Polimeráz láncreakció Polimeráz láncreakció (PCR)(PCR)

Készítette: Lakatos Készítette: Lakatos ValériaValériaBiológia-Biológia-HáztartásökonómiaHáztartásökonómiaszakos hallgatószakos hallgatóIII. évfolyamIII. évfolyam

A polimeráz A polimeráz láncreakcióláncreakció

Angol név: Polymerase Chain Reaction (PCR)Angol név: Polymerase Chain Reaction (PCR)K. Mullis- 1985K. Mullis- 1985Előnye az óriási sokszorozó képességeElőnye az óriási sokszorozó képességeMolekuláris biológiai alkalmazásai:Molekuláris biológiai alkalmazásai:1.1. DNS próbák előállítás hibridizációhozDNS próbák előállítás hibridizációhoz2.2. Módosított DNS előállítása Módosított DNS előállítása 3.3. KlónozásKlónozás4.4. DNS szekvenálásához minta előkészítéseDNS szekvenálásához minta előkészítése5.5. Genetikai betegségek kimutatásaGenetikai betegségek kimutatása6.6. Fertőzést okozó élőlények detektálása Fertőzést okozó élőlények detektálása

betegtől vett mintákbólbetegtől vett mintákból7.7. Igazságügyi orvostani vizsgálatokIgazságügyi orvostani vizsgálatok8.8. Rokonsági viszonyok, stb.Rokonsági viszonyok, stb.

A PCR elveA PCR elve

A DNS függő polimeráz (primer DNS A DNS függő polimeráz (primer DNS szál megkettőzését végző enzimek) szál megkettőzését végző enzimek) reakciót két megfelelő oligonukleotid reakciót két megfelelő oligonukleotid primer jelenlétében többször primer jelenlétében többször megismételve az eredeti DNS megismételve az eredeti DNS szekvencia egy része szekvencia egy része megsokszorozható. Ehhez szükség megsokszorozható. Ehhez szükség van DNS targetre, DNS polimerázra és van DNS targetre, DNS polimerázra és két olyan oligonukleotid primerre, két olyan oligonukleotid primerre, amely a DNS két szálával amely a DNS két szálával hibridizálnak úgy, hogy a 3’ végük hibridizálnak úgy, hogy a 3’ végük egymással szembenéz.egymással szembenéz.

A reakció lépéseiA reakció lépései

1. A kettősszálú DNS denaturálása 1. A kettősszálú DNS denaturálása hőkezeléssel (95 Celsius fok)hőkezeléssel (95 Celsius fok)

2. A targettel komplementer két 2. A targettel komplementer két oligonukleotid hibridizálása az egyes DNS oligonukleotid hibridizálása az egyes DNS szálakhoz úgy, hogy az egyikük az egyik, szálakhoz úgy, hogy az egyikük az egyik, másikuk a másik szálhoz kötődjön. A másikuk a másik szálhoz kötődjön. A kapcsolat stabilizálásához az elegyet le kell kapcsolat stabilizálásához az elegyet le kell hűteni és az oligonukleotidokat nagy hűteni és az oligonukleotidokat nagy feleslegben kell alkalmazni feleslegben kell alkalmazni

3. Új DNS szálak szintézise dNTP és DNS 3. Új DNS szálak szintézise dNTP és DNS polimeráz segítségévelpolimeráz segítségével

4. A ciklus megismétlése. Ekkor a 4. A ciklus megismétlése. Ekkor a sokszorozandó DNS szakasz megduplázódiksokszorozandó DNS szakasz megduplázódik

Plató effektusPlató effektus

Kb. 10Kb. 1066-szoros sokszorozás-szoros sokszorozás Exponenciális növekedés leállExponenciális növekedés leáll Magyarázat: DNS olyan Magyarázat: DNS olyan

mértékben koncentrálódik, hogy mértékben koncentrálódik, hogy gyakoribb a hosszú szálak gyakoribb a hosszú szálak renaturálódása mint az renaturálódása mint az oligonukleotiddal történő oligonukleotiddal történő hibridizáció hibridizáció

