Por:

M. en C. de Educ. Guadalupe E. Daleth Guedea Fernández

abril 2006

4ª y última parte

Distribución de la luz en el Distribución de la luz en el espectrofotómetro espectrofotómetro

Curva Patrón Tipos de EspectrofotómetroTipos de Espectrofotómetro

Referencias e ImágenesReferencias e Imágenes

Distribución de la luz en Distribución de la luz en el espectrofotómetroel espectrofotómetro

 

Espectrofotómetro Mecanismo Interno

Met.Cient. I

 

COLORCOLOR LONGITUD DE ONDA (LONGITUD DE ONDA ())

Rojo (Rojo (RR)) 700 nm700 nm

Verde (Verde (GG)) 546.1 nm546.1 nm

Azul (Azul (BB))435.8 nm435.8 nm

  

¿Porque leer a diferentes (longitudes de onda) compuestos parecidos pero diferentes?

Es usual que al seguir una “receta” para la determinación de la concentración de un compuesto en particular se indica una longitud de onda (específicaa la que hay que leer con el colorímetro o espectrofotómetro.

La explicación radica en el hecho de que cada producto químico se caracteriza por zonas del espectro visible o no visible en el cual absorbe con mayor o menor intensidad conformando en su conjunto el espectro de absorción de tal sustancia.

Cada compuesto (de complejo a simple) presenta un espectro de absorción característico

Las longitudes de onda con mayor absorción (picos) corresponderán de forma general a aquellas con las que se leerá la muestra para determinar su concentración

La relación entre la absorbancia por una sustancia a una determinada y su concentración es directamente proporcional es decir: a mayor concentración mayor proporción de luz absorbida.

Absorbancia Conc.

Absorbancia

Absorbancia

Así, el espectro de absorción de la clorofila es:

Espectro de Absorción (línea continua) y Espectro de Transmisión (línea discontinua).

Colorante común, la Rodamina 6G en Metanol..

celda de 5uL

La muestra se coloca en una cubeta* de forma prismática

Se asume que el tubo, celda o “cubeta” en la cual se vierte la solución a leer no debe desviar la trayectoria de la luz como requisito para el cumplimiento de la ley de Beer

Como el cuarzo aparte de ser muy transparente muestra un comportamiento constante ante la variación de la longitud de onda, es usual que las celdas del espectrofotómetro o colorímetro sean de este material .

El argumento para el proceso de determinación de una concentración desconocida es:

A partir de concentraciones conocidas de las cuales también se sabe su absorbancia (curva patrón), es posible interpolar (intercalar) la concentración del problema sabiendo su absorbancia (línea roja en figura siguiente)

Curva Patrón

CURVA PATRÓN

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0 2 4 6 8 10 12

Concentración mg/lt

AB

S

0

R

B

A

N

C

I

A

Interpolación

Absorbancia del problema

Con base en que la Absorbancia guarda una relación lineal con la concentración, se comprende la existencia de una relación de proporcionalidad entre la Absorbancia y la concentración:

A1 / A2 = C1 / C2 Donde:A1 = Absorbancia del problema.A2 = Absorbancia de un estándar de concentración conocida.C1 = Concentración del problema.C2 = Concentración del estándar.

Si despejamos C1 = Conc del problema

A1 (problema) * Conc estándarConc. (problema) = A2 (estándar)

Ejemplo de curva patrón para la determinación de safranina; donde se solubiliza este colorante únicamente en agua siendo por tanto el agua misma el tubo blanco o de referencia para la calibración del equipo (colorímetro o espectrofotómetro)

TUBOTUBO Stock de SafraninaStock de Safranina

(3 x10 -4 g/ml) ml(3 x10 -4 g/ml) mlAgua Destilada mlAgua Destilada ml

11 0 0 1010

22 0.05 0.05 9.959.95

33 0.100.10 9.99.9

44 0.200.20 9.89.8

55 0.400.40 9.69.6

66 0.800.80 9.29.2

En este ejemplo de determinación de Glucosa, en la preparación de los tubos para la lectura de la curva patrón, se incluyen más elementos y por lo cual el tubo “blanco” (0) contiene todos los componentes excepto la glucosa con el fin de de poder calibrar la absorbancia del equipo a cero

