A., D. K. Y. Solaiman, and D. H. Steinberg. 1998. Structural and functional properties of the hsp16.4-bearing plasmid pER341 in Streptococcus thermophilus. Plasmid 40:61-72. Sorvig, E., M. Skaugen, K. Naterstad, V. G. Eijsink, and L. Axelsson. 2005. Plasmid p256 from Lactobacillus plantarum represents a new type of replicon in lactic acid bacteria, and contains a toxin-antitoxin-like plasmid maintenance system. Microbiology 151:421-431. Steele, J. L., and L. L. McKay. 1986. Partial characterization of the genetic basis for sucrose metabolism and nisin production in Streptococcus lactis. Appl. Environ. Microbiol. 51:57-64. Syvanen, M. 1985. Cross-species gene transfer: implications for a new theory of evolution. J. Theor. Biol. 112:333-343. Takami, H., K. Nakasone, Y. Takami, G. Maeno, R. Sasaki, et al. 2000. Complete genome sequence of the alkaliphilic bacterium Bacillus halodurans and genomic sequence comparison with Bacillus subtilis. Nuc. Acid Res. 28:4317-4331. Takechi, S., H. Matsui, and T. Itoh. 1995. Primer RNA synthesis by plasmid-specific Rep protein for initiation of ColE2 DNA replication. EMBO J. 14:5141-5147. Takiguchi, R., H. Hashiba, K. Aoyama, and S. Ishii. 1989. Complete nucleotide sequence and characterization of a cryptic plasmid from Lactobacillus helveticus subsp. jugurti. Appl. Environ. Microbiol. 55:1653-1655. Tanaka, T., and M. Ogura. 1998. A novel Bacillus natto plasmid pLS32 capable of replication in Bacillus subtilis. FEBS Lett. 422:243-246. Tannock, G. W., J. B. Luchansky, L. Miller, H. Connell, S. Thode-Andersen, A. A. Mercer, and T. R. Klaenhammer. 1994. Molecular characterization of a plasmid-borne (pGT633) erythromycin resistance determinant (ermGT) from Lactobacillus reuteri. Plasmid 31:60-71. Teuber, M., L. Meile, and F. Schwartz. 1999. Adquired antibiotic resistance in lactic acid bacteria from food. Antonie van Leeuwenhoek 76:115-137. Thomas, C. M. 1988. Recent studies on the control of plasmid replication. Biochem. Biophys. Acta 949:253-263. Thompson, J. K., S. Foley, K. J. McConville, C. Nicholson, M. A. Collins, and R. D. Pridmore. 1999. Complete sequence of plasmid pLH1 from Lactobacillus helveticus ATCC15009: analysis reveals the presence of regions homologous to other native plasmids from the host strain. Plasmid 42:221-235. Tichaczek, P. S., R. F. Vogel, and W. P. Hammes. 1993. Cloning and sequencing of curA encoding curvacin A, the bacteriocin produced by Lactobacillus curvatus LTH1174. Arch. Microbiol. 160:279-283. Turgeon, N., and S. Moineau. 2001. Isolation and characterization of a Streptococcus thermophilus plasmid closely related to pMV158 family. Plasmid 45:171-183.