Egy tipikus PCR ciklus Egy tipikus PCR ciklus hőmérsékleti profiljaihőmérsékleti profiljai

1.1. Denaturálás 92-95 Celsius fokonDenaturálás 92-95 Celsius fokon

2.2. Primerek hibridizálása az Primerek hibridizálása az oligonukleotidok oligonukleotidok olvadáspontjától függő olvadáspontjától függő hőmérsékletenhőmérsékleten

3.3. DNS szintézis 72 Celsius fokonDNS szintézis 72 Celsius fokon

4.4. Újabb hődenaturálásÚjabb hődenaturálás

OptimalizálásOptimalizálás

Legfontosabb tényezők:Legfontosabb tényezők: 20-30 nukleotid hosszúságú primerek 20-30 nukleotid hosszúságú primerek

tervezése tervezése Optimális reakcióközeg beállításaOptimális reakcióközeg beállítása Nagy tisztaságú dNTP oldatok használataNagy tisztaságú dNTP oldatok használata Elvileg egyetlen kettős szálú DNS molekula Elvileg egyetlen kettős szálú DNS molekula

elegendő a másolás beindításához, de ekkor elegendő a másolás beindításához, de ekkor magasabb ciklus szám szükségesmagasabb ciklus szám szükséges

Rendkívül fontos a szennyezések és Rendkívül fontos a szennyezések és keresztszennyezések elkerülése (nem keresztszennyezések elkerülése (nem kívánatos szennyező DNS sokszorosítása)kívánatos szennyező DNS sokszorosítása)

Felmerülő problémák:Felmerülő problémák: A Taq polimeráz nem rendelkezik ellenőrző A Taq polimeráz nem rendelkezik ellenőrző

aktivitássalaktivitással Primerek aspecifikus kötődése – félrevezető Primerek aspecifikus kötődése – félrevezető

eredményeredmény A primerek összekapcsolódásával un. A primerek összekapcsolódásával un.

primer dimer keletkezhetprimer dimer keletkezhet Alkalmazásának korlátot szab, hogy csak Alkalmazásának korlátot szab, hogy csak

akkor használható, ha már van megbízható akkor használható, ha már van megbízható szekvencia információnk vagy a nukleinsav szekvencia információnk vagy a nukleinsav vagy a fehérje szintjén vagy a fehérje szintjén

PCR alkalmazásaiPCR alkalmazásai

Fertőző ágensek kimutatásaFertőző ágensek kimutatása Szövetminta in situ vizsgálataSzövetminta in situ vizsgálata Kettős szálú DNS megsokszorozásaKettős szálú DNS megsokszorozása mRNS átalakítása cDNS-sé, ennek mRNS átalakítása cDNS-sé, ennek

megsokszorozásamegsokszorozása Fehérjék meghatározása Fehérjék meghatározása

immundetektálás specifitásával ötvözveimmundetektálás specifitásával ötvözve Mutációk detektálásaMutációk detektálása

PCR szerepe a DNS PCR szerepe a DNS szekvenálásbanszekvenálásban Aszimmetrikus PCR. Aszimmetrikus PCR. Lényege: Lényege: a primereket nem 1:1 arányban a primereket nem 1:1 arányban

alkalmazzuk, hanem az egyik primert alkalmazzuk, hanem az egyik primert 100x-os feleslegben visszük be a 100x-os feleslegben visszük be a reakcióközegbe. Ilyenkor a PCR reakcióközegbe. Ilyenkor a PCR sokszorozás addig tart, amíg a kisebb sokszorozás addig tart, amíg a kisebb koncentrációjú primer el nem használódik, koncentrációjú primer el nem használódik, ezt követően csak a feleslegben jelenlévő ezt követően csak a feleslegben jelenlévő primer működik, így a szintézis egyszálú primer működik, így a szintézis egyszálú termékhez vezet. termékhez vezet.

