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PRÓ REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO GRADUAÇÃO-
Mestrado em Ciências da Saúde
ANA PAULA BIADOLA
POLIMORFISMO GÊNICO NOD2 (RS8057341):
PAPEL NA SUSCEPTIBILIDADE, PRODUÇÃO DE ÓXIDO NÍTRICO E
SEVERIDADE DA TUBERCULOSE.
PRESIDENTE PRUDENTE - SP
2017
PRÓ REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO GRADUAÇÃO-
Mestrado em Ciências da Saúde
ANA PAULA BIADOLA
POLIMORFISMO GÊNICO NOD2 (RS8057341):
PAPEL NA SUSCEPTIBILIDADE, PRODUÇÃO DE ÓXIDO NÍTRICO E
SEVERIDADE DA TUBERCULOSE.
Projeto de Pesquisa apresentado à
Universidade do Oeste Paulista (UNOESTE)
para curso de Mestrado em Ciências da Saúde.
Orientadora: Prof. Dra. Eliana Peresi Lordelo
Alunos de Graduação:
Airton Lucio Da Silva
Andre Aparecido Dos Santos Correa
Felipe Antonio Bassoli Neves
Ualter Guilherme Cipriano Rosa
PRESIDENTE PRUDENTE - SP
2017
RESUMO
Introdução: A tuberculose (TB) é uma doença infecto-contagiosa, causada pelo
Mycobacterium tuberculosis (MTB), responsável por 10,4 milhões de novos casos de
TB em 2015 no mundo. A proteção inicial contra o bacilo se dá através do seu
reconhecimento por receptores de reconhecimento padrão, como os receptores do
tipo NOD. O NOD2 é capaz de reconhecer o dipeptídeo muramil da micobactéria,
ativando a via do fator de transcrição NF-κB, induzindo, assim, a transcrição de
citocinas pró-inflamatórias, promovendo a ativação dos macrófagos para a produção
de óxido nitrico (NO), um potente agente antimicrobiano no combate à micobactéria.
O NOD2 possui um papel importante no direcionamento da resposta imune frente à
agentes infecciosos, entretanto poucos estudos avaliaram a associação de
polimorfismos gênicos de base única (SNPs) nos genes do NOD2 com a TB e, Para
o nosso conhecimento, não existem estudos que avaliaram SNPs no gene do NOD2
associado à tuberculose na população brasileira. Objetivo: investigar a associação
genética de polimorfismos no gene NOD2 (rs8057341) com a tuberculose e sua
influência sobre a produção de óxido nítrico (NO) e a severidade da tuberculose.
Casuística e Métodos: Serão estudados doentes com tuberculose pulmonar e
doadores de sangue como controles. A frequência alélica e de genótipos do
polimorfismo NOD2 (rs8057341) será realizada por PCR em tempo real através da
técnica de discriminação alélica. Para comparações das freqüências de alelos e
genótipos dos grupos de casos e controles serão empregados modelos de
regressão logística, com cálculo de odds ratio (OR). A dosagem de NO será
realizada pela técnica de ELISA e avaliado através do teste de Kruskal-Wallis,
seguido do teste de Dunn. Para a avaliação da severidade da doença será realizada
uma análise estatística descritiva dos dados de prontuários avaliados. Após esta
avaliação, será realizada a comparação das proporções através do χ2 e será
calculada a razão de chances (odds ratio) e seu respectivo intervalo de 95% de
confiança. Serão considerados significativos resultados com p<0,05.
Palavras-chave: Tuberculose, NOD2, polimorfismo gênico, NO, severidade.