45
van Kranenburg, R., and W. M. de Vos 1998. Characterization of multiple regions involved in replication and mobilization of plasmid pNZ4000 coding for exopolysaccharide production in Lactococcus lactis. J. Bacteriol. 180:5285-5290. van Kranenburg, R., N. Golic, R. Bongers, R. J. Leer. W. M. de Vos, R. J. Siezen, and M. Kleerebezem. 2005. Functional analysis of three plasmids from Lactobacillus plantarum. Appl. Environ. Microbiol. 71:1223-1230. Vaughan, E. E., S. David, A. Harrington, C. Daly, G. F. Fitzgerald, and W. M. de Vos. 1995. Characterization of plasmid-encoded citrate-permease (citP) genes from Leuconostoc species reveals high sequence conservation with the Lactococcus lactis citP gene. Appl. Environ. Microbiol. 61:3172-3176. Vaughan, E. E., R. D. Pridmore, and B. Mollet. 1998. Transcriptional regulation and evolution of lactose genes in the galactose-lactose operon of Lactococcus lactis NCDO2054. J. Bacteriol. 180:4893-4902. von Wright, A., and S. Tynkkynen. 1987. Construction of Streptococcus lactis subsp. lactis strains with a single plasmid associated with mucoid phenotype. Appl. Environ. Microbiol. 53:1385-1386. von Wright, A., and K. Räty. 1993. The nucleotide sequence for the replication region of pSV40, a lactococcal food grade cloning vector. Lett. Appl. Microbiol. 17:25-28. Vujcic, M., and L. Topisirovic. 1993. Molecular analysis of the rolling-circle replicating plasmid pA1 of Lactobacillus plantarum A112. Appl. Environ. Microbiol. 59:274-280. Walsh, P. M., and L. L. McKay. 1981. Recombinant plasmid associated with cell aggregation and high-frecuency conjugation of Streptococcus lactis ML3. J. Bacteriol. 146:937-944. Walsh, P. M., and L. L. McKay. 1982. Restriction endonuclease analysis of the lactose plasmid in Streptococcus lactis ML3 and two recombinant lactose plasmids. Appl. Environ. Microbiol. 43:1006-1010. Wang, T. T., and B. H. Lee. 1997. Plasmids in lactobacilli. Crit. Rev. Biotechnol. 17:227-272. Whitehead, T. R., and M. A. Cotta. 2001. Sequence analysis of a broad host-range plasmid containing ermT from a tylosin-resistant Lactobacillus spp. isolated from swine faeces. Curr. Microbiol. 43:17-20. Williams, D. R., and C. M. Thomas. 1992. Active partitioning of bacterial plasmids. J. Gen. Microbiol. 138:1-16. Xu, F.-F., L. E. Pearce, and P. L. Yu. 1991. Genetic analysis of a lactococcal replicon. Mol. Gen. Genet. 227:33-39. Yildirim, Z., D. K. Winters, and M. G. Johnson. 1999. Purification, amino acid sequence and mode of action of bifidocin B produced by Bifidobacterium bifidum NCFB 1454. J. Appl. Microbiol. 86:45-54. Zúñiga, M., I. Pardo, and S. Ferrer. 1996. Nucleotide sequence of plasmid p4028, a cryptic plasmid from Leuconostoc oenos. Plasmid 36:67-74. Zwahlen, M.-C., and B. Mollet. 1993. Characterization of the lacZ gene and discovery of a novel IS element (ISL2) in Lactobacillus helveticus. FEMS Microbiol. Rev. 12:Abstract P27-B9.
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47
Tabla 1.- Plásmidos de los géneros y especies más típicos de las bacterias lácticas y de las bifidobacterias cuyas regiones de replicación o los plásmidos completos han sido secuenciados.