Irányított mutagenézisIrányított mutagenézis

A PCR primerek és a target DNS A PCR primerek és a target DNS szekvenciája nem kell, hogy szekvenciája nem kell, hogy szükségszerűen 100%-ig szükségszerűen 100%-ig komplementer legyen. Lehetőség komplementer legyen. Lehetőség van eltérő szekvenciák van eltérő szekvenciák beépítésére. Ezek a szekvenciák a beépítésére. Ezek a szekvenciák a sokszorosított DNS részévé válnak sokszorosított DNS részévé válnak és maguk is sokszorozódnak.és maguk is sokszorozódnak.

Új restrikciós hely Új restrikciós hely kiépítésekiépítése

PCR segítségével a sokszorozott PCR segítségével a sokszorozott szekvencia végére olyan szekvencia végére olyan restrikciós helyet építhetünk be, restrikciós helyet építhetünk be, amely a természetes DNS-ben amely a természetes DNS-ben fordul elő. Ez akkor előnyös, ha a fordul elő. Ez akkor előnyös, ha a termék végét restrikciós enzim termék végét restrikciós enzim kezeléssel „ragadóssá” akarjuk kezeléssel „ragadóssá” akarjuk tenni pl. klónozás céljából. tenni pl. klónozás céljából.

G-C kapocs készítéseG-C kapocs készítése

A PCR reakció egyik primerjének 5’ A PCR reakció egyik primerjének 5’ végére G és C gazdag mesterséges végére G és C gazdag mesterséges szekvencia illeszthető. Ez erős szekvencia illeszthető. Ez erős hidrogénhíd kapcsolatot hoz majd létre. hidrogénhíd kapcsolatot hoz majd létre. A PCR termék a natív DNS szakaszhoz A PCR termék a natív DNS szakaszhoz képest stabilabban kapcsolódik össze. képest stabilabban kapcsolódik össze. Denaturáló gradiens során a PCR Denaturáló gradiens során a PCR termék nem esik szét. Felhasználható termék nem esik szét. Felhasználható pontmutációk detektálásának pontmutációk detektálásának érzékennyé tételére. érzékennyé tételére.

Pontmutáció Pontmutáció létrehozásalétrehozása

Az oligonukleotidban tudatosan Az oligonukleotidban tudatosan beépíthetünk egy, a target beépíthetünk egy, a target szekvenciával nem komplementer szekvenciával nem komplementer nukleotidot, és így jól nukleotidot, és így jól meghatározott helyen meghatározott helyen pontmutációt idézhetünk elő. pontmutációt idézhetünk elő.

Egyéb módszerekEgyéb módszerek

Géntechnológiai manipulációk (inzerció, Géntechnológiai manipulációk (inzerció, deléció, rekombináció)deléció, rekombináció)

Módosított nukleutidok beépítéseMódosított nukleutidok beépítése Részben vagy egyáltalán nem ismert DNS Részben vagy egyáltalán nem ismert DNS

szekvenciák sokszorozásaszekvenciák sokszorozása cDNS végek gyors erősítése (RACE)cDNS végek gyors erősítése (RACE) Szomszédos DNS szakaszok sokszorozásaSzomszédos DNS szakaszok sokszorozása RNS kvantitálási módszerei (Northern RNS kvantitálási módszerei (Northern

analízis, In situ hibridizáció, Rnasa protection analízis, In situ hibridizáció, Rnasa protection assay, microarray, Reverz traszkriptciós PCR)assay, microarray, Reverz traszkriptciós PCR)

ÖsszegzésÖsszegzés

A fenti példákkal illusztráltam a PCR A fenti példákkal illusztráltam a PCR sokoldalúságát. A fejlesztés még sokoldalúságát. A fejlesztés még korán sem zárult le, újabb és újabb korán sem zárult le, újabb és újabb technikákat vezetnek be különleges technikákat vezetnek be különleges és speciális problémák megoldására. és speciális problémák megoldására. Mindez azt bizonyítja, hogy a Mullis Mindez azt bizonyítja, hogy a Mullis által felfedezett egyszerű által felfedezett egyszerű sokszorozási reakció döntő befolyást sokszorozási reakció döntő befolyást gyakorolt a molekuláris biológia gyakorolt a molekuláris biológia módszertanára.módszertanára.

Köszönöm a figyelmet!Köszönöm a figyelmet!