SUMÁRIO
1. Introdução .............................................................................................................. 4
2. Justificativa ............................................................................................................ 9
3. Objetivo ................................................................................................................ 10
3.1. Objetivo geral ................................................................................................ 10
3.2. Objetivos específicos ................................................................................... 10
4. Casuística e Métodos .......................................................................................... 11
4.1. Casuística ...................................................................................................... 11
4.2. Métodos ......................................................................................................... 12
4.2.1. Avaliação clínica dos pacientes com tuberculose pulmonar ............. 12
4.2.2. Polimorfismo gênico .............................................................................. 12
4.2.3 Dosagem de Óxido Nítrico (NO) ............................................................. 13
4.3. Análise Estatística ..................................................................................... 13
5. Cronograma ......................................................................................................... 15
Referências .............................................................................................................. 16
4
1. INTRODUÇÃO
A tuberculose (TB) é uma doença infecto-contagiosa, causada pelo
Mycobacterium tuberculosis (MTB), que pode ser considerada uma enfermidade da
civilização humana, que com o passar das décadas foi se inserindo silenciosamente
nas comunidades do mundo inteiro, gerando taxas de mortalidade muito maiores
que as encontradas na somatória geral de todas as outras pestes que assolaram a
humanidade. (SABOTA, 2000; NOGUEIRA et al, 2012).
Em 2015, foram registrados 10,4 milhões de novos casos de TB no mundo,
distribuídos em diferentes regiões (Figura 1), onde 5,9 milhões eram homens jovens,
3,5 milhões mulheres jovens e 1,0 milhões crianças. (WHO, 2016).
Figura 1. Incidência de Tuberculose no ano de 2015 (WHO, 2016).
A epidemia mundial da tuberculose é de difícil controle, sendo um problema
de saúde pública, principalmente em países em desenvolvimento como o Brasil,
causando altas taxas de mortalidade em adultos jovens (entre 15 e 49 anos)
5
(MARQUIEVIZ et al, 2013). A transmissão da TB ocorre de pessoa a pessoa através
de gotículas de saliva contendo o MTB, quando o indivíduo tosse, espirra ou fala e
acomete principalmente os pulmões (LEWANDOWSKI,2015). Apesar dos avanços
tecnológicos existentes, ainda não foi possível controlá-la por conta de alguns
fatores como: bolsões de pobreza, a epidemia de aids e a deterioração dos serviços
de saúde (SABOTA, 2000).
O diagnóstico da TB pulmonar é feito principalmente pelos dados clínicos e
radiológicos além da confirmação obtida pela baciloscopia e/ou cultura. A
baciloscopia é um exame rápido e barato, sendo por isso eleito pelos serviços de
saúde pública, apesar de apresentar uma baixa sensibilidade. Por outro lado a
cultura, considerada o padrão ouro, tem alta sensibilidade, mas como a reprodução
do bacilo é lenta, o resultado pode demorar de quatro até oito semanas, tempo
considerado muito longo, uma vez que o diagnóstico e o tratamento precoces
interrompem o ciclo de transmissão do agente (BRASIL, 2011).
Atualmente existe o teste rápido para a detecção do complexo MTB, o Xpert®
MTB/RIF. O teste, baseado na metodologia de PCR em tempo real, pode ser
realizado diretamente da amostra de escarro e outros fluidos corporais e libera o
resultado dentro de duas horas. Além de avaliar a presença do complexo MTB, este
teste também avalia a resistência da cepa à rifampicina, principal droga utilizada no
tratamento antituberculose. Entretanto, este diagnóstico é realizado somente em
centros de referência e, no Brasil, a baciloscopia continuará a ser utilizada para os
casos em que o Xpert® MTB/RIF não pode ser usado, como amostras com
quantidade insuficiente para processamento no equipamento e, principalmente, para
o controle de tratamento (ACOSTA, et al; 2014; BRASIL, 2015).
Os indivíduos diagnosticados com TB em atividade recebem tratamento anti-
TB por seis meses, utilizando-se quatro drogas de primeira linha: isoniazida,
etambutol, pirazinamida e rifampicina, e quando necessário este tratamento pode se
estender por até nove meses. Estes fármacos apresentam alto nível de eficácia e
6
um grau aceitável de toxicidade, entretanto já existem cepas de MTB resistentes a
estes medicamentos, sendo necessário utilizar drogas de segunda linha, como
levofloxacina e estreptomicina (BRASIL, 2015).