Especie y cepa
Plásmido
Replicón tipo
Kpb
Fenotipo relevantea
Nº de secuencia
GeneBankb
Lactococcus
L. lactis pCRL291.1 Theta 4,6 - AF380336 L. lactis DCH-4 pSRQ700 Theta/RCM 7,8 R/M U16027 L. lactis subsp. cremoris W10 pEW104 Theta - R/M LlaGI AF097471 L. lactis subsp. cremoris 2204 pWC1 RCM 2,8 - L75827 L. lactis subsp. cremoris HO2 pCI605 Theta 4,5 Sistema de R/M de tipo I AF142640 L. lactis subsp. cremoris HP pHP003 Theta 13,4 Proteinasa extracelular AF247159 L. lactis subsp. cremoris NCDO712 pSH71 RCM 2,1 - A09338 L. lactis subsp. cremoris P8-2-47 pBM02 RCM 3,8 Mov AY026767 L. lactis subsp. cremoris SK11 pSK11A Theta 10,4 Mov DQ149242 L. lactis subsp. cremoris SK11 pSK11B Theta 13,3 α-acetolactato decarboxilasa DQ149243 L. lactis subsp. cremoris SK11 pSK11L Theta 47,2 Mov, Lactosa, PepO, PepF1, Opp DQ149244 L. lactis subsp. cremoris SK11 pSK11P Theta 75,8 Mov, Proteinasa, resistencia a Cu DQ149245 L. lactis subsp. cremoris UC503 pCI528 Theta 46 Resistencia a fagos L06274 L. lactis subsp. cremoris W12 pAW122 Theta - Especificidad R/M 1C AF097472 L. lactis subsp. cremoris W56 pJW563 Theta 11,5 Sistema de R/Mde tipo II X85168 L. lactis subsp. cremoris W60 pAW601 Theta - ABI S AJ132009 L. lactis subsp. cremoris Wg2 pWV01 RCM 2,2 - X56954 L. lactis subsp. cremoris Wg2 pWV02 Theta 3,8 - Z22704 L. lactis subsp. cremoris Wg2 pWV04 Theta 19 - Z25476 L. lactis subsp. cremoris Wg2 pWV05 Theta 27 Proteinasa Z25477 L. lactis subsp. lactis pND302 Theta 8,8 Resistencia a Cd U79032 L. lactis subsp. lactis pCIS3 Theta 6,1 R/M tipo I, transportador de Mg AF153414 L. lactis subsp. lactis 5136 pDI25 RCM 5,5 - X54310 L. lactis subsp. lactis CNRZ270 pUCL22 Theta 55 Lactosa y proteinasa X60454 L. lactis subps. lactis LL57-1 pND324 Theta 3,6 Termoestabilidad U44843 L. lactis subps. Lactis M14 pAR141 RCM 1,6 - DQ288662 L. lactis subsp. lactis diacetylactis pCT1138 Theta 8,3 Citrato permeasa L27067
48
L. lactis subsp. lactis diacetylactis Bu2 pSL2 Theta 7,8 Citrato permeasa X56550 L. lactis subsp. lactis diacetylactis CDR3 pNP40 Theta 65,0 Tra, R/M LlaJI, Abi, Cd resistencia DQ534432 L. lactis subsp. lactis diacetylactis DPC220 pAH33 Theta 6,1 Mov AF207855 L. lactis subsp. lactis diacetylactis DPC721 pAH82 Theta 20,3 R/M, PAI, resistencia a Cd, Mob AF243383 L. lactis subsp. lactis diacetylactis S50 pS7a Theta 7,3 Especificidad R/M AJ550509 L. lactis subsp. lactis diacetylactis S50 pS7b Theta 7,2 Especificidad R/M AJ550510 L. lactis subsp. lactis diacetylactis SSD207 pVS40 Theta 7,8 Citrato permeasa L02920 L. lactis subsp. lactis DPC3147 pMRC01 Theta 60 Lacticina 3147, ABI, Tra AE001272 L. lactis subsp. lactis IL2614 pIL2614 Theta - Sistema de R/M de tipo I U90222 L. lactis subsp. lactis IL594 pIL7 Theta 31 Sistema de R/M Z25475 L. lactis subsp. lactis IL964 pIL103 Theta - Sistema de R/M de tipo I, ABI AF013595 L. lactis subsp. lactis IL964 pIL105 Theta 6,5 ABI AF116286 L. lactis subsp. lactis IPLA972 pBL1 Theta 10,9 Lactococcina 972 AF242367 L. lactis subsp. lactis K214 pK214 Theta 29,8 Resistencia a Sm, Tc y Cm; Mob X92946 L. lactis subsp. lactis MJC15 pCD4 Theta 6,1 Especificidad R/M I AF306799 L. lactis subsp. lactis NCDO275 pCI2000 Theta 60 - AF154674 L. lactis subsp. lactis NIZO B40 pNZ4000 Theta (x4) 42,1 Síntesis de exopolisacárido, Mob AF036485 L. lactis subsp. lactis UC317 pCI305 Theta 8,7 - AF179848 L. lactis W-1 pRSQ800 Theta 7,8 ABI K U35629 L. lactis W-37 pRSQ900 Theta 10,8 ABI Q AF001314