CompuestoCompuesto1 1

(blanc(blanco)o)

22 33 44 55 66 77

Glucosa 0,1 mg/ml Glucosa 0,1 mg/ml (mL)(mL) 0.00.0 0.10.1 0.20.2 0.40.4 0.60.6 0.80.8 1.01.0

Agua destilada Agua destilada (mL)(mL) 1.01.0 0.40.4 0.90.9 0.80.8 0.20.2 0.60.6 0.00.0

Fenol al 5% (mL)Fenol al 5% (mL) 1.01.0 1.01.0 1.01.0 1.01.0 1.01.0 1.01.0 1.01.0

Acido sulfúrico Acido sulfúrico (mL)(mL) 5.05.0 5.05.0 5.05.0 5.05.0 5.05.0 5.05.0 5.05.0

TubosTubos AbsorbanciaAbsorbancia

11 00

22 0.1350.135

33 0.2530.253

44 0.4170.417

55 0.6580.658

66 0.5740.574

77 0.7680.768

Absorbancia en el Espectrofotómetro a 490 nm

RESULTADO de la curva patrón anterior

Curva de calibración de glucosa

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1 2 3 4 5 6 7

Tubos

Abso

rban

cia

Un aspecto importante de la evaluación espectrofotométrica, es que muchas moléculas orgánicas no absorben en el intervalo del espectro visible sino en el rango de longitudes de onda acordes al ultravioleta o al infrarrojo

Por lo que es común, actualmente, que la mayoría de los espectrofotómetros, actuales, se encuentren provistos con lo necesario para leer en de tales intervalos

Así, los grupos carbonilo presentes en los aldehídos (RCHO), cetonas (RCOR), ácidos carboxílicos (RCOOH), l ésteres (RCOOR´) y amidas (RCONHR´) dan lugar a absorciones intensas en la región del espectro de infrarrojo situada entre 1780-1640 cm-1.

Absorciones máximas (picos de absorción) de algunos compuestos que absorben en la región

ultravioleta:

Grupos funcionales cuyos picos de absorción se localizan en la región del infrarojo

Tipos de Tipos de EspectrofotómetroEspectrofotómetro

Existen en la actualidad Existen en la actualidad diversos tipos de aparatos con diversos tipos de aparatos con los mismos principios los hay los mismos principios los hay mecánicos y digitales; unos mecánicos y digitales; unos miden solo la luz visible, otros miden solo la luz visible, otros son más precisos y miden son más precisos y miden también luz U.V. , Infrarroja, de también luz U.V. , Infrarroja, de absorción atómica (AA), absorción atómica (AA), flurescencia de rayos-X de flurescencia de rayos-X de emisión de plasma (ICP),, emisión de plasma (ICP),, multipropósitos (para medir multipropósitos (para medir directamente la solución con directamente la solución con suspensión, muestras sólidas y suspensión, muestras sólidas y biológicas), acoplado a biológicas), acoplado a masas,etc..masas,etc..

Diferentes tipos de espectrofotómetros

MCI MCI

MCI

Para medir Luz Visible

Para medir Luz Visible y U.V.

Para medir Luz Visible y U.V.

Spectronic 20 D Spectrónic 20

Partes del Spectronic 20 DPartes del Spectronic 20 D

Manejo de Manejo de espectrofotómetroespectrofotómetro

En las siguientes diapositivas se les proporciona el instructivo para el manejo el espectrofotómetro Modelo Spectronic 20.

Manejo de espectrofotómetroManejo de espectrofotómetro Prender el aparato (Prender el aparato (aa)10 minutos antes de utilizarse, se )10 minutos antes de utilizarse, se

activará la luz roja de encendido (activará la luz roja de encendido (bb).). Seleccionar la longitud de onda con el botón (Seleccionar la longitud de onda con el botón (cc).). Ajuste (con Ajuste (con aa) a 0% de transmitancia, con la tapa cerrada y ) a 0% de transmitancia, con la tapa cerrada y

sin muestra.sin muestra. Insertar la cubeta con el Insertar la cubeta con el blancoblanco en su sección ( en su sección (dd).).

a

b

cd

Ajustar (con e) a 100% transmitancia (0 absorbancia)Ajustar (con e) a 100% transmitancia (0 absorbancia) Retirar el Retirar el blanco blanco de la cubeta, agregarle la muestra de la cubeta, agregarle la muestra

problema, e insertar en su espacio, bajar la tapa.problema, e insertar en su espacio, bajar la tapa. La aguja (d) del lector se deslizará sobre la escala (f) , se La aguja (d) del lector se deslizará sobre la escala (f) , se

lee en % de transmitancia ó en unidades de absorbancialee en % de transmitancia ó en unidades de absorbancia

e

d

f

CUIDADOSCUIDADOS Las muestras no deben tener burbujas, encontrarse Las muestras no deben tener burbujas, encontrarse

turbias o con precipitados.turbias o con precipitados. El volumen de la muestra en la cubeta, no debe ser El volumen de la muestra en la cubeta, no debe ser

excesivo para evitar que se desborde, en caso de excesivo para evitar que se desborde, en caso de que sucediera, se debe limpiar con un paño limpio o que sucediera, se debe limpiar con un paño limpio o papel absorbente suave, para evitar rayarla.papel absorbente suave, para evitar rayarla.

La cubeta se sujeta por los lados opacos.La cubeta se sujeta por los lados opacos. La cantidad a adicionar es, máximo, hasta ¾ partes La cantidad a adicionar es, máximo, hasta ¾ partes

de la cubetade la cubeta No se deben derramar líquidos, sobre todo No se deben derramar líquidos, sobre todo

solventes, ácidos o álcalis; dentro del contenedor solventes, ácidos o álcalis; dentro del contenedor de la cubeta, se puede dañar parte del mecanismode la cubeta, se puede dañar parte del mecanismo

Se debe mantener, el espectrofotómetro, limpio y Se debe mantener, el espectrofotómetro, limpio y libre de humedadlibre de humedad

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* * Basado en el trabajo de ppw : Arriaga F. Alberto y Basado en el trabajo de ppw : Arriaga F. Alberto y Guedea Fdz. Guadalupe., “ Fundamentos de Guedea Fdz. Guadalupe., “ Fundamentos de colorimetría y espectrometría” Julio de 2005, para colorimetría y espectrometría” Julio de 2005, para Met. Científica 1 Biología , FES Iztacala UNAM. Met. Científica 1 Biología , FES Iztacala UNAM. Sin Sin publicarpublicar

***Imagenes proporcionadas por Carlos S. Chinea ***Imagenes proporcionadas por Carlos S. Chinea casanchi@ya.comcasanchi@ya.com

Las imágenes señaladas con MCI fueron tomadas en Las imágenes señaladas con MCI fueron tomadas en el 2005 de los aparatos que se encuentran en el el 2005 de los aparatos que se encuentran en el Laboratorio de Metodología Científica I de la Carrera Laboratorio de Metodología Científica I de la Carrera de Biología en la Facultad de Estudios Superiores de Biología en la Facultad de Estudios Superiores Iztacaca UNAM México.Iztacaca UNAM México.

DATOS DEL AUTORDATOS DEL AUTOR Mexicana, Bióloga (UNAM) y Maestra en Mexicana, Bióloga (UNAM) y Maestra en

Ciencias de la Educación (ETAC); Ciencias de la Educación (ETAC); Correo: Correo: daleth_guede@yahoo.com.mx , daleth_guede@yahoo.com.mx ,

dalethguedea@hotmail.com y/o dalethguedea@hotmail.com y/o daleth.guedea@gmail.comdaleth.guedea@gmail.com