A proteção inicial contra o bacilo se dá através do reconhecimento de
moléculas associadas a micro-organismos (PAMP), como lipopolissacarídeos,
lipoproteínas, peptideoglicanos, entre outros, por receptores de reconhecimento
padrão (PRR), presentes nas células apresentadoras de antígenos (APC), como os
receptores do tipo Toll (TLR) e os receptores do tipo NOD (NLR). Os NLRs são
responsáveis pela detecção intracelular de PAMPs presentes em micro-organismos,
e até o momento, foram descobertos 22 tipos de proteínas em humanos (PINHO,
2008; TING, 2008). O NOD2 é capaz de reconhecer o dipeptídeo muramil, um dos
componentes do peptideoglicano da parede de bactérias Gram-positivas e negativas
e da micobactéria, ativando a via do fator de transcrição NF-κB, induzindo, assim, a
transcrição de proteínas pró-inflamatórias, como TNF-α e IL-1β para o combate
contra o patógeno (TING, 2010).
Após a fagocitose do MTB, o TNF-α, junto com IFN-γ produzido pelas células
NK, ativam os macrófagos induzindo diferentes mecanismos microbicidas, como a
produção de óxido nitrico (NO), de radicais superóxido e a indução dependente de
vitamina D de peptideos antimicrobianos, incluindo a catelicidina e β-defensinas. A
resposta imune inata efetiva, combinada à baixa virulencia estaá associada às
baixas taxas de desenvolvimento da doença. Por outro lado, o sucesso da infecção
e a sobrevivencia do bacilo dependem de sua capacidade de escapar das
estratégias de defesa montadas pelo hospedeiro. (LIU et al., 2006; LEANDRO et al.,
2009). Estudo in vitro realizado por Landes e colaboradores (2017) demonstrou que
macrófagos humanos são capazes de produzir NO após infecção com MTB e que
esta produção era devido à expressão de iNOS dependente do NOD2 e que o fator
de transcrição NF-κB era um dos requisitos para esta indução.
7
Diversos estudos sustentam a hipótese de que a composição genética do
individuo influencia na suscetibilidade à doenças, tanto em relação ao aparecimento
quanto a evolução para diferentes formas clinicas (MARQUET; SCHURR, 2001). Na
tuberculose, aproximadamente 90% dos indivíduos infectados pelo MTB irão
permanecer assintomáticos, apresentando a infecção latente, e apenas 10% irão
desenvolver a TB ativa, fato que reforça um papel importante de fatores associados
à genética do hospedeiro para regular a progressão do tipo de infecção da
tuberculose (MURRAY, 1990).
A associação de um gene e a suscetibilidade/resistencia à doença é baseada
na comparação das frequencias alélicas de um marcador genético entre individuos
afetados e não afetados e o marcador será considerado associado ao fenótipo
quando houver uma diferença significativa nas frequencias observadas entre esses
dois grupos. Existem diversos tipos de marcadores genéticos, como os
polimorfismos do tipo microssatélite e os polimorfismos de base única (SNP)
(PACHECO; MORAES, 2009).
Os SNPs são variações ou mutações na sequencia do DNA que ocorrem quando
uma única base [adenina (A), timina (T), citosina (C) ou guanina (G)] é alterada na
sequencia do genoma (SACHIDANANDAM; WEISSMAN; SCHMIDT et al. 2001).
Podem estar presentes em regiões intragenicas não codificantes ou em regiões
codificantes ou intergenicas. Sua presença pode alterar a afinidade de ligação entre
regiões promotoras e fatores de transcrição, modificar sitios de splicing e até mesmo
provocar a troca de um aminoácido, levando a variações na estrutura e/ou função de
uma proteina (MORAES et al., 2006).