Lactobacillus
L. acidophilus K8912 pLA105 - 3,2 - D49554 L. acidophilus TK8912 pLA103 Theta - - D55703 L. acidophilus TK8912 pLA106 RCM 2,8 Mov D88438 L. casei A23 pSMA23 RCM 3,5 - DQ116709 L. casei CRL705 pRC18 Theta 18 Bacteriocina Lac705 AF200347 L. casei NCIB4114 pLC88 - - Mov U31333 L. curvatus pLC2.5 RCM 3,3 - AF546865 L. curvatus KLC140 pKLCA RCM 1,4 - AY188776 L. curvatus LTH683 pLC2 RCM 2,5 - Z14234 L. delbrueckii subsp. bulgaricus pLBB1 Theta 6,1 Mov AF236060 L. delbrueckii subsp. lactis CRL1212 pL1212 Theta 8,7 Especificidad R/M I AF109691 L. delbrueckii subsp. lactis JCL414 pJBL2 Theta 8,7 Especificidad R/M I AJ421486 L. delbrueckii subsp. lactis NCC88 pN42 Theta 8,1 Especificidad R/M I AJ421627 L. delbrueckii subsp. lactis WS58 pWS58 - 7,9 - Z50864 L. fermentum KC5b pKC5b Theta 4,4 - AF378372
49
L. fermentum LEM89 pLEM3 RCM 5,7 Resistencia a Em U48430 L. fermentum ROT1 pLME300 Theta 19,3 R/M, Mov, resistencia a Em- AJ488494 L. fermentum VKM1311 pLF1311 RCM 2,3 - X74860 L. johnsonii FI9785 p9785S RCM 3,5 - AY86214 L. helveticus ATCC15009 pLH1 Theta 19,3 - AJ222725 L. helveticus ATTC15009 pLH3 - 3,4 - X81979 L. helveticus LBL4 pLH4 - 2,5 - X81980 L. helveticus subsp. jugurti SBT2161 pLJ1 Theta 3,2 - J04240 L. hilgardii pLAB1000 RCM 3,3 - M55222 L. paracasei NFBC338 pCD01 - 19,8 MDR AY662330 L. paracasei NFBC338 pCD02 - 8,5 - AY662331 L. paraplantarum pC7 RCM 2,1 - AF459640 L. pentosus MD353 p353-2 RCM 2,4 - X62347 L. plantarum pC30i1 RCM 2,1 - J03319 L. plantarum pPSC22 RCM 7 - X95843 L. plantarum 5057 pMD5057 Theta 10,8 Resistencia a Tc AF44077 L. plantarum A112 pA1 RCM 2,8 - Z11717 L. plantarum AS1-2986 p2000 RCM 2,0 - AY096004 L. plantarum AS1-2986 p9000 RCM 9,2 Transportador de Mg AY096005 L. plantarum ATTC14917 pLF1 Theta 7,7 Proteína de estrés al frío AF508808 L. plantarum ATTC8014 p8014-2 RCM 1,9 - X62346 L. plantarum BIFI-38 pPB1 RCM 2,9 - NC006399 L. plantarum CCM1904 pLP1 RCM 2,1 - M31223 L. plantarum L137 pLTK2 RCM 2,3 - AB024514 L. plantarum NCDO1088 pLB4 RCM 3,5 - M33531 L. plantarum NC7 p256 Theta nuevo 7,2 Sistema toxina-antitoxina NC006278 L. plantarum NGRI0101 pLKS RCM 2,0 Resistencia a bacteriófagos AB035265 L. plantarum WCFS1 pWCFS101 RCM 1,9 - CR377164 L. plantarum WCFS1 pWCFS102 RCM 2,3 - CR377165 L. plantarum WCFS1 pWCFS103 Theta 36 Tra, resistencia a arsenato y arsenito CR377166 L. reuteri 100-23 pGT232 RCM 5,1 - U21859 L. reuteri AE78 pTE44 - 4,5 Resistencia a Em AY082384 L. reuteri G4 pTC82 RCM - Resistencia a Cm AF183511 L. reuteri N16 pTE15 - - - AF036766 L. sakei pRN500 Theta 12,9 Especificidad R/M AF438419 L. sakei LTH679 pSAK1 Theta 19 - Z50862 L. sakei RV332 pRV500 Theta 13 Sistema de R/M de tipo I- AF438419 Lactobacillus ssp. p121BS - 4,2 Resistencia a Em, Ty AF310974