Uma revisão sistemática avaliou a associação entre SNPs no gene NOD2 e a
TB de cinco publicações diferentes. Os resultados indicaram que o alelo C do gene
NOD2 Arg702Trp está associado com proteção contra a TB em uma população afro-
americana, mas que os SNPs Arg587Arg e Gly908Arg não são fatores de risco para
a susceptibilidade à TB (Wang, 2014). Outro estudo realizado com uma população
8
da Europa Oriental, entretanto, não demonstrou associação do SNP Arg702Trp com
a susceptibilidade à TB (Cucu, 2017). A associação de SNPs no gene NOD2 foi
observada em outras doenças, como a hanseníase, onde estudo realizado na
população brasileira demonstrou associação do alelo A do NOD2 (rs8057341) com
proteção (Sales-Marques, 2014).
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2. Justificativa
O NOD2 possui um papel importante no direcionamento da resposta imune
frente à agentes infecciosos, entretanto poucos estudos avaliaram a associação de
SNPs nos genes do NOD2 com a tuberculose.
Para o nosso conhecimento, não existem estudos que avaliaram o gene do
NOD2 associado à tuberculose na população brasileira, portanto, o projeto de
pesquisa proposto, do tipo caso-controle, poderá contribuir para um melhor
entendimento da resposta imune à tuberculose, através da associação do SNP
NOD2 (rs805734) à susceptibilidade, evolução clínica, diagnóstico e
acompanhamento do tratamento de pacientes com TB pulmonar no Brasil.
Foi verificado que também não existem estudos que realizaram uma análise
funcional deste gene em relação à produção de sérica de NO, possibilitando assim
um melhor entendimento deste gene na resposta imune anti-TB.
Além disso, futuras associações com outros SNPs no gene do NOD2 e outros
de interesse poderão ser avaliadas, permitindo uma melhor compreensão da
resposta imune à TB.
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3. OBJETIVO
3.1. Objetivo geral
Investigar a associação genética de polimorfismos no gene NOD2 (rs8057341)
com a tuberculose e sua influência sobre a produção de óxido nítrico (NO) e a
severidade da tuberculose.
3.2. Objetivos específicos
3.2.1. Avaliar a frequência alélica e de genótipos para polimorfismos no gene
NOD2 (rs8057341) em pacientes com tuberculose e em controles saudáveis.
3.2.2. Investigar a associação de polimorfismos no gene NOD2 (rs8057341) com
o risco de desenvolver tuberculose.
3.2.3. Investigar a associação de polimorfismos no gene NOD2 (rs8057341)
sobre a produção de NO em pacientes com tuberculose e em controles
saudáveis.com a severidade da tuberculose.
3.2.4. Avaliar a influência de polimorfismos no gene NOD2 (rs8057341) sobre a
produção de NO em pacientes com tuberculose.
11
4. Casuística e Métodos
4.1. Casuística
Serão estudados dois grupos:
Grupo controle (n ≥ 200)
O presente projeto irá analisar as amostras do biorrepositório de DNA dos
sujeitos da pesquisa intitulada “Investigação de polimorfismos gênicos em
doadores de sangue como controles para o estudo de genes de
susceptibilidade à tuberculose e outras doenças infecciosas.”, conduzido pela
pesquisadora orientadora e já aprovado com o protolocolo CCPq/
CAAE: 2359/39826414.8.0000.5515.
Estas amostras são provenientes de doadores de sangue do Núcleo de
Hemoterapia de Presidente Prudente, sem queixas clínicas, maiores de 18 anos,
ambos os sexos e sem histórico prévio de doenças infecciosas e que concordaram
em participar da pesquisa acima citada após esclarecimento e assinatura do Termo
de Consentimento Livre e Esclarecido.
Grupo tuberculose pulmonar (n ≥ 100)
Serão analisadas as amostras do biorrepositório de DNA e de soro dos sujeitos
da pesquisa intitulada “Investigação de polimorfismos genéticos em genes de
susceptibilidade à tuberculose.”, sob a responsabilidade da pesquisadora
orientadora, aprovado sob o protocolo CPDI/CAAE: 2824/49097215.4.0000.5515.