50
Leuconostoc -
L .citreum 22R p22R Theta 9,9 Mov, resistencia a Cm AJ493278 L .citreum IH3 pIH01 RCM 1,8 - NC006822 L. lactis NCDO533 pCI411 RCM 2,9 - L25529 L. mesenteroides subsp. mesenteroides FR52 pFR18 RCM 1,8 - Z99436 L. mesenteroides subsp. mesenteroides Y110 pTXL1 Theta 2,6 - AJ272077
Oenococcus -
O. oeni PRS1 RCM 2,5 Mov AJ006467 O. oeni pRS2 RCM 2,5 Proteínas de estrés al calor AJ310613 O. oeni pRS3 RCM 3,9 Mov, proteínas de estrés al calor AJ310614 O. oeni 8413 pLo13 RCM 3,9 Mov, proteínas de estrés al calor M95954 O. oeni bOg32 pOg32 RCM 2,5 Mov X86402 O. oeni CECT4028 p4028 - 4,4 - Z29976 Streptococcus thermophilus
S. thermophilus pST1 RCM 2,1 - X65856 S. thermophilus pSMQ172 RCM 4,2 - AF295100 S. thermophilus pER13 RCM 4,1 Sistema de R/M de tipo II AY033392 S. thermophilus pSMQ173b RCM 4,4 - NC005323 S. thermophilus pSMQ308 Theta 8,1 NC005322 S. thermophilus pt38 RCM 2,9 Proteína de estrés al calor AJ566638 S. thermophilus ER1 pER1-2 RCM 4,4 - AJ242478 S. thermophilus NDI-6 pCI65st RCM 6,5 Resistencia al calor AF027167 S. thermophilus No.29 pST1 RCM - S67974 S. thermophilus St0 pSt0 RCM 4,4 Sistema de R/M de tipo II AJ242480 S. thermophilus ST116 pER16 RCM 4,5 Especificidad R/M, prot. estrés AF177166 S. thermophilus ST134 pER341 RCM 2,8 Proteína de estrés al calor AF019139 S. thermophilus ST135 pER35 RCM 9,5 R/M tipo IC, proteína de estrés AF177167 S. thermophilus ST136 pER36 RCM 3,7 Proteína de estrés AF177168 S. thermophilus ST137 pER371 RCM 2,6 - AF022180 S. thermophilus ST2-1 pND103 RCM 3,5 - AY250830 S. thermophilus ST371 pER371 RCM 2,6 - AF022180
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Bifidobacterium -
B. asteroides pAP1 RCM 2,1 - Y11549 B. bifidum B80 pB80 RCM 4,8 Mov DQ305402 B. breve ATCC15698 pNBb1 RCM 2,2 - E17316 B. breve NCFB 2258 pCIBb1 RCM 5,7 Sistema de partición Par NC002133 B. catenulatum L48 pBC1 Theta 2,5 - NC007068 B. longum B2577 pMB1 Theta 1,8 - X84655 B. longum BK51 pTB6 RCM 3,6 Mov NC006843 B. longum DJ10A pDOJH10L RCM 10 Mov NC004252 B. longum DJ10A pDOJH10S Theta 3,6 Mov NC004253 B. longum KJ pKJ36 RCM 3,6 Mov NC002635 B. longum KJ pKJ50 RCM 4,9 Mov NC004978 B. longum NC2705 pBLO1 RCM 3,6 Mov NC004943 B. longum RW041 pNAC2 RCM 3,6 Mov NC004769 B. longum RW041 pNAC3 RCM 10,2 TraA NC004768 B. longum RW048 pNAC1 RCM 3,5 Posible sistema de R/M de tipo II NC004770
a Distinto al de las funciones de replicación. R/M, sistema o componente de un sistema de restricción-modificación; Mov, elementos de movilización; ABI, sistema de infección abortiva; Tra, región de transferencia conjugativa; MDR, multi drug resistance; Sm, estreptomicina; Tc, tetraciclina; Cm, cloranfenicol; Cd, cadmio; Em, eritromicina, Ty, tilosina. b Las secuencias pueden obtenerse a través de Internet en la dirección: http://www.ncbi.nlm.gov/PubMed/
55
LEYENDAS A LAS FIGURAS.
Figura 1.- A, Representación esquemática de la región de replicación de los plásmidos
RCM del grupo pMV158/pE194 y su control. B, Secuencia nucleotídica del origen de
replicación del plásmido pBM02. En ambos paneles se representan los mismos
elementos, aunque en el panel A no se reproducen a escala. El sso está formado por dos
IRs, ambas necesarias para una actividad completa. El dso consta de una DR repetida tres
veces (zona de reconocimiento de Rep) y una IR (punto de corte). Pcr y PctRNA
representan los promotores a partir de los cuales se transcribe el RNAm de los genes cop y
rep y el ctRNA, respectivamente. La proteína Rep inicia y activa la replicación, mientras
que Cop la inhibe uniéndose al promotor Pcr. La traducción de Rep se inhibe también por
el apareamiento de su RNAm con el ctRNA. Tras una ronda de síntesis de la cadena líder,
la síntesis de la cadena retrasada se inicia en el sso.
Figura 2.- A, Representación esquemática de la región de replicación del grupo
mayoritario de los plásmidos Theta de lactococos. B, Secuencia nucleotídica del
origen de replicación del plásmido pBL1. El replicón mínimo comienza con una típica
DR en tándem de 10-11 pb separada por una región rica en A-T de las DRs de 22 pb
repetidas tres veces y media que constituyen los iterones. Separando estos elementos se
encuentran las denominadas pinzas GC, que impiden la separación excesiva de las cadenas
durante el inicio de la replicación. La DR final truncada se encuentra al extremo de la
región que funciona en cis y forma parte también de una repetición invertida, IR1, a la que
se une la proteína RepB con mucha afinidad. IR1 contiene el putativo sitio -35 de la región
promotora de repB. Otra IR importante se sitúa solapando parcialmente el posible RBS y el
56
triplete de iniciación (IR3). La posición de éstas y otras IRs sugiere una participación en la
regulación de la replicación y/o en el control del número de copias.
Figura 3.- Dendograma filogenético de las secuencias de las proteínas Rep de
diferentes plásmidos de lactococos. Las distancias evolutivas se han medido como
porcentajes de identidad aminoacídica. A, Homología de las secuencias de las proteínas
Rep de los plásmidos de tipo RCM. Excepto para los plásmidos pSH71, pDI25 y pWV01,
prácticamente idénticos, la similitud de las secuencias aminoacídicas de sus proteínas Rep
es escasa. Aún así, la organización estructural y funcional de todos ellos es muy similar. B,
Homología de las proteínas de los plásmidos de tipo Theta. Las secuencias de todas las
proteínas Rep, con excepción de las de pCRL291.1, pCI2000, y pNP40 pertenecen a una
sola clase y comparten más del 50% de identidad aminoacídica.
Figura 4.- A, Esquema genético y funcional de pBC1 de Bifidobacterium catenulatum
L48. B, Secuencia nucleotídica de su origen de replicación. Se destaca la posición,
orientación y tamaño de las distintas pautas abiertas de lectura y el punto de corte para
diversos enzimas de restricción. En la secuencia, se han representado las DRs e IRs más
representativas de la zona inmediatamente anterior al gen que codifica la proteína de
replicación. La numeración sigue la de la secuencia del plásmido.