Essas amostras são provenientes de pacientes com tuberculose pulmonar,
atendidos no Ambulatório de Tisiologia do Centro de Saúde Integrado de Presidente
Prudente, maiores de 18 anos, ambos os sexos, com diagnóstico de tuberculose
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pulmonar, em diferentes etapas do tratamento antituberculose: casos novos, em
tratamento e curados (tratamento finalizado), que não pertencerem ao sistema
penitenciário e que concordaram em participar da pesquisa acima citada após
esclarecimento e assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido.
4.2. Métodos
4.2.1. Avaliação clínica dos pacientes com tuberculose pulmonar
Serão utilizados dados dos prontuários dos pacientes com tuberculose, como a
confirmação do diagnóstico da tuberculose (baciloscopia, cultura e exames de
imagem), diagnóstico de HIV, vacinação pelo BCG, tuberculose prévia, histórico de
contato com doentes tuberculose, teste da tuberculina (PPD), coletados pela
pesquisa acima citada, e utilizados para classificar os pacientes quanto à severidade
da tuberculose: severa, moderada e amena.
4.2.2. Polimorfismo gênico
Para as genotipagens serão utilizadas amostras de DNA extraídas de 5 ml de
sangue periférico em EDTA, dos grupos controle e tuberculose pulmonar dos
biorrepositórios dos projetos acima citados.
Para a avaliação do polimorfismo NOD2 (rs8057341) as reações de PCR em
tempo real serão feitas em equipamento ABI Prism SDS 7000 utilizando sistema Taq
Man (TaqMan Master Mix – Applied Biosystems – 4318157). A sonda específica
para a sequência de interesse está descrita na Tabela 1 e será adquirida através do
serviço de “Assay-by-Design” do fabricante (Applied Biosystems).
Tabela 1. Sequência a ser investigada pela técnica de discriminação alélica.
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Gene SNP Sequência
NOD2 rs8057341 AGCTGACTGAGGCAGCGGGAGTTGA[A/G]AAGAAACGATATTAGTTCATGGTG
A
4.2.3 Dosagem de Óxido Nítrico (NO)
Soros dos pacientes com TB mantidos a -80oC serão descongelados no
momento do uso e a dosagem de NO será realizada pela técnica de ELISA,
seguindo as normas de fabricação do kit comercial.
4.3. Análise Estatística
Para a análise do SNP serão calculadas as frequências alélicas (números de
alelos/cromossomo analisado), frequências genotípicas (número de indivíduos com
um determinado genótipo/número de indivíduos total estudado) e frequências de
portadores (soma do número de indivíduos homozigotos e heterozigotos para o
alelo/número total de indivíduos analisados).
Desvio do Equilíbrio de Hardy-Weinberg (EHW) será testado comparando as
frequências de genótipos observadas com as esperadas pela lei de Hardy-Weinberg
utilizando o teste de Qui-quadrado.
Para comparações das frequências de alelos e genótipos dos grupos de
casos e controles serão empregados modelos de regressão logística, com cálculo de
odds ratio (OR) e p-valor, adotando como medida de significância estatística p-
valor<0,05.
Para a avaliação da severidade da doença será realizada uma análise
estatística descritiva dos dados de prontuários avaliados. Após esta avaliação, será
14
realizada a comparação das proporções através do χ2 e será calculada a razão de
chances (odds ratio) e seu respectivo intervalo de 95% de confiança, adotando como
medida de significância estatística p-valor<0,05.
Para a avaliação da produção de NO será realizado o teste de Kruskal-Wallis,
seguido do teste de Dunn, adotando como medida de significância estatística p-
valor<0,05.
Os procedimentos estatísticos serão realizados empregando-se o programa
GraphPad Prism version 5.00 for Windows, GraphPad Software, San Diego,
California USA, www.graphpad.com.
15
5. CRONOGRAMA
Atividades Semestres
1° 2° 3° 4°
Revisão de Literatura X X X X
Obtenção de Créditos X X X
Coleta de dados X X
Análise e interpretação dos Dados X X X
Participação do ENEPE X
Exame de Qualificação X
Defesa e Redação final da Dissertação X
Elaboração e submissão de artigo científico X X
